DE10010616A1

DE10010616A1 - Anti-body against signal regulator proteins

Info

Publication number: DE10010616A1
Application number: DE10010616A
Authority: DE
Inventors: Hans-Joerg Buehring; Axel Ullrich; Zhengjun Chen; Charles Cant
Original assignee: Eberhard Karls Universitaet Tuebingen; Universitaetsklinikum Tuebingen
Current assignee: Eberhard Karls Universitaet Tuebingen
Priority date: 1999-11-30
Filing date: 2000-03-03
Publication date: 2001-06-13

Abstract

The invention relates to monoclonal antibodies which specifically bind to the extracellular domains of the cell surface glycoproteins SIRP and in certain cases block the interaction of SIRP with the CD47 surface molecule.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft monoklonale Antikörper, die spezifisch an die extrazelluläre Domäne der Zelloberflächenglyko proteine SIRP binden.The present invention relates to monoclonal antibodies which specifically to the extracellular domain of the cell surface glyco bind proteins SIRP.

Signal-Regulator-Proteine (im folgenden: SIRP) sind Zelloberflä chenglykoproteine, die auf myeloischen und neuronalen Zellen ex primiert werden; siehe WO 97/48723 und Kharitonenkov et al.: A family of proteins that inhibit signaling through tyrosine kinase receptors, in Nature, Band 386, März 1997, Seiten 181-186. Signal regulator proteins (hereinafter: SIRP) are cell surfaces Chenglycoproteins, which are ex. on myeloid and neuronal cells be primed; see WO 97/48723 and Kharitonenkov et al .: A family of proteins that inhibit signaling through tyrosine kinase receptors, in Nature, volume 386, March 1997, pages 181-186.

Gemäß der eingangs genannten Veröffentlichungen sind die SIRP an der negativen Regulation von Rezeptor-Tyrosin-Kinase gekoppelten Signalwegen beteiligt. Die SIRP-Familie enthält wenigstens 15 Mitglieder, die in zwei Subfamilien fallen. Alle SIRP-Proteine haben eine häufig bei Rezeptoren vorliegende Immunglobulin-artige extrazelluläre Domäne und eine transmembrane Domäne. Die beiden Subfamilien unterscheiden sich bezüglich des Vorhandenseins oder Fehlens einer zytoplasmatischen Domäne, die in der Lage ist, SH-2 Domänen zu binden. Die in der WO 97/48723 SIRP4 und in der Veröf fentlichung von Kharitonenkov et al. SIRPα genannte Subfamilie weist eine derartige zytoplasmatische Domäne auf, während die in der WO 97/48723 SIRP1 und in dem Artikel von Kharitonenkov et al. SIRPβ genannte Subfamilie diese Domäne nicht aufweist.According to the publications mentioned above, the SIRP are on the negative regulation of receptor tyrosine kinase coupled Signaling pathways involved. The SIRP family contains at least 15 Members who fall into two subfamilies. All SIRP proteins have an immunoglobulin-like type often found in receptors extracellular domain and a transmembrane domain. The two Subfamilies differ in terms of existence or Lack of a cytoplasmic domain capable of SH-2 Bind domains. The in WO 97/48723 SIRP4 and in Veröf Publication by Kharitonenkov et al. Subfamily called SIRPα has such a cytoplasmic domain, while the in WO 97/48723 SIRP1 and in the article by Kharitonenkov et al. SIRPβ called subfamily does not have this domain.

Die zelluläre Signalübertragung ist ein fundamentaler Mechanis mus, durch den externe Stimulationen, die verschiedene zelluläre Prozesse regeln, in das Innere von Zellen übertragen werden. Ein zentraler biochemischer Mechanismus der Signalübertragung bein haltet die reversible Phosphorylierung von Proteinen, wodurch die Aktivität von reifen Proteinen dadurch reguliert wird, daß deren Struktur und Funktion verändert wird. An diesem Prozeß sind ei nerseits Proteinphosphatasen beteiligt, die durch Hydrolyse Phos phorylgruppen von Substratproteinen abspalten, die andererseits durch Protein-Kinasen auf die Substratproteine übertragen werden. Die gegenläufigen Funktionen von Protein-Kinasen und Proteinphos photasen regulieren den Signalfluß in den Signal übertragungsprozessen.Cellular signal transmission is a fundamental mechanism mus, through the external stimulations, the various cellular Regulate processes that are transferred to the interior of cells. On central biochemical mechanism of signal transmission stops the reversible phosphorylation of proteins, causing the Activity of mature proteins is regulated by their Structure and function is changed. There are egg in this process on the other hand, protein phosphatases involved, which are obtained by hydrolysis Phos cleave phoryl groups from substrate proteins, on the other hand are transferred to the substrate proteins by protein kinases. The opposite functions of protein kinases and protein phos photases regulate the signal flow in the signal transmission processes.

