DE10018745A1

DE10018745A1 - Hoch-zeitauflösende Impedanzspektroskopie

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Publication number: DE10018745A1
Application number: DE10018745A
Authority: DE
Inventors: Gerald Wiegand; Erich Sackmann
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1999-10-12
Filing date: 2000-04-15
Publication date: 2001-04-19
Also published as: DE60043738D1; KR20020060709A; ATE456044T1; KR100530689B1

Description

Verfahren und Vorrichtung zur Messung von komplexen elektrischen Widerständen (Impedanzen) und Impedanzspektren in zeitlich schneller Abfolge zum Ziele der wiederholten bzw. kontinuierlichen Charakterisierung der elektrischen Eigenschaften einer Probe.

Impedanzspektroskopie ist ein Verfahren zur Charakterisierung der elektrischen und elektrochemischen Eigenschaften der zu untersuchenden Systeme und ihrer zeitlichen Änderung. Dabei wird zwischen Arbeits- und Gegenelektrode ein Wechselspannungssignal angelegt. Gegebenenfalls wird eine gleichzeitig angelegte Biasgleichspannung mittels einer Referenzelektrode kontrolliert. Gemessen wird sowohl das angelegte Wechselspannungssignal, als auch die Stromantwort des Systems. Aus dem Quotienten des Spannungs- und Stromsignals im Frequenzraum kann der komplexe elektrische Widerstand, genannt Impedanz Z(ω), des Systems als Funktion der Frequenz, das sogenannte Impedanzspektrum,

ermittelt werden. Aus dem Verlauf der Impedanzspektren lassen sich unterschiedliche elektrische Eigenschaften des Systems oder elektrochemische Prozesse charakterisieren. Insbesondere an Systemen, bei denen das Fließen von Gleichstrom nicht möglich ist, sind Untersuchungen mittels Wechselspannungssignalen unvermeidlich. Aufgrund des hohen Informationsgehaltes der Impedanzspektroskopie, ist sie oft die bevorzugte Technik. Im Bereich der Elektrochemie wird die Impedanzspektroskopie als Standardanalysetechnik zur Untersuchung von z. B. Korrosionsprozessen, Redox- Reaktionen, flüssiger und fester Elektrolyte, dünner Polymerfilme, Membranen und Batterien benutzt. Einführung und Überblick über Technik und Anwendung der elektrochemischen Impedanzspektroskopie wird von Macdonald¹ und Gabrielli^2,3 gegeben. Desweiteren wird die Impedanzspektroskopie zur Charakterisierung von Halbleitermaterialien⁴ und in der Biotechnologie^5-7 eingesetzt. Insbesondere in der Biotechnologie hat der Einsatz der Impedanzspektroskopie stark zugenommen. Dazu werden in den meisten Fällen die Elektroden durch chemische oder physikalische Ankopplung biofunktionaler Moleküle und Aggregate (z. B. Lipid/Protein Membranen) modifiziert. Aber auch die Detektion von Adsorptionsprozessen gehört zu den Anwendungsfeldern der Impedanzspektroskopie.

Folgende zwei Formen der Impedanzspektroskopie werden unterschieden: die Messung von Impedanzspektren in der Frequenzdomäne (Methode I) und in der Zeitdomäne (Methode II).

Methode I Frequenzdomänenverfahren

Bei der ersten Form wird innerhalb eines begrenzten Zeitintervalls ein sinusförmiges Signal konstanter Frequenz und Amplitude angelegt und die komplexe Impedanz dieser diskreten Frequenz bestimmt. Um ein Spektrum zu erhalten werden nacheinander Signale verschiedener Frequenzen angelegt. Die Aufnahme der Impedanzdaten erfolgt somit sequentiell. Die Zeitauflösung, definiert als der zeitliche Abstand, in dem die ermittelten Spektren aufeinander folgen, ist bei dieser Form der Impedanzspektroskopie gering. Die Aufnahme der Datensätze, aus den sich das Spektrum zusammensetzt, dauert ein Vielfaches der Periode der geringsten im Spektrum enthaltenen Frequenz. Die genaue Zeitdauer hängt zusätzlich von der Anzahl der im Spektrum enthaltenen Frequenzen ab. Für den Wechsel der Frequenz wird eine Übergangszeit zum Equilibrieren des Systems eingeräumt. Für typische Spektren befindet sich die Zeitauflösung im Bereich von einigen Sekunden bis Stunden in Abhängigkeit des betrachteten Frequenzbandes.

Methode II Zeitdomänenverfahren

Bei der zweiten Form wird ein Wechselspannungssignal mit hohem Frequenzgehalt wie z. B. Rechteckpulse, strukturiertes oder weißes Rauschen, angelegt. Hier kann mit Hilfe der Fouriertransformation aus einem einzigen Datensatz des zeitlichen Verlaufs des Spannungs- und Stromsignals das Impedanzspektrum für die im Anregungssignal enthaltenen Frequenzen bestimmt werden. Die Zeitdauer der Messung ist mindestens solange wie eine Periode der niedrigsten im Spektrum enthaltenen Frequenz. In der Regel ist eine Meßdauer von mehreren Perioden der niedrigsten im Spektrum enthaltenen Frequenz notwendig, um das Signal/Rausch Verhältnis ausreichend zu verbessern. Die maximalen Zeitauflösung hängt hier davon ab mit welcher Wiederholungsrate die Datensätze für die Fouriertransformation aufgenommen werden. Da bei dieser Methode die Impedanz für alle Frequenzen des Spektrums gleichzeitig gemessen wird, ist die Zeitauflösung meist wesentlich besser ist, als bei der ersten Methode.

