EP1483293A2 - Use of an active substance that binds to cd28 for producing a pharmaceutical composition - Google Patents

Use of an active substance that binds to cd28 for producing a pharmaceutical composition

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EP1483293A2
EP1483293A2 EP03717153A EP03717153A EP1483293A2 EP 1483293 A2 EP1483293 A2 EP 1483293A2 EP 03717153 A EP03717153 A EP 03717153A EP 03717153 A EP03717153 A EP 03717153A EP 1483293 A2 EP1483293 A2 EP 1483293A2
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EP
European Patent Office
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cells
mab
superagonistic
specific
regulatory
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EP03717153A
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German (de)
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Thomas Huenig
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TheraMAB LLC
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TeGenero AG
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Publication date
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    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
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    • C07K16/2818—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily against CD28 or CD152
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    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL

Definitions

  • Tumor cell have arisen.
  • the C'-D loop of CD28 comprises amino acids 52 to 66 of the above CD28 sequence (for numbering see also Ostrov, D.A., et al.; Science (2000), 290: 816-819).
  • the term “C'-D loop” should also be understood to mean any partial sequences from this.
  • a loop or a binding site arranged in it is freely accessible if none for a defined binding partner for the binding site in the loop steric hindrance due to sequences or molecules connected to the loop.
  • Regulatory T cells are CD4 + T cells which, when mixed with naive CD4 + T cells, inhibit their activation. These include in particular CD4 + CD25 + T cells. Another feature of regulatory T cells is a low expression of the high molecular isoforms of CD45 (human: RA) compared to other T cells. The constitutive expression of CD152 is typical for regulatory T cells.
  • CD4 + CD8-SP thymocytes are one of the major sources of regulatory T cells.
  • Homology denotes an at least 70%, preferably at least 80%, most preferably at least 90% sequence identity at the protein level, a homologous protein or peptide binding a defined binding partner with at least the same affinity. Sequence variations can include deletions, substitutions, insertions, and elongations.
  • a facial expression compound is a natural or synthetic chemical structure that behaves like a defined mAb in a defined binding assay, which the facial expression compound mimicizes.
  • the term mAb also includes structures which consist exclusively of the Fab fragment. It is also possible to use only the variable region, the heavy chain fragment being connected to the light chain fragment in a suitable manner, for example also by means of synthetic bridge molecules, in such a way that the binding regions of the chains form the antibody epitope.
  • the term antibody also includes (possibly complete) chimeric and humanized antibodies.
  • Superagonistic stimulation of the proliferation of CD 28 specific T cells means that no costimulation, i.e. no other binding event besides binding a mAb or a mimicriver connection to CD28 is required to stimulate or inhibit proliferation.
  • the activation of resting T cells for proliferation and functional differentiation first requires the occupation of two surface structures, so-called receptors: 1. the antigen receptor, which has a different specificity from cell to cell and for recognition of antigens, for example viral fission products, is necessary; and 2. the CD28 molecule which is equally expressed on all resting T cells, with the exception of a subset of the CD8 T cells of humans, which naturally binds to ligands on the surface of other cells of the immune system.
  • TH1 and TH2 cells are CD4-expressing T cells.
  • TH1 cells are also called pro-inflammatory T-helper cells
  • TH2 cells "support. The. Activation of B cells and. Secrete the cytokines IL-4, IL-5 and IL-10. The differentiation. From CD4 T cells to the above • functionally different subgroups is not only achieved by
  • CD28 deficient mice show normal TH1 but reduced TH2 dependent responses and the cytokine profile of TCR-transgenic CD4 cells is determined by CD28 ligation
  • T cells are important in autoimmune reactions. For example, in experimental animal models of multiple sclerosis, type I diabetes and inflammatory bowel diseases the ability of these cells
  • GBS Guillain-Barre syndrome
  • CDP chronic demyelinating polyneuropathy
  • CDP 10-20 per 100,000 people.
  • the invention teaches the use of a CD28-specific superagonistic monoclonal antibody (mAb) or one
  • Facial expression compound for this purpose, for the production of a pharmaceutical composition for induction and / or proliferation of regulatory T cells.
  • the invention is based on the knowledge that the active substances used according to the invention appear to be a very good means of treating Guillian-Barre syndrome and / or chronically demyelinating polyneuropathy and other autoimmune-related ones
  • the invention therefore further teaches the use according to the invention for the treatment of these diseases.
  • mAb can be a mAb, which is available with hybridoma cells as deposited under the DSM numbers DSM ACC2531 (mAb: 9D7 or 9D7G3H11) or DSM ACC2530 (mAb: 5th ILA or 5.11A1C2H3).
  • the mAb can be one or more of the sequences SEQ ID 9, 11, 13 and / or
  • SEQ ID 13 shows the nucleic acid sequence of the variable region of the heavy chain of a mAb 5.11A according to the invention.
  • SEQ ID 14 shows the peptide encoded thereby.
  • SEQ ID 15 shows the nucleic acid sequence of the variable region of the light chain of this mAb.
  • SEQ ID 16 is the peptide encoded thereby.
  • SEQ-ID 9 shows the nucleic acid sequence of the variable region of the light chain of a mAb 9D7 according to the invention.
  • SEQ-ID 10 shows the peptide encoded thereby.
  • SEQ ID 11 shows the nucleic acid sequence of the variable region of the heavy chain of this mAb.
  • SEQ-ID 12 is the peptide encoded thereby. Show SEQ ID 18 and 19
  • the invention also relates to curative methods in which a disease based on low regulator T cell numbers or high T lymphocyte infiltration in organs or tissues, for example a person suffering from GBS and / or CDP, an inventive pharmaceutical composition in pharmacologically effective dosage and is administered in galenic preparation suitable for administration.
  • a disease based on low regulator T cell numbers or high T lymphocyte infiltration in organs or tissues for example a person suffering from GBS and / or CDP
  • an inventive pharmaceutical composition in pharmacologically effective dosage and is administered in galenic preparation suitable for administration.
  • Fig. 4 Binding of different human CD28 specific mAb to CD28 (a) and costimulatory (b) and • superagonistic (c) activity of the mAb of Figure 4a,
  • Fig. 5 Binding experiments which prove that superagonistic mAb bind specifically to 'the C'-D loop
  • Fig. 11 Induction of CD4 + CD25 + proliferation
  • Fig. 15 Disease course of the active EAN under
  • Fig. 17 Treatment corresponding to Fig. 15, but with a different treatment plan
  • Proliferation of the indicator cells with and without stimulation (CD3 / anti CD28), B: suppression of the proloferation of the indicator cells in the presence of expanded CD4 + CD25 +++ T cells.
  • FIG. 1 shows the stimulation of freshly isolated T lymphocytes in the form of a 3H-thymidine incorporation in the rat.
  • the methodology corresponds to that described in reference W098 / 54225, to which full reference is made here and below, and the contents of which are hereby incorporated into the present text.
  • the costimulation is shown in FIG. 1 a, ie T-cell receptor (TCR) -specific mAbs were bound to the plastic surface in all wells. In the absence of costimulation, the negative control (top row) shows no installation. Costimulation is then given in soluble form by the addition of CD28-specific mAb. The entire range of CD28-specific mAb shown was used.
  • This series of different CD28-specific mAbs originates from an approach of immunization and production of hybridoma cell lines already described in WO98 / 54225.
  • the culture supernatants contained enough CD28-specific mAb for saturating binding to 2 ⁇ 10 5 T cells. It can be seen from FIG. 1 a that all of these mAb are capable of activating in a costimulating manner, ie in the presence of the anti-TCR mAb the thymidine incorporation to stimulate. The stimulation in the absence of TCR-specific mAb is shown in FIG. 1b.
  • This experiment was also carried out as described in reference W098 / 54225. It can be seen that only two mAbs are able to stimulate T lymphocytes in the absence of a TCR signal. So these mAb have superagonistic activity.
  • CD28-specific mAbs bind to different areas of the CD28 molecule.
  • the mAbs were prepared by immunizing mice with rat CD28; therefore, as expected, they all do not react with mouse CD28 (not shown). Since the mAb can therefore only recognize those regions of the rat CD28 molecule which differ from that of the mouse, a sequence comparison between CD28 of the mouse and the rat was first carried out (see FIG. 2, upper part). The differences between the two species are highlighted. The one-letter code was used to name the amino acids. JJ319 was used as a prototype for a conventional rat CD28-specific mAb, and JJ316 was used for a superagonistic mAb (see W098 / 54225).
  • FIG. 3 The mapping of the binding is shown in FIG.
  • Expression plasmids were constructed in which part of the extracellular domain of CD28 originates from the mouse and another part from the rat. This is represented symbolically by bars and dashes; to the right is shown the binding of mAb JJ316 and JJ319 to mouse fibroblasts (L929 cells) that had been transfected with these expression plasmids.