Eine Gruppe der an der reversiblen Phosphorylierung beteiligten Kinasen sind die Protein-Tyrosinkinasen vom Rezeptor-Typ. A group of those involved in reversible phosphorylation Kinases are the receptor-type protein tyrosine kinases.

Tyrosin-Phosphatasen können die katalytische Aktivität von Prote in-Kinasen herunterregeln, die in die Zellproliferation invol viert sind und deshalb für mögliche Antitumorproteine gehalten werden. Darüber hinaus geht man davon aus, daß Proteinphosphata sen auch in zelluläre Differenzierungsprozesse involviert sind. Das am besten charakterisierte Mitglied der humanen SIRP-Familie, SIRPα (oder auch SIRP4) ist ein Substrat von aktivierten Rezep tor-Tyrosin-Kinasen. Eine Überexpression von SIRPα führt zu einer reduzierten Reaktion auf die Rezeptor-Tyrosin-Kinase Liganden EGF (epidermal growth factor), Insulin und PDGF (platelet-derived growth factor).Tyrosine phosphatases can reduce the catalytic activity of Prote down-regulate in-kinases that are involved in cell proliferation fourth and are therefore thought to be possible anti-tumor proteins become. In addition, it is believed that protein phosphates are also involved in cellular differentiation processes. The best characterized member of the human SIRP family, SIRPα (or SIRP4) is a substrate of activated recipes tor tyrosine kinases. Overexpression of SIRPα leads to reduced response to the receptor tyrosine kinase ligand EGF (epidermal growth factor), insulin and PDGF (platelet-derived growth factor).

Aus den beiden eingangs erwähnten Druckschriften ergibt sich so mit, daß SIRP als negativer Regulator in der Proliferation und Differenzierung von Zellen wirkt, so daß Antikörper gegen SIRP nicht nur zur Untersuchung der Expression und Funktion von SIRP sondern auch in therapeutischen und diagnostischen Anwendungen im Zusammenhang mit Krankheiten oder Beeinträchtigungen eine Rolle spielen können, bei denen eine Unregelmäßigkeit in einem Si gnalübertragungsweg vorliegt.From the two publications mentioned at the beginning, it follows that with that SIRP as a negative regulator in proliferation and Differentiation of cells works so that antibodies against SIRP not only to study the expression and function of SIRP but also in therapeutic and diagnostic applications in Related to illness or impairment can play in which an irregularity in a Si signal transmission path is present.

In der WO 97/48723 wird in diesem Zusammenhang allgemein ein Ver fahren beschrieben, um monoklonale Antikörper gegen SIRP- Polypeptide zu erzeugen, wobei ferner die therapeuti sche/diagnostische Anwendung derartiger Antikörper insbesondere im Zusammenhang mit immunologischen Testverfahren erwähnt wird. Monoklonale Antikörper selbst werden in dieser Druckschrift je doch nicht vorgestellt, insbesondere nicht auf eine Hinterlegung nach dem Budapester Vertrag verwiesen. In this connection, WO 97/48723 generally describes a ver drive to raise monoclonal antibodies against SIRP To produce polypeptides, the therapeutic cal / diagnostic application of such antibodies in particular is mentioned in connection with immunological test methods. Monoclonal antibodies themselves are described in this publication not presented, especially not on a deposit referred to under the Budapest Treaty.

