DE10041539A1 - Neue Amiditderivate zur Synthese von Polymeren auf Oberflächen - Google Patents
Neue Amiditderivate zur Synthese von Polymeren auf OberflächenInfo
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Abstract
Die Erfindung betrifft neue Amiditderivate und deren Verwendung als Linkerbausteine zur Synthese von Polymeren, insbesondere Biopolymeren wie Nukleinsäuren, Peptiden und Sacchariden, auf der Oberfläche von festen Trägern. Die Verwendung der erfindungsgemäßen Linkerderivate erlaubt eine zerstörungsfreie Regeneration der Oberflächen.
Description
Die Erfindung betrifft neue Amiditderivate und deren Verwendung als
Linkerbausteine zur Synthese von Polymeren, insbesondere Biopolymeren
wie Nukleinsäuren, Peptiden und Sacchariden, auf der Oberfläche von
festen Trägern. Die Verwendung der erfindungsgemäßen Linkerderivate
erlaubt eine zerstörungsfreie Regeneration der Oberflächen.
Seit Einführung der Synthese von Biopolymeren an festen Oberflächen
durch Merryfield im Jahr 1965 ist eine Vielzahl an Publikationen über diese
Technik erschienen. Eine neuere Entwicklung auf diesem Gebiet ist die
Herstellung von so genannten Biopolymer-Arrays, bei denen eine Vielzahl
unterschiedlicher Biopolymere wie etwa Nukleinsäuren oder Peptide in
definierten Flächenbereichen auf einem Träger immobilisiert sind.
Bei der Synthese von Biopolymeren an einer Festphase wird im Allgemeinen
ein Abstandhalter, ein so genannter Spacer zwischen dem Träger und dem
eigentlichen Biopolymer verwendet. Die Verwendung eines Spacers hat den
Vorteil, dass das Biopolymer weiter von der Oberfläche des festen Trägers
entfernt ist, so dass dessen Einflüsse zurückgedrängt werden, so dass das
immobilisierte Biopolymer quasi homogene Reaktionen eingehen kann. Die
Natur des Spacers, seine Länge, Polarität und seine anderen
physikochemischen Eigenschaften, haben demzufolge einen entscheidenden
Einfluss auf die Kopplungsausbeute bei der Polymersysthese auf dem
Träger, damit auf die Qualität des Polymers und auf dessen spätere
Anwendung.
Für den Spaceraufbau werden im Allgemeinen Strategien verwendet, die auf
der Polykondensation von im weitesten Sinne Aminosäuremonomeren oder
Cyanoethyl- oder anderweitig geschützten Phosphoramiditen bzw. H-
Phosphonaten beruhen. Dabei werden üblicherweise Verbindungen mit der
folgenden allgemeinen Struktur verwendet:
worin R' eine geschützte Linkergruppe darstellt, R den Vorgänger-
Synthesebaustein oder die funktionelle Gruppe einer festen Phase darstellt
und Q H oder eine organische Schutzgruppe wie Cyanoethoxy oder
Methoxy darstellt, die bei der Verankerung auf der Oberfläche keine Rolle
spielt.
Ein wesentlicher Nachteil der bisher bekannten Spacermoleküle sind die
negativen Ladungen, die im Rahmen der Abspaltung der Schutzgruppen an
den Phosphatgruppen auftreten. Diese zusätzlichen potentiellen
Kopplungszentren verhindern ein mögliches Recycling durch geeignete
chemische oder enzymatische Vorgehensweisen der Spacer.
Die der Erfindung zu Grunde liegende Aufgabe bestand somit darin, neue
Spacerbausteine für die Synthese von Polymeren auf festen Trägern
bereitzustellen. Gelöst wird diese Aufgabe durch eine Verbindung der
allgemeinen Formel (I)
worin R1 und R2 jeweils unabhängig einen C1-C10-Kohlenwasserstoffrest,
z. B. einen C1-C6-Alkylrest der C3-C4-Cycloalkylrest, darstellen oder
miteinander verbunden sind, z. B. um einen 5- oder 6gliedrigen Ring zu
ergeben und
R3 und R4 jeweils unabhängig eine geschützte Linkergruppe der allgemeinen Formel (II) sind:
R3 und R4 jeweils unabhängig eine geschützte Linkergruppe der allgemeinen Formel (II) sind:
-L-(X)n
worin L einen Linker, X eine Schutzgruppe und n eine ganze Zahl von 1-3
darstellt.
