DE10033194C2 - Bio probes and their use - Google Patents

Bio probes and their use

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DE10033194C2 DE10033194A DE10033194A DE10033194C2 DE 10033194 C2 DE10033194 C2 DE 10033194C2 DE 10033194 A DE10033194 A DE 10033194A DE 10033194 A DE10033194 A DE 10033194A DE 10033194 C2 DE10033194 C2 DE 10033194C2
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Description

Die Erfindung betrifft Biosonden, die durch spezifische Bindung an biologisches Material dessen elektrische und/oder dielektrische Eigenschaften verändern und dadurch eine Detektion und/oder Reinigung des so modifizierten Materials mittels Elektrophorese und/oder Dielektrophorese ermöglichen.The invention relates to biosondes which are bound specifically to biological Material whose electrical and / or dielectric properties change and thereby detection and / or cleaning of the material so modified by means of Allow electrophoresis and / or dielectrophoresis.

In der Biotechnologie, Bioanalytik und Diagnostik stellt sich häufig die Aufgabe, eine oder mehrere biologische Spezies selektiv aus einer Vorlage von biologischem Material bzw. von einem Hintergrund, der aus sehr ähnlichen biologischen Spezies besteht, abzutrennen. Bei dem biologischen Material kann es sich hierbei etwa um Gewebe, Zellen, Viren, Zellorganellen, Proteine, Proteinkomplexe, Kohlenhydrate, Lipide oder andere organische Verbindungen oder eine Mischung der aufgeführten Gruppen handeln. Die unterschiedlichen Spezies stammen entsprechend aus mindestens einer dieser Gruppen. Die Unterschiede in den Eigenschaften der verschiedenen biologischen Spezies, auf denen das Trennungs- oder Detektionsprinzip beruht, können sehr gering sein, so daß eine Trennung und/oder Detektion oft sehr schwierig oder überhaupt nicht zu erreichen ist.In biotechnology, bioanalytics and diagnostics, the task often arises or several biological species selectively from a template of biological Material or background from very similar biological species exists to separate. The biological material can be about Tissues, cells, viruses, cell organelles, proteins, protein complexes, carbohydrates, Lipids or other organic compounds or a mixture of the listed Trade groups. The different species come from accordingly at least one of these groups. The differences in the properties of the different biological species on which the separation or Detection principle based, can be very small, so that a separation and / or Detection is often very difficult or impossible to achieve.

Es existieren eine Vielzahl von Lösungsstrategien zum Nachweis und zur Trennung von biologischem Material (Lottspeich and Zorbas (1998) Bioanalytik. Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg). Grundsätzlich kann man Methoden, die sich die Unterschiede in den Eigenschaften der aufzutrennenden Spezies zur Trennung und zum Nachweis nutzbar machen, von solchen unterscheiden, bei denen erst durch eine selektive Modifikation des vorgelegten biologischen Materials die Detektion und Trennung der Spezies erreicht werden kann.There are a variety of solution strategies for detection and separation of biological material (Lottsspeich and Zorbas (1998) Bioanalytik. Spektrum Academic publishing house, Heidelberg). Basically, you can use methods that are Differences in the properties of the species to be separated and make it usable for proof, distinguish it from those for which only through a selective modification of the presented biological material the detection and species separation can be achieved.

Die dem biologischen Material eigene Eigenschaften, die zur Detektion und/oder Trennung verschiedener Spezies verwendet werden, sind u. a. Polarität, Hydrophobizität, Ladung, Größe, Gewicht und Dichte. Beispiele für Verfahren, die sich diese Eigenschaften zunutze machen, sind z. B. Elektrophorese, Gelfiltration, Affinitätschromatographie und Zentrifugation.The properties inherent in the biological material, those for detection and / or Separation of different species are used. a. Polarity,  Hydrophobicity, charge, size, weight and density. Examples of procedures that take advantage of these properties are z. B. electrophoresis, gel filtration, Affinity chromatography and centrifugation.

Verfahren, bei denen das biologische Material selektiv auf spezifische Weise markiert wird und erst aufgrund der Markierung oder aufgrund der durch die Markierung veränderten Eigenschaften Trennung oder Nachweis der verschiedenen Spezies möglich werden, sind alle Verfahren, die auf einer Antikörper-Antigen- Wechselwirkung basieren. Beispiele hierfür sind ELISA-Verfahren (enzyme-linked immunosorbent assay) und bestimmte Varianten von FACS (fluorescence-activated cell sorting) und MACS (magnetic-activated cell sorting). In diesen Fällen wird unter Verwendung von spezifisch bindenden Antikörpern selektiv ein Enzym, ein Fluoreszenzfarbstoff oder ein Magnetkügelchen an bestimmte Spezies des biologischen Materials gebunden, um Detektion oder Reinigung der so markierten Spezies zu ermöglichen.Procedures in which the biological material is selective in a specific way is marked and only on the basis of the marking or on the basis of the Marking changed properties separation or evidence of different Species are possible, all methods based on an antibody-antigen Interaction. Examples of this are ELISA methods (enzyme-linked immunosorbent assay) and certain variants of FACS (fluorescence-activated cell sorting) and MACS (magnetic-activated cell sorting). In these cases, under Use of specific binding antibodies to selectively select an enzyme Fluorescent dye or a magnetic bead to certain species of biological material bound for detection or purification of the so labeled To enable species.