Vor diesem Hintergrund liegt der vorliegenden Anmeldung die Auf gabe zugrunde, monoklonale Antikörper der eingangs erwähnten Art zu schaffen, die spezifisch an die extrazelluläre Domäne der Zelloberflächenglykoproteine SIRP binden.Against this background, the present application lies on based on monoclonal antibodies of the type mentioned to create the specific to the extracellular domain of the Binding cell surface glycoproteins SIRP.

Vorzugsweise werden derartige monoklonale Antikörper produziert von Hybridomzellen, die ausgewählt sind aus der Gruppe der fol genden, am 30.11.1999, 25.11.1999 bzw. 13.01.2000 bei der Deut schen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, DSMZ, nach dem Budapester Vertrag hinterlegten Hybridomzellen SE5A5, SE7C2, SE12B6, P3C4 (alle 30.11.1999), B1D5 (25.11.1999) und B4B6 (13.01.2000).Such monoclonal antibodies are preferably produced of hybridoma cells selected from the group of fol on November 30, 1999, November 25, 1999 and January 13, 2000 at Deut collection of microorganisms and cell cultures GmbH, DSMZ, hybridoma cells deposited under the Budapest Treaty SE5A5, SE7C2, SE12B6, P3C4 (all November 30th, 1999), B1D5 (November 25th, 1999) and B4B6 (01/13/2000).

Ferner betrifft die Erfindung Hybridomzellen, die die Fähigkeit aufweisen, einen derartigen Antikörper zu produzieren und freizu setzen.The invention further relates to hybridoma cells which have the ability have to produce and release such an antibody put.

Die Erfinder der vorliegenden Anmeldung haben mit den genannten Antikörpern SE5A5, SE7C2, SE12B6, P3C4, B1D5 und B4B6 erstmals monoklonale Antikörper sowie diese produzierende und freisetzende Hybridomzellen bereitgestellt, die eine gezielte Erkennung und Beeinflussung von Zellen ermöglichen, die die extrazelluläre Do mäne von SIRP aufweisen. Die Antikörper stellen damit ein bisher einzigartiges und vielseitig einsetzbares Mittel für den Arzt und Forscher bereit, um einerseits derartige Zellen nachzuweisen, und zwar sowohl in Zellkultur als auch im Patientenorganismus, und um andererseits diese Zellen ggf. zu manipulieren, entweder durch den Antikörper selbst oder durch daran gekoppelte spezifische Reagenzien. The inventors of the present application have with the mentioned Antibodies SE5A5, SE7C2, SE12B6, P3C4, B1D5 and B4B6 for the first time monoclonal antibodies as well as those producing and releasing them Hybridoma cells provided targeted detection and Influencing cells that allow the extracellular Do have SIRP. The antibodies have so far stopped unique and versatile agent for the doctor and Researchers ready to detect such cells on the one hand, and both in cell culture and in the patient organism, and around on the other hand, manipulate these cells if necessary, either by the antibody itself or through specific coupled to it Reagents.

Die Erfinder der vorliegenden Anmeldung haben dabei festgestellt, daß die Antikörper SE5A5, SE7C2, SE12B6, und P3C4 sowohl an Poly peptide der Subfamilie SIRPα als auch SIRPβ binden, während die Antikörper B1D5 und B4B6 nur spezifisch an SIRPβ binden.The inventors of the present application have found that the antibodies SE5A5, SE7C2, SE12B6, and P3C4 both on poly SIRPα and SIRPβ peptides bind while the Only bind antibodies B1D5 and B4B6 specifically to SIRPβ.

Vor diesem Hintergrund betrifft die Erfindung auch einen monoklo nalen Antikörper, der spezifisch nur an die extrazelluläre Domäne von SIRPβ bindet.Against this background, the invention also relates to a monoclo nalen antibody that is specific only to the extracellular domain binds from SIRPβ.

Mit diesen Antikörpern, insbesondere mit dem B1D5 und dem B4B6 lassen sich damit spezifisch Funktion und Expression von SIRPβ untersuchen.With these antibodies, especially with the B1D5 and B4B6 function and expression of SIRPβ examine.

Die Erfinder haben ferner festgestellt, daß die Antikörper SE5A5, SE7C2 und SE12B6 die Interaktion von SIRPα mit dem Oberflächen- Marker CD47 blockieren.The inventors also found that the antibodies SE5A5, SE7C2 and SE12B6 the interaction of SIRPα with the surface Block marker CD47.