In den Verbindungen (I) sind R1 und R2 vorzugsweise jeweils Methyl-, Ethyl-
oder i-Propylreste oder sie bilden zusammen einen Morpholinrest. Es können
jedoch selbstverständlich auch andere Alkyl- oder Cycloalkylreste verwendet
werden.
Die Linkergruppe (II) enthält im Allgemeinen lineare oder verzweigte
aliphatische, olefinische oder/und aromatische Kohlenwasserstoffgruppen,
die ggf. durch Heteroatome substituiert sind. Sie enthält vorzugsweise eine
Alkylenkette, in der ggf. ein oder mehrere CH2-Gruppen durch Heteroatome
wie O, S oder NH ersetzt sein können. Die Kettenlänge des Linkers beträgt
vorzugsweise 1-100 Atome, vorzugsweise 10-45 Atome und besonders
bevorzugt 10-25 Atome. Die Kette kann weiterhin eine oder mehrere
Verzweigungen enthalten, wobei eine Linkergruppe vorzugsweise bis zu drei
Verzweigungen enthalten kann. Die Verzweigungen können in die
Linkergruppe beispielsweise durch ω-Bis- oder Trishydroxyverbindungen
wie etwa Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan eingeführt werden. In einer
besonders bevorzugten Ausführungsform enthält die Linkergruppe (II) eine
Struktur, ausgewählt aus (a) (CH2)n-X, worin n = 1-12, vorzugsweise 3-6,
oder (b) [(CH2)rO]s-X worin r = 1-4, vorzugsweise 2-3 und s = 1-100,
vorzugsweise 3-9 beträgt.
Am Ende bzw. an den Enden der Linkergruppe befinden sich eine oder
mehrere Schutzgruppen X, die aus für die Festphasensynthese von
Nukleinsäuren bzw. Peptiden bekannten Schutzgruppen ausgewählt werden
können. Vorzugsweise ist X eine Schutzgruppe, die durch chemische oder
enzymatische Reaktionen vom Linker abgespalten werden kann, wobei
durch die Abspaltung eine reaktive Gruppe z. B. eine Hydroxyl- oder
Aminogruppe freigesetzt wird. Beispiele für geeignete Schutzgruppen sind
säurelabile Schutzgruppen wie etwa Dimethoxytrityl (DMT), MMT, Pixyl,
Fpmp, basenlabile Schutzgruppen, wie etwa Benzyl, Benzoyl, Isobutyryl,
Phenoxyacetyl, Laevulinyl etc., oxidations- oder/und reduktionslabile
Schutzgruppen, photolabile Schutzgruppen, wie etwa NVOC, NPPOC,
katalytisch, z. B. durch Pd abspaltbare Schutzgruppen, wie etwa Allyl, AOC
und durch Fluorid abspaltbare Schutzgruppen, wie etwa TMS und Derivate
davon, z. B. TBDMS.
Die erfindungsgemäßen Verbindungen sind hervorragend als Spacer oder
Spacerbausteine zur Synthese von Polymeren auf festen Trägern geeignet.
Für die Synthese eines Polymermoleküls können ein oder mehrere Moleküle
der Verbindungen (I) eingesetzt werden. Dabei werden die Verbindungen (I)
üblicherweise zuerst zum Aufbau des Spacers an den Träger gekoppelt und
anschließend unter Verwendung geeigneter Synthesebausteine das Polymer
auf dem Spacer synthetisiert. Als feste Phasen kommen anorganische oder
organische Träger in Betracht, z. B. funktionalisiertes Controlled-Pore-Glas
(CPG), andere Gläser wie Foturan, Pyrex oder gewöhnliche Kalk-Natron-
Gläser, metallische Träger wie etwa Silizium, oder organische Harze wie
etwa Tentagel. Besonders bevorzugt ist der Träger ein Chip, der zur
Synthese von Polymer-Arrays eingesetzt wird.