Als Beispiel für ein Verfahren, bei dem eine Auftrennung von biologischem Material nur sehr schlecht möglich ist, sei die free flow-Elektrophorese (FFE) genannt (Bauer, J. (1999) J. Chrom. B 722: 55). Bei diesem Verfahren wird ein laminarer Flüssigkeitsstrom zwischen zwei eng beieinander stehenden Glasplatten hindurchgeleitet. Durch ein senkrecht zur Fließrichtung angelegtes elektrisches Feld kann eine Auftrennung der verschiedenen Spezies des vorgelegten biologischen Materials aufgrund ihrer unterschiedlichen Ladung erreicht werden. Wird die FFE beispielsweise zur Auftrennung von Zellen eingesetzt, so werden diese aufgrund ihrer negativen Ladung von der Kathode elektrisch angezogen. Die laterale Wanderungsgeschwindigkeit der Zellen hängt hierbei von der Oberflächenladungsdichte der Zellen ab. Zellen mit unterschiedlichen Oberflächenladungsdichten haben unterschiedliche laterale Wanderungsgeschwindigkeiten und können so voneinander getrennt werden. Der entscheidende Nachteil der FFE ist, daß biologisches Material vielfach sehr ähnliche Ladungseigenschaften besitzt. Zellen etwa besitzen alle eine negative und zudem vielfach eine fast identische Oberflächenladungsdichte und können so nur sehr schlecht mittels FFE voneinander getrennt werden. Oft ist bei der FFE nur dann eine ausreichende Trennschärfe zu erreichen, wenn durch eine pathogene Veränderung die Oberflächenladungsdichte der Zellen hinreichend modifiziert ist. Aus diesem Grund ist der Einsatz der FFE heute sehr stark zurückgegangen und die Methode wurde durch andere, vielfach teurere und apparativ aufwendigere Methoden verdrängt.As an example of a method in which a separation of biological material free flow electrophoresis (FFE) is only very poorly possible (Bauer, J. (1999) J. Chrom. B 722: 55). In this process, a laminar Liquid flow between two closely spaced glass plates passed. By an electric field applied perpendicular to the direction of flow can be a separation of the different species of the presented biological Materials can be achieved due to their different charge. Will the FFE used for example for the separation of cells, so these are due its negative charge is electrically attracted to the cathode. The lateral The rate of migration of the cells depends on the Surface charge density of the cells. Cells with different Surface charge densities have different lateral ones Migration speeds and can thus be separated from one another. The crucial disadvantage of the FFE is that biological material is very often has similar charge properties. Cells, for example, all have a negative and also an almost identical surface charge density and can only do so very difficult to separate from each other using FFE. Often at the FFE only  then achieve sufficient selectivity if by a pathogenic Change in the surface charge density of the cells is sufficiently modified. For this reason, the use of the FFE has declined significantly today the method was replaced by other, often more expensive and more complex equipment Methods ousted.

Auch bei dem relativ neuen Verfahren der Dielektrophorese (Fiedler et al. (1998) Anal. Chem. 70: 1909; Betts et al. (1999) J. Appl. Microbiol. Symp. Suppl. 85: 201) hat man mit ähnlichen Problemen zu tun, wie sie sich bei elektrophoretischen Verfahren, wie der zuvor beschriebenen FFE ergeben. Die Dielektophorese (DEP) ist ein Verfahren, bei dem man sich die dielektrischen Eigenschaften von biologischem Material zunutze macht, um dieses voneinander zu trennen. Dielektrophorese findet statt, wenn man biologisches Material inhomogenen elektrischen Wechselfeldern aussetzt. Das biologische Material bewegt sich in dem inhomogenen elektrischen Feld aufgrund seiner dielektrischen Eigenschaften (permanenter oder induzierbarer elektrischer Dipol), wodurch eine Auftrennung möglich wird.Even with the relatively new method of dielectrophoresis (Fiedler et al. (1998) Anal. Chem. 70: 1909; Betts et al. (1999) J. Appl. Microbiol. Symp. Suppl. 85: 201) one has to deal with similar problems as with electrophoretic Procedures such as the FFE previously described. Dielectophoresis (DEP) is a process in which one looks at the dielectric properties of uses biological material to separate it. Dielectrophoresis takes place when biological material is inhomogeneous electrical alternating fields. The biological material moves in the inhomogeneous electric field due to its dielectric properties (permanent or inducible electrical dipole), causing a disconnection becomes possible.

In Zellen beispielsweise gibt es verschiedene Bereiche, die polarisierbar sind, und damit für die Dielektrophorese nutzbar gemacht werden können. Hierzu gehören die elektrische Ladungsdoppelschicht, die eine Zelle umgibt, die Zellmembranen, die die Zelle bzw. die Zellorganellen begrenzen, sowie das polare Cytoplasma im Zellinnern.In cells, for example, there are different areas that can be polarized and so that they can be used for dielectrophoresis. These include the electric charge bilayer that surrounds a cell, the cell membranes that limit the cell or cell organelles, as well as the polar cytoplasm in the Cell interior.

Die Dielektrophorese kann verwendet werden zur Auftrennung von Zellen, Bakterien und anderen Mikroorganismen. Denkbar ist der Einsatz der Dielektrophorese auch zur Auftrennung von anderem biologischen Material wie etwa Nukleinsäuren, Proteinen, Lipiden oder anderen organischen Verbindungen.Dielectrophoresis can be used to separate cells and bacteria and other microorganisms. The use of dielectrophoresis is also conceivable for the separation of other biological material such as nucleic acids, Proteins, lipids or other organic compounds.

Anwendungsmöglichkeiten der Dielektrophorese sind z. B. die Untersuchung von Trinkwasser, Lebensmitteln und biologischen Flüssigkeiten in Hinblick auf krankheitserregende Mikroorganismen oder die Anreicherung von Stammzellen aus dem Knochenmark oder periphären Blut.Applications of dielectrophoresis are e.g. B. the investigation of Drinking water, food and biological fluids with regard to disease-causing microorganisms or the accumulation of stem cells the bone marrow or peripheral blood.

Der Nachteil der Dielektrophorese ist, daß auch die dielektrischen Eigenschaften von biologischem Material oft sehr ähnlich sind, wodurch eine Auftrennung von unterschiedlichen Spezies erschwert wird.The disadvantage of dielectrophoresis is that the dielectric properties of biological material are often very similar, causing a separation of different species is difficult.

Die erfindungsgemäße Aufgabe besteht deshalb darin, die Trennschärfe von elektrophoretischen und/oder dielektrophoretischen Verfahren zu vergrößern und damit ein verbessertes Nachweis- und/oder Reinigungsverfahren zur Verfügung zu stellen.The object of the invention is therefore the selectivity of enlarge electrophoretic and / or dielectrophoretic processes and thus an improved detection and / or cleaning method is available put.

Gelöst wird die Aufgabe durch die spezifische Bindung von Biosonden an eine bestimmte Spezies oder an eine Gruppe bestimmter Spezies aus einer Vorlage von biologischem Material, das unterschiedliche Spezies enthält, wodurch selektiv und spezifisch die elektrischen und/oder dielektrischen Eigenschaften der so markierten Spezies verändert werden und dadurch die Reinigung und/oder Detektion der so markierten Spezies bzw. des durch Bindung der Biosonde entstandenen Komplexes aus Biosonde und biologischer Spezies möglich wird.The task is solved by the specific binding of bio-probes to one certain species or to a group of certain species from a template of biological material that contains different species, making it selective and specifically the electrical and / or dielectric properties of the so marked Species are changed and thereby the cleaning and / or detection of the so labeled species or the complex formed by binding the biosonde from biosonde and biological species.