Vor diesem Hintergrund betrifft die Erfindung ferner einen mono klonalen Antikörper, der spezifisch an die extrazelluläre Domäne von SIRPα bindet und die Interaktion von SIRPα mit dem Oberflä chen-Marker CD47 blockiert.Against this background, the invention further relates to a mono clonal antibody specific to the extracellular domain of SIRPα binds and the interaction of SIRPα with the surface Chen marker CD47 blocked.

Die Erfinder konnten zeigen, daß CD47 der extrazelluläre Ligand für humanes SIRP ist und daß diese beiden gegenseitigen Rezepto ren an zellulärer Adhäsion beteiligt sind, die durch die monoklo nalen Antikörper SE5A5, SE7C2 und SE12B6 blockiert werden kann. Damit sind diese Antikörper hervorragend zu diagnostischen und therapeutischen Zwecken geeignet, wobei sich durch die unter schiedlichen Eigenschaften der insoweit beschriebenen Antikörper, die teils blockierend, teils nicht-blockierend, teils SIRPα- und SIRPβ-spezifisch, teils nur SIRPβ-spezifisch sind, die verschie densten Untersuchungen sowie therapeutischen Effekte erzielen lassen.The inventors were able to show that CD47 is the extracellular ligand for human SIRP and that these two are mutual receptors ren are involved in cellular adhesion caused by the monoclo nalen antibodies SE5A5, SE7C2 and SE12B6 can be blocked. This makes these antibodies excellent for diagnosis and suitable for therapeutic purposes, whereby the under different properties of the antibodies described so far, partly blocking, partly non-blocking, partly SIRPα- and SIRPβ-specific, sometimes only SIRPβ-specific, which differ most research and therapeutic effects to let.

Vor diesem Hintergrund betrifft die Erfindung ferner ein pharma zeutisches Mittel mit einem der neuen Antikörper, der vorzugswei se an ein zellulär gerichtetes Therapeutikum bzw. Diagnostikum gekoppelt ist.Against this background, the invention further relates to a pharmaceutical Teutonic agent with one of the new antibodies, the preferred se to a cellularly directed therapeutic or diagnostic is coupled.

Ein erfindungsgemäßer Antikörper, der mit einem Nachweismittel, bspw. einem radioaktiven Marker, gekoppelt ist, bindet dieses Nachweismittel indirekt an die entsprechenden Zellen und ermög licht damit den direkten Nachweis dieser Zellen, bspw. mit rönt gendiagnostischen/szintigraphischen Methoden. In entsprechender Weise kann durch die Kopplung mit einem therapeutisch wirksamen Mittel auch eine direkte und gezielte Beeinflussung SIRP tragen der Zellen ermöglicht werden.An antibody according to the invention, which with a detection agent, For example, a radioactive marker that is coupled binds it Detection means indirectly to the corresponding cells and enables thus illuminates the direct detection of these cells, e.g. with X-rays genetic diagnostic / scintigraphic methods. In corresponding Way, by coupling with a therapeutically effective Means also carry a direct and targeted influence on SIRP of the cells are made possible.

Im Rahmen der vorliegenden Erfindung wurde ferner überraschender weise gefunden, daß SIRP nicht nur an der Funktion von mye loischen Zellen beteiligt ist, sondern ebenfalls auf hämatopoeti schen Stammzellen und mesenchymalen Zellen exprimiert ist. Mit den erfindungsgemäßen Antikörpern wurde ferner festgestellt, daß die SIRP-Expression auf myeloischen Zellen von verschiedenen Leu kämien signifikant reduziert ist, so daß die erfindungsgemäßen Antikörper zur Isolierung von Stammzellen verwendet werden kön nen, was insbesondere im Zusammenhang mit einer Stammzelltrans plantation bei der Behandlung von Leukämien von großem Interesse ist. In the context of the present invention, it also became more surprising we have found that SIRP is not only a function of mye loischen cells is involved, but also on hematopoeti stem cells and mesenchymal cells is expressed. With the antibodies of the invention have also been found that SIRP expression on myeloid cells from different Leu Kämien is significantly reduced, so that the invention Antibodies can be used to isolate stem cells nen, which in particular in connection with a stem cell trans plantation of great interest in the treatment of leukemia is.