  • Fig. 3 m / r and r / m 1-37
  • the binding of both antibodies to the "right" half of the sequence is mapped: both bind if this originates from the rat; No binding takes place in the reverse construct (rm CD28 1-37, left rat, right mouse).
  • the third line (m / r CD28 1-66) shows that JJ316 no longer binds, while the part of the rat sequence ("right") that is still available is still sufficient for recognition by JJ319. Accordingly, the two mAb recognize different epitopes on the CD28 molecule, and the binding of the superagonist JJ316 must therefore be sought in the region that originated from the rat in the first line construct, but not in the third line construct.
  • the clear candidate for this is the area encased in FIG. 2.
  • mice were immunized with human CD28-transfected A20 / J mouse B lymphoma cells (see WO98 / 54225) and additionally before the fusion with commercially available human CD28-FC
  • Fusion protein boosted (purchased from R and D Systems).
  • approximately 20 were identified from several thousand cell lines that produce human CD28-specific mAbs (binding to mouse L929 cells that express human CD28 but not to untransfected L929 cells), analogously to the screen in reference W098 / 54,225th Two of these showed the desired superagonistic activity (9D7 and 5.11A), while all new mAbs have conventional costimulatory activity.
  • the two superagonistic mAbs are described in particular below.
  • the newly generated mAb 7.3B6 is used as an example of a conventional human CD28-specific mAb.
  • FIG. 4a shows that the preparations used for the three new mAbs bind to human T lymphocytes comparatively well and also with a comparable titer.
  • An experiment is shown in which freshly isolated mononuclear cells from human blood (so-called PBMC) were first treated with various dilution levels of the mAb used on ice; then it was washed and the bound mAb visualized by a fluorescent dye-labeled secondary antibody that specifically recognizes the bound mouse mAb.
  • PBMC mononuclear cells from human blood
  • the binding of the titrated mAb could be determined selectively for CD4 T lymphocytes by electronic gating.
  • MFI indicates the average fluorescence intensity, which is a measure of the amount of bound CD28-specific mAb.
  • concentrations represent 3-fold dilutions of a standardized 'starting preparation. It is quite normal that the highest concentration gives a weaker signal than the following titration steps in this test; this has to do with the avidity (bivalent binding) of mAb and plays no role in the contexts discussed here.
  • Figures 4b and c compare the ability of superagonistic human CD28-specific mAb with that of conventional CD28-specific mAb - in the presence and absence of a ' TCR signal - to stimulate freshly isolated human T cells to grow. A 3H-thymidine incorporation is again shown, as described above for the rat.
  • the wells were coated with a mAb that reacts with the human TCR / CD3 complex. So costimulation was measured. It can be seen that there is no proliferation without costimulation with one of the mAbs (negative control), but all three antibodies are able to stimulate cell division.
  • Figure 4c was worked in the absence of a TCR / CD3 specific mAb. Only antibodies 9D7 and 5. ILA were able to stimulate superagonistically.
  • FIG. 1 A three-dimensional model of the CD28 molecule is shown in FIG. The newly identified binding region is highlighted. It corresponds to the encased sequence in Figure 2.
  • the extracellular The domain of CD28 belongs structurally to the so-called immunoglobulin superfamily, which is characterized by two ß-leaflets one above the other as the basic structure. These tapes are labeled according to a pattern given in the literature. It is important for the representation shown here that the region identified as an epitope for superagonistic CD28-specific mAbs in rats and mice is referred to as "C'-D loop".
  • mAb with specificity for the C'-D loop of the CD28 molecule have superagonistic activity, that is to say can be used in the sense of literature reference W098 / 54225 for activating T lymphocytes.
  • the superagonistic activity of the C'-D loop of specific mAbs in rats and humans shows that it is not the sequence of the epitope that matters, but its location or shape.
  • FIG. 7 shows that there is no IL-2 production without stimulation (negative control). Stimulation with a T cell receptor-specific mAb induces IL-2 production (positive control).
  • FIG. 7 shows that there is no IL-2 production without stimulation (negative control). Stimulation with a T cell receptor-specific mAb induces IL-2 production (positive control).
  • FIG. 7a shows the results when using the rat superagonistic mAb JJ316
  • FIG. 7b shows results for the mAb 5.11A specific for human C'-D loop.
  • the stimulation is not carried out by means of "conventional" CD28-specific mAb, since these not only do not bind to the C'-D loop, but cannot recognize the construct at all, because they are used for rat or are human-specific sequences that are not included in the construct.
  • FIG. 9 shows dot plots in which each measured cell is represented by a point.
  • the phenotypic characterization of the regulatory T cells was carried out by combining the cell surface molecules CD4 and CD25. For this purpose the cell suspensions are incubated with corresponding fluorescent dye labeled monoclonal antibodies to CD4 or CD25 •, washed and examined these antibodies in a fürflußzytophotometer for binding. The results shown were obtained three days after ip injection of a costimulatory (Fig. 9a, JJ319) or superagonistic CD28 specific mAb (Fig. 9b, JJ316).
  • CD4 T cells In the case of JJ319, about 7% of the CD4 T cells are also CD25 positive (4 / (50 + 4)), which corresponds to results not shown in untreated animals. In contrast, after treatment with JJ316, approximately 20% are CD4 + CD25 + (10 / (10 + 40)). In addition, the level of CD25 expression is much higher than in the control animal. Such a high level is characteristic of regulatory T cells.
  • FIG. 10 shows a phenotypic characterization in the form of a histogram.
  • the marker CD45RC was detected in FIGS. 10a to 10c, a high molecular isoform of the CD45 molecule, which is strong on naive CD4 T cells but low on stimulated CD4 T cells is expressed. Low expression is typical of regulatory T cells.
  • 10a shows that CD4 + CD25 cells from untreated animals mostly express CD45RC strongly. In contrast, in the case of CD4 + CD25 + cells from untreated animals, strong ones are found
  • FIG. 10b In the case of treatment with the superagonistic CD28-specific mAb (FIG. 10c), the down-regulation of CD45CD45RC is much more pronounced than in the case of FIG. 10b.
  • FIGS. 10d to 10e the CD152 (CTLA-4) constitutively expressed by regulatory T cells is detected by staining. This staining has to be carried out due to the intracellular localization of CD152 after permeabilization of fixed cells and is therefore associated with an unspecific background. To check this, a so-called isotype control was carried out, ie an intracellular staining was carried out with a mAb of the same immunoglobulin class, which, however, cannot recognize anything specifically.
  • the specific CD152 detection results as a shift of the CD152 histogram compared to the isotype control histogram. There is no shift in FIG. 10d and consequently no CD152 expression in the CD4 + CD25 cells.
  • FIGS. 10e In the untreated CD4 + CD25 + cells, a slight shift (FIG. 10e) and in the JJ316 (superagonistic CD28-specific mAb) treated cells, a stronger shift can be seen in accordance with the results of FIGS. 10a to 10c.
  • FIGS. 9 and 10 show phenotypically how regulatory T cells can be identified and that superagonistic CD28-specific mAb preferentially increase or induce regulatory CD4 T cells in vivo.
  • CD4 + CD25 + cells were isolated by electronic cell sorting either from untreated rats (FIG. 11a) or from rats treated with JJ316 (FIG. 11b) and cultured in 96 well plates according to the prior art. Cell proliferation was measured by 3H thymidine incorporation between days 2 and 3 of cultivation.
  • “(-)” means no stimulation
  • costimulation means stimulation with a non-superagonistic CD28 specific mAb (JJ319) as well as with the TCR specific R73
  • JJ316 shows the superagonistic stimulation.
  • Both Figures 11a and 11b show that regulatory T cells react poorly to costimulation, but well to stimulation with a superagonistic CD28 specific mAb. Stimulation with mAb used according to the invention thus shows a considerable increase in regulatory T cells even in cell culture.
  • FIG. 13 shows a representation corresponding to FIG. 10f, but after in vitro stimulation with superagonistic CD28-specific mAbs (JJ316). An even more detectable CD152 expression can be seen.
  • FIG. 13 shows the inhibitory function of regulatory T cells on CD4 + CD25 T cells, which serve as indicator cells for the suppressive effect.
  • CD4 + CD25- T cells were used for costimulation (R73 + JJ319).
  • the 3H thymidine incorporation was measured between days 2 and 3 of the cultivation.
  • CD25 + means electronically sorted CD4 + CD25 + T cells from animals treated three days earlier with superagonistic CD28-specific mAb (JJ316).
  • CD25- stands for the indicator cells.
  • CD25 + / CD25- in Fig. 13a means that both cell populations were mixed together in equal parts. It can be seen that the CD25 + cells do not respond to costimulation with proliferation. In addition, the proliferation of indicator cells is suppressed.
