DE10028725B4 - Primary structure of HNA-2a (formerly NB1) antigen - Google Patents

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Abstract

Nucleotidsequenz umfassend eine Nucleotidsequenz SEQ ID NO 1, die ein HNA-2a-Antigen codiert, zur Verwendung als Diagnostikum, welches mit Alloantikörpern reagiert, die HNA-2a spezifisch sind.A nucleotide sequence comprising a nucleotide sequence of SEQ ID NO 1 encoding a HNA-2a antigen for use as a diagnostic agent which reacts with alloantibodies specific to HNA-2a.

Description

Es ist bekannt, daß das HNA-2a (NB1)-Merkmal zur Bildung von Allo- und Autoantikörpern führen kann. Diese Antikörper können zu Erkrankungen wie der neonatalen Immunneutropenie, der transfusionsassoziierten akuten Lungeninsuffizienz, der Immun neutropenie nach Knochenmarktransplantation, der Medikamentinduzierten Immunneutropenie sowie der Autoimmunneutropenie führen. Man weiß, daß es sich bei dem HNA-2a (NB1)-Antigen um ein auf einer Subpopulation der Granulozyten exprimiertes Glykoprotein handelt. Die dem Glykoprotein zugrundeliegende Nukleotid- und Aminosäuresequenz ist bisher nicht bekannt gewesen, weshalb die fragilen und nicht lagerbaren Granulozyten für die Antigen und Antikörper-Diagnostik benutzt werden müssen. Hierzu sind die Granulozyten zunächst arbeits- und zeitaufwendig aus dem Blut von Patienten (Antigennachweis) bzw. ausgesuchter, gesunder Spender (Antikörpernachweis) zu isolieren. Erst dann können die notwendigen Untersuchungen für die Diagnostik der oben angeführten Erkrankungen durchgeführt werden. Dies hatte zur Folge, daß diese Untersuchungen nur von wenigen Speziallaboratorien durchgeführt werden, was wiederum Postversand notwendig macht, bzw. der Patient wegen der Instabilität der Granulozyten zur Blutentnahme zum Speziallabor reisen muß. It is known that the HNA-2a (NB1) feature can lead to the formation of allo- and autoantibodies. These antibodies can lead to diseases such as neonatal immune neutropenia, transfusion-associated acute lung injury, immune neutropenia after bone marrow transplantation, drug-induced immune neutropenia and autoimmune neutropenia. It is known that the HNA-2a (NB1) antigen is a glycoprotein expressed on a subpopulation of the granulocytes. The nucleotide and amino acid sequence underlying the glycoprotein has not hitherto been known, which is why the fragile and non-storable granulocytes must be used for antigen and antibody diagnostics. For this purpose, the granulocytes are laborious and time consuming to isolate from the blood of patients (antigen detection) or selected, healthy donor (antibody detection). Only then can the necessary examinations for the diagnosis of the above-mentioned diseases be carried out. This had the consequence that these examinations are carried out by only a few specialized laboratories, which in turn makes mailing necessary, or the patient must travel to the special laboratory for blood collection because of the instability of the granulocytes.

Das Problem der Erfindung lag daher in der Aufklärung der kodierenden Nukleotidsequenz und der hieraus ableitbaren Aminosäuresequenz, um auf die Verwendung von humanen Granulozyten verzichten zu können. The problem of the invention was therefore to elucidate the coding nucleotide sequence and the amino acid sequence derivable therefrom in order to be able to dispense with the use of human granulocytes.