Ein Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist somit auch ein Träger zur
Festphasensynthese der allgemeinen Formel (Ia)
worin T ein fester Träger wie zuvor angegeben ist und R3 und R4 wie zuvor
definiert sind. Der Träger (Ia) wird durch Kopplung einer Verbindung (I) an
eine reaktive Gruppe des Trägers, z. B. eine Hydroxygruppe, unter
Abspaltung der -NR1NR2-Gruppe hergestellt. Ggf. kann eine Oxidation des
Trägers (Ia) z. B. mit molekularem I2 erfolgen, wobei das P-Atom von der
Oxidationsstufe III in die Oxidationsstufe V überführt wird.
An den Linkern R3 und R4 kann mindestens eine der Schutzgruppen X
abgespalten werden. Auf die nach Abspaltung der Schutzgruppen X
freigesetzten reaktiven Gruppen können ein oder mehrere Polymere
synthetisiert werden, wobei diese Polymere aus z. B. Nukleinsäuren wie DNA
oder RNA, Nukleinsäurenanaloga wie etwa PNA oder LNA, Peptiden und
Sacchariden ausgewählt sein können.
Die erfindungsgemäßen Verbindungen (I) zeichnen sich dadurch aus, dass
sie keine P(V)-Schutzgruppe benötigen und nach Deblockierung und ggf.
Oxidation zum Phosphat keine negative Ladung tragen. Auf diese Weise
können die erfindungsgemäßen Verbindungen im Zusammenspiel mit
anderen Synthesebausteinen, z. B. trifunktionellen Zucker- oder
Nukleotideinheiten, die mit orthogonalen Schutzgruppen versehen sind, zum
Aufbau von Polymeren und zum zerstörungsfreien Recycling der
Oberflächen eingesetzt werden, ohne dass bei nachfolgenden Synthesen
störende Ladungen auftreten.
Dabei wird zunächst die erfindungsgemäße Verbindung (I) an eine reaktive
Gruppe, z. B. eine Hydroxygruppe des festen Trägers gekoppelt.
Anschließend wird die Schutzgruppe X gespalten, wobei die Schutzgruppe
X zu einer Schutzgruppe Y auf dem Polymersynthesebaustein orthogonal
ist. Nach Beendigung der Polymersynthese und ggf. Deblockierung der
resultierenden Polymeren wird die zu den bisher verwendeten
Synthesebedingungen orthogonale Schutzgruppe Y abgespalten. Ein Beispiel
für einen derartigen Synthesebaustein mit der allgemeinen Formel (III) ist
wie folgt:
worin X und Y zueinander orthogonale Schutzgruppen sind, wobei X z. B.
eine säure- oder/und photolabile Schutzgruppe ist und Y eine durch Katalyse
abspaltbare Schutzgruppe ist und R eine Nukleobase oder einen Fluorophor,
einen Chromophor oder eine andere Markierungsgruppe darstellt. Nach
Abspaltung von Y im basischen Milieu wird dann das 3'-Phosphat von der
2'-Hydroxygruppe unter Ausbildung eines zyklischen Phosphats angegriffen,
was einer Hydrolyse gleichkommt und zur Wiederherstellung der
ursprünglichen Hydroxygruppe führt.
Bei Verwendung eines RNA-Teilabschnitts als Sonden-"Sockel" kann eine
chemische Regeneration des Reaktionsträgers erfolgen. Dabei wird zunächst
die Synthese unter Verwendung von 2'-OH-geschützten
Phosphitamidbausteinen durchgeführt. Nach Hybridisierung wird die
Schutzgruppe des RNA-Teilabschnitts abgespalten, woraus eine freie 2'-OH-
Gruppe resultiert. Daraufhin kann in einem folgenden chemischen
Reaktionsschritt mit Hilfe von Perjodat oder anderen Oxidationsmitteln der
Ribosezucker gespalten und die Sonde durch β-Eliminierung vom
Reaktionsträger entfernt werden.