Zur Charakterisierung stationärer Systeme wird meist die Methode I angewendet. Für diese Messungen sind kommerzielle Geräte erhältlich, sogenannte "Frequency Response Analyzer" (FRA). Der Hauptanwendungsbereich der Methode II sind im Moment noch Messungen, bei denen die Impedanzspektren sehr niedrige Frequenzen enthalten (bis zu 10^-4 Hz) wie sie z. B. bei Korrosionsstudien nötig sind.

Problemstellung Impedanzspektrometer für Messungen an nicht-stationäre Systemen

Die elektrischen Eigenschaften bzw. die Impedanz von nicht-stationären Systemen, d. h. Systemen, deren Eigenschaften zeitlich nicht konstant sind, können durch die bisher bekannten Verfahren der Impedanzspektroskopie nur ungenügend vermessen werden. Der ausgeprägte zeitlichen Mittelungseffekt der bekannten Methoden, bei der Methode I über die Summe von mehreren Perioden aller im Spektrum enthaltenen Frequenzen und bei Methode II über mehrere Perioden der niedrigsten im Spektrum enthaltenen Frequenz, erlaubt keine Wiedergabe von zeitlichen Veränderungen des Systems, die schneller als diese Mittelungszeit ablaufen. Bei einem Impedanzspektrometer für Messungen an nicht-stationären Systemen muß diese Mittelungszeit weitgehend reduzieren werden. Ein einzelnes Impedanzspektrum würde dann den zeitlich lokalisierten elektrischen Zustand des Systems wiedergeben. Zusätzlich müssen in einer Sequenz von Impedanzspektren die einzelnen Spektren in zeitlich kurzer Folge bestimmt werden, um den zeitlichen Verlauf der systemcharakterisierenden Größen mit möglichst hoher Zeitauflösung ermitteln zu können.

Beispiele für nicht-stationäre Systeme, die bisher nicht mit impedanzspektroskopischen Verfahren gemessen werden konnten:

- Substratgestützte Membranen mit integrierten, schaltenden Ionenkanälen. Die Kinetik vieler biologischer Prozesse wie das Öffnen und Schließen von Ionenkanälen in substratgestützten Membranen befindet sich auf einer Zeitskala im Bereich von einigen Millisekunden. Diese Systeme haben eine hohe Relevanz in den Bereichen der Biotechnologie und Humanphysiologie.
- Metall- bzw. Halbleitergrenzflächen zu flüssigen oder festen Elektrolyten mit dynamischen Grenzflächenprozessen. In der Halbleitercharakterisierung und der Elektrochemie bleiben viele dynamische Vorgänge wie z. B. die in situ Verfolgung schneller Ätzvorgänge oder die Relaxation eines elektrochemischen Systems nach Spannungssprüngen der Untersuchung mittels Impedanzspektroskopie verschlossen, da die nötige Zeitauflösung in den geforderten Bandbreiten nicht möglich ist.

Die Problemstellung wird durch die hoch-zeitauflösende Impedanzspektroskopie gelöst. Die hoch-zeitaufgelösten Impedanzspektroskopie kann prinzipiell den Zeitdomänenverfahren (Methode II.) zugeordnet werden und basiert auf drei Schlüsselelementen. (I.) Als Anregungssignal wird ein optimiertes, vielfrequenzhaltiges Wechselspannungssignal verwendet. (II.) In der Signalverarbeitung der gemessenen Zeitsignale der Spannung U(t) und des Stroms I(t) werden nicht-stationäre Zeit- Frequenz-Transformationsalgorithmen zur Ermittelung zeitlich lokalisierter Impedanzspektren eingesetzt. (III.) Die systemcharakterisierenden Größen werden mittels der Methode der Äquivalenzschaltkreisanpassung in einer zeitauflösungsoptimierten Form aus den Impedanzspektren ermittelt.

Zu I.: Prinzipiell können alle Vielfrequenzsignale, wie z. B. die Überlagerung einer bestimmten Anzahl von Sinusschwingungen, Spannungssprünge, -pulse oder Rauschsignale verwendet werden. Je höher das Signal/Rausch Verhältnis des Anregungssignals ist, desto geringer ist die zeitliche Ausdehnung der Datenbasis, die zum Erreichen einer bestimmten Meßgenauigkeit erforderlich ist. Deswegen wird für die hoch-zeitauflösende Impedanzspektroskopie strukturiertes Rauschen als Anregungssignal verwendet. Unter strukturiertem Rauschen versteht man die Überlagerung einer begrenzten Zahl von Sinussschwingungen (Abb. 1: Zeitsignal U(t); Abb. 2: Leistungsspektrum des Spannungs- und Stromsignals U(ω) und I(ω))

wobei U_0,i die Amplitude der i-ten Sinusschwingung und ϕ_i die Phase angibt. Ein besonders gutes Signal/Rausch-Verhältnis wird erzielt, wenn das Anregungssignal U(t) auf das System und das Ziel der Messung abgestimmte bzw. optimiert wird^8,9. Hierbei sind verschiedene Optimierungsschritte für die hoch-zeitauflösende Impedanzspektroskopie unerläßlich:

- Das Frequenzband, in dem das Impedanzspektrum gemessen werden soll: Da es in der Evaluation der Impedanzspektren möglich ist, gezielt nur bestimmte Frequenz der n im Anregungssignal enthaltenen Frequenzen zur Auswertung heranzuziehen, wird das Frequenzband des Anregungssignals am maximalen spektralen Bereich, der durch die Messung abgedeckt werden soll, orientiert (siehe auch Punkt III, Frequenzauswahl in der Auswertung der Spektren und multiple Auswertung).
- Anzahl n und Frequenzlage ω_i der n Einzelfrequenzen: Die Anzahl und Frequenzlage der Einzelfrequenz kann grundsätzlich beliebig gewählt werden und ermöglicht somit dem Anwender eine maximale Anpassungsfähigkeit des hoch- zeitauflösenden Impedanzspektrometers an das untersuchte System und das Ziel der Messung. Abgesehen von speziellen Anforderungen des untersuchten Systems wird die Anzahl und Frequenzlage der Einzelfrequenzen folgendermaßen bestimmt. Die Leistung, die durch das strukturierte Rauschsignal auf die Probe übertragen wird, hängt u. a. von der Anzahl der im Rauschsignal enthaltenen Frequenzen ab. Da sich viele Systeme nur bei niedrigem Leistungseintrag linear verhalten, muß die Anzahl der Frequenzen so gering wie möglich gewählt werden. Andererseits erfordert die Wiedergabe der charakteristischen Systemantwort eine Mindestanzahl von Frequenzen im Impedanzspektrum. Da in der Impedanzspektroskopie die Impedanz meist über mehrere Größenordnungen der Frequenz bestimmt wird, ist die Zahl von fünf Einzelfrequenzen pro Frequenzdekade die geeignete Wahl, solange nicht spezielle Anforderungen des Systems eine Abweichung verlangen. Die Verteilung der Frequenzlage der Einzelfrequenzen orientiert sich an der logarithmischen Gleichverteilung der Frequenzen über das gesamte Frequenzband. Ein wichtiger Faktor dabei ist allerdings, daß die Einzelfrequenzen keine Harmonischen voneinander bilden. So kann die Verfälschung der gemessenen Impedanzspektren durch nichtlineare Systemantworten bzw. die Anregung von höheren Harmonischen vermieden werden.
- Amplitude U_0,i der Einzelfrequenzen: Die Amplitude der Einzelfrequenzen kann grundsätzlich beliebig gewählt werden. Um den linearen Bereich der Meßverstärker optimal auszunutzen und ein optimales Signal/Rausch-Verhältnis für jede im Spektrum enthaltene Frequenz zu erzielen, werden die Amplituden der Einzelfrequenzen an die Meßsituation angepaßt. Entweder werden die Amplituden der einzelnen Frequenzen im Anregungssignal so gewählt, daß der Leistungseintrag der Einzelfrequenzen im Anregungssignal konstant ist (stark nichtlineare Systeme), oder die Leistung der Stromantwort der angeregten Einzelfrequenzen konstant ist (Reduktion des Einflusses von Nichtlinearitäten des Meßverstärkers/Abb. 2), oder die Leistung der Einzelfrequenzen, sowohl im Anregungssignal als auch in der Stromantwort, möglichst geringe Unterschiede aufweist (Optimales Signal/Rausch- Verhältnis).
- Phase ϕ_i der Einzelfrequenzen: Die Phasenlage der Einzelfrequenzen kann grundsätzlich beliebig gewählt werden. Eine lineare Systemantwort ist insbesondere durch ein möglichst geringe Gesamtamplitude des Anregungssignals gewährleistet. Die Phasen der Einzelfrequenzen im strukturierten Rauschen werden so gewählt, daß bei gleichbleibenden Amplituden der Einzelfrequenzen die Gesamtamplitude des Signals minimal ist. Somit bleibt die Leistung der Einzelfrequenzen trotz reduzierter Gesamtamplitude erhalten bzw. bei fester Gesamtamplitude wird die Leistung der Einzelfrequenzen maximiert und eine Verbesserung des Signal/Rausch- Verhältnisses erzielt.

Zu II.: Kernpunkt der Lösung der genannten Problemstellung durch die hoch- zeitauflösende Impedanzspektroskopie ist die Ermittlung zeitlich lokalisierter Impedanzspektren mit reduzierter Mittelungszeit in schneller zeitlicher Abfolge. Dazu werden in der hoch-zeitauflösenden Impedanzspektroskopie nicht-stationäre Zeit- Frequenz-Transformationsalgorithmen^10-12 verwendet. Die Mittelungszeit ist gleichbedeutend mit der zeitlichen Ausdehnung der Datenbasis, die für die Ermittlung eines einzelnen Impedanzspektrums notwendig ist. Durch die Anwendung von Fensterfunktionen mit geringer zeitlicher Ausdehnung auf das Meßsignal X(t) (entweder U(t) oder I(t)) und das Wiederholen dieser Prozedur mit um kurze Zeitintervalle verschobenen Fensterfunktionen, werden Sequenzen von lokalisierten Spektren X(ω) aus den Zeitsignalen X(t) ermittelt. Die Zeitsignale, sowohl das an der Probe anliegende Wechselspannungssignal U(t), als auch die Stromantwort I(t) der Probe, wird kontinuierlich oder abschnittsweise kontinuierlich über einen beliebigen Zeitraum, lediglich begrenzt von der Speicherkapazität des verwendeten Datenträgers, aufgenommen. Zu den anwendbaren nicht-stationären Zeit-Frequenz- Transformationsverfahren gehören u. a. die gleitende Kurzzeit-Fourier-Transformation, die Wavelet Transformation und die Wigner bzw. Wigner-Ville Verteilung. Zwei dieser Methoden sollen näher beschrieben werden, (1) die gleitende Kurzzeit-Fourier- Transformation und (2) die Wavelet Transformation.