  • 13b shows a titration of the regulatory T cells by mixing them with indicator cells in different proportions. It can be seen that suppression can still be observed even when the ratio of regulatory to indicator cells is 1:16. This shows the high effectiveness of the regulatory cells stimulated with mAb used according to the invention.
  • FIG. 14 shows a comparison of the reactions of human CD4 + CD25 T cells (naive cells) to CD4 + CD25 + T cells (regulatory cells) in response to costimulation (anti-CD3 + conventional anti-CD28 mAb) or to human specific superagonistic CD28 specific mAb (9D7 and 5.11A).
  • the experiments correspond to those described above for the rat. Starting from the left, the first three groups show unstimulated controls (no 3H thymidine incorporation). These are the entire CD4 + T cells, then the CD25 fraction obtained by sorting and finally the CD25 + fraction obtained by sorting, "med” means medium. This is followed by two groups, in which was stimulated superagonistically (9D7 and 5.11A).
  • the regulatory T cells react better to the stimulation with superagonistic CD28-specific mAbs compared to the total population of the CD4 + cells and their CD25 fraction.
  • the last group of three shows the results of conventional costimulation. In contrast, the reaction of the unseparated T cells and the CD25 fraction is rather better.
  • FIG. 15 shows the course of the disease of the active EAN under treatment with various mAbs.
  • 7-8 week old female LEW rats available from Charles River Laboratories (Sulzfeld, Germany) were used.
  • the animals were immunized with a synthetic peptide which corresponds to a part of the myelin protein P2 which surrounds peripheral nerve fibers (amino acids 53-78 of the bovine P2 protein, 50 ⁇ l of a 0.5mg / ml solution, inoculation in the balls of the feet).
  • peripheral nerve fibers amino acids 53-78 of the bovine P2 protein, 50 ⁇ l of a 0.5mg / ml solution, inoculation in the balls of the feet.
  • progressive paralysis develops, which can be quantified according to standardized scoring (King et al., Exp Neurol, 87: 9-19 (1985).
  • Figure 15a shows preventive therapy with superagonistic CD28-specific mAbs (JJ316 15b Treatment with conventional mAb (JJ319)
  • the application was carried out ip in lmg / animal doses either on the day of the P2 immunization (DO), on day 12 (D12), ie after the onset of symptoms, or on both days.
  • the different groups included 3 to 6 animals.
  • a comparison of FIGS. 15a and 15b shows that treatment with superagonistic CD28-specific mAb is significantly more effective than treatment with conventional mAb.
  • FIG. 16 shows results corresponding to FIG. 15, but with a prophylactic treatment, d-7 being treatment 7 days before the immunization, d-21 21 days before the immunization. It can be seen that a resistant status can be achieved by increasing regulatory T cells when treated within a week before the immunization, but not when treated 3 weeks before the immunization.
  • FIG. 17 is based on a procedure as in FIG. 15, but treatment with JJ316 on day 0 and 4.
  • FIG. 17a shows the course of the disease in accordance with the illustration in FIG. 15a.
  • FIG. 17b shows electrophysical properties, namely the speed of the conduction as a direct clinical parameter for the damage to the sciatic nerve.
  • the measurements were carried out according to the literature Adlkofer et al. Nat Genet, 11: 274-280 (1995) and Heininger et al. , Ann Neurol, 19: 44-49 (1986).
  • the pathological findings can be seen in the control groups, particularly in the prolongation of the N1 and F latencies (see days 0 and 12, open symbols).
  • FIG. 18 shows results of a therapy of passive or adoptive transfer EAN (AT-EAN). This is not induced by immunization with the nerve antigen, as described above, but rather an intravenous injection of an autoreactive CD4 + T cell clone with specificity for the P2 myelin antigen (8xl0 ⁇ 6, cell line G7) according to the Stienekemeier et al. , Brain, 122: 523-535 (1999).
  • FIG. 18a shows the course of the disease in a control group, in the case of treatment with JJ316 on day 1 (dl) and in the case of treatment on day 3 (d3). It is remarkable that even after the onset of the symptoms of the disease, ie treatment on day 3, the disease can be stopped.
  • CD4 + CD25 +++ T cells expanded by means of monoclonal antibodies according to the invention also have their functional properties, e.g. the suppression of the proliferation of "conventional" T cells.
  • the CD4 + T cells were purified from human peripheral mononuclear cells (PBMC) by means of magnetic separation
  • CD8 +, CDllb +, CD16 +, CD19 +, CD36 + and CD56 + cells were then loaded with a CD25-specific antibody and subsequently a PE-conjugated secondary antibody, sorted into CD4 + CD25 +++ and CD4 + CD25-T cells (see FIG. 19) and after addition of monoclonal antibodies according to the invention coupled to Dyna-beads ( hulG4) and interleukin 2 (IL-2) cultivated (day 0). On day 5, the expanded cells were stained with anti-CD4 and anti CD-25 on the cell surface, and intracellularly with anti-CTLA-4 and Ki-67.
  • hulG4 Dyna-beads
  • IL-2 interleukin 2
  • expanded CD4 + CD25 +++ or CD4 + CD25-T cells were mixed with the CFSE-labeled indicator cells in a ratio of 1: 1 or 1: 5 and co-cultivated (stimulation with anti-CD3 mAb, clone HIT3a, final concentration 0.1 ⁇ g / ml, and anti-CD-28 mAb, clone CD28.2, final concentration 0.05 ⁇ g / ml).
  • Figure 22b shows that the number of cell divisions in the indicator cells was greatly reduced by the presence of the expanded CD4 + CD25 +++ T cells, while the CD4 + CD25-T cells showed only a slight effect.

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Abstract

The invention relates to the use of a superagonistic CD28-specific monoclonal antibody (mAb) or a mimic compound of the same, for producing a pharmaceutical composition for the induction and/or reproduction of regulatory T-cells.

Description

Verwendung einer an CD28 bindenden Wirksubstanz zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung. Use of an active substance that binds to CD28 for the production of a pharmaceutical composition.
Gebiet der Erfindung.Field of the Invention.
Die Erfindung betrifft die Verwendung einer an CD28 bindenden Wirksubstanz zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung.The invention relates to the use of an active substance which binds to CD28 for the production of a pharmaceutical composition.
Definitionen.Definitions.
Als monoklonale Antikörper (mAb) sind Antikörper bezeichnet, die von Hybrid-Zellinien (sog. Hybridomen) produziert werden, die typischerweise durch Fusion einer Antikörper produzierenden B-Zelle tierischer oder menschlicher Herkunft mit einer geeigneten MyeloMonoclonal antibodies (mAb) are antibodies that are produced by hybrid cell lines (so-called hybridomas), which are typically produced by fusion of an antibody-producing B cell of animal or human origin with a suitable myelo
Tumorzelle entstanden sind.Tumor cell have arisen.
Die Aminosäuresequenz von Human CD28 ist unter derThe amino acid sequence of Human CD28 is below that
Accession No . NM_006139 bekannt.Accession No. NM_006139 known.
Das C'-D Loop von CD28 umfaßt die Aminosäuren 52 bis 66 der vorstehenden CD28 Sequenz (zur Numerierung siehe auch Ostrov, D.A., et al . ; Science (2000), 290:816-819). Unter dem Begriff des C'-D Loops sollen im Folgenden auch beliebige Teilsequenzen hieraus verstanden sein.The C'-D loop of CD28 comprises amino acids 52 to 66 of the above CD28 sequence (for numbering see also Ostrov, D.A., et al.; Science (2000), 290: 816-819). In the following, the term “C'-D loop” should also be understood to mean any partial sequences from this.
Ein Loop bzw. eine darin angeordnete Bindungsstelle ist frei zugänglich, wenn für einen definierten Bindungspartner für die Bindungsstelle im Loop keine sterische Hinderung durch an das Loop anschließende Sequenzen oder Moleküle vorliegt.A loop or a binding site arranged in it is freely accessible if none for a defined binding partner for the binding site in the loop steric hindrance due to sequences or molecules connected to the loop.