Der wesentliche Vorteil der hier beschriebenen Erfindung gegenüber den üblichen Verfahren liegt in der Möglichkeit der einfachen und schnellen Trennung und/oder Detektion des durch Bindung der Biosonde an die biologische Spezies entstandenen Komplexes aus biologischer Spezies und Biosonde, was zum einen dazu verwendet werden kann, um den Nachweis oder die Reinigung der so selektiv markierten Spezies zu ermöglichen, umgekehrt aber auch dazu verwendet werden kann, eine oder mehrere Biosonden aus einer Vorlage von Biosonden mit unterschiedlichen Bindungsspezifitäten selektiv abzutrennen.The main advantage of the invention described here over the usual The method lies in the possibility of simple and quick separation and / or Detection of the by binding the biosonde to the biological species resulting complex of biological species and biosonde, on the one hand can be used to detect or purify the so selective to allow marked species, but vice versa can also be used can use one or more bio-probes from a template of bio-probes selectively separate different binding specificities.

Der entscheidende Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens gegenüber Verfahren wie FACS und MACS ist, daß die Biosonde nicht auf aufwendige Weise mit einem Fluoreszenzfarbstoff oder einem Magnetkügelchen modifiziert werden muß, um Detektion und/oder Reinigung des markierten biologischen Materials zu ermöglichen, und daß ebenfalls der apparative Aufwand, der bei Verfahren wie FACS oder MACS unumgänglich ist, wegfällt.The decisive advantage of the method according to the invention over A method like FACS and MACS is that the biosonde is not costly be modified with a fluorescent dye or a magnetic bead must in order to detect and / or purify the labeled biological material enable, and that also the equipment involved in processes such as FACS or MACS is unavoidable.

Die erfindungsgemäßen Biosonden bestehen aus einem Teil A, der die spezifische Wechselwirkung zwischen der Sonde und dem biologischen Material vermittelt, und einem Teil B, der die Eigenschaften des biologischen Materials in der gewünschten Art verändert, also in Hinblick auf die Elektrophorese die Ladung, in Hinblick auf die Dielektrophorese die Dielektrizitätskonstante oder die spezifische Leitfähigkeit bzw. die Polarisierbarkeit verändert. Die Teile A und B müssen nicht strukturell voneinander getrennt sein.The biosondes according to the invention consist of part A, which is the specific one Mediated interaction between the probe and the biological material, and a part B, which contains the properties of the biological material in the desired  Kind changes, so in terms of electrophoresis the charge, in terms of Dielectrophoresis the dielectric constant or the specific conductivity or the polarizability changed. Parts A and B do not have to be structural be separated from each other.

Teil A der Biosonde ist oder umfaßt z. B. ein spezifisch an biologisches Material bindendes Peptid. In diesem Fall kommt eine spezifische Wechselwirkung zwischen dem Peptid und einem Peptid-Rezeptor, der sich auf dem biologischen Material befindet, zustande. Ein Beispiel für eine derartige Wechselwirkung ist die des α- Faktor-Rezeptors Ste2p aus Saccharomyces cerevisiae mit dem dazugehörigen Peptid-Liganden α-Faktor. Weitere Beispiele sind der TSH-Rezeptor (Schuppert et al. (1996) Thyroid 6: 575), der FSH-Rezeptor (Tilly et al. (1992) Endocrinology 131: 799), der EGF-Rezeptor (Christensen et al. (1998) Dan. Med. Bull. 45: 121), der TNF-Rezeptor (Murphy et al. (1994) Thymus 23: 177), der Transferrin-Rezeptor (Ponka and Lok (1999) Int. J. Biochem. Cell Biol. 31: 1111), der Insulin-Rezeptor (Milazzo et al. (1992) Cancer Res. 52: 3924), der FGF-Rezeptor (Kiefer et al. (1991) Growth Factors 5: 115), der TGFβ-Rezeptor (Derynck et al. (1994) Princess Takamatsu Symp. 24: 264), der IGF-Rezeptor (Peyrat and Bonneterre (1992) Breast Cancer Res. Treat. 22: 59), der Angiotensin II-Rezeptor (Smith and Timmermans (1994) Curr. Opin. Nephrol. Hypertens. 3: 112) oder der Somatostatin-Rezeptor (Schonbrunn (1999) Ann. Oncol. 10 Suppl. 2: 17) und die Wechselwirkungen mit ihren jeweiligen Liganden. Analog sind alle Peptide einsetzbar, die in der Lage sind, spezifisch an das gewünschte biologische Material zu binden. Bei dem spezifisch bindenden Teil A kann es sich auch um einen Antikörper handeln. Besonders interessant ist hierbei ein Antikörper, der Markerstrukturen auf Zelloberflächen erkennt. Ein Beispiel für eine solche Markerstruktur ist der Transferrin-Rezeptor. Teil A kann desweiteren auch aus einer niedermolekularen Struktur bestehen, die spezifisch an biologisches Material bindet. Ein Beispiel für eine derartige niedermolekulare Struktur ist Acetylcholin, das vom Acetylcholin-Rezeptor spezifisch gebunden wird. Teil A der Biosonde kann aber auch ein Kohlenhydrat, ein Lipid, eine anorganische Verbindung, eine Nukleinsäure oder ein anderer Ligand, der spezifisch an biologisches Material bindet, sein oder eine dieser Gruppen umfassen.Part A of the biosonde is or comprises e.g. B. a specific to biological material binding peptide. In this case there is a specific interaction between the peptide and a peptide receptor that is on the biological material located. An example of such an interaction is that of the α- Factor receptor Ste2p from Saccharomyces cerevisiae with the associated one Peptide ligand α factor. Further examples are the TSH receptor (Schuppert et al. (1996) Thyroid 6: 575), the FSH receptor (Tilly et al. (1992) Endocrinology 131: 799), the EGF receptor (Christensen et al. (1998) Dan. Med. Bull. 45: 121), the TNF receptor (Murphy et al. (1994) Thymus 23: 177), the transferrin receptor (Ponka and Lok (1999) Int. J. Biochem. Cell Biol. 31: 1111), the insulin receptor (Milazzo et al. (1992) Cancer Res. 52: 3924), the FGF receptor (Kiefer et al. (1991) Growth Factors 5: 115), the TGFβ receptor (Derynck et al. (1994) Princess Takamatsu Symp. 24: 264), the IGF receptor (Peyrat and Bonneterre (1992) Breast Cancer Res. Treat. 22:59), the angiotensin II receptor (Smith and Timmermans (1994) Curr. Opin. Nephrol. Hypertens. 3: 112) or the somatostatin receptor (Schonbrunn (1999) Ann. Oncol. 10 Suppl. 2: 17) and the interactions with their respective ligands. All peptides which are able to bind specifically to the desired biological material. At that specifically binding part A can also be an antibody. Especially of interest here is an antibody, the marker structures on cell surfaces recognizes. An example of such a marker structure is the transferrin receptor. Part A can also consist of a low molecular structure, the binds specifically to biological material. An example of one low molecular weight structure is acetylcholine, that of the acetylcholine receptor is specifically bound. Part A of the biosonde can also contain a carbohydrate, a lipid, an inorganic compound, a nucleic acid or another  Ligand that specifically binds to biological material, or one of these Include groups.

