Das
zu lösende
Strukturproblem besteht darin, in den BioMolekularen Maschinen die
relative Lage (Topologie) der einzelnen makromolekularen Untereinheiten
zueinander (Positionen, Distanzen) quantitativ zu bestimmen; ange strebt
wird eine so große
Genauigkeit der togologischen Bestimmung, daß ein Vergleich der Ergebnisse
mit Methoden des Biocomputing eine verbesserte Voraussage der Gesamtstruktur
der Biomolekularen Maschine möglich macht.
Das Ziel ist die Bestimmung von Positionen mit einem Fehler im Subnanometerbereich
und eine Bestimmung von Distanzen zwischen den Untereinheiten im
Nanometerbereich, ebenfalls mit einem Fehler im Subnanometerbereich.
Dies ermöglicht
es beispielsweise, zwischen pharmazeutisch aktiven und inaktiven
Komplexen zu unterscheiden. Dazu sollen zunächst einzelne Untereinheiten
(hier insbesondere Proteine) in situ so identifiziert und markiert werden,
daß der
Ort der Markierung mit atomarer Auflösung bekannt ist. Beim gegenwärtigen Stand der
Technik sind eine Reihe verschiedener Verfahren bekannt, die eine
Fluoreszenzmarkierung linearer Biopolymere bewirken (
DE 100 52 823 Cremer & Grunze). Der
Ort der Markierung selbst ist jedoch oftmals nicht mit der erforderlichen
Auflösung
gegeben. Dies gilt insbesondere von der Fluoreszenzmarkierung von
Proteinen. In dem hier beschriebenen erfindungsgemäßen Verfahren
wird dieses wesentliche Problem der Optimierung der Anordnung linearer
Biopolymere auf Microarrays für
lichtnanoskopische Messungen dadurch gelöst, daß einzelne an bekannten Stellen
fluoreszenzmarkierte, proteinspezifische Sondenmoleküle (z.B.
Aptamere) an gereinigte, für die
höchstauflösende Magnetresonanz-Strukturananlyse
(HMR) präparierte
(Protein)-Untereinheiten in Lösung
gebunden und ihre Position in den betreffenden Untereinheiten durch
HMR-Verfahren mit
atomarer Auflösung
bestimmt wird. Aptamere sind einsträngige Oligonukleotidsequenzen,
die in spezifischer Weise an spezifische Proteine binden; für die hier
beschriebenen Analysen sind sie in ganz besonderer Weise geeignet.
Während Aptamere
mit spezifischer Bindung an lineare Biopolymere zum Stand der Technik
gehören,
ist der Einsatz fluoreszenzmarkierter Aptamere in der hier beschriebenen
Weise neu.
Für jede so
fluoreszenzmarkierte Untereinheit der zu analysierenden Biomolekularen
Maschine wird dabei eine lichtoptisch unterschiedliche spektrale
Signatur (gekennzeichnet z.B. durch Fluoreszenzemissionsspektrum;
Fluoreszenzlebensdauer etc.) gewählt.
Unter geeigneten Bedingungen ist es möglich, von jedem einzelnen
solcher Fluoreszenzmarkermoleküle
ca. 10,000 – 50,000
Photonen zu detektieren und von benachbarten Fluoreszenzmarkermolekülen anderer
spektraler Signatur getrennt zu registrieren.
Die
so markierten Untereinheiten werden mit geeigneten Verfahren zu
einzelnen supramolekularen Komplexen zusammengefügt. Diese Zusammenfügung, auch
Bildung genannt, hat so zu erfolgen, daß die erhaltenen Strukturen
möglichst
nahe dem unter physiologischen Bedingungen auftretenden Zustand
sind. Die Bildung erfolgt auf nanostrukturierten Micoarrays, wobei
die Anordnung der linearen Biopolymere auf den Microarrays in der
erfindungsgemäßen Weise
optimiert erfolgt. Diese Optimierung der Anordnung ist von größter Bedeutung
für das
erfindungsgemäße Ziel,
die BMM unter physiologischen Bedingungen analysieren zu können. Als
physiologisch werden hier Bedingungen bezeichnet, die den in lebenden
Organismen typischen Verhältnissen
in Bezug auf wäßriges Milieu,
Innenkonzentrationen, Temperatur, funktionsrelevante Moleküle und Enzyme
in Lösung
etc. entsprechen. Verfahren dieser Optimierung sind im Detail in
der Erfindungsbeschreibung dargestellt.