Regulatorische T-Zellen sind CD4+ T-Zellen, welche in Mischung mit naiven CD4+ T-Zellen deren Aktivierung inhibieren. Hierzu gehören insbesondere CD4+CD25+ T-Zellen. Ein weiteres Merkmal regulatorischer T-Zellen ist eine vergleichsweise zu anderen T-Zellen niedrige Expression der hochmolekularen Isoformen von CD45 (human: RA) . Für regulatorische T-Zellen ist die konstitutive Expression von CD152 typisch. CD4+CD8-SP Thymocyten sind eine der wesentlichen Quellen für regulatorische T-Zellen. Für eine weitergehende Charakterisierung von regulatorischen T- Zellen wird auf die Literaturstelle K.J. Maloy et al.,Nature Immunology, Vol. 2, No . 9, Seiten 816 ff., 2001, verwiesen.Regulatory T cells are CD4 + T cells which, when mixed with naive CD4 + T cells, inhibit their activation. These include in particular CD4 + CD25 + T cells. Another feature of regulatory T cells is a low expression of the high molecular isoforms of CD45 (human: RA) compared to other T cells. The constitutive expression of CD152 is typical for regulatory T cells. CD4 + CD8-SP thymocytes are one of the major sources of regulatory T cells. For further characterization of regulatory T cells, reference is made to the reference K.J. Maloy et al., Nature Immunology, Vol. 2, No. 9, pages 816 ff., 2001.
Mit Induktion regulatorischer T-Zellen ist die Vermehrung der Stoffwechselaktivität, Vergrößerung des Zellvolumens, Synthese immunologisch wichtiger Moleküle und Eintritt in die Zellteilung (Proliferation) auf einen äußeren Reiz hin bezeichnet. Im Ergebnis liegen nach der Induktion mehr regulatorische T-Zellen vor als vorher.Induction of regulatory T cells means the increase in metabolic activity, enlargement of the cell volume, synthesis of immunologically important molecules and entry into cell division (proliferation) due to an external stimulus. As a result, there are more regulatory T cells after induction than before.
Homologie bezeichnet eine zumindest 70%ige, vorzugsweise zumindest 80%ige, höchstvorzugsweise zumindest 90%ige Sequenzidentität auf Proteinebene, wobei ein homologes Protein oder Peptid einen definierten Bindungspartner mit zumindest gleicher Affinität bin- det. Abweichungen in der Sequenz können Deletionen, Substitutionen, Insertionen und Elongationen sein. Eine Mimikriverbindung ist eine natürliche oder synthetische chemische Struktur, die sich in einem definierten Bindungsassay wie ein definierter mAb verhält, welchen die Mimikriverbindung mimikriert.Homology denotes an at least 70%, preferably at least 80%, most preferably at least 90% sequence identity at the protein level, a homologous protein or peptide binding a defined binding partner with at least the same affinity. Sequence variations can include deletions, substitutions, insertions, and elongations. A facial expression compound is a natural or synthetic chemical structure that behaves like a defined mAb in a defined binding assay, which the facial expression compound mimicizes.
Der Begriff der mAb umfaßt neben Strukturen des üblichen Fab/Fc Aufbaus auch Strukturen, die ausschließlich aus dem Fab-Fragment bestehen. Es ist auch möglich, lediglich die variable Region zu nutzen, wobei das Fragment der schweren Ketten mit dem Fragment der leichten Kette auf geeignete Weise, beispielsweise auch mittels synthetischer Brückenmoleküle, so verbunden ist, daß die Bindungsregionen der Ketten das Antikörperepitop bilden. Der Begriff der Antikörper umfaßt auch (ggf. vollständige) chimäre sowie humanisierte Antikörper.In addition to structures of the usual Fab / Fc structure, the term mAb also includes structures which consist exclusively of the Fab fragment. It is also possible to use only the variable region, the heavy chain fragment being connected to the light chain fragment in a suitable manner, for example also by means of synthetic bridge molecules, in such a way that the binding regions of the chains form the antibody epitope. The term antibody also includes (possibly complete) chimeric and humanized antibodies.
Superagonistische Stimulation der Proliferation von CD 28 spezifischen T-Zellen meint, daß keine Costimulation, i.e. kein weiteres Bindungsereignis neben einer Bindung eines mAb oder einer Mimikriverbindung an CD28 zur Stimulation oder Inhibierung der Proliferation erforderlich ist.Superagonistic stimulation of the proliferation of CD 28 specific T cells means that no costimulation, i.e. no other binding event besides binding a mAb or a mimicriver connection to CD28 is required to stimulate or inhibit proliferation.
Hintergrund der Erfindung und Stand der Technik.Background of the Invention and Prior Art.
Zum Verständnis der Erfindung ist zunächst folgender technologischer Hintergrund wichtig. Die Aktivierung ruhender T-Zellen zur Proliferation und funktioneilen Differenzierung erfordert zunächst die Besetzung zweier Oberflächenstrukturen, sogenannter Rezeptoren: 1. des Antigenrezeptors, der von Zelle zu Zelle eine unterschiedliche Spezifität besitzt und für die Erkennung von Antigenen, z.B viralen Spaltprodukten, notwendig ist; sowie 2. des auf allen ruhenden T-Zellen mit Ausnahme einer Untergruppe der CD8 T-Zellen des Menschen gleichermaßen exprirαierten CD28 Moleküls, welches natürlicherweise an Liganden auf der Oberfläche anderer Zellen des Immunsystems bindet. Man spricht von der Costimulation der antigenspezifischen Immunreaktion durch CD28. In Zellkultur können diese Vorgänge nachgestellt werden durch Besetzung des Antigenrezeptors sowie des CD28-Moleküls mit geeigneten mAbs. Im klassischen System der Costimulation führt weder die Besetzung des Antigenrezeptors noch die des CD28-Moleküls allein zur T-Zellproliferation, die Besetzung beider Rezeptoren ist jedoch effektiv. Diese Beobachtung wurde an T-Zellen des Menschen, der Maus und der Ratte gemacht.The following technological background is important for understanding the invention. The activation of resting T cells for proliferation and functional differentiation first requires the occupation of two surface structures, so-called receptors: 1. the antigen receptor, which has a different specificity from cell to cell and for recognition of antigens, for example viral fission products, is necessary; and 2. the CD28 molecule which is equally expressed on all resting T cells, with the exception of a subset of the CD8 T cells of humans, which naturally binds to ligands on the surface of other cells of the immune system. One speaks of the costimulation of the antigen-specific immune reaction by CD28. In cell culture, these processes can be simulated by filling the antigen receptor and the CD28 molecule with suitable mAbs. In the classic system of costimulation, neither the occupation of the antigen receptor nor that of the CD28 molecule alone leads to T cell proliferation, but the occupation of both receptors is effective. This observation was made on human, mouse and rat T cells.
Dagegen sind auch CD28-spezifische mAbs bekannt, die ohne Costimulation die T-Zellproliferation einleiten können. Eine solche superagonistische, d. h. von der Besetzung des Antigenrezeptors unabhängige Aktivierung ruhender T-Lymphozyten durch CD28-spezifische mAb ist aus der Literaturstelle Tacke et al . , Eur . J. Im unol . , 1997, 27:239-247 bekannt. Demnach wurden zwei Arten von CD28-spezifischen monoklonalen Antikörpern mit unterschiedlichen funktioneilen Eigenschaften beschrieben: costimulatorische mAb, die die Aktivierung ruhender T-Zellen nur bei gleichzeitiger Besetzung des Antigenrezeptors costimulieren; und superagonistische mAb, die ohne Besetzung des Antigenrezeptors T-Lymphozyten aller Klassen in vitro und im Versuchstier zurIn contrast, CD28-specific mAbs are also known which can initiate T cell proliferation without costimulation. Such a superagonistic, i.e. H. activation of resting T lymphocytes by CD28-specific mAb, independent of the occupation of the antigen receptor, is known from the literature reference Tacke et al. , Eur. J. In unol. , 1997, 27: 239-247. Accordingly, two types of CD28-specific monoclonal antibodies with different functional properties have been described: costimulatory mAb, which costimulate the activation of resting T cells only when the antigen receptor is occupied; and superagonistic mAb which produce T lymphocytes of all classes in vitro and in the test animal without occupation of the antigen receptor
Proliferation aktivieren können. Beide insofern bekannte mAb rühren aus einer Immunisierung mit Zellen, auf denen Ratten-CD28 exprimiert ist und sind durch auf ihre ..jeweiligen beschriebenen Eigenschaften gerichtete .unterschiedliche Selektionen erhältlich.Can activate proliferation. Both known mAbs result from immunization with cells on which rat CD28 is expressed and are through on their ..different selections available for the properties described.