Zur Lösung dieses Problems wurden zunächst Granulozyten aus dem Blut HNA-2a (NB1) tragender Individuen separiert und anschließend lysiert. Mittels Immunaffinitätschromatographie wurde das Antigen aus dem Granulozytenlysat isoliert. Nach Auftrennung in der SDS-Polyacrylamid- Gelelektropherese wurde das isolierte Antigen mittels Immunoblot unter Verwendung von mehreren Referenzantikörpern als HNA-2a (NB1)-Antigen bestätigt. Die N-terminale Aminosäuresequenz wurde durch Edman-Abbau ermittelt und Primer zur Aufklärung der cDNA-Sequenz konstruiert. Nach Isolierung von m-RNA aus Granulozyten HNA-2a (NB1)-positiver Individuen wurde die cDNA-Sequenz mittels RACE-PCR ("rapid amplification of cDNA ends polymerase chain reaction) ermittelt. Die aus der cDNA-Sequenz abgeleitete Aminosäuresequenz enthielt Aminosäuresequenzen von 3 Trypsinspaltprodukten des immunchromatographisch isolierten Antigens. Die gefundene Nukleinsäuresequenz wurde in COS- und CHO-Säugerzellen zur Expression gebracht. Das exprimierte Glykoprotein (Antigen) wurde von monoklonalen und humanen Antikörpern sowohl in der Durchflußzytometrie als auch in immunchemischen Methoden wie dem Immunoblot und der Immunpräzipitation erkannt. Somit ist nach derzeit gültigen wissenschaftlichen Maßstäben nachgewiesen, daß die von uns aufgeklärte Nukleinsäuresequenz für das bekannte HNA-2a-(NB1)-Antigen codiert. Nukleinsäuresequenz-Datenbanksuchen zeigten, daß der Anfangsteil der Nukleotidsequenz bereits im Rahmen des Human Genome Projekts sequenziert worden waren, ohne jedoch die Bedeutung der Nukleotidsequenz als kodierende Sequenz für das HNA-2a (NB1)-Antigen zu erkennen, was sich auch in den Protein-Datenbanksuchen bestätigte. Bei dem HNA-2a (NB1)-Antigen handelte es sich somit um ein Glykoprotein der Granulozytenmembran mit bislang unbekannter Primärstruktur. To solve this problem, granulocytes were first separated from the blood HNA-2a (NB1) carrying individuals and then lysed. The antigen was isolated from the granulocyte lysate by immunoaffinity chromatography. After separation in SDS-polyacrylamide gel electropheresis, the isolated antigen was confirmed by immunoblot using several reference antibodies as HNA-2a (NB1) antigen. The N-terminal amino acid sequence was determined by Edman degradation and primers designed to elucidate the cDNA sequence. After isolation of mRNA from granulocytes of HNA-2a (NB1) -positive individuals, the cDNA sequence was determined by means of rapid amplification of cDNA ends polymerase chain reaction (RACE-PCR) .The amino acid sequence derived from the cDNA sequence contained amino acid sequences of The truncated nucleic acid sequence was expressed in COS and CHO mammalian cells The expressed glycoprotein (antigen) was recognized by both monoclonal and human antibodies in both flow cytometry and immunochemical techniques such as immunoblotting and immunoprecipitation Thus, according to current scientific standards, the nucleic acid sequence we have elucidated has been shown to encode the known HNA-2a (NB1) antigen, Nucleic acid sequence database searches showed that the initial part of the nucleotide sequence had already been sequenced in the human genome project , oh However, the importance of the nucleotide sequence as a coding sequence for the HNA-2a (NB1) antigen to recognize, which was also confirmed in the protein database searches. The HNA-2a (NB1) antigen was thus a granulocyte membrane glycoprotein of previously unknown primary structure.

Mit Hilfe der gewonnenen Nukleotidsequenz lassen sich einfache und sichere molekularbiologische Methoden, z. B. Polymerase-Ketten-Reaktionen, zur Antigenbestimmung entwickeln, die nur geringe Mengen lagerbare DNA und nicht fragile Granulozyten als Ausgangsmaterial erfordern. Die DNA-basierten Techniken erlauben im Gegensatz zu intakten Granulozyten auch einen Versand der Patientenblutproben. Weiterhin kann mit Hilfe der Rekombinationstechnologie das HNA-2a (NB1)-Antigen in großer Menge und ohne Verunreinigungen durch andere humane Glykoproteine hergestellt und in Antikörpernachweisverfahen, z. B. ELISA, eingesetzt werden. With the help of the obtained nucleotide sequence can be simple and safe molecular biology methods, eg. As polymerase chain reactions, to develop antigens that require only small amounts of storable DNA and not fragile granulocytes as starting material. The DNA-based techniques, unlike intact granulocytes, also allow patient blood samples to be shipped. Furthermore, by means of recombinant technology, the HNA-2a (NB1) antigen can be produced in large quantity and without contamination by other human glycoproteins, and can be detected in antibodies, e.g. B. ELISA used.