In
einer früheren
Offenlegung (
DE 100 52 823 ,
Verfahren zur lichtmikroskopischen Analyse der Topologie molekularer
Strukturen in Rasteranordnungen) wird im Einzelnen beschrieben,
wie derartige Microarrays strukturiert sein müssen, damit die erfindungsgemäße lichtoptische
Analyse durchgeführt werden
können.
Nicht geoffenbart wurde jedoch, in welcher spezifischen Weise die
Anordnung der linearen Biopolymere auf den Rasteranordnungen so
optimiert erfolgen kann, daß der
Prozeß in
der für
die Analysen, insbesondere auch für High Through Put Analysen,
erforderlichen Weise auch von Seiten der Struktur der linearen Biopolymere
optimiert wird. Einer der wesentlichen Aspekte einer Reproduzierbarkeit
der Analyse von BMM ist beispielsweise, daß die Faltung der beteiligten
Biopolymere und ihre Assoziation zu Komplexen in der Weise erfolgt,
daß sie
dem nativen Zustand entspricht, also dem unter funktionsrelevanten
Bedingungen in lebenden Zellen bestehenden Zustand möglichst
nahe kommt. Zahlreiche Ergebnisse nach dem Stand der Technik haben
gezeigt, daß ohne
eine solche Optimierung der Anordnung die gebundenen linearen Biopolymere
ganz oder teilweise denaturiert werden können, d.h. in nicht-funktionelle
und variable Faltungsstrukturen übergehen
können.
Dies aber mindert entscheidend die Aussagekraft jeder Topologieanalyse
der gebildeten Komplexe. Die hier beschriebene Erfindung erlaubt
es, dieses wesentliche Problem zu lösen und damit ganz entscheidend
eine Optimierung der Anordnung zu bewirken.
Über den
Aspekt der Strukturanalyse hinaus können optimierte Anordnungen
linearer Biopolymere auf Microarrays, z.B. im obigen Sinne optimierte BMM-Microarrays, auch
für die
Synthese von biologischen Makromolekülen eingesetzt werden. Geht man
z.B. von einem Array von der Größe 1 cm2 und einem Abstand der BMM-Features von
1 μm aus,
so ergeben sich bei voller Belegung 108 BMMs.
Unter nativen Bedingungen entspricht dies der Synthesekapazität (je nach
angenommener BMM) von tausenden bis vielen Millionen Zellen.
Fernfeldlichtmikroskopische
Verfahren bieten den großen
Vorteil einer berührungsfreien
und minimalinvasiven Analyse bei relativ großem Gesichtsfeld. So entfällt das
bei Anwendung von Rasterkraftmikroskopie (AFM) Methoden bestehende
Problem der Auflagekraft-abhängigen
Bildgebung. Ein Vergleich der beiden auf diese Weise gewonnenen Bilder
würde die
Analyse dynamischer Struktureigenschaften erheblich verbessern.
Zum Beispiel kann man bei Anordnung von BMMs in einem Array mit Abständen von
500 nm zwischen den einzelnen BMM-Features in einem einzigen Gesichtsfeld
viele tausende von einzelnen BMM analysieren; die. Untersuchungen
können
unter physiologischen Bedingungen durchgeführt werden können; insbesondere sind
Wechselwirkungen zwischen BMM-Strukturen und Pharmaka/Toxinen möglich. Geht
man für
einen bestimmten Analysepunkt von einem Bedarf von 1000 Array-gebundenen
BMMs aus, so ist dies bei einem angenommen Molekulargewicht in der
Größenordnung
von 1 Megadalton eine Gesamtsubstanzmasse im Bereich von Femtogramm.
Die benötigte Menge
an BMMs ist damit derartig klein, daß selbst tausende von Untersuchungen
nur sehr wenig Material erfordern.
Bis
vor wenigen Jahren war es allgemeine Meinung, dass solche lichtmikroskopische
Ultrastrukturanalysen wegen der auf etwa eine halbe Wellenlänge begrenzten
lichtoptischen Auflösung
physikalisch nicht möglich
seien. Mit neuen, in jüngster
Zeit entwickelten Verfahren ist es jedoch möglich geworden, für bestimmte
wichtige strukturelevante Parameter diese Grenze zu überwinden.