Teil B der Biosonde ist oder umfaßt eine Struktur, die dem biologischen Material, an das die Biosonde spezifisch bindet, die gewünschte Eigenschaft verleiht (elektrische Ladung, veränderte Dielektrizitätskonstante und/oder spezifische Leitfähigkeit). Beispiele für Träger elektrischer Ladung sind saure und basische Aminosäuren (Aspartat, Glutamat, Lysin, Arginin), Nukleinsäuren (einzelsträngige und doppelsträngige DNA und RNA, DNA/RNA-Heteroduplex), organische Säuren und Basen (Tartrat, Citrat, Amine), polyquarternäre Amine sowie anorganische Ladungsträger. Strukturen, die das dielektrische Verhalten des biologischen Materials verändern, sind neben den oben genannten Strukturen auch hydrophobe, elektrisch neutrale Strukturen, wie Lipide, Fettsäuren, Wachse, Öle und Sterole. In einer bevorzugten Ausführung ist Teil B der Biosonde eine Nukleinsäure, die unmittelbar oder über ein Zwischenglied an Teil A der Biosonde kovalent geknüpft ist. Die Nukleinsäure umfaßt hierbei vorzugsweise mindestens 5 Nukleotide. In einer besonders bevorzugten Ausführung der Biosonde ist Teil B der Biosonde eine Nukleinsäure, die die genetische Information für Teil A der Biosonde umfaßt, wobei Teil A der Biosonde ein Protein oder Polypeptid ist, und Teil B der Biosonde eine einzel- oder doppelsträngige RNA oder DNA oder eine RNA/DNA-Heteroduplex ist, die kovalent an Teil A der Biosonde geknüpft ist. Besonders bevorzugt handelt es sich auch hier bei Teil A der Biosonde um Liganden für den Ste2p-Rezeptor, den TSH-Rezeptor, den FSH-Rezeptor, den EGF-Rezeptor, den TNF-Rezeptor, den Transferrin-Rezeptor, den Insulin-Rezeptor, den FGF-Rezeptor, den TGFβ- Rezeptor, den IGF-Rezeptor, den Angiotensin II-Rezeptor oder den Somatostatin- Rezeptor und bei Teil B der Biosonde jeweils um eine Nukleinsäure, die die für die genannten Liganden kodierende Sequenzen umfaßt. Bevorzugt sind bei dieser bevorzugten Ausführungsform Teil A und Teil B der Biosonde über ein Puromycin- Molekül kovalent miteinander verknüpft (Roberts et al. (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94: 12297). Part B of the biosonde is or includes a structure that matches the biological material that specifically binds the biosonde, gives the desired property (electrical Charge, changed dielectric constant and / or specific conductivity). Examples of carriers of electrical charge are acidic and basic amino acids (Aspartate, glutamate, lysine, arginine), nucleic acids (single stranded and double-stranded DNA and RNA, DNA / RNA heteroduplex), organic acids and Bases (tartrate, citrate, amines), polyquaternary amines and inorganic Charge carrier. Structures that determine the dielectric behavior of the biological Material, in addition to the structures mentioned above, they are also hydrophobic, electrically neutral structures such as lipids, fatty acids, waxes, oils and sterols. In a preferred embodiment, part B of the biosonde is a nucleic acid which directly or covalently linked to part A of the biosonde is. The nucleic acid here preferably comprises at least 5 nucleotides. In a particularly preferred embodiment of the biosonde, part B is the biosonde a nucleic acid which contains the genetic information for part A of the biosonde, wherein part A of the biosonde is a protein or polypeptide, and part B of the biosonde a single or double stranded RNA or DNA or an RNA / DNA heteroduplex which is covalently linked to part A of the biosonde. Acts particularly preferred Part A of the biosonde is also a ligand for the Ste2p receptor, the TSH receptor, the FSH receptor, the EGF receptor, the TNF receptor, the Transferrin receptor, the insulin receptor, the FGF receptor, the TGFβ Receptor, the IGF receptor, the angiotensin II receptor or the somatostatin Receptor and in part B of the biosonde each by a nucleic acid which is responsible for the said ligand encoding sequences. These are preferred preferred embodiment part A and part B of the biosonde via a puromycin Molecule covalently linked (Roberts et al. (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94: 12297).  

Zusätzlich zur selektiven Markierung bestimmter Spezies mit einer spezifisch bindenden Biosonde kann zusätzlich eine Markierung dieser Spezies mit einem Fluoreszenzfarbstoff, einem Farbstoff (wie z. B. Propidiumjodid, Calcofluor), einem entsprechend markierten spezifisch bindenden Antikörper (z. B. FITC), einer radioaktiven Markierung (z. B. 35S-Methionine) oder einer anderen Verbindung, die eine einfache Detektion des biologischen Materials ermöglicht, durchgeführt werden.In addition to the selective labeling of certain species with a specifically binding biosonde, a labeling of these species with a fluorescent dye, a dye (such as propidium iodide, calcofluor), a correspondingly labeled specifically binding antibody (e.g. FITC), a radioactive Labeling (e.g. 35 S-methionine) or another compound that enables easy detection of the biological material.

Der Nachweis und/oder die Auftrennung der mittels der Biosonde markierten biologischen Materialien kann entweder elektrophoretisch unter Verwendung eines konstanten elektrischen Feldes, beispielsweise durch free flow Elektrophorese, oder unter Verwendung eines inhomogenen Wechselfeldes durch Dielektrophorese erfolgen. Insbesondere bei der DEP kann durch die Verwendung der Biosonden eine signifikante Verbesserung der Trennschärfe erreicht werden.The detection and / or the separation of those marked by means of the biosonde biological materials can be used either electrophoretically constant electric field, for example by free flow electrophoresis, or using an inhomogeneous alternating field by dielectrophoresis respectively. In the case of DEP in particular, the use of the biosondes a significant improvement in selectivity can be achieved.