Aus der Literaturstelle DE-197 22 888 ist .es bekannt, daß 5 superagonistische mAb in der Lage sind, eine Immundeviation TH1 zu TH2 zu bewirken und sich insofern zum Einsatz gegen die Adjuvans Arthritis eignen. TH1 und TH2 Zellen sind CD4 expri ierende T-Zellen. TH1 Zellen werden auch pro-inflammatorische T-Helfer-Zellen genannt undFrom document DE-197 22 888 it is known that 5 superagonistic mAbs are able to bring about an immunodeviation TH1 to TH2 and are therefore suitable for use against the adjuvant arthritis. TH1 and TH2 cells are CD4-expressing T cells. TH1 cells are also called pro-inflammatory T-helper cells
10 sezernieren die Cytokine IL-2, TNF und IFN-γ. TH2 Zellen "unterstützen .die. Aktivierung von B-Zellen und .sezernieren die Cytokine IL-4, IL-5 und IL-10. Dabei wird die Differenzierung .von CD4 T-Zellen- zu den vorstehenden •funktional unterschiedlichen Untergruppen nicht nur durch10 secrete the cytokines IL-2, TNF and IFN-γ. TH2 cells "support. The. Activation of B cells and. Secrete the cytokines IL-4, IL-5 and IL-10. The differentiation. From CD4 T cells to the above • functionally different subgroups is not only achieved by
15...die -verfügbaren Cytokine kontrolliert, sondern sie wird auch durch Costimulation über CD28 moduliert. CD28-defiziente Mäuse zeigen normale TH1 aber reduzierte TH2 abhängige Antworten und das Cytokinprofil von TCR-transgenen CD4 Zellen wird durch CD28 Ligation in15 ... controls the available cytokines, but is also modulated by costimulation via CD28. CD28 deficient mice show normal TH1 but reduced TH2 dependent responses and the cytokine profile of TCR-transgenic CD4 cells is determined by CD28 ligation
20 Richtung TH2 verschoben. Dagegen verhindert ein starkes TCR Signal CD28 vermittelte TH2 Differenzierung.20 shifted towards TH2. In contrast, a strong TCR signal CD28 prevents TH2 differentiation.
Aus der in der Literaturstelle K.J. Maloy et al., Nature Immunology, Vo . 2, No . 9, Seiten 816 ff., 2001,From the K.J. Maloy et al., Nature Immunology, Vo. 2, no. 9, pages 816 ff., 2001,
25 zusammengefaßten Primärliteratur ist bekannt, daß regulatorische T-Zellen bei Autoimmunreaktionen wichtig sind. So wurde z.B. in experimentellen Tiermodellen der Multiplen Sklerose, des Typ I Diabetes und von entzündlichen Darmerkrankungen die Fähigkeit dieser Zellen25 summarized primary literature is known that regulatory T cells are important in autoimmune reactions. For example, in experimental animal models of multiple sclerosis, type I diabetes and inflammatory bowel diseases the ability of these cells
30 gezeigt, die entsprechenden Krankheitsbilder zu unterdrücken . Guillain-Barre-Syndrom (GBS) ist eine akute autoimmun-inflammatorische Erkrankung des peripheren menschlichen Nervensystems. Die Inzidenz von GBS liegt bei 1-2 pro 100.000 Menschen. Die chronische Verlaufsform ist die chronische demyelinisierende Polyneuropathie (CDP) . Die Inzidenz von CDP liegt bei 10-20 pro 100.000 Menschen. mAb oder verwandte Substanzen zur Prävention und/oder Behandlung dieser Krankheiten sind nicht bekannt.30 shown to suppress the corresponding clinical pictures. Guillain-Barre syndrome (GBS) is an acute autoimmune inflammatory disease of the peripheral human nervous system. The incidence of GBS is 1-2 per 100,000 people. The chronic form is chronic demyelinating polyneuropathy (CDP). The incidence of CDP is 10-20 per 100,000 people. mAb or related substances for the prevention and / or treatment of these diseases are not known.
Technisches Problem der Erfindung.Technical problem of the invention.
Der Erfindung liegt das technische Problem zu Grunde, eine pharmazeutische Zusammensetzung anzugeben, mittels welcher sich regulatorische T-Zellen stimulieren lassen und welche sich insbesondere zur Prävention und/oder Behandlung der multiplen Sklerose, Typ I Diabetes, entzündlichen Darmerkrankungen, GBS und/oder CDP eignet.The invention is based on the technical problem of specifying a pharmaceutical composition by means of which regulatory T cells can be stimulated and which is particularly suitable for the prevention and / or treatment of multiple sclerosis, type I diabetes, inflammatory bowel diseases, GBS and / or CDP ,
Grundzüge der Erfindung und bevorzugte Ausführungsformen.Basics of the invention and preferred embodiments.
Zur Lösung dieses technischen Problems lehrt die Erfindung die Verwendung eines CD28-spezifischen superagonistischen monoklonalen Antikörpers (mAb) oder einerTo solve this technical problem, the invention teaches the use of a CD28-specific superagonistic monoclonal antibody (mAb) or one
Mimikriverbindung hierzu, zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Induktion μnd/oder Vermehrung regulatorischer T-Zellen.Facial expression compound for this purpose, for the production of a pharmaceutical composition for induction and / or proliferation of regulatory T cells.
Die Erfindung beruht zunächst auf der Erkenntnis, daß mittels superagonistischer CD28 spezifischer Wirksubstanzen, mAb oder Mimikriverbindungen hierzu, CD4+CD25+ T-Zellen sich induzieren lassen, i.e. deren Zahl nach Behandlung eines Organismus mit der Wirksubstanz deutlich höher ist als in einem Organismus, welcher nicht oder mit nicht-superagonistischen Wirksubstanzen behandelt wurde .The invention is based initially on the knowledge that CD28 + CD25 + T cells, ie their number, can be induced by means of superagonistic CD28-specific active substances, mAb or mimicrial compounds after treatment of an organism with the active substance is significantly higher than in an organism that has not been treated or has been treated with non-superagonistic active substances.
Weiterhin beruht die Erfindung auf der Erkenntnis, daß die erfindungsgemäß eingesetzten Wirksubstanzen offenbar ein sehr gutes Mittel zur Behandlung des Guillian-Barre- Syndroms und/oder der chronisch demyelinisierenden Polyneuropathie sowie weiteren autoimun-verbundenenFurthermore, the invention is based on the knowledge that the active substances used according to the invention appear to be a very good means of treating Guillian-Barre syndrome and / or chronically demyelinating polyneuropathy and other autoimmune-related ones
Krankheiten ist. Daher lehrt die Erfindung weiterhin die erfindungsgemäße Verwendung zur Behandlung dieser Krankheiten.Diseases. The invention therefore further teaches the use according to the invention for the treatment of these diseases.
Erfindungsgemäß verwendete superagonistische CD28 spezifische Wirksubstanzen, i.e. mAb oder Mimikriverbindungen hierzu, sind solche, die unabhängig von der Besetzung des Antigenrezeptors mehrere bis alle Untergruppen der T-Lymphozyten aktivieren.Superagonistic CD28-specific active substances used according to the invention, i.e. mAb or mimicro compounds to this are those that activate several to all subgroups of T lymphocytes, regardless of the occupation of the antigen receptor.
Die Wirksubstanz bindet an CD28 oder an eine Teilsequenz hieraus. Die Teilsequenz kann beispielsweise eine Aminosäurensequenz Seq.-ID 1, oder 2 - 7, oder 17 enthalten, welche zumindest teilweise im Bereich des C'-D Loops von CD28 liegen. An eine der Sequenzen mit Val am 5 '-Ende kann eine oder mehrere Aminosäuren der Sequenz 8 in der dort definierten Reihenfolge angeschlossen sein. Das Loop liegt im Bereich mit der Sequenz GNYSQQLQVYSKTGF. Erfindungsgemäße Mimikriverbindungen lassen sich in einem Screeningverfahren identifizieren, wobei eine prospektive Mimikriverbindung oder eine Mischung von prospektiven Mimikriverbindungen einem Bindungsassay mit CD28 oder einer Teilsequenz hieraus, insbesondere dem C'-D-Loop, unterworfen werden, und wobei an CD28 oder an die Teilsequenz hieraus bindende Wirksubstanzen selektiert werden, ggf. gefolgt von einem Assay zur Prüfung auf superagonistische Stimulation von mehreren bis allen Untergruppen der T-Lymphozyten. Im Falle einer Mischung wird es zweckmäßig sein, eine Dekonvolution durchzuführen. Unter den selektierten Mimikriverbindungen kann gleichsam ein Ranking nach Maßgabe der Selektivität und/oder Affinität erfolgen, wobei hochaffine Wirksubstanzen bevorzugt sind. Zusätzlich oder anstelle eines solchenThe active substance binds to CD28 or to a partial sequence from it. The partial sequence can contain, for example, an amino acid sequence SEQ ID 1, or 2-7, or 17, which are at least partially in the region of the C'-D loop of CD28. One or more amino acids of sequence 8 can be connected to one of the sequences with Val at the 5 'end in the order defined there. The loop lies in the area with the sequence GNYSQQLQVYSKTGF. Mimicriver compounds according to the invention can be identified in a screening process, a prospective mimicriver compound or a mixture of prospective mimicriver compounds using a binding assay with CD28 or a partial sequence thereof, in particular the C'-D loop, are subjected to, and wherein active substances binding to CD28 or to the partial sequence are selected therefrom, possibly followed by an assay for testing for superagonistic stimulation of several to all subgroups of the T-lymphocytes. In the case of a mixture, it will be expedient to carry out a deconvolution. The selected facial expression compounds can, as it were, be ranked according to selectivity and / or affinity, with high-affinity active substances being preferred. In addition to or instead of one
Rankings kann ein .Ranking anhand einer Quantifizierung der Induktion der Regulator T-Zellen erfolgen bzw. anhand der Hemmung der Erkrankung beispielsweise im Tierversuch anhand von Krankheitsmodellen.Rankings can be based on a quantification of the induction of the regulator T cells or on the inhibition of the disease, for example in animal experiments using disease models.