Zum Beispiel ist es nunmehr mit Fluoreszenz Resonanz Energie Transfer
(FRET) möglich,
einzelne Distanzen von wenigen Nanometern zwischen zwei Fluorochrom-Positionen
in einer Struktur abzuschätzen, oder
qualitative Aussagen über
die Zusammensetzung von BioMolekularen Maschinen zu erhalten. Quantitative
topologische Analysen im o.g. Sinne sind mit solchen Verfahren jedoch
kaum durchführbar.
Hier kann dies erreicht werden durch eine Kombination von Methoden
des Point Spread Function [PSF] Engineering " mit Spectral Precision Distance Microscopy " [SPDM].
Die
für die
optische Auflösung
eines Fluoreszenzmikroskopsystems entscheidende Größe ist die Punktabbildungsfunktion
oder Point Spread Function [PSF]. Diese kann definiert werden durch
die normierte räumliche
Verteilung der Fluoreszenzintensität des Beugungsbildes eines
punktförmigen
Objekts. In jüngster
Zeit wurden verschiedene Verfahren entwickelt, die Gestalt der PSF
so zu verändern,
dass eine gegenüber
den konventionellen Lichtmikros kopieverfahren wesentlich erhöhte Auflösung von Strukturparametern
der zu analysierenden Objekte möglich
wird. Beispielsweise erlauben es neue fernfeldlichtmikroskopische
Verfahren des Point-Spread-Function-Engineering mit Stimulation Emission
Depletion [STED]-4Pi-Mikroskopie derzeit experimentell, die optische
Auflösung
(gemäß ihrer üblichen
Definition als kleinste meßbare
Distanz zwischen zwei punktförmigen
fluoreszenzmarkierten Objekten derselben spektralen Signatur) in
einer bestimmten Raumrichtung (derjenigen der optischen Achse des
Systems) auf etwa 30 Nanometer (d.h. um etwa ein Zehnfaches des
konventionellen Wertes, entsprechend etwa 1/20 der Anregungswellenlänge) zu
verbessern. Andere Verfahren des PSF-Engineering haben es ebenfalls
möglich
gemacht, durch geeignete Strukturierte Beleuchtung die optische
Auflösung
wesentlich zu verbessern (auf etwa 50 – 100 nm, entsprechend 1/5
bis 1/10 der Anregungswellenlänge).
Mithilfe eines speziellen Verfahrens der strukturierten Beleuchtung,
der Spatially Modulated Illumination [SMI] Mikroskopie gelang es,
bei einzelnen optisch isolierten fluoreszierenden Objekten eine
Größenauflösung (Durchmesser)
von etwa 25 nm zu erzielen, entsprechend etwa 1/20 der Anregungswellenlänge; sowie
eine Distanzauflösung
(in Richtung der Optischen Achse des Systems) von wenigen Nanometer
und einer Präzision
von 1.0 nm, entsprechend ca. 1/500 der Anregungswellenlänge).
Die
oben skizzierten fernfeldlichtoptischen PSF-Engineering Verfahren
haben bei fluoreszenzmarkierten Objekten optische Auflösungen und
Größenauflösungen realisiert,
die weit jenseits dessen liegen, was vor kurzem noch licht-physikalisch
möglich
schien. Sie sind bereits ausreichend, um Kolokalisationsvolumina
von BMM wesentlich besser zu bestimmen, als dies mit konventionellen
lichtoptischen Verfahren wie z.B. konfokaler Laserfluoreszenzmikroskopie
oder Epifluoreszenzmikroskopie möglich war.
Unter Kolokalisationsvolumen wird hier ein sphärisches oder ellipsoidförmiges Volumen
verstanden, das alle linearen Biopolymere eines Komplexes oder einer
BMM enthält.
Beträgt
beispielsweise das aufgrund von kristallographischen Untersuchungen gewonnene
wahre (sphärische)
Kolokalisationsvolumen 2 × 10–22 m3 (angenommener Durchmesser 50 nm), so wird
mit konventioneller Fluoreszenzmikroskopie statt dessen aufgrund
der begrenzten lichtoptischen Auflösung ein scheinbares (ellipsoidförmiges) Kolokalisationsvolumen
im Bereich von 10–20 m3 bestimmt.