Besonders bevorzugt anzuwenden ist das erfindungsgemäße Verfahren der Markierung von biologischen Spezies mit Biosonden und der anschließenden Auftrennung des biologischen Materials durch Elektrophorese oder Dielekrophorese bei der Verwendung von Biochips. Bevorzugt sind hierbei Biochips anzuwenden, wie sie von Cheng et al. beschrieben werden (Cheng et al. (1998) Anal. Chem. 70: 2321). Biochips erlauben eine Durchführung der Trennung und/oder des Nachweises in miniaturisierter Form. Durch die Miniaturisierung kann der experimentelle Aufwand z. B. im Vergleich zu FACS zusätzlich reduziert werden.The method of the invention is particularly preferably to be used Labeling of biological species with biosondes and the subsequent one Separation of the biological material by electrophoresis or plate electrophoresis when using biochips. It is preferable to use biochips as described by Cheng et al. (Cheng et al. (1998) Anal. Chem. 70: 2321). Biochips allow the separation and / or the Proof in miniaturized form. Due to the miniaturization experimental effort z. B. can also be reduced compared to FACS.

Über die dielektrische Auftrennung von Zellen auf einem Chip ist bereits berichtet worden (Cheng et al. (1998) Anal. Chem. 70: 2321), wobei in diesem speziellen Fall die Unterschiede in den dielektrischen Eigenschaften der aufzutrennenden Spezies groß genug waren, um eine Auftrennung zu ermöglichen. Die Verwendung der erfindungsgemäßen Biosonden erlaubt auch dann eine Auftrennung biologischer Spezies, wenn die Unterschiede in den dielektrischen Eigenschaften der biologischen Spezies selbst nicht groß genug sind, um Auftrennung durch Dielektrophorese zu ermöglichen. The dielectric separation of cells on a chip has already been reported (Cheng et al. (1998) Anal. Chem. 70: 2321), in this particular case the differences in the dielectric properties of the species to be separated were large enough to allow separation. The use of the Bio probes according to the invention also allow biological separation Species when the differences in the dielectric properties of the biological species themselves are not large enough to be separated by To enable dielectrophoresis.  

BeispieleExamples Beispiel 1example 1 Herstellung einer BiosondeProduction of a biosonde

Die Biosonde wird ausgehend von einer DNA-Sequenz über eine in vitro Transkription und Translation hergestellt. Nach Roberts and Szostak (1997; Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94: 12297) wird das bei der Translation entstehende Peptid über ein Puromycin kovalent mit seiner mRNA verknüpft. Somit stellt der Peptid- Anteil den spezifischen Binder dar, während der mRNA-Anteil durch seine starke negative Ladung im neutralen pH-Bereich die physikalischen Eigenschaften des biologischen Materials so verändert, daß eine Selektion bzw. Detektion ermöglicht wird. Im Ausführungsbeispiel ist das biologische Material eine Population von Hefezellen der Art Saccharomyces cerevisiae vom Paarungstyp MATa, die den α- Faktor-rezeptor (STE2) exprimieren (Davis and Davey (1997) Biochem. Soc. Trans. 25: 1015). Die detaillierte Ausführung wird im folgenden beschrieben: Ausgehend von einer DNA-Sequenz (Seq. 1), die über Standardverfahren (Oligonucleotid- Synthese) hergestellt werden kann, oder die kommerziell erhältlich ist (z. B. INTERACTIVA The Virtual Laboratory, Ulm), wird über eine Polymerase- Kettenreaktion (PCR) ein doppelsträngiges DNA Molekül (Seq. 2) generiert. Das DNA Molekül enthält folgende Sequenzbereiche: eine T7-Promotorsequenz, eine TMV Translationsinitiationssequenz, einen kodierenden Bereich mit einem 5' kodierten E-tag, einer α-Faktor Sequenz und einem 3' kodierten Strep-tag. Die Durchführung der PCR ist Stand der Technik und sieht wie folgt aus:
In ein PCR-Reaktionsgefäß werden folgende Bestandteile gegeben:
1 µl DNA (aus der Oligonucleotid-Synthese entspricht 1 nmol, Seq. 1)
10 µl Taq-Polymerase Puffer 10 × (Promega, Mannheim)
10 µl 25 mM MgCl2 (Promega, Mannheim)
10 µl 2,5 mM dNTP-Mix (Promega, Mannheim)
10 µl 10 µM Primer 1 (Seq. 3)
10 µl 10 µM Primer 2 (Seq. 4)
2 µl 5 U/µl Taq-Polymerase (Promega, Mannheim)The biosonde is made from a DNA sequence via in vitro transcription and translation. According to Roberts and Szostak (1997; Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94: 12297), the peptide formed during translation is covalently linked to its mRNA via a puromycin. The peptide fraction thus represents the specific binder, while the mRNA fraction changes the physical properties of the biological material due to its strong negative charge in the neutral pH range in such a way that selection or detection is made possible. In the exemplary embodiment, the biological material is a population of yeast cells of the type Saccharomyces cerevisiae of the mating type MATa, which express the α-factor receptor (STE2) (Davis and Davey (1997) Biochem. Soc. Trans. 25: 1015). The detailed description is described below: Starting from a DNA sequence (Seq. 1) that can be produced using standard methods (oligonucleotide synthesis) or that is commercially available (e.g. INTERACTIVA The Virtual Laboratory, Ulm), a double-stranded DNA molecule (Seq. 2) is generated via a polymerase chain reaction (PCR). The DNA molecule contains the following sequence regions: a T7 promoter sequence, a TMV translation initiation sequence, a coding region with a 5 'coded E-tag, an α-factor sequence and a 3' coded strep tag. The implementation of the PCR is state of the art and looks as follows:
The following components are placed in a PCR reaction vessel:
1 µl DNA (from the oligonucleotide synthesis corresponds to 1 nmol, Seq. 1)
10 ul Taq polymerase buffer 10 × (Promega, Mannheim)
10 µl 25 mM MgCl 2 (Promega, Mannheim)
10 µl 2.5 mM dNTP mix (Promega, Mannheim)
10 µl 10 µM Primer 1 (Seq. 3)
10 µl 10 µM Primer 2 (Seq. 4)
2 µl 5 U / µl Taq polymerase (Promega, Mannheim)

Das PCR Programm ist wie folgt charakterisiert:
10 Zyklen mit 1 min 95°C, 2 min 55°C, 2 min 72°C.The PCR program is characterized as follows:
10 cycles with 1 min 95 ° C, 2 min 55 ° C, 2 min 72 ° C.