Ein Beispiel einer erfindungsgemäß verwendeten Wirksubstanz ist ein superagonistischer CD28 spezifischer mAb. Er ist beispielsweise herstellbar, indem ein nichtmenschliches Säugetier mit CD28 oder einem Peptid mit einer Teilsequenz hieraus, beispielsweise wie vorstehend angegeben oder Homologen hierzu, immunisiert wird, wobei aus dem nichtmenschlichen Säugetier Zellen entnommen und aus den Zellen Hybridomzellen hergestellt werden, und wobei die so erhaltenen Hybridomzellen mit der Maßgabe selektiert werden, daß in deren Kulturüberstand mAb enthalten sind, die an CD28 binden. Mit üblichen Verfahren kann eine Humanisierung durchgeführt werden. Geeignete mAb lassen sich alternativ dadurch herstellen, daß B-Lymphozyten selektiert werden, welche an das Loop binden, und deren exprimierte Immunglobulingene kloniert werden. Auch ist eine Isolierung geeigneter mAb aus Phagenbibliotheken möglich. Im Einzelnen kann es sich um einen mAb handeln, welcher mit Hybridomzellen, wie hinterlegt unter den DSM Nummern DSM ACC2531 (mAb: 9D7 bzw. 9D7G3H11) oder DSM ACC2530 (mAb: 5. ILA bzw. 5.11A1C2H3), erhältlich ist. Der mAb kann eine oder mehrere der Sequenzen Seq.-ID 9, 11, 13 und/oderAn example of an active substance used according to the invention is a superagonistic CD28-specific mAb. It can be produced, for example, by immunizing a non-human mammal with CD28 or a peptide with a partial sequence thereof, for example as stated above or homologues therefor, cells from the non-human mammal being removed and hybridoma cells being produced from the cells, and the so obtained Hybridoma cells are selected with the proviso that their culture supernatant contains mAb which bind to CD28. Humanization can be carried out using conventional methods. Suitable mAb can alternatively be prepared by selecting B lymphocytes that bind to the loop and cloning their expressed immunoglobulin genes. It is also possible to isolate suitable mAbs from phage libraries. Specifically, it can be a mAb, which is available with hybridoma cells as deposited under the DSM numbers DSM ACC2531 (mAb: 9D7 or 9D7G3H11) or DSM ACC2530 (mAb: 5th ILA or 5.11A1C2H3). The mAb can be one or more of the sequences SEQ ID 9, 11, 13 and / or
15, oder eine oder mehrere Sequenzen Seq.-ID 10, 12, 14,15, or one or more sequences SEQ ID 10, 12, 14,
16, 18 und/oder 19 oder hierzu homologe Sequenzen enthalten bzw. dadurch (teilweise) codiert sein. In SEQ-ID 13 ist die Nukleinsäuresequenz der variablen Region der schweren Kette eines erfindungsgemäßen mAb 5.11A wiedergegeben. SEQ-ID 14 zeigt das hierdurch codierte Peptid. SEQ-ID 15 zeigt die Nukleinsäuresequenz der variable Region der leichten Kette dieses mAb. SEQ-ID 16 ist das hierdurch codierte Peptid. SEQ-ID 9 zeigt die Nukleinsäuresequenz der variablen Region der leichten Kette eines erfindungsgemäßen mAb 9D7 wiedergegeben. SEQ-ID 10 zeigt das hierdurch codierte Peptid. SEQ-ID 11 zeigt die Nukleinsäuresequenz der variable Region der schweren Kette dieses mAb. SEQ-ID 12 ist das hierdurch codierte Peptid. SEQ-ID 18 und 19 zeigen16, 18 and / or 19 or sequences homologous thereto or be (partially) encoded thereby. SEQ ID 13 shows the nucleic acid sequence of the variable region of the heavy chain of a mAb 5.11A according to the invention. SEQ ID 14 shows the peptide encoded thereby. SEQ ID 15 shows the nucleic acid sequence of the variable region of the light chain of this mAb. SEQ ID 16 is the peptide encoded thereby. SEQ-ID 9 shows the nucleic acid sequence of the variable region of the light chain of a mAb 9D7 according to the invention. SEQ-ID 10 shows the peptide encoded thereby. SEQ ID 11 shows the nucleic acid sequence of the variable region of the heavy chain of this mAb. SEQ-ID 12 is the peptide encoded thereby. Show SEQ ID 18 and 19
Aminosäurensequenzen der variablen Region eines humanisierten mAb 5. ILA, und zwar der leichten Kette und der schweren Kette, respektive.Amino acid sequences of the variable region of a humanized mAb 5th ILA, namely the light chain and the heavy chain, respectively.
Die Erfindung betrifft schließlich auch Heilverfahren, bei welchen einer auf niedrige Regulator T-Zellzahlen bzw. hohe T-Lyphozyten-Infiltration in Organen oder Gewebe beruhenden Erkrankung, beispielsweise einer an GBS und/oder CDP leidenden Person, eine erfindungsgemäße pharmazeutische Zusammensetzung in pharmakologisch wirksamer Dosierung und in für die Verabreichung geeigneter galenischer Herrichtung verabreicht wird. Im Folgenden wird die Erfindung anhand von lediglich Ausführungsformen darstellenden Beispielen näher erläutert. Hierbei sind in den Figuren 1 bis 9 sowie den begleitenden Textteilen hierzu Verfahrensweisen und Ergebnisse gezeigt, die einerseits Zielstrukturen für die Findung geigneter Wirksubstanzen darstellen und andererseits erfindungsgemäß einsetzbare Wirksubstanzen beschreiben. In den Figuren 10 bis 15 sind Ergebnisse dargestellt, die die Induktion regulatorischer T-Zellen durch erfindungsgemäß eingesetzte Wirksubstanzen belegen. In den Figuren 16 bis 21 sind Ergebnisse dargestellt, die die Wirkung erfindungsgemäßer Wirksubstanzen in einem Tiermodell, der experimentellen allergischen Neuritis der LEW-Ratte (EAN) belegen. Bei der EAN handelt es sich um ein Modell für das humane GBS und der CDP (auch CIDP bzw. chronische inflammatorische demyelinisierende Polyradikulonneuropathie genannt) . Es zeigen:Finally, the invention also relates to curative methods in which a disease based on low regulator T cell numbers or high T lymphocyte infiltration in organs or tissues, for example a person suffering from GBS and / or CDP, an inventive pharmaceutical composition in pharmacologically effective dosage and is administered in galenic preparation suitable for administration. The invention is explained in more detail below on the basis of examples which merely illustrate embodiments. Procedures and results are shown in FIGS. 1 to 9 and the accompanying text parts, which on the one hand represent target structures for finding suitable active substances and on the other hand describe active substances that can be used according to the invention. FIGS. 10 to 15 show results that demonstrate the induction of regulatory T cells by active substances used according to the invention. In Figures 16 to 21 results are shown which demonstrate the effect of active substances according to the invention in an animal model, the experimental allergic neuritis of the LEW rat (EAN). The EAN is a model for human GBS and CDP (also called CIDP or chronic inflammatory demyelinating polyradiculoneuropathy). Show it:
Fig. 1: Stimulation von T-Lymphozyten der Ratte mit verschiedenen CD28 spezifischen mAb (a:Fig. 1: Stimulation of rat T lymphocytes with different CD28-specific mAb (a:
Costimulation, b: superagonistische Stimulation),Costimulation, b: superagonistic stimulation),
Fig. 2: einen Sequenzvergleich zwischen Maus, Ratte und Human CD28 im Bereich des C'-D Loops (eingekastelt),2: a sequence comparison between mouse, rat and human CD28 in the area of the C'-D loop (boxed),
Fig. 3: experimentelle Ergebnisse zur Lokalisierung der Bindungsstelle superagonistischer mAb am CD28 Moleküle der Ratte,3: experimental results for the localization of the binding site of superagonistic mAb on the CD28 molecules of the rat,
Fig. 4: Bindung von verschiedenen human CD28 spezifischen mAb an CD28 (a) sowie costimulatorische (b) und •superagonistische (c) Aktivität der mAb aus Figur 4a,Fig. 4: Binding of different human CD28 specific mAb to CD28 (a) and costimulatory (b) and • superagonistic (c) activity of the mAb of Figure 4a,