1. Gleitende Kurzzeit-Fourier-Transformation

Die Zeit-Frequenz-Transformation wird entsprechend dem Formalismus der kontinuierlichen Kurzzeit-Fourier- Transformation¹⁰

(τ, ω) = ∫x(t)g . (t - τ) . e^-iωt dt (4)

durchgeführt. Hierbei entspricht x(t) dem gemessenen Zeitsignal, g(t) ist eine Fensterfunktion, deren Charakteristik auf das Spektrum X(τ, ω), das als Ergebnis eines Transformationsschritts erhalten wird, abgestimmt ist. Mögliche Fensterfunktionen sind u. a. von Harris¹³ beschrieben. Das resultierende Impedanzspektrum Z(τ, ω) enthält man nach Gleichung (1) aus dem Quotienten der nach Gleichung (4) ermittelten Spektren des Spannungssignals U(τ, ω) und des Stromsignals I(τ, ω). Dieses Impedanzspektrum ist dem Zeitpunkt τ zugeordnet, d. h. es charakterisiert die untersuchte Probe zum Zeitpunkt τ der Messung. Somit wird die spektrale Information zum Zeitpunkt τ lokalisiert, indem nur ein Ausschnitt des gesamten Datensatzes um diesen Zeitpunkt herum für die Zeit- Frequenz-Transformation herangezogen wird. Das Impedanzspektrum liefert die komplexen Impedanz in Abhängigkeit von der Kreisfrequenz ω = 2 . π . f, wobei f die Frequenz ist. Eine Sequenz von Impedanzspektren erhält man durch die wiederholte Berechnung von Impedanzspektren nach dem beschriebenen Verfahren, wobei sich der Zeitpunkt τ um das Intervall Δτ bei jedem weiteren Spektrum verschiebt. Eine solche Sequenz von Impedanzspektren ist in Abb. 3 als Funktion der Frequenz f und der Zeit τ für ein nicht-stationäres System dargestellt. Auf diese Weise werden die gemessenen Datensätze vollständig analysiert, wenn τ vom Startzeitpunkt der Messung so oft wie innerhalb der Datensätze möglich um Δτ verschoben wird. Wird das Intervall kleiner als die zeitliche Ausdehnung der Fensterfunktion g(t) gewählt, so spricht man von gleitender Kurzzeit-Fourier-Transformation, da sich die auf die Datensätze angewendete Fensterfunktionen g(t - τ) innerhalb der Sequenz überlappen. Das Intervall Δτ, um das die Fensterfunktion zwischen jeder Transformation verschoben wird, legt die Zeitauflösung des Verfahrens fest. Um eine hohe zeitliche Auflösung zu erreichen, muß Δτ entsprechend klein gewählt werden. Gleichzeitig sollte der zeitliche Bereich über den g(t) verschieden von Null ist möglichst klein sein um die zeitliche Mittelung bei der Zeit-Frequenz-Transformation zu reduzieren. Die Fensterfunktion g(t) legt die maximale Peak-to-Peak Auflösung Δt_pp der Kurzzeit-Fourier-Transformation gegeben durch den Ausdruck

fest. Wenn die gemessenen Datensätze von U(t) und I(t) in diskreten Form vorliegen, was z. B. bei der rechnergestützten Datenakquisition der Fall ist, so ist anstatt der kontinuierlichen Kurzzeit-Fourier-Transformation der diskrete Algorithmus

anzuwenden. Hierbei stellt T_a das Abtastintervall der Datenaufnahme, n die Laufvariable für die Nummer der betrachteten Datenpunkte und N die Gesamtzahl der Datenpunkte dar. Alle anderen Größen entsprechen der Definition bei der kontinuierlichen Kurzzeit-Fourier-Transformation. Hier muß das Vorschubintervall Δτ ein ganzzahliges Vielfaches von T_a sein. Die Frequenzauflösung Δf und die Frequenzobergrenze f_max innerhalb jedes einzelnen Impedanzspektrums unterliegt dem Abtasttheorem¹⁴

wobei N_W die Anzahl der Datenpunkte ist, über die die Fensterfunktion g(nT_a) verschieden von Null ist.

2. Wavelet-Transformation

Die Zeit-Frequenz-Transformation wird entsprechend dem Formalismus der kontinuierlichen Wavelet-Transformation^11,12

durchgeführt. Anstelle der Variablen der Kreisfrequenz ω wird bei der Wavelet- Transformation üblicherweise die Skala s verwendet. Dies resultiert aus der Tatsache, daß die Impulsantworten der verwendeten Wavelet-Funktionen h_s(t) mit s skalieren wie beispielsweise bei einem Basis- oder Prototypen Wavelet der Form

Eine mögliche Form für die Fensterfunktion h(t) ist eine modulierte Fensterfunktion g(t), wie sie bei der Kurzzeit-Fourier-Transformation verwendet wird

h(t) = g(t)e^-iω₀t. (10)