Die erfindungsgemäße Verbindung Ia lässt sich auch durch geeignete
biochemische Ansätze ohne das Einkoppeln eines speziellen Moleküls zum
zerstörungsfreien Recycling der Oberflächen einsetzen. Hierbei werden die
mit dem Reaktionsträger verknüpften Polymer- bzw. Oligomersonden mit
einem DNA- bzw. RNA-abbauenden Enzym oder einem Peptid-spaltenden
Enzym gespalten, wodurch es zu einem teilweisen oder vollständigen Abbau
der Sonden kommt. Im Anschluß kann der Reaktionsträger erneut zur
Synthese neuer Sonden verwendet werden.
Als Enzyme kommen Nucleasen wie Exonucleasen oder Endonucleasen in
Frage, die einen Nucleinsäurestrang von den Enden bzw. innerhalb des
Sondenstrangs angreifen und Nucleotide bzw. Nucleoside als Spaltprodukte
hinterlassen. Im Falle von RNA ist die Verwendung von RNAsen (wie RNAse
H usw.) möglich, die bei Ausbildung eines RNA-DNA-Doppelstrangs selektiv
den RNA-Teil zerschneiden, wodurch bei RNA-Sonden die gesamte Sonde
und bei RNA-Teilabschnitten als Sollbruchstelle der RNA-Abschnitt
gespalten wird. Die Regeneration eines Reaktionsträgers mit DNA-Sonden
kann ebenfalls durch Einsatz von DNAsen (DNAse I, DNAse II, etc.) erreicht
werden, wodurch sowohl einzelsträngige als auch doppelsträngige DNA
abgebaut werden kann.
Ebenfalls können Peptid-spaltende Enzyme für den Abbau von Peptidsonden
bzw. Peptid-Sequenzabschnitten als Sollbruchstelle eingesetzt werden.
Ein weiterer Vorteil der erfindungsgemäßen Verbindungen besteht darin,
dass auf Grund der Verzweigung eine Signalamplifikation erfolgt, da die
Dotierungsdichte der funktionellen Gruppen auf der Oberfläche erhöht wird.
Weiterhin zeichnen sich die erfindungsgemäßen Verbindungen dadurch aus,
dass sie eine kostengünstigere Polymersynthese ermöglichen und sich ohne
weiteres in die DNA-Festphasensynthese integrieren lassen bei gleichzeitiger
Verringerung der benötigten Amiditports gegenüber der Verwendung
kommerziell erhältlicher Amidite.
Die Herstellung der erfindungsgemäßen Verbindungen erfolgt durch
Umsetzung der monogeschützten Spacergrundmoleküle mit
Phosphortrichlorid zum bisubstituierten Monochlorderivat. Anschließend
wird dann das sekundäre Amin in das Molekül eingeführt.
Weiterhin soll die Erfindung durch das nachfolgende Beispiel erläutert
werden.
1,37 g (10 mmol) PCl3 und 5 Äquivalente N-Ethyldiisopropylamin oder
Pyridin werden unter Schutzgas in absolutem Ether aufgenommen. Zu dieser
gekühlten Lösung wird monotrityliertes Triethylenglykol, gelöst in Ether und
N-Ethyldiisopropylamin, langsam zugetropft. Nach zweistündigem Rühren
bei Raumtemperatur werden 3 Äquivalente Diisopropylamin, gelöst in Ether,
langsam zu dem Reaktionsansatz getropft. Anschließend lässt man den
Ansatz weitere 12 h bei Raumtemperatur rühren. Nach dem Einengen wird
der Ansatz in Methylenchlorid aufgenommen und mehrfach mit den üblichen
Lösungen extrahiert, bevor die Substanz dann durch Chromatographie an
Kieselgel isoliert wird.
Das Syntheseschema ist wie folgt:
Claims (19)
1. Verbindung der allgemeinen Formel (I)
worin R1 und R2 jeweils unabhängig einen C1-C10- Kohlenwasserstoffrest darstellen oder miteinander verbunden sind, um einen 5- oder 6-gliedrigen Ring zu ergeben und
R3 und R4 jeweils unabhängig eine geschützte Linkergruppe der allgemeinen Formel (II) sind:
-L-(X)n (II)
worin L einen Linker, X eine Schutzgruppe und n eine ganze Zahl von 1-3 darstellt.
worin R1 und R2 jeweils unabhängig einen C1-C10- Kohlenwasserstoffrest darstellen oder miteinander verbunden sind, um einen 5- oder 6-gliedrigen Ring zu ergeben und
R3 und R4 jeweils unabhängig eine geschützte Linkergruppe der allgemeinen Formel (II) sind:
-L-(X)n (II)
worin L einen Linker, X eine Schutzgruppe und n eine ganze Zahl von 1-3 darstellt.