Fig. 5: Bindungsversuche, die belegen, daß superagonistische mAb spezifisch an 'das C'-D Loop binden,Fig. 5: Binding experiments which prove that superagonistic mAb bind specifically to 'the C'-D loop,
Fig. 6: eine dreidimensionale Darstellung von CD28 mit Markierung des C'-D Loop,6: a three-dimensional representation of CD28 with marking of the C'-D loop,
Fig. 7: Experimente zur Aktivierung von. Zellen mittels erfindungsgemäßer mAb,Fig. 7: Experiments to activate. Cells using mAb according to the invention,
Fig. 8: Darstellung der Sequenzen SEQ-ID 9 - 16 (a - h) , sowie der humanisierten variablen Domäne des Antikörpers 5.11A (leichte Kette: VLC5.11, i; schwere Kette: VHC5.11, j), SEQ-ID 18 - 19,8: Representation of the sequences SEQ-ID 9 - 16 (a - h) and the humanized variable domain of the antibody 5.11A (light chain: VLC5.11, i; heavy chain: VHC5.11, j), SEQ- ID 18 - 19,
Fig. 9: Frequenz der CD4+CD25+ Zellen an der Gesamtpopulation der CD4 Zellen einer Ratte, im Vergleich nach Behandlung mit einem superagonistischen CD28 spezifischen mAb und einem costimulatorischen mAb,9: Frequency of the CD4 + CD25 + cells on the total population of the CD4 cells of a rat, in comparison after treatment with a superagonistic CD28-specific mAb and a costimulatory mAb,
Fig. 10: phänotypische Charakterisierung von durch superagonistische CD28 spezifische mAb induzierten CD4+CD25+ Zellen und Vergleich mit CD4+CD25- und CD4+CD25+ Zellen aus unbehandelten Kontrolltieren,10: Phenotypic characterization of CD4 + CD25 + cells induced by superagonistic CD28-specific mAb and comparison with CD4 + CD25 and CD4 + CD25 + cells from untreated control animals,
Fig. 11: Induktion der Proliferation von CD4+CD25+Fig. 11: Induction of CD4 + CD25 + proliferation
T-Zellen durch superagonistische CD28 spezifische mAb in Zellkultur, Fig. 12: Weitere Phänotypisierung der gemäß Fig. 11 erhaltenen CD4+CD25+ T-Zellen,T cells by superagonistic CD28 specific mAb in cell culture, 12: Further phenotyping of the CD4 + CD25 + T cells obtained according to FIG. 11,
Fig. 13: inhibitorische Funktion der regulatorischen T-Zellen,13: inhibitory function of the regulatory T cells,
Fig. 14: Experimente entsprechend Fig. 11 mit menschlichen T-Zellen und Einsatz superagonistischer human-CD28 spezifischer mAb,14: Experiments corresponding to FIG. 11 with human T cells and the use of superagonistic human CD28-specific mAb,
Fig. 15: Krankheitsverlauf der aktiven EAN unterFig. 15: Disease course of the active EAN under
Behandlung mittels superagonistischer CD28 spezifischer mAb im Vergleich mit costimulatorischen mAb,Treatment with superagonistic CD28 specific mAb in comparison with costimulatory mAb,
Fig. 16: Wirkung gegen EAN durch Gabe superagonistischer CD28 spezifischer mAb vor der Immunisierung mit dem EAN induzierenden Autoantigen,16: Effect against EAN by administration of superagonistic CD28-specific mAbs before immunization with the EAN-inducing autoantigen,
Fig. 17: Behandlung entsprechend Fig. 15, jedoch mit abweichendem Behandlungsplan,Fig. 17: Treatment corresponding to Fig. 15, but with a different treatment plan,
Fig. 18: Behandlung entsprechend Fig. 15, jedoch für den Fall der passiven bzw. adoptiv-Transfer EAN,Fig. 18: Treatment according to Fig. 15, but for the case of passive or adoptive transfer EAN,
Fig. 19: Sortierung humaner CD4+ Zellen in CD4+CD25+++ und CD4+CD25- T-Zellen,19: sorting of human CD4 + cells into CD4 + CD25 +++ and CD4 + CD25- T cells,
Fig. 20: Wachstumskurven von durch erfindungsgemäße monoklonale Antikörper und IL-2 expandierten T-Zellen aus Fig. 19 (sortiert) , Fig. 21; CTLA-4 Expression der expandierten T-Zellen aus Fig. 20,20: growth curves of T cells from FIG. 19 expanded by monoclonal antibodies according to the invention and IL-2 (sorted), Fig. 21; CTLA-4 expression of the expanded T cells from FIG. 20,
Fig. 22: Funktionelle Analyse der expandierten T-Zellen aus Fig. 20 mittels eines Suppressions-Assays, A:22: Functional analysis of the expanded T cells from FIG. 20 by means of a suppression assay, A:
Proliferation der Indikatorzellen ohne und mit Stimulation (CD3/anti CD28), B: Unterdrückung der Proloferation der Indikatorzellen in Anwesenheit expandierter CD4+CD25+++ T-Zellen.Proliferation of the indicator cells with and without stimulation (CD3 / anti CD28), B: suppression of the proloferation of the indicator cells in the presence of expanded CD4 + CD25 +++ T cells.
Fig. 1 zeigt die Stimulation frisch isolierter T-Lymphozyten der Ratte in Form eines 3H-Thymidin-Einbaus . Die Methodik entspricht jener, wie in der Literaturstelle W098/54225 beschrieben, auf welche hier und folgend vollumfänglich Bezug genommen wird und deren Offenbarungsinhalt hiermit in den vorliegenden Text inkorporiert wird. In der Fig. la ist die Costimulation gezeigt, d. h. in allen Näpfen waren T-Zellrezeptor (TCR) -spezifische mAb an die Plastikoberfläche gebunden. Mangels Costimulation zeigt die Negativkontrolle (oberste Reihe) keinen Einbau. Costimulation wird sodann durch die Zugabe CD28-spezifischer mAb in löslicher Form gegeben. Zum Einsatz kam die gesamte gezeigte Palette CD28-spezifischer mAb. Diese Serie von verschiedenen CD28-spezifischen mAb stammt aus einem in W098/54225 bereits beschriebenen Ansatz der Immunisierung und Herstellung von Hybridom-Zelllinien. Es handelt sich um Kulturüberstände, die genug CD28-spezifische mAb für eine sättigende Bindung an 2xlO 5 T-Zellen enthielten. Der Figur la ist entnehmbar, daß sämtliche dieser mAb in der Lage sind, costimulierend zu aktivieren, d.h. in Anwesenheit der anti-TCR mAb den Thymidin-Einbau anzuregen. In Fig. lb ist die Stimulation in Abwesenheit TCR-spezifischer mAb gezeigt. Auch dieses Experiment wurde so durchgeführt, wie in der Literaturstelle W098/54225 beschrieben. Man erkennt, daß nur zwei mAb in der Lage sind, in Abwesenheit eines TCR-Signals die T-Lymphozyten zu stimulieren. Diese mAb besitzen also superagonistische Aktivität.1 shows the stimulation of freshly isolated T lymphocytes in the form of a 3H-thymidine incorporation in the rat. The methodology corresponds to that described in reference W098 / 54225, to which full reference is made here and below, and the contents of which are hereby incorporated into the present text. The costimulation is shown in FIG. 1 a, ie T-cell receptor (TCR) -specific mAbs were bound to the plastic surface in all wells. In the absence of costimulation, the negative control (top row) shows no installation. Costimulation is then given in soluble form by the addition of CD28-specific mAb. The entire range of CD28-specific mAb shown was used. This series of different CD28-specific mAbs originates from an approach of immunization and production of hybridoma cell lines already described in WO98 / 54225. The culture supernatants contained enough CD28-specific mAb for saturating binding to 2 × 10 5 T cells. It can be seen from FIG. 1 a that all of these mAb are capable of activating in a costimulating manner, ie in the presence of the anti-TCR mAb the thymidine incorporation to stimulate. The stimulation in the absence of TCR-specific mAb is shown in FIG. 1b. This experiment was also carried out as described in reference W098 / 54225. It can be seen that only two mAbs are able to stimulate T lymphocytes in the absence of a TCR signal. So these mAb have superagonistic activity.