Mithilfe der genannten PSF-Engineering Verfahren kann das korrekte
Kolokalisationsvolumen bestimmt werden. Da die hier zu analysierenden
Strukturen von Biomolekularen Maschinen jedoch typischerweise eine
Größe im Bereich
von wenigen zehn Nanometer bis wenige hundert Nanometer haben, sind
selbst derartige Auflösungen
für die
hier angestrebte topologische Analyse noch nicht ausreichend. Das
gleiche gilt von den Verfahren der Near Field Optical Scanning Microscopy,
die gegenwärtig eine
optimale optische (laterale) Auflösung im Bereich von ca. 15
nm erreicht.
In
Ergänzung
der o.g. Verfahren wurden in jüngster
Zeit Methoden der digitalen Fluoreszenzmikroskopie entwickelt (Spektrale
Präzisionsdistanzmikroskopie,
SPDM), die in Verbindung mit neuen Verfahren der spektral unterschiedlichen
Fluoreszenzmarkierung individueller biologischer Makromoleküle erstmals
die Ermittlung von relativen räumlichen
Positionen in situ weit jenseits der jeweiligen optischen Auflösung des
verwendeten Mikroskopiesystems erlauben.
Physikalisch
beruht dieses Verfahren auf der in der Astronomie seit langem bekannten
und angewandten Positionsanalyse spektral diskriminierter punktförmiger Einzelobjekte.
Bei der Untersuchung von fluoreszenzmarkierten Genom-Nanostrukturen in
situ wurde so unter Verwendung der konfokalen Laser-Rastermikroskopie
eine experimentelle 3D-Distanzauflösung von
ca. 50 Nanometer bestimmt: d.h. in einzelnen, dreidimensional konservierten
Zellkernen konnten noch individuelle 3D-Distanzen von 50 Nanometern
zwischen Objekten verschiedener spektraler Signatur detektiert werden
(i.e. ca. zehnmal kleiner als die axiale optische Auflösung).
Bei
hoher Photonenzahl wurden experimentell konfokale Positionierungsgenauigkeiten
um 0,2 Nanometer erreicht. Sofern die Fehler der chromatischen Aberration
eliminiert werden können,
entspricht dieser Wert in etwa auch der erreichbaren Präzision von
Distanzmessungen. Unterscheiden sich die verwendeten Fluorochrome
in ihren Anregungs/Emissionswellenlängen, so können die Fehler der Kalibrierung
der chromatischen Aberration den Positionierungsfehler jedoch wesentlich übersteigen. Eine
Lösung
dieses Problems bei der Analyse der Topologie molekularer Strukturen
in Rasteranordnungen wurde in
DE
100 52 823 (C. Crerner & M.
Grunze, Prodatum 24.10.2000, Universität Heidelberg) beschrieben.
Durch
Realisierung spektraler Signaturunterschiede durch verschiedene
Fluoreszenzlebensdauern (aber bei derselben Anregungs- und Emissionswellenlänge) kann
die chromatische Aberration eliminiert werden: Vor kurzem wurden
so Messungen bei Fluoreszenzlebensdauermarkierung von DNA-Sequenzen
mit nur etwa 35 Fluorochrommolekülen
unter Verwendung konfokaler Mikroskopie und spezieller Bildanalysealgorithmen
durchgeführt;
dabei wurde eine laterale Positionierungsgenauigkeit von ca. 0,2
Nanometer erhalten, entsprechend einem tausendstel der optischen
Auflösung
des Systems. Für die
Limitierung der Positionierungsgenauigkeit durch das Photonenrauschen
bei einem einzelnen Fluorochrommolekül konnte hieraus unter den
genannten Bedingungen ein Wert von 1.2 Nanometer abgeschätzt werden.
Experimentell wurden kürzlich
bei einzelnen fluoreszenzmarkierten Oligonukleotiden und fernfeldlichtmikroskopischer
konfokaler SPDM (laterale) Distanzauflösungen im Bereich von 15 nm realisiert.
Die
in oben beschriebenen lichtnanoskopischen Verfahren des PSF-Engineering
und der Spektralen Präzisionsdistanzmikroskopie
werden kombiniert und bei der Analyse der Topologie von fluoreszenzmarkierten
Untereinheiten (hier insbesondere Aptamermarkierte Proteine) in
rekonstituierten Biomolekularen Maschinen auf nanostrukturierten
Arrays eingesetzt.