ω₀ entspricht hier der Modulationsfrequenz des Basis- oder Prototypen Wavelets. Durch die Skalierung der Basisfunktionen für die Zeit-Frequenz-Transformation wird die Zeitauflösung hier nicht für das gesamte Spektrum festgelegt sondern variert mit der betrachteten Frequenz bzw. Skala. Dies hat den Vorteil, daß im Bereich von hohen Frequenzen durch Reduktion der Datenbasis die zeitliche Mittelung durch die Zeit- Frequenz-Transformation verringert wird, was einer Verstärkung der zeitlichen Lokalisierung entspricht und eine wesentlich höhere Zeitauflösung in diesem Bereich ermöglicht. Zusätzlich wird im Bereich niedriger Frequenzen die betrachtete Datenbasis so erweitert, daß auch der Beitrag dieser Frequenzen in die spektrale Information integriert werden kann. Insgesamt wird der Informationsgehalt der ermittelten Sequenz von Impedanzspektren deutlich erhöht. In Abhängigkeit von dem zur weiteren Analyse betrachteten Frequenzbandes der durch die Wavelet-Transformation gewonnenen Impedanzspektren kann so die Zeitauflösung mittels geeigneter Wahl des Vorschubintervals Δτ optimal eingestellt werden.

Im Falle von diskreten Datensätzen wird ein entsprechender Algorithmus für die diskrete Wavelet-Transformation oder die Wavelet-Reihenentwicklung verwendet.

Ein besonderer Vorteil der hoch-zeitauflösenden Impedanzspektroskopie liegt in der Verwendung von reduzierten Impedanzspektren (Kombination aus I und II). Die mittels nicht-stationärer Zeit-Frequenz-Transformation gewonnenen Impedanzspektren, z. B. bei der Kurzzeit-Fourier-Transformation bestehend aus N_W/2 + 1 beitragenden Frequenzen, werden auf die n Frequenzen reduziert, die im strukturierten Rauschen enthalten sind. Da die diskreten Algorithmen nur Impedanzwerte zu diskreten, äquidistanten Frequenzen liefern werden die Frequenzen ausgewählt, die am nächsten an den angeregten Frequenzen liegen. Mit diesem Schritt wird der gesamte Rauschhintergrund der Messung aus den Impedanzspektren entfernt. Es tragen somit nur die Frequenzen mit dem besten Signal/Rausch-Verhältnis. Dies ermöglicht wiederum die Anwendung von zeitlich gering ausgedehnten Fensterfunktionen bzw. eine geringe Mittelungszeit der lokalisierten spektralen Information.

Zu III.: Im Anschluß an die Ermittlung der reduzierten Impedanzspektren werden die Spektren durch das Anpassen geeigneter Äquivalenzschaltkreise analysiert¹, um die systemcharakterisierenden Größen und deren zeitlichen Verlauf zu bestimmen. Die Elemente, aus denen sich diese Äquivalenzschaltkreise zusammensetzen, werden aus physikalischen Modellen für die im System vorkommenden, dominanten Prozesse abgeleitet und entsprechen oft dem Verhalten idealer elektrischer Bauelemente wie Widerstände, Kapazitäten und Induktivitäten. Im Impedanzspektrum dominieren die einzelnen Elemente die Impedanzantwort des Systems in unterschiedlichen Bereichen. Bei der hoch-zeitauflösenden Impedanzspektroskopie werden entweder die gemessenen reduzierten Impedanzspektren vollständig, oder auch nur in bestimmten Bereichen der Spektren, ausgewertet. Prinzipiell kann für jede zum reduzierten Impedanzspektrum beitragende Frequenz bestimmt werden, ob sie zur Auswertung herangezogen wird oder nicht. Ein wesentlicher Vorteil ist die Möglichkeit der hoch-zeitauflösenden Impedanzspektroskopie zur multiplen Analyse eines Datensatzes mit verschiedenen Zeitauflösungen Δτ. Bei der multiplen Analyse werden zuerst Impedanzspektren mit großer Mittelungszeit und geringer Zeitauflösung ermittelt und die reduzierten Impedanzspektren vollständig ausgewertet. Die Parameter der stationären, d. h. zeitlich konstanten Prozesse werden so mit höherer Genauigkeit bestimmt. Anschließend werden bei erneuten Analysen des selben Datensatzes die Impedanzspektren mit kürzerer Mittelungszeit und hoher Zeitauflösung ermittelt. Bei der Auswertung der Spektren werden nur die Bereiche der reduzierten Spektren herangezogen, die die dynamischen, nicht-stationären Prozesse charakterisieren, wobei die Parameter für die statischen bzw. stationären Prozesse im Äquivalenzschaltkreis auf die vorher ermittelten Werte festgelegt werden.

Die komplexen Impedanzwerte können in unterschiedlichen Form angegeben und dargestellt werden. Beispielsweise kann die Impedanz in Polarkoordinaten oder komplexen Koordinaten angegeben werden

Z(ω) = Re[Z(ω)] + i . Im[Z(ω)] = Z₀(ω) . e^iϕ(ω). (11)