Die DNA wird quantifiziert und etwa 1 nmol der doppelsträngigen DNA werden als Template für die in vitro Transkription verwendet. Die Transkription erfolgt mit einem käuflichen System von Ambion (Austin, USA). Der Standard-Ansatz sieht wie folgt aus:
50 µl DNA-Template (1 nmol)
20 µl Reaction Puffer (Ambion, Austin)
20 µl 75 mM ATP (Ambion, Austin)
20 µl 75 mM CTP (Ambion, Austin)
20 µl 75 mM GTP (Ambion, Austin)
20 µl 75 mM UTP (Ambion, Austin)
20 µl Enzyme-Mix (Ambion, Austin)
30 µl H2OThe DNA is quantified and about 1 nmol of the double-stranded DNA is used as a template for in vitro transcription. The transcription is carried out using a commercially available system from Ambion (Austin, USA). The standard approach looks like this:
50 µl DNA template (1 nmol)
20 µl reaction buffer (Ambion, Austin)
20 µl 75 mM ATP (Ambion, Austin)
20 µl 75 mM CTP (Ambion, Austin)
20 µl 75 mM GTP (Ambion, Austin)
20 µl 75 mM UTP (Ambion, Austin)
20 µl enzyme mix (Ambion, Austin)
30 µl H 2 O

Der Ansatz wird für eine Stunde bei 37°C inkubiert. Die RNA wird über Phenol- Chloroform Extraktion aufgearbeitet (Davis et al. 1994) und anschließend quantifiziert.The mixture is incubated for one hour at 37 ° C. The RNA is Chloroform extraction worked up (Davis et al. 1994) and then quantified.

Die mRNA muß zur Herstellung der Biosonde am 3' Ende modifiziert werden, so daß sich an der mRNA eine kurze DNA-Sequenz und an deren 3' Ende ein Puromycin befindet. Diese Technik ist bei Roberts und Szostak (1997; s. o.) beschrieben. Im Ausführungsbeispiel erfolgt die Modifikation wie folgt:
2 nmol mRNA
2 nmol Linker (Seq. 5; INTERACTIVA, Ulm)
2 nmol Splint (Seq. 6; INTERACTIVA, Ulm)
ad 125 µl H2OTo produce the biosonde, the mRNA must be modified at the 3 'end so that there is a short DNA sequence on the mRNA and a puromycin at its 3' end. This technique is described by Roberts and Szostak (1997; see above). In the exemplary embodiment, the modification is as follows:
2 nmol mRNA
2 nmol linker (Seq. 5; INTERACTIVA, Ulm)
2 nmol sapwood (Seq. 6; INTERACTIVA, Ulm)
ad 125 µl H 2 O

Der Ansatz wird für 3 min auf 70°C erwärmt und 15 min bei RT abgekühlt. Anschließend werden 15 µl 10 × Ligase-Puffer (Promega, Mannheim) und 10 µl 20 U/µl T4 DNA-Ligase (Promega, Mannheim) zugegeben. Durch Inkubation für 4 h bei Raumtemperatur wird der Puromycin-tragende Linker mit der mRNA ligiert. Der gesamte Ansatz wird mit 10 nmol Antisplint (Seq. 7) versetzt und für 5 min auf 80°C erwärmt. Anschließend wird der Ligationsansatz auf Eis abgekühlt und die ligierte mRNA wird quantifiziert.The mixture is heated to 70 ° C. for 3 min and cooled at RT for 15 min. Then 15 ul 10 × ligase buffer (Promega, Mannheim) and 10 ul 20 U / ul T4 DNA ligase (Promega, Mannheim) added. By incubation for 4 h The puromycin-bearing linker is ligated to the mRNA at room temperature. The entire batch is mixed with 10 nmol antisplint (Seq. 7) and opened for 5 min Heated to 80 ° C. The ligation mixture is then cooled on ice and the ligated mRNA is quantified.

Zur Herstellung der Biosonde werden 200 pmol ligierte mRNA mit 10 µl 35S- Methionin (APbiotech, Freiburg), 15 µl Aminosäure Mastermix ohne Methionin (Ambion, Austin) und 200 µl Retic Lysate IVT (Ambion, Austin) versetzt und translatiert. Es wird auf 300 µl mit H2O aufgefüllt. Der Ansatz wird bei 30°C für 30 min inkubiert. Anschließend werden 100 µl 2,5 M KCl und 70 µl 1 M MgCl2 zugegeben. Der Ansatz wird über Nacht bei -20°C gelagert.To prepare the biosonde, 200 pmol ligated mRNA is mixed with 10 ul 35 S-methionine (APbiotech, Freiburg), 15 ul amino acid master mix without methionine (Ambion, Austin) and 200 ul retic lysate IVT (Ambion, Austin). Make up to 300 µl with H 2 O. The mixture is incubated at 30 ° C for 30 min. Then 100 ul 2.5 M KCl and 70 ul 1 M MgCl 2 are added. The batch is stored at -20 ° C. overnight.

Zur Aufarbeitung der Biosonden wird der Translationsansatz mit 10 ml Bindungspuffer (100 mM Tris/HCl pH 8,0; 10 mM EDTA pH 8,0; 1 M NaCl; 0,25% Triton X-100) versetzt und es werden 10 mg Oligo-dT Cellulose (Apbiotech, Freiburg) zugegeben. Der Ansatz wird eine Stunde bei 4°C inkubiert. Die Cellulose mit den gebundenen Biosonden wird durch Filtration abgetrennt und mit 8 ml Bindungspuffer gewaschen. Die Biosonden werden mit 4 mal 100 µl H2O eluiert. Durch eine Bestimmung der 35S-Zerfälle in einem Scintillationszähler werden die Biosonden quantifiziert und können anschließend zur Bindung an das biologische Material eingesetzt werden.To work up the biosondes, the translation mixture is mixed with 10 ml binding buffer (100 mM Tris / HCl pH 8.0; 10 mM EDTA pH 8.0; 1 M NaCl; 0.25% Triton X-100) and 10 mg oligo are added -dT cellulose (Apbiotech, Freiburg) added. The mixture is incubated at 4 ° C. for one hour. The cellulose with the bound bio-probes is separated by filtration and washed with 8 ml binding buffer. The biosondes are eluted with 4 times 100 ul H 2 O. The biosondes are quantified by determining the 35 S decays in a scintillation counter and can then be used for binding to the biological material.