Vor diesem Hintergrund betrifft die vorliegende Erfindung ferner die Verwendung eines erfindungsgemäßen Antikörpers zur Isolation von hämatopoetischen Stammzellen.Against this background, the present invention further relates the use of an antibody according to the invention for isolation of hematopoietic stem cells.

Weitere Vorteile ergeben sich aus der nachstehenden Beschreibung.Further advantages result from the description below.

Es versteht sich, daß die vorstehend genannten und die nach stehend noch zu erläuternden Merkmale nicht nur in den jeweils angegebenen Kombinationen, sondern auch in anderen Kombinationen oder in Alleinstellung verwendbar sind, ohne den Rahmen der vor liegenden Erfindung zu verlassen.It is understood that the above and the following standing features to be explained not only in each specified combinations, but also in other combinations or can be used alone, without the scope of the to leave lying invention.

Die Erfindung wird im folgenden anhand von Anwendungs- und Aus führungsbeispielen näher erläutert.The invention is based on application and Aus management examples explained in more detail.

example 1 Production and characterization of monoclona len antibodies against the cell surface glyco protein SIRP

Als Antigen werden rekombinante Fusionsproteine verwendet, die die gesamte extrazelluläre Domäne von SIRPα1 (SIRPα1ex) bzw. SIRPβ1 (SIRPβ1ex) enthalten. Die Sequenz der verwendeten, extra zellulären Domänen ist in den beiden eingangs erwähnten Veröf fentlichungen wiedergegeben.Recombinant fusion proteins are used as the antigen the entire extracellular domain of SIRPα1 (SIRPα1ex) or SIRPβ1 (SIRPβ1ex) included. The sequence of used, extra cellular domains is in the two publications mentioned at the beginning publications reproduced.

Vier bis acht Wochen alte weibliche Balb/c-Mäuse werden dreimal in Intervallen von 14 Tagen mit 15 µg Protein immunisiert, das 1 : 2 in RIBI Adjuvans (PanSystems, Aidenbach, Deutschland) ver dünnt war. Vier Tage nach der letzten Injektion wurde die Milz entfernt und mit Myelomzellen des bekannten Stammes SP2/0 fusio niert. Die fusionierten Zellen wurden kultiviert, die Auswahl der spezifischen Antikörper wurde dann auf einer mit SIRPα1 bzw. SIRPβ1 transfizierten Zellinie vorgenommen.Four to eight week old female Balb / c mice are given three times immunized with 15 µg protein at 14 day intervals 1: 2 in RIBI Adjuvans (PanSystems, Aidenbach, Germany) ver was thin. Four days after the last injection, the spleen was removed removed and with myeloma cells of the known strain SP2 / 0 fusio kidney. The fused cells were cultured, the selection of specific antibody was then on a SIRPα1 or SIRPβ1 transfected cell line.

Die Produktion, Reinigung und Charakterisierung der Antikörper erfolgte mit den in Fachkreisen allgemein bekannten Methoden.The production, purification and characterization of the antibodies was carried out using the methods generally known in specialist circles.

Die Reaktivitäten und Eigenschaften der verschiedenen, so herge stellten SIRP-Antikörper ergeben sich aus der beigefügten Tabelle und den folgenden Beispielen. The reactivities and properties of the different, so forth SIRP antibodies are shown in the attached table and the following examples.

Die monoklonalen Antikörper B1D5 und B4B6 sind spezifisch für SIRPβ1. Alle SIRPα1-spezifischen monoklonalen Antikörper reagie ren auch mit SIRPβ1, so daß die Antikörper SE5A5, SE7C2, SE12B6 und P3C4 als spezifisch für SIRP angesehen werden können, da an dere Mitglieder der SIRP-Familie sehr ähnliche extrazelluläre Do mänen aufweisen.The monoclonal antibodies B1D5 and B4B6 are specific for SIRPβ1. All SIRPα1-specific monoclonal antibodies reacted ren also with SIRPβ1, so that the antibodies SE5A5, SE7C2, SE12B6 and P3C4 can be considered specific for SIRP because of their members of the SIRP family have very similar extracellular do have men.