Ebenso kann auch die reziproke Impedanz, genannt Admittanz, oder verwandte Größen wie die komplexe frequenzabhängige Dieelektrizitätskonstante in beiden Koordinatenformen verwendet werden. Die Signifikanz einzelner Prozesse in bestimmten Frequenzbereichen der Impedanzspektren variiert mit der verwendeten Koordinatenform und variiert zwischen den unterschiedlichen elektrischen Variablen. Die hoch-zeitauflösende Impedanzspektroskopie verwendet zur Analyse die elektrische Variable und Koordinatenform, die die nicht-stationären Prozesse im höchsten Frequenzbereich signifikant wiedergibt. Je höher die Frequenzen sind, bei denen der zu untersuchende Prozesse analysiert werden kann, desto kleiner bezüglich ihrer zeitlichen Ausdehnung können die Fensterfunktionen bei der gleitenden Kurzzeit-Fourier- Transformation gewählt werden und desto kleiner kann das Vorschubintervall Art bei allen nicht-stationären Zeit-Frequenz-Transformationen gewählt werden. Ein Problem der Minimierungsalgorithmen für die Anpassung der Äquivalenzschaltkreise an die Impedanzdaten (z. B. Levenberg-Marquardt, Powell's Minimierungsmethode in Multidimensionen¹⁵) besteht darin, daß die Algorithmen oft nur lokale Minimas statt des globalen Minimums in der Anpassung finden. Um die Wahrscheinlichkeit für das Ermitteln des globalen Minimums in der Anpassung zu erhöhen, können auch verschiedene Koordinatenformen und Variablen kombiniert berücksichtigt werden. Bei der hoch-zeitauflösenden Impedanzspektroskopie werden Sequenzen von Impedanzspektren durch einen automatisierten Anpassungsprozess ausgewertet. Als Ergebnis werden die zeitlichen Verläufe der systemcharakterisierenden Größen bestimmt.

Das Verfahren ist nicht auf die elektrische Impedanz beschränkt, sondern kann gleichermaßen zur Ermittelung von mechanischen Impedanzspektren wie u. a. bei rheologischen Meßmethoden, magnetischen und optischen Pinzetten Methoden, Quarz- Resonanz-Waagen und akustischen Impedanzmessungen sowie anderen Verfahren, bei denen eine Vielfrequenzanregung eines Systems mit der Systemantwort ins Verhältnis gesetzt wird.

Ausführungs- und Anwendungsbeispiel Zielanwendung

Die Messung einzelner Ionenkanäle in substratgestützten Lipidmembranen. Die Substrate tragen hier planare Dünn-Film-Mikroelektroden die sich in Multielektrodenanordnungen (Multiplex-Messung) auf dem Substrate befinden. Die Substrate können z. B. auf Siliziumbasis mit Metall- oder Halbleiterelektroden hergestellt werden. Die Substrate werden in eine elektrochemische Zelle eingebaut, bei denen der Flüssigkeitsaustausch durch automatisiert Flüssigkeitskontroll- und - steuersysteme erfolgen kann. Ein solches Szenario entspricht der Messung an einem elektrischen Zweipol der vereinfacht durch den Schaltkreis in Abb. 4 dargestellt werden kann. Typische Werte der Komponenten können im Bereich von R₁ ~ 100 kΩ, R_2a,2b ~ 1 GΩ und C ~ 6 pF angenommen werden. Umschaltraten des Schalters können mit beispielsweise 50 Hz angenommen werden.

Der auf diese Anwendung ausgerichtete, realisierte Aufbau wurde aus verschiedenen kommerziell erhältlichen Geräten zusammengestellt und ist in Abb. 5 schematisch dargestellt. Das strukturierte Rauschen des Wechselspannungsanregungssignals wurde vom Computer berechnet und in den Speicher des Multifunktionsgenerators (Analogic® 2030 A) übertragen. Dieser erzeugt das Anregungssignal und speist es in den Patch- Clamp-Verstärker (HEKA® EPC8) ein. Bei der Verwendung von digitalen Datensätzen für das Anregungssignal müssen die Übergänge zwischen den diskreten Spannungswerten klein sein und geglättet werden. Um nur kleine Schritthöhen zwischen zwei Werten des Anregungssignals zu ermöglichen sollte die Sampling Rate, mit der der Datensatz vom Funktionsgenerator ausgegeben wird, mindestens einen Faktor zehn größer sein als die größte in den Impedanzspektren enthaltenen Frequenz. Zum Glätten der diskreten Übergänge kann das Anregungssignal Tiefpaß-gefiltert werden, wobei die Kantenfrequenz dieses Filters ebenfalls einen Faktor zehn oberhalb der größten in den Impedanzspektren enthaltenen Frequenz sein sollte. Der Patch-Clamp-Verstärker überträgt das Wechselspannungsanregungssignal über eine externe Vorverstärkereinheit auf die Probe. Diese Vorverstärkereinheit mißt gleichzeitig die tatsächlich anliegende Wechselspannung an der Probe und die Stromantwort der Probe. Das Stromsignal wird gefiltert, verstärkt und I/U-gewandelt. Somit sind beide Zeitsignale U(t) und I(t) als Spannungssignale an den entsprechenden Ausgängen des Patch-Clamp-Verstärkers abgreifbar. Beide Signale werden durch zwei Kanäle der A/D-Wandlerkarte (National Instruments Lab-NB) des Meßrechners (Apple Macintosh IIfx) eingelesen und in Datensätzen auf Datenträgern des Rechners gespeichert.

Die zum Betrieb des Aufbaus nötige Software besteht aus zwei Programmen. Das erste Programm steuert die Datenaufnahme durch den Meßrechner mit A/D-Wandlerkarte. Es besteht aus einer Anwenderprozedur der Datenanalyse-Software Igor Pro® (WaveMetrics) unter Benutzung eines Erweiterungspackets für die Datenaufnahme (NIDAQ Tools). Das zweite Programm dient der Signalverarbeitung der gemessenen Datensätze von U(t) und I(t). Es besteht aus einem selbstgeschriebenen C++-Programm für Macintosh und Windows-PC-Rechner. Implementiert wurde der gleitende Kurzzeit- Fourier-Transformationsalgorithmus basierend auf dem Cooley-Tukey FFT- Algorithmus¹⁵. Für die Anpassung der Äquivalenzschaltkreise an die Impedanzspektren wurde ein modifizierter Minimierungsalgorithmus nach der Methode von Powell in Multidimensionen¹⁵ verwendet. Für die oben spezifizierte Anwendung wurden für die Minimierung die Logarithmen des Realteils und des Imaginärteils der Impedanzspektren (komplexe Koordinaten) berücksichtigt.