Bei
Verwendung der oben genannten SPDM-Verfahren in Verbindung mit einem
Point Spread Function Engineering verbesserten Mikroskopsystem [PSF-SPDM]
von z.B. 100 Nanometer optischer Auflösung oder 20 nm Größen-Auflösung ergibt
sich als Limitierung der Positionierungsgenauigkeit eines einzelnen
Fluorochrommoleküls
unter Zugrundlegung derzeit realisierbarer Photonendetektionsraten
ein Wert im Subnanometerbereich; bei geeigneter Verbesserung der
Kalibrierungsverfahren, auch unter Verwendung von nanolithographisch
hergestellten Standards, und optimalen optischen Bedingungen sind
Distanzmessungen im Bereich von wenigen Nanometer mit der geforderten
Präzision physikalisch-technisch
möglich.
Mithilfe
der o.g. SPDM-Techniken können auch
Kolokalisationsmessungen wesentlich verbessert werden. Bei Verwendung
eines PSF-SPDM-Verfahrens mit einer Distanz- oder Größenauflösung im Bereich von wenigen
zehn Nanometer kann bei Kolokalisation eine Zugehörigkeit
von markierten Untereinheiten zu derselben Suprastruktur mit hoher
Sicherheit angenommen werden.
Die
beschriebenen neuen Lichtmikroskopieverfahren eröffnen, insbesondere in ihrer
gegenseitigen Verbindung [PSF-SPDM], erstmals methodische Wege,
um bei der fernfeldlichtoptischen Analyse von SMMs die zwischen
den Fluoreszenzenergietransfermessungen (Distanzmessungen von wenigen
Nanometer) und den konventionellen fernfeldmikroskopischen Verfahren
(Epifluoreszenzmikroskopie; konfokale Laser Scanning Mikroskopie;
optimale optische 3D-Auflösung
einige hundert Nanometer) bestehende Lücke zu schließen. Es
sei darauf hingewiesen, dass die o.g. SPDM Verfahren auch bei Nahfeldlichtmikroskopiemethoden
angewandt werden können.
Des weiteren ist es seit kurzem möglich, Nahfeldlichtmikroskopie,
Atomare Kraftmikroskopie und Fernfeldlichtmikroskopie in demselben
Aufbau miteinander zu kombinieren (A. Lewis, Nanonics/Jerusalem).
Dabei kann die Nahfeldlichtmikroskopie dazu eingesetzt werden, als
optische Pinzette die bei Lebendbeobachtungen typischerweise auftretenden erheblichen
thermisch bedingten Bewegungen von intrazellulären BioMolekularen Maschinen
zu eliminieren und so die höchstauflösende topologische Lichtnanoskopie
ganz wesentlich zu vereinfachen. Durch solche multifunktionalen
Abbildungsverfahren ergeben sich daher erhebliche weitere Verbesserungsmöglichkeiten
der togologischen Analyse.
Mathematische
Modellierungsmethoden von linearen Biopolymeren, unterstützt durch
computergrafische Visualisierung, haben inzwischen einen hohen Grad
an berechenbarer Komplexität
erreicht. Diesen Simulationen liegen biochemische oder physikalische
Gesetzmäßigkeiten
zu Grunde. Die Modellierung von Dynamik, Funktion und Biomechanik
in molekularbiologischen Anwendungen umfaßt bisher u.a.: Protein-Membran-Komplexe,
die Regulation und Packung von Proteinen, DNA-Bindungsdomänen, sowie
verschiedene Strukturproteine. Durch die mathematische Komplexität ist jedoch
eine Beschränkung
auf das Verhalten innerhalb enger Grenzen der strukturellen Hierarchie
notwendig.
Verfahren
des Biocomputing haben es in den letzten Jahren möglich gemacht,
auf der Grundlage von atomaren Strukturdaten von einzelnen isolierten linearen
Biopolymeren (Untereinheiten ) auch sterisch mögliche Strukturen von Komplexen
aus solchen Untereinheiten mit hoher effektiver räumlicher Auflösung zu
berechnen. Es ergeben sich jedoch oftmals mehrere solcher Strukturmöglichkeiten,
so dass die Lösungen
nicht eindeutig sind.
Einfache
geometrische Betrachtungen (Puzzle-Theorem) zeigen, dass Messungen
von wenigen Positionen/Distanzen zwischen identifizierten, im atomarem
Detail bekannten Partnern des Makromolekülkomplexes die Anzahl der mit
hoher (in günstigen
Fällen
sogar atomarer) Auflösung
berechneten möglichen
3D-Strukturen eines von diesen Partnern gebildeten Komplexes ganz
erheblich einschränken können.