Sowohl die DNA-basierten Antigentests als auch die Antikörpernachweisverfahren unter Verwendung rekombinanter Antigene lassen sich in Form von fertig konfektionierten Testkits als einfache diagnostische Verfahren für Laboratorien vermarkten. Die Aufklärung der HNA-2a (NB1)-Primärstruktur führt somit zu einer entscheidenden Vereinfachung seiner Antigen- und Antikörper-Diagnostik. Both the DNA-based antigen tests and the antibody detection methods using recombinant antigens can be marketed in the form of ready-made test kits as simple diagnostic procedures for laboratories. The elucidation of the HNA-2a (NB1) primary structure thus leads to a significant simplification of its antigen and antibody diagnostics.

Die Ausführung der Testkits kann zum Beispiel analog zu den bereits im Handel befindlichen PCR-SSP-Testkits für die molekulare HLA-Antigenbestimmung erfolgen, wobei die Nukleotidsequenzen für die HLA-Primer durch HNA-2a (NB1)-Antigenspezifische Primersequenzen zu ersetzen wären. The execution of the test kits can be carried out, for example, analogously to the already commercially available PCR-SSP test kits for molecular HLA antigen determination, wherein the nucleotide sequences for the HLA primers would have to be replaced by HNA-2a (NB1) antigen-specific primer sequences.

Der Antikörpernachweistest könnte entsprechend einem ebenfalls bereits auf dem Markt befindlichen Testkit zum Nachweis antinukleärer Antikörper unter Verwendung rekombinat hergestellter Antigene konfiguriert werden. Hierzu könnte die rekombinate Herstellung des HNA-2a (NB1)-Antigens in größerem Stile ebenfalls im Baculovirus-Insektenzellen-Expressionssystem erfolgen. The antibody detection assay could be configured in accordance with an already on the market assay kit for detection of antinuclear antibodies using recombinantly produced antigens. For this purpose, the recombinant production of HNA-2a (NB1) antigen in a larger scale could also be carried out in the baculovirus insect cell expression system.

Zum Sequenzprotokoll wird auf die Offenlegungsschrift DE 100 28 725 A1 verwiesen. The sequence listing is based on the published patent application DE 100 28 725 A1 directed.

Claims (6)

Nucleotidsequenz umfassend eine Nucleotidsequenz SEQ ID NO 1, die ein HNA-2a-Antigen codiert, zur Verwendung als Diagnostikum, welches mit Alloantikörpern reagiert, die HNA-2a spezifisch sind. A nucleotide sequence comprising a nucleotide sequence of SEQ ID NO 1 encoding a HNA-2a antigen for use as a diagnostic agent which reacts with alloantibodies specific to HNA-2a. Aminosäuresequenz umfassend eine Aminosäuresequenz SEQ ID NO 2, welche mit Alloantikörpern reagiert, die HNA-2a spezifisch sind. An amino acid sequence comprising an amino acid sequence SEQ ID NO 2 which reacts with alloantibodies which are specific to HNA-2a. Verwendung einer Nucleotidsequenz SEQ ID NO 1 gemäß Anspruch 1 zur Bestimmung des HNA-2a Antigens. Use of a nucleotide sequence SEQ ID NO 1 according to claim 1 for the determination of the HNA-2a antigen. Verwendung einer Aminosäuresequenz SEQ ID NO 2 gemäß Anspruch 2 zur Identifizierung HNA-2a spezifischer Alloantikörper. Use of an amino acid sequence SEQ ID NO 2 according to claim 2 for identifying HNA-2a-specific alloantibodies. Testkit zur Bestimmung des HNA-2a Antigens, umfassend eine Nucleotidsequenz SEQ ID NO 1 gemäß Anspruch 1. A test kit for the determination of HNA-2a antigen, comprising a nucleotide sequence of SEQ ID NO 1 according to claim 1. Testkit zur Identifizierung HNA-2a spezifischer Alloantikörper, umfassend eine Aminosäuresequenz SEQ ID NO 2 gemäß Anspruch 2. Test kit for identifying HNA-2a-specific alloantibodies, comprising an amino acid sequence SEQ ID NO 2 according to claim 2.
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SKUBITZ, K.M. u.a.: Neutrophil-specific antigen NB1 is anchored via a glycosyl-phosphatidylinositol linkage. J. Leukoc. Biol. (1991) 49 (2) 163-71 *

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