2. Verbindung nach Anspruch 1,
dadurch gekennzeichnet,
dass R1 und R2 jeweils unabhängig einen C1-C6-Alkylrest oder einen
C3-C4-Cycloalkylrest darstellen.
3. Verbindung nach Anspruch 1 oder 2,
dadurch gekennzeichnet,
dass R1 und R2 jeweils Methyl, Ethyl oder i-Propyl sind oder
zusammen einen Morpholinrest bilden.
4. Verbindung nach einem der Ansprüche 1-3,
dadurch gekennzeichnet,
dass die Linkergruppe (II) lineare oder verzweigte aliphatische,
olefinische oder/und aromatische Kohlenwasserstoffgruppen enthält,
die ggf. teilweise durch Heteroatome substituiert sind.
5. Verbindung nach einem der Ansprüche 1-4,
dadurch gekennzeichnet,
dass die Linkergruppe (II)
- a) eine Struktur -(CH2)m-X
worin m = 1-12 oder - b) eine Struktur -[(CH2)rO]s-X
worin r = 1-4 und
s = 1-100
6. Verbindung nach einem der Ansprüche 1-5,
dadurch gekennzeichnet,
dass X eine Schutzgruppe ausgewählt aus durch chemische oder
enzymatische Reaktionen abspaltbaren Schutzgruppen ist.
7. Verbindung nach Anspruch 6,
dadurch gekennzeichnet,
dass X eine säurelabile Schutzgruppe ist.
8. Verbindung nach Anspruch 6,
dadurch gekennzeichnet,
dass X eine basenlabile Schutzgruppe ist.
9. Verbindung nach Anspruch 6,
dadurch gekennzeichnet,
dass X eine oxidations- oder/und reduktionslabile Schutzgruppe ist.
10. Verbindung nach Anspruch 6,
dadurch gekennzeichnet,
dass X eine photolabile Schutzgruppe ist.
11. Verbindung nach Anspruch 6,
dadurch gekennzeichnet,
dass X eine katalytisch abspaltbare Schutzgruppe ist.
12. Verbindung nach Anspruch 6,
dadurch gekennzeichnet,
dass X eine durch Fluorid abspaltbare Schutzgruppe ist.
13. Träger zur Festphasensynthese der allgemeinen Formel (Ia)
worin T ein fester Träger ist und R3 und R4 wie in einem der Ansprüche 1 und 4 bis 12 definiert sind.
worin T ein fester Träger ist und R3 und R4 wie in einem der Ansprüche 1 und 4 bis 12 definiert sind.
14. Träger nach Anspruch 13,
dadurch gekennzeichnet,
dass mindestens eine Schutzgruppe X in den Linkergruppen R3 und
R4 abgespalten ist.
15. Träger nach Anspruch 14,
dadurch gekennzeichnet,
dass an die nach Abspaltung der Schutzgruppen X freigesetzten
reaktiven Gruppen ein oder mehrere Polymere synthetisiert sind.
16. Träger nach Anspruch 15,
dadurch gekennzeichnet,
dass das Polymer ausgewählt ist aus Nukleinsäuren,
Nukleinsäureanaloga, Peptiden und Sacchariden.
17. Verfahren zur Synthese von Polymeren auf einem festen Träger,
dadurch gekennzeichnet,
dass man eine Verbindung der Formel (I) wie in den Ansprüchen 1-12
definiert kovalent an den festen Träger koppelt und dann auf der
Verbindung (I) aus Synthesebausteinen ein Polymer aufbaut.
18. Verfahren nach Anspruch 17,
dadurch gekennzeichnet,
dass die Verbindung (I) an eine Hydroxygruppe auf den festen Träger
gekoppelt wird.
19. Verfahren nach Anspruch 17 oder 18,
dadurch gekennzeichnet
dass die Polymere ausgewählt werden aus Nukleinsäuren,
Nukleinsäureanaloga, Peptiden und Sacchariden.
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