Example 2 Expression of SIRP on bone marrow cells or peripheral blood cells

Der monoklonale Antikörper P3C4 wurde verwendet, um die Oberflä chenexpression von SIRP auf mononukleären Knochenmarkzellen und peripheren Blutzellen zu untersuchen. Mittels Immunfluoreszenz konnte nachgewiesen werden, daß auf Monozyten die stärkste Ex pression vorliegt, auf Granulozyten eine mittlere Expression und nahezu keine Expression auf Lymphozyten vorhanden ist. CD83⁺ den dritische Zellen waren ebenfalls stark positiv bezüglich SIRP.The monoclonal antibody P3C4 was used to examine the surface expression of SIRP on mononuclear bone marrow cells and peripheral blood cells. Using immunofluorescence, it was possible to demonstrate that the greatest expression is present on monocytes, that there is medium expression on granulocytes and almost no expression on lymphocytes. CD83 ⁺ third cells were also strongly positive for SIRP.

Eine Untersuchung der Koexpression von CD-Antigenen und SIRP auf verschiedenen Knochenmarkzellen zeigte die stärkste Expression von SIRP auf C33⁺ und CD34⁺ myeloischen/monozytischen Vorläufer zellen. Darüber hinaus wird SIRP auch auf CD19⁺ B Lymphoiden so wie auf unreifen CD117⁺ und AC133⁺ Vorläuferzellen exprimiert. Im Gegensatz dazu wurde keine SIRP-Expression auf CD3⁺ T-Zellen, CD56⁺ natürlichen Killerzellen oder Glykophorin A⁺ erythroiden Vorläufer-Zellen gefunden.Examination of the coexpression of CD antigens and SIRP on different bone marrow cells showed the highest expression of SIRP on C33 ⁺ and CD34 ⁺ myeloid / monocytic precursor cells. In addition, SIRP is also expressed on CD19 ⁺ B lymphoids as well as on immature CD117 ⁺ and AC133 ⁺ progenitor cells. In contrast, no SIRP expression was found on CD3 ⁺ T cells, CD56 ⁺ natural killer cells or glycophorin A ⁺ erythroid progenitor cells.

Hieraus folgt, daß die SIRP-Expression im Knochenmark hauptsäch lich auf myeloischen und CD34⁺ Stammzellen und Vorläuferzellen gefunden wird. It follows that SIRP expression in the bone marrow is mainly found on myeloid and CD34 ⁺ stem cells and progenitor cells.

Um die SIRP⁺ Subsets weiter zu analysieren, wurden CD34⁺ Knochen markzellen durch MACS gereinigt und mit Antikörpern gegen CD34, SIRP und ausgewählte CD-Marker gefärbt. Es ergab sich, daß SIRP auf CD34⁺CD90⁺, CD34⁺CD117⁺ und CD34⁺CD164^brigt-Stammzellen und mye loischen Subsets aber nicht auf CD34⁺CD19⁺ B-Zellsubsets oder CD34⁺CD71^brigt erythroiden Vorläuferzellen exprimiert wird, was darauf hindeutet, daß SIRP eine Rolle bei der Regulation von Stammzell-Wachstum und -differenzierung spielt.In order to further analyze the SIRP ⁺ subsets, CD34 ⁺ bone marrow cells were cleaned by MACS and stained with antibodies against CD34, SIRP and selected CD markers. It was found that SIRP is expressed on CD34 ⁺ CD90 ⁺ , CD34 ⁺ CD117 ⁺ and CD34 ⁺ CD164 -brigant ^stem cells and mye subsets but not on CD34 ⁺ CD19 ⁺ B-cell subsets or CD34 ⁺ CD71 ^brigt erythroid progenitor cells, which indicates that SIRP plays a role in regulating stem cell growth and differentiation.

Die obigen Ergebnisse lassen sich dahingehend interpretieren, daß SIRP nicht nur an der Funktion von myeloischen Zellen beteiligt ist, sondern auch eine wichtige Rolle in der Regulation der Stammzellendifferenzierung spielt.The above results can be interpreted to mean that SIRP is not only involved in the function of myeloid cells is, but also an important role in the regulation of Stem cell differentiation plays.