In
günstigen
Fällen
ist es somit möglich, durch
solche gröberen
Positions/Distanzmessungen (z.B. mit einem Fehler im Bereich von
0.5 – 1.0
nm) ein bestimmtes hochaufgelöstes
Modell einer gesamten supramolekularen Biostruktur als das einzige mit
allen experimentellen Strukturdaten Kompatible zu identifizieren.
Nach denselben Prinzipien ist es möglich, bei Vorliegen von multiplen
Positions/Distanzmessungen als Funktion der Zeit (4D-Topohogie) detaillierte,
experimentell testbare Strukturberechnungen von Komplexen zu den
gemessenen Zeitpunkten durchzuführen. Über die
Bestimmung der Topologie der fluoreszenzmarkierten Untereinheiten mithilfe
der oben skizzierten PSF-SPDM -Methoden hinaus ist es von größter Bedeutung,
die Lage der Fluoreszenzmarkierungsorte in den Untereinheiten (z.B.
der fluoreszenzmarkierten Aptamere) so genau als möglich zu
können.
HMR-Messungen an solchen Untereinheiten bei atomerer Auflösung sind
daher essentiell, um die mithilfe von SPDM-PSF-Methoden realisierbaren
topologischen Karten der Lage und der gegenseitigen Abstände von
Untereinheiten in Biomolekularen Maschinen soweit zu verfeinern,
daß Voraussagen
der atomaren Struktur großer
Gesamtkomplexe möglich
werden.
Die
Biocomputing Methoden gehen dabei von der mithilfe von Magnetresonanzverfahren
oder anderen Verfahren ermittelten Struktur der einzelnen linearen
Bio-Polymere als Partner im Komplex aus; unter geeigneten Voraussetzungen
entspricht diese dem Stand der Technik zufolge weitgehend der nativen
Struktur unter physiologischen Bedingungen. Damit ist es eine wesentliche
Voraussetzung der Anwendung der genannten Biocomputing Methoden, daß die Faltungsstruktur
auch auf den Microarrays diesen nativen Strukturen weitgehend entspricht.
Es wurde bereits darauf hingewiesen, daß eine physiologische Umgebung
hierzu nicht ausreichend ist, wenn nicht auch die Anordnung der
linearen Bio-Polymere auf den Microarrays ebenfalls so optimiert
ist, daß die
native Faltungsstruktur erhalten bleibt.
Erfindungsgemäß optimierte
Anordnungen linearer Bio-Polymere
auf Microarrays bieten vielfache Möglichkeiten des lichtnanoskopischen
High Through Put Screening von BMM-Pharma/Toxin-Wechselwirkungen,
allgemein von linearen Biopolymeren oder Komplexen. Zum Beispiel
kann das Kolokalisationsvolumen und die BMM-Topologie als Konsequenz
einer bestimmten Testsubstanz untersucht werden. Ist die Substanz
selbst markiert und ihre atomare Struktur bekannt, so kann auch
der Ort der Bindung in der BMM mit einem Fehler im 1 nm Bereich (unter
besonders günstigen
Umständen
auch darunter) bestimmt werden. Da die Analyse auf der Ebene der
einzelnen BMMs erfolgt, werden im Unterschied zu biochemischen Verfahren
nur kleinste Substanzmengen im Milli-Attomol-Bereich (10–21 Mol)
benötigt. Ein
weiterer Vorteil des Verfahrens besteht in der Erfassung von Heterogenitäten in der
BMM-Pharmawechselwirkung auf der Ebene einzelner BMMs. Bei addressierbaren
BMM-Arrays können
einzelne BMMs aufgrund der lichtoptischen Nanoskopiebefunde ausgewählt und
z.B. mit Rasterkraftmikroskopie oder lichtoptischer Nahfeldmikroskopie
nachuntersucht werden.
Nimmt
man beispielsweise eine zu untersuchende Anzahl von 1000 BMMs pro
Testsubstanz an, bei einem Abstand von 1 μm im BMM-Array, so sind auf
1 cm2 Array-Oberfläche etwa 105 verschiedene Testsubstanzen
lokal testbar. Da 1000 BMMs unter den gemachten Annahmen eine Fläche von
rund (32 μm)2 einnehmen, kann die lokale Zuführung durch geeignete
Mikrostrukturierung nach dem Stand der Technik erfolgen.