Leistungsmerkmale des beschriebenen Aufbaus wurden durch Simulationen und Testmessungen quantifiziert.

Für die Simulationen wurden zu den gewählten strukturierten Rauschanregungssignalen die entsprechende Stromantwortsignale eines idealen Systems mit dem Computer berechnet und die so erzeugten Signale U(t) und I(t) mit dem Signalverarbeitungs- und Datenanalyseverfahren der hochzeitauflösenden Impedanzspektroskopie ausgewertet. In Tabelle 1 sind beispielhafte Parameter für das strukturierte Rauschsignal und die Datenverarbeitung in der Spalte Simulationen angegeben. Hier wurde gezeigt, daß ein Membranllonenkanal-System mit den charakteristischen Größen R₁ = 100 kΩ, R₂ im Bereich 0.8-20 GΩ und C = 6 pF durch die Verwendung der Logarithmen der komplexen Koordinaten im Minimierungsverfahren sogar in einem schmalen Frequenzband von 0.3-20 kHz und nur sechs Einzelfrequenzen korrekt vermessen werden kann. In Abb. 6 ist der Zeitverlauf der nicht-stationären systemcharakterisierenden Größe, des schaltbaren Parallelwiderstandes R₂ im Schaltkreis der Abb. 4 dargestellt, und zwar wie er für die Simulation angenommen (durchgezogenen Linie) und durch die hoch-zeitauflösende Impedanzspektroskopie ermittelt wurde (Kreise). In Abb. 7 ist ein Sprung in R₂ aus Abb. 6 vergrößert dargestellt, wobei hier die Ergebnisse der hoch-zeitauflösenden Impedanzspektroskopie unter Verwendung verschiedener Fensterfunktion g(t) angegeben ist. Verwendet wurden Fensterfunktionen der Charakteristik Hanning¹³ 1.0 (Cos.), Kaiser-Bessel¹³ mit α = 2.0 (KB2) und Kaiser-Bessel mit α = 3.5 (KB3). Die Analyse der Daten ergibt, daß bei der hoch-zeitauflösenden Impedanzspektroskpie idealerweise die reale nicht-stationäre Systemcharakteristik gefaltet mit der angewendeten Fensterfunktion erhalten wird. Die erzielte Zeitauflösung betrug Δτ = 0.67 ms und die Anstiegszeit τ_r je nach Fenster zwischen 2.0 und 3.1 ms.

Für die Testmessungen wurde die Schaltung in Abb. 4 mit elektronischen Komponenten zu Modellproben zusammengebaut, die das Verhalten von einzelnen Ionenkanälen in substratgestützten Lipidmembranen nachahmen. Diese Proben wurden mit der hoch- zeitauflösenden Impedanzspektroskopie vermessen.

In einer ersten Testmessung wurde ein Modell mit der Charakteristik R_2a,2b = 680 kΩ und C = 1 nF (kein zusätzliches Element für R₁) verwendet und der Schalter mit einer Frequenz von 50 Hz umgeschaltet. In Tabelle 1 sind die Parameter des strukturierten Rauschsignals und der Datenauswertung in der Spalte schnelles Modell angegeben. Die mit der hoch-zeitauflösenden Impedanzspektroskopie ermittelten Zeitverläufe von R₁, R₂ und C sind in Abb. 8 dargestellt. Abweichungen in den Absolutwerten um bis zu 20% ergeben sich aus nicht ausreichend kompensierten Filtereffekten des Aufbaus. Der stufenartige Verlauf von R₂ wird gut wiedergegeben. Die erzielte Zeitauflösung beträgt 1.1 ms und die Anstiegszeit 8 ms. In Abb. 9a und b sind exemplarisch zwei Impedanzspektren dargestellt, die zwei Punkten in den Verläufen von Abb. 8 zugrunde liegen. Hier wurden nicht alle angeregten Frequenzen des strukturierten Rauschsignals für die Auswertung herangezogen, sondern nur der eingeschränkte Bereich von 0.4-4 kHz.

In einer zweiten Testmessung wurde ein Modell mit der Charakteristik R_2a,2b = 1 GΩ und C = 3 pF (kein zusätzliches Element für R₁) verwendet und der Schalter per Hand in unregelmäßigen Abständen umgeschaltet. In Tabelle 1 sind die Parameter des strukturierten Rauschsignals und der Datenauswertung in der Spalte Gigaohm-Modell angegeben. Die mit der hoch-zeitauflösenden Impedanzspektroskopie ermittelten Zeitverläufe von R₁, R₂ und C sind in Abb. 10 dargestellt. Auch hier ergeben sich Abweichungen in den Absolutwerten um bis zu 20% aus nicht ausreichend kompensierten Filtereffekten des Aufbaus. Der stufenartige Verlauf von R₂ wird auch bei diesen hohen Impedanzen gut wiedergegeben. Die erzielte Zeitauflösung beträgt 4.4 ms. In Abb. 11a und b ist ein Impedanzspektrum dargestellt, das einem Punkt in den Verläufen von Abb. 10 zugrunde liegt. Lediglich fünf beitragende Frequenzen im Impedanzspektrum sind ausreichend, um drei unabhängige, teilweise dynamische Variablen aus den Impedanzspektren zu ermitteln. Dies zeigt den signifikant höheren Informationsgehalt einer Messung mit der hoch-zeitauflösenden Impedanzspektroskopie, selbst in einem stark eingeschränkten Frequenzband, im Vergleich zu einer Widerstandsmessung bei einer Einzelfrequenz.