Example 3 Expression of SIRP on AML and CML blasts

Der Antikörper P3C4 wurde ebenfalls eingesetzt, um mittels Immun fluoreszenz die Expression von SIRP auf Blasten der aktuten mye loischen Leukämie (AML) sowie der chronisch-myeloischen Leukämie (CML) zu überprüfen. Es wurde festgestellt, daß im Gegensatz zu normalen myeloischen Zellen alle vier analysierten myeloischen CML-Blastenpopulationen und 26 von 59 getesteten AML-Blasten populationen SIRW waren, während 15 von 59 der AML-Blasten SIRP zu geringem Maß exprimierten und nur 18 der 59 Blasten SIRP im selben Ausmaß exprimierten wie normale myeloische oder monozyti sche Zellen im Knochenmark. Alle unreifen leukämischen Blasten vom M0 oder M1 FAB-Typ waren SIRW oder exprimierten SIRP in ge ringem Umfang.The antibody P3C4 was also used to immunize fluorescence shows the expression of SIRP on blasts of the acute mye local leukemia (AML) and chronic myeloid leukemia (CML) review. It was found that contrary to normal myeloid cells all four analyzed myeloid cells CML blast populations and 26 out of 59 AML blasts tested SIRW populations were SIRP, while 15 out of 59 of the AML blasts expressed too little and only 18 of the 59 blasts SIRP in expressed to the same extent as normal myeloid or monozyti cells in the bone marrow. All immature leukemic blasts of the M0 or M1 FAB type were SIRW or expressed SIRP in ge ring size.

Diese Ergebnisse belegen, daß die SIRP-Expression auf vielen leu kämischen Blasten herunterreguliert ist. These results demonstrate that SIRP expression on many leu comic blasts is down-regulated.

Aufgrund der obigen Ergebnisse ist es möglich, daß die reduzierte SIRP-Expression in den meisten leukämischen Blasten entweder die Ursache oder eine Folge von fehlerhafter Proliferation dieser Zellen ist.Based on the above results, it is possible that the reduced SIRP expression in most leukemic blasts is either that Cause or a consequence of incorrect proliferation of this Cells is.

Example 4 Interaction of SIRP with its extracellular Ligands

Um die mögliche Interaktion von SIRP mit zellulären Komponenten auf normalen und malignen hämatopoetischen Zellen zu untersuchen, wurden Zellbindungstests mit immobilisierten Fusionsproteinen von SIRPα1ex, SIRPα2ex und SIRPβ1ex durchgeführt. Alle getesteten myeloblastischen, monoblastischen, erythroblastischen, mega karyoblastischen, B- und T-lymphoblastischen Zellinien banden stark an SIRPα1ex und SIRPα2ex, nicht aber an SIRPβ1ex, wobei durch Verdünnungsreihen gezeigt wurde, daß B- und T- lymphoblastische Zellinien eine größere Anzahl von Bindungsstel len für SIRP aufweisen.To the possible interaction of SIRP with cellular components to investigate normal and malignant hematopoietic cells were cell binding tests with immobilized fusion proteins from SIRPα1ex, SIRPα2ex and SIRPβ1ex performed. All tested myeloblastic, monoblastic, erythroblastic, mega bound karyoblastic, B- and T-lymphoblastic cell lines strong on SIRPα1ex and SIRPα2ex, but not on SIRPβ1ex, whereby was shown by dilution series that B- and T- lymphoblastic cell lines have a larger number of binding sites len for SIRP.

Ferner konnte gezeigt werden, daß die Zellbindung an SIRPα1ex und SIRPα2ex durch einige der erfindungsgemäßen monoklonalen Antikör per inhibiert wird, wie die Tabelle aus Beispiel 1 zeigt.It was also shown that cell binding to SIRPα1ex and SIRPα2ex by some of the monoclonal antibodies according to the invention is inhibited by, as the table from Example 1 shows.

Weitere Untersuchungen der Expression von möglichen SIRP-Liganden zeigten eine starke Bindung von löslichen SIRPα1ex und SIRPα2ex an Lymphozyten, während die Bindung an Monozyten und Granulozyten wesentlich schwächer war.Further studies on the expression of possible SIRP ligands showed strong binding of soluble SIRPα1ex and SIRPα2ex to lymphocytes, while binding to monocytes and granulocytes was much weaker.