Sequenzen sequences

SEQUENZPROTOKOLL SEQUENCE LISTING

Claims (20)

1. Verfahren zum Nachweis oder zur Reinigung von biologischem Material durch Elektrophorese oder Dielektrophorese, folgenden Schritte umfassend:
  • a) Vorlage von biologischem Material, das unterschiedliche Spezies enthält.
  • b) Hinzufügen einer Biosonde, enthaltend einen Teil A, der spezifisch an mindestens eine der Spezies bindet, und einen Teil B, der die elektrischen und/oder dielektrischen Eigenschaften der durch spezifische Bindung der Biosonde markierten Spezie(s) verändert, so daß der Nachweis und/oder die Reinigung dieser markierten Spezie(s) durch Elektrophorese und/oder Dielektrophorese ermöglicht oder verbessert wird.
  • c) Aufbau eines elektrischen Feldes zum Nachweis oder zur Reinigung des Komplexes bzw. der Komplexe aus biologischer Spezie(s) und spezifisch gebundener Biosonde durch Elektrophorese oder Dielektrophorese.
1. A method for the detection or purification of biological material by electrophoresis or dielectrophoresis, comprising the following steps:
  • a) Presentation of biological material that contains different species.
  • b) adding a biosonde containing part A, which binds specifically to at least one of the species, and part B, which changes the electrical and / or dielectric properties of the species (s) marked by specific binding of the biosonde, so that the detection and / or the purification of these labeled species (s) is made possible or improved by electrophoresis and / or dielectrophoresis.
  • c) Establishment of an electric field for the detection or purification of the complex or complexes of biological species (s) and specifically bound biosonde by electrophoresis or dielectrophoresis.
2. Verfahren zum Nachweis oder zur Reinigung von Biosonden, die spezifisch an biologisches Material binden, durch Elektrophorese oder Dielektrophorese, folgende Schritte umfassend:
  • a) Vorlage von biologischem Material, das mindestens eine Spezie enthält.
  • b) Hinzufügen verschiedener Biosonden, enthaltend jeweils einen Teil A, der spezifisch an mindestens eine der Spezies binden kann, und einen Teil B, der die elektrischen und/oder dielektrischen Eigenschaften der durch Bindung einer Biosonde markierten Spezie(s) verändert, so daß Detektion und/oder Reinigung eines so entstehenden Komplexes aus biologischer Spezie(s) und biologischem Material möglich wird, wobei die verschiedenen Biosonden unterschiedliche Bindungsspezifitäten besitzen und mindestens eine der hinzugefügten Biosonden an das biologische Material bindet.
  • c) Aufbau eines elektrischen Feldes zum Nachweis oder zur Reinigung des Komplexes bzw. der Komplexe aus biologischer Spezie(s) und spezifisch gebundener Biosonde durch Elektrophorese oder Dielektrophorese.
2. A method for the detection or purification of bio-probes which bind specifically to biological material by electrophoresis or dielectrophoresis, comprising the following steps:
  • a) Submission of biological material that contains at least one species.
  • b) adding different biosondes, each containing a part A which can bind specifically to at least one of the species and a part B which changes the electrical and / or dielectric properties of the species (s) marked by binding a biosonde, so that detection and / or purification of a complex of biological species (s) and biological material formed in this way is possible, the different biosondes having different binding specificities and binding at least one of the added biosondes to the biological material.
  • c) Establishment of an electric field for the detection or purification of the complex or complexes of biological species (s) and specifically bound biosonde by electrophoresis or dielectrophoresis.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, charakterisiert dadurch, daß Teil A der Biosonde ein Antikörper oder Peptid, eine anorganische Verbindung, ein Kohlenhydrat, eine Nukleinsäure oder ein Lipid ist oder mindestens eine der genannten Gruppen umfaßt.3. The method according to claim 1 or 2, characterized in that part A of Biosonde an antibody or peptide, an inorganic compound Is carbohydrate, a nucleic acid or a lipid or at least one of the mentioned groups includes. 4. Verfahren nach Anspruch 3, charakterisiert dadurch, daß Teil B der Biosonde eine Nukleinsäure, ein elektrisch geladenes Peptid, ein polyquarternäres Amin, eine organische Säure, eine organische Base, eine anorganische Substanz, ein Lipid, eine Fettsäure oder eine Verbindung aus der Familie der Wachse, Öle oder Sterole ist oder mindestens eine der genannten Gruppen umfaßt.4. The method according to claim 3, characterized in that part B of the biosonde a nucleic acid, an electrically charged peptide, a polyquaternary amine, an organic acid, an organic base, an inorganic substance Lipid, a fatty acid or a compound from the family of waxes, oils or Is sterols or comprises at least one of the groups mentioned. 5. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, charakterisiert dadurch, daß Teil A der Biosonde ein Peptid oder Protein und Teil B der Biosonde eine für das Peptid oder Protein kodierende Nukleinsäure ist, die kovalent an dieses Peptid oder Protein gebunden ist, wobei die kovalente Bindung des Peptids bzw. Proteins an die Nukleinsäure über ein Puromycin-Molekül erfolgt.5. The method according to claim 1 or 2, characterized in that part A of Biosonde a peptide or protein and Part B of the biosonde one for the peptide or nucleic acid encoding protein which is covalent to this peptide or Protein is bound, the covalent binding of the peptide or protein to the nucleic acid occurs via a puromycin molecule. 6. Verfahren nach Anspruch 3 bis 5, wobei es sich bei der Nukleinsäure um einzelsträngige RNA, doppelsträngige RNA, einzelsträngige DNA, doppelsträngige DNA oder um eine DNA/RNA-Heteroduplex handelt.6. The method according to claim 3 to 5, wherein it is the nucleic acid single-stranded RNA, double-stranded RNA, single-stranded DNA, double-stranded DNA or a DNA / RNA heteroduplex. 7. Verfahren nach Anspruch 3 bis 6, wobei es sich bei dem spezifisch bindenden Peptid, das Teil A der Biosonde ist oder von diesem umfaßt wird, um einen Liganden handelt, der an einen Rezeptor aus der Gruppe der folgenden Rezeptoren bindet: Ste2p-Rezeptor aus Saccharomyces cerevisiae, TSH-, FSH-, EGF-, TNF-, Transferrin-, Insulin-, FGF-, TGFβ-, IGF-, Angiotensin II- oder Somatostatin-Rezeptor. 7. The method according to claim 3 to 6, wherein it is the specific binding Peptide, which is part A of the biosonde or is comprised by this, around a Ligand acts on a receptor from the group of the following Receptors bind: Ste2p receptor from Saccharomyces cerevisiae, TSH, FSH, EGF, TNF, transferrin, insulin, FGF, TGFβ, IGF, angiotensin II or somatostatin receptor.   