Prinzip des technischen Aufbaus

Der prinzipielle Aufbau eines hoch-zeitauflösenden Impedanzspektrometers beruht auf wenigen wesentlichen Elementen wie schematisch in Abb. 12 gezeigt. Eine zentrale Prozessereinheit steuert die Signalgeneration und die Datenaufnahme an zwei Kanälen. Die Daten für das strukturierte Rauschsignal werden durch den Prozessor nach einem abgelegten Algorithmus generiert, und das Spannungssignal nach D/A-Wandlung an einem Ausgang angelegt. An einem Eingangskanal wird das gemessene Spannungssignal U(t) A/D-gewandelt und im Datenspeicher abgelegt. Am zweiten Eingangskanal wird das Stromsignal I(t) nach vorheriger Verstärkung und I/U- Wandlung ebenfalls A/D-gewandelt und in den Datenspeicher übertragen. Die gemessenen Daten des Spannungs- und Stromsignals werden mit Hilfe einer abgelegten Routine verarbeitet und analysiert und die Ergebnisse auf dem Datenträger gespeichert.

Der Einsatz der hoch-zeitauflösenden Impedanzspektroskopie nach obiger Beschreibung bietet folgende Vorteile:

- Wesentliche Verbesserung der Zeitauflösung der Impedanzspektroskopie.
- Zeitauflösung bis zu einem Bruchteil der jeweils im Impedanzspektrum betrachteten Frequenz.
- Kontinuierliche Messung mit schnellen Reaktionszeiten der Technik.
- Realisierung von Echtzeit-Messungen.
- Optimierung des Meßverfahrens durch Anpassung des Anregungssignals und der Datenverarbeitung und -analyse an das zu untersuchende System. Dabei auch wiederholte Analyse der gemessenen Datensätze jeweils angepaßt an den Auswertefokus.
- Hohe Flexibilität der Technik
- Untersuchung von bisher für impedanzspektroskopische Methoden nicht meßbaren dynamischen Prozessen wie z. B. dem Öffnen und Schließen einzelner Ionenkanäle in natürlichen oder artifiziellen, freien oder substratgestützten Membranen.
- Sehr gutes Signal/Rausch-Verhältnis

Literaturverzeichnis ¹

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Tabelle 1

Claims

1. Hoch-zeitauflösende elektrische Impedanzspektroskopie, gekennzeichnet durch die kontinuierliche oder abschnittsweise kontinuierliche Aufnahme des Wechselspannungs anregungssignals und des Stromantwort-Signals und ihre Verarbeitung mittels Methoden zur nicht-stationären Zeit-Frequenz Transformation wie beispielsweise der Kurzzeit- Fourier Transformation, der Wavelet Transformation und der Wigner Verteilung.

2. Verfahren nach Anspruch 1, gekennzeichnet durch die Verwendung von strukturiertem Rauschen als Anregungssignal.

3. Verfahren nach Anspruch 1-2, gekennzeichnet durch die Verwendung von Hochleistungs- Signalverstärkern wie beispielsweise Patch-Clamp Verstärkern.

4. Verfahren nach Anspruch 1-3, gekennzeichnet durch die Verwendung von Geräten zur Analog-Digital Wandlung der Meßsignale.

5. Verfahren nach Anspruch 1-4, gekennzeichnet durch die Verwendung von Datenverarbeitungshard- und -software zur Echtzeitanalyse der Impedanzspektren.

6. Verfahren nach Anspruch 1-5 zur Leitfähigkeitsbestimmung von natürlichen oder artifiziellen, freihängenden oder substratgestützten Lipidmembranen mit und ohne Ionenkanälen, gekennzeichnet durch die Verwendung des Frequenzbandes von 100 Hz-100 kHz und der logarithmische Analyse des Real- und Imaginärteils der Impedanz.

7. Verfahren nach Anspruch 5, gekennzeichnet durch die Verwendung von "complex-nonlinear- least-square" (CNLS) Methoden zur Parameteranpassung des Equivalenzschaltkreises an die gemessenen Impedanzspektren.

8. Verfahren zur Detektion von Verbindungen aus Lösung mit leitfähigkeitsverändernder Wirkung bezüglich Biomembranen nach Anspruch 4 und 5, gekennzeichnet durch Verwendung von Messkammern mit Temperatur- und Flüssigkeitssteuerung.

9. Verfahren nach Anspruch 7, gekennzeichnet durch die Verwendung von Multielektroden Anordnungen.

10. Verfahren nach Anspruch 7 und 8, gekennzeichnet durch die Verwendung von Multimeßkammersystemen mit paralleler oder sequentieller Datenaufnahme und -analyse.

11. Verfahren nach Anspruch 9, gekennzeichnet durch die Verwendung von automatisierten Flüssigkeitssteuerungssystemen.

12. Verfahren nach Anspruch 1-9, gekennzeichnet durch die Integartion der Analysetechnik in Produktions- und Prozessflussautomation.