Um den extrazellulären Liganden für SIRPα1 und SIRPα2 auf hämato poetischen Zellen zu identifizieren, wurden die SIRP-negativen aber stark SIRPα1ex- und SIRPα2ex-bindenden Zellen CCRF-CEM ver wendet, um monoklonale Antikörper zu erzeugen, die die Bindung von SIRPα1ex und SIRPα2ex an diese Zellen inhibieren. Der gefun dene Antikörper CC2C6 blockierte diese Bindung vollständig.To the extracellular ligand for SIRPα1 and SIRPα2 on hematoma To identify poetic cells, the SIRP were negative but strongly SIRPα1ex and SIRPα2ex-binding cells CCRF-CEM ver uses to generate monoclonal antibodies that bind inhibit SIRPα1ex and SIRPα2ex on these cells. The found The antibody CC2C6 completely blocked this binding.

Die zelluläre Reaktivität dieses Antikörpers wurde mit 166 ver schiedenen Antikörpern gegen CD-Moleküle verglichen, wobei sich herausstellte, daß CC2C6 CD47 als extrazellulären Liganden für SIRPα1 und SIRPα2 erkennt.The cellular reactivity of this antibody was verified at 166 ver different antibodies against CD molecules compared, where found that CC2C6 CD47 as an extracellular ligand for SIRPα1 and SIRPα2 recognizes.

Ferner wurde gefunden, daß nur funktionell aktive, CD47- spezifische monoklonale Antikörper die Interaktion zwischen CD47 und SIRP vollständig blockieren können, während nicht-funktionale monoklonale Antikörper keinen Effekt auf diese Interaktion haben. Das deutet darauf hin, daß die Bindung von SIRP an CD47 essenti ell für viele für CD47 beschriebene Funktionen ist. Vor diesem Hintergrund sind sowohl die blockierenden als auch die nicht- blockierenden erfindungsgemäßen Antikörper wertvolle Werkzeuge, um die Beteiligung von SIRP an verschiedenen immunologischen Pro zessen in vitro zu untersuchen.Furthermore, it was found that only functionally active CD47 specific monoclonal antibodies interacting between CD47 and can block SIRP completely while non-functional monoclonal antibodies have no effect on this interaction. This indicates that the binding of SIRP to CD47 is essential ell for many functions described for CD47. Before this The background is both the blocking and the non- blocking antibodies according to the invention are valuable tools, the involvement of SIRP in various immunological pro to investigate processes in vitro.

Claims

1. Monoclonal antibody specific to the extracellu Lär domain of the cell surface glycoproteins SIRP binds.

2. Monoclonal antibody according to claim 1, characterized records that it specifically only addresses the extracellular Do binding of SIRPβ.

3. Monoclonal antibody according to claim 1 or 2, characterized characterized by the interaction of SIRP with the Blocked surface marker CD47.

4. Antibody according to one of claims 1 to 3, characterized ge indicates that it is produced by hybridoma cells, which are selected from the group of the following, on November 30, 1999, November 25, 1999 and January 13, 2000 for the Germans Collection for microorganisms and cell cultures GmbH, DSMZ, hybridoma cells deposited under the Budapest Treaty SE5A5, SE7C2, SE12B6, P3C4 (all November 30th, 1999), B1D5 (25.11.1999) and B4B6 (13.01.2000).

5. Hybridoma cell, characterized in that it is capable keit, an antibody according to any one of claims 1 to produce and release up to 4.

6. Pharmaceutical agent with an antibody after a of claims 1 to 4.

7. Pharmaceutical composition according to claim 6, characterized records that the antibody is directed to a cellular Therapeutic agent is coupled.

8. Pharmaceutical composition according to claim 6, characterized records that the antibody is directed to a cellular Diagnostic device is coupled.

9. Use of an antibody according to one of claims 1 to 4 for the isolation of hematopoietic stem cells.

10. Use of an antibody according to one of claims 1 to 4 for the detection of SIRP-expressing cells.