8. Verfahren nach Anspruch 1 bis 7, wobei es sich bei dem biologischen Material um Gewebe, Zellen, Zellorganellen, Viren, Proteine, Peptide, Nukleinsäuren, Kohlenhydrate oder Lipide handelt oder dieses zumindest eine der genannten Gruppen umfaßt.8. The method according to claim 1 to 7, wherein it is the biological material around tissues, cells, cell organelles, viruses, proteins, peptides, nucleic acids, Carbohydrates or lipids or this is at least one of the above Groups. 9. Verfahren nach Anspruch 1 bis 8, gekennzeichnet dadurch, daß es sich bei dem elektrophoretischen Verfahren um die free flow Elektrophorese handelt.9. The method according to claim 1 to 8, characterized in that it is in the electrophoretic process is free flow electrophoresis. 10. Verfahren nach Anspruch 1 bis 9, charakterisiert dadurch, daß das elektrophoretische oder dielektrophoretische Verfahren unter Verwendung von Biochips durchgeführt wird.10. The method according to claim 1 to 9, characterized in that the electrophoretic or dielectrophoretic methods using Biochips is carried out. 11. Verfahren nach Anspruch 1 bis 10, charakterisiert dadurch, daß das mit Hilfe der Biosonden spezifisch markierte Material zusätzlich auf andere Weise spezifisch markiert wird.11. The method according to claim 1 to 10, characterized in that using the Material specifically labeled for bio-probes is also specifically specific in another way is marked. 12. Verfahren nach Anspruch 11, charakterisiert dadurch, daß es sich bei der zusätzlichen Markierung um eine Farbmarkierung, eine Fluoreszenzmarkierung oder eine radioaktive Markierung handelt.12. The method according to claim 11, characterized in that it is in the additional marking around a color marking, a fluorescent marking or a radioactive label. 13. Molekül, im folgenden Biosonde genannt, das einen spezifisch an einen Rezeptor bindenden Proteinteil enthält, der unmittelbar oder über ein Zwischenglied kovalent mit einer Nukleinsäure verknüpft ist, wobei die Nukleinsäure mehr als 5 Nukleotide umfaßt, gekennzeichnet dadurch, daß der Proteinteil des Moleküls einen Liganden für einen Rezeptor aus der Gruppe der folgenden Rezeptoren umfaßt: Ste2p-Rezeptor aus Saccharomyces cerevisiae, TSH-, FSH-, EGF-, TNF-, Transferrin-, Insulin-, FGF-, TGFβ-, IGF-, Angiotensin II- oder Somatostatin-Rezeptor.13. Molecule, hereinafter called biosonde, which specifically targets a receptor contains binding protein part, directly or via an intermediate link is covalently linked to a nucleic acid, the nucleic acid being more than 5 Nucleotides, characterized in that the protein part of the molecule a ligand for a receptor from the group of the following receptors includes: Ste2p receptor from Saccharomyces cerevisiae, TSH, FSH, EGF, TNF, transferrin, insulin, FGF, TGFβ, IGF, angiotensin II or Somatostatin receptor. 14. Biosonde nach Anspruch 13, wobei die Nukleinsäure die genetische Information für den Proteinteil umfaßt. 14. The biosonde according to claim 13, wherein the nucleic acid contains the genetic information for the protein portion.   15. Biosonde nach Anspruch 13 oder 14, wobei es sich bei der Nukleinsäure um einzelsträngige RNA, doppelsträngige RNA, einzelsträngige DNA, doppelsträngige DNA oder um eine DNA/RNA-Heteroduplex handelt.15. Biosonde according to claim 13 or 14, wherein it is the nucleic acid single-stranded RNA, double-stranded RNA, single-stranded DNA, double-stranded DNA or a DNA / RNA heteroduplex. 16. Molekül, im folgenden Biosonde genannt, das einen spezifisch an biologisches Material bindenden Proteinteil enthält, der unmittelbar oder über ein Zwischenglied kovalent mit einem Lipidmolekül verknüpft ist, wobei es sich bei dem biologischen Material um Gewebe, Zellen, Zellorganellen, Viren, Proteine, Peptide, Nukleinsäuren, Kohlenhydrate oder Lipide handelt oder dieses zumindest eine der genannten Gruppen umfaßt.16. Molecule, hereinafter called biosonde, which has a specific biological Contains material-binding protein part that is immediately or via a Intermediate link is covalently linked to a lipid molecule, where it is the biological material around tissues, cells, cell organelles, viruses, proteins, Peptides, nucleic acids, carbohydrates or lipids comprises at least one of the groups mentioned. 17. Molekül, im folgenden Biosonde genannt, das einen spezifisch an biologisches Material bindenden Proteinteil enthält, der unmittelbar oder über ein Zwischenglied kovalent mit einer polyquarternären Ammoniumverbindung verknüpft ist, wobei es sich bei dem biologischen Material um Gewebe, Zellen, Zellorganellen, Viren, Proteine, Peptide, Nukleinsäuren, Kohlenhydrate oder Lipide handelt oder dieses zumindest eine der genannten Gruppen umfaßt.17. Molecule, hereinafter called biosonde, which has a specific biological Contains material-binding protein part that is immediately or via a Intermediate link covalently with a polyquaternary ammonium compound is linked, the biological material being tissue, cells, Cell organelles, viruses, proteins, peptides, nucleic acids, carbohydrates or Lipids or this comprises at least one of the groups mentioned. 18. Biosonde nach Anspruch 16 oder 17, wobei es sich bei dem Proteinteil um ein Molekül handelt, das einen Liganden für einen Rezeptor aus der Gruppe der folgenden Rezeptoren umfaßt: Ste2p-Rezeptor aus Saccharomyces cerevisiae, TSH-, FSH-, EGF-, TNF-, Transferrin-, Insulin-, FGF-, TGFβ-, IGF-, Angiotensin II- oder Somatostatin-Rezeptor.18. Biosonde according to claim 16 or 17, wherein the protein part is a Molecule is a ligand for a receptor from the group of includes the following receptors: Ste2p receptor from Saccharomyces cerevisiae, TSH, FSH, EGF, TNF, transferrin, insulin, FGF, TGFβ, IGF, angiotensin II or somatostatin receptor. 19. Biosonde nach Anspruch 13 bis 18, wobei das Zwischenglied ein Puromycin- Molekül umfaßt.19. Biosonde according to claim 13 to 18, wherein the intermediate member is a puromycin Molecule includes. 20. Komplex aus biologischem Material und einer spezifisch an dieses gebundenen Biosonde nach Anspruch 13 bis 19, wobei es sich bei dem biologischen Material um Gewebe, Zellen, Zellorganellen, Viren, Proteine, Peptide, Nukleinsäuren, Kohlenhydrate, Lipide oder andere organische Verbindungen handelt oder dieses zumindest eine der genannten Gruppen umfaßt.20. A complex of biological material and one specifically bound to it Biosonde according to claim 13 to 19, wherein it is the biological material around tissues, cells, cell organelles, viruses, proteins, peptides, nucleic acids, Carbohydrates, lipids or other organic compounds comprises at least one of the groups mentioned.
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