Im Weiteren wurde untersucht, ob costimulatorische und superagonistische CD28-spezifische mAb an unterschiedliche Bereiche des CD28-Moleküls binden. Die mAb wurden durch Immunisierung von Mäusen mit CD28 der Ratte hergestellt; erwartungsgemäß reagieren sie deshalb alle nicht mit Maus CD28 (nicht gezeigt) . Da die mAb also nur solche Bereiche des Ratten CD28-Moleküls erkennen können, die sich von dem der Maus unterscheiden, wurde zunächst ein Sequenzvergleich zwischen CD28 der Maus und der Ratte vorgenommen (siehe Fig. 2, oberer Teil) . Die Unterschiede zwischen beiden Spezies sind hervorgehoben. Zur Benennung der Aminosäuren wurde der Ein-Buchstaben-Code verwendet. Als Prototypen für einen konventionellen Ratten-CD28-spezifischen mAb wurde JJ319, für einen superagonistischen mAb wurde JJ316 verwendet (siehe W098/54225) .Furthermore, it was investigated whether costimulatory and superagonistic CD28-specific mAbs bind to different areas of the CD28 molecule. The mAbs were prepared by immunizing mice with rat CD28; therefore, as expected, they all do not react with mouse CD28 (not shown). Since the mAb can therefore only recognize those regions of the rat CD28 molecule which differ from that of the mouse, a sequence comparison between CD28 of the mouse and the rat was first carried out (see FIG. 2, upper part). The differences between the two species are highlighted. The one-letter code was used to name the amino acids. JJ319 was used as a prototype for a conventional rat CD28-specific mAb, and JJ316 was used for a superagonistic mAb (see W098 / 54225).
In Figur 3 ist die Kartierung der Bindung gezeigt. Es wurden Expressionsplasmide konstruiert, in denen ein Teil der extrazellulären Domäne von CD28 aus der Maus, ein anderer aus der Ratte stammt. Dies ist jeweils symbolisch durch Balken bzw. Striche dargestellt; rechts daneben ist die Bindung der mAb JJ316 und JJ319 an Maus-Fibroblasten (L929-Zellen) gezeigt, die mit diesen Expressionsplasmiden transfiziert worden waren. In den ersten beiden Zeilen der Abb. 3 (m/r und r/m 1-37) wird die Bindung beider Antikörper zur "rechten" Hälfte der Sequenz kartiert: Beide binden, wenn diese aus der Ratte stammt; Im umgekehrten Konstrukt (rm CD28 1-37, links Ratte, rechts Maus) findet keine Bindung statt. In der dritten Zeile (m/r CD28 1-66) wird gezeigt, dass JJ316 nicht mehr bindet, während der noch vorhandene Teil der Rattensequenz ("rechts") für die Erkennung durch JJ319 noch ausreicht. Demnach erkennen die beiden mAb unterschiedliche Epitope auf dem CD28-Molekül, und die Bindung des Superagonisten JJ316 muss folglich in dem Bereich zu suchen sein, der in dem Konstrukt der ersten Zeile, nicht aber in dem Konstrukt der dritten Zeile aus der Ratte stammte. Klarer Kandidat dafür ist der in Figur 2 eingekastelte Bereich.The mapping of the binding is shown in FIG. Expression plasmids were constructed in which part of the extracellular domain of CD28 originates from the mouse and another part from the rat. This is represented symbolically by bars and dashes; to the right is shown the binding of mAb JJ316 and JJ319 to mouse fibroblasts (L929 cells) that had been transfected with these expression plasmids. In the first two lines of Fig. 3 (m / r and r / m 1-37) the binding of both antibodies to the "right" half of the sequence is mapped: both bind if this originates from the rat; No binding takes place in the reverse construct (rm CD28 1-37, left rat, right mouse). The third line (m / r CD28 1-66) shows that JJ316 no longer binds, while the part of the rat sequence ("right") that is still available is still sufficient for recognition by JJ319. Accordingly, the two mAb recognize different epitopes on the CD28 molecule, and the binding of the superagonist JJ316 must therefore be sought in the region that originated from the rat in the first line construct, but not in the third line construct. The clear candidate for this is the area encased in FIG. 2.
In den Zeilen 4 und 5 der Figur 3 wurden deshalb zunächst zwei und dann drei Aminosäuren in diesem Bereich des Maus CD28-Moleküls so verändert, dass sie nun die Rattensequenz darstellen. Durch diese "Transplantation" von nur drei Aminosäuren konnte die Bindungsfähigkeit für mAb JJ316, nicht aber (wie erwartet) die von JJ319 übertragen werden. In Tab. 1 sind die Bindungsdaten für die ganze Palette CD28-spezifischer mAb zusammengefasst . Es ergibt sich eine eindeutige Korrelation: Die beiden mAb, die auch ohne TCR-Stimulation funktionieren (Superagonisten) erkennen das besagte ("eingekastelte", Figur 2) Epitop, die konventionellen (nur costimulatorischen) mAb dagegen nicht. Ein costimulatorischer mab (5S35) erkennt das eingekastelte Epitop sehr schwach und bindet sehr stark an das "konventionelle" Epitop.In lines 4 and 5 of FIG. 3, two and then three amino acids in this region of the mouse CD28 molecule were therefore changed so that they now represent the rat sequence. This "transplantation" of only three amino acids enabled the binding ability for mAb JJ316, but not (as expected) that of JJ319 to be transferred. Tab. 1 summarizes the binding data for the entire range of CD28-specific mAbs. There is a clear correlation: the two mAb, which also function without TCR stimulation (superagonists) recognize the said ("encased", Figure 2) epitope, the conventional (only costimulatory) mAb, however, not. A costimulatory mab (5S35) recognizes the encapsulated epitope very weakly and binds very strongly to the "conventional" epitope.
Die nächsten Figuren beschäftigen sich mit superagonistischen human-spezifischen mAb. Auch diese wurden in Mäusen hergestellt, reagieren also nicht mit dem CD28-Molekül der Maus. Die Mäuse wurden mit human-CD28-transfizierten A20/J Maus B-Lymphomzellen immunisiert (siehe W098/54225) und zusätzlich vor der Fusion mit käuflich erhältlichem human CD28-FCThe next figures deal with superagonistic human-specific mAbs. This too were made in mice, so they do not react with the mouse CD28 molecule. The mice were immunized with human CD28-transfected A20 / J mouse B lymphoma cells (see WO98 / 54225) and additionally before the fusion with commercially available human CD28-FC
Fusionsprotein geboostert (von R und D Systems gekauft) . In einer Serie von Fusionsexperimenten wurden aus mehreren Tausend Zelllinien ca. 20 identifiziert, die human-CD28 spezifische mAb produzieren (Bindung an Maus L929 Zellen, die human-CD28 exprimieren, aber nicht an untransfizierte L929 Zellen) , analog zum Screen in der Literaturstelle W098/54225. Von diesen zeigten zwei die gesuchte superagonistische Aktivität (9D7 und 5.11A), während alle neuen mAb konventionelle costimulatorische Aktivität besitzen. Im Weiteren werden insbesondere die beiden superagonistischen mAb beschrieben. Als Beispiel für einen konventionellen human-CD28-spezifischen mAb wird der ebenfalls neu generierte mAb 7.3B6 verwendet.Fusion protein boosted (purchased from R and D Systems). In a series of fusion experiments, approximately 20 were identified from several thousand cell lines that produce human CD28-specific mAbs (binding to mouse L929 cells that express human CD28 but not to untransfected L929 cells), analogously to the screen in reference W098 / 54,225th Two of these showed the desired superagonistic activity (9D7 and 5.11A), while all new mAbs have conventional costimulatory activity. The two superagonistic mAbs are described in particular below. The newly generated mAb 7.3B6 is used as an example of a conventional human CD28-specific mAb.
Figur 4a zeigt, dass die verwendeten Präparate der drei neuen mAb vergleichbar gut und auch mit vergleichbarem Titer an menschliche T-Lymphozyten binden. Gezeigt ist ein Experiment, in dem frisch isolierte mononukleäre Zellen aus dem menschlichen Blut (sog. PBMC) zunächst mit verschiedenen Verdünnungsstufen der eingesetzten mAb auf Eis behandelt wurden; dann wurde gewaschen und der gebundene mAb durch einen Fluoreszenz-Farbstoff markierten Sekundärantikörper sichtbar gemacht, der spezifisch die gebundenen Maus mAb erkennt. Durch Verwendung eines weiteren mAb, der menschliche CD4 T-Zellen detektiert und an den ein zweiter Fluoreszenz-Farbstoff gebunden war, konnte die Bindung der titrierten mAb durch elektronisches gating selektiv für CD4 T-Lymphozyten bestimmt werden. Angegeben ist mit "MFI" die durchschnittliche Fluoreszenzintensität, die ein Maß für die Menge des gebundenen CD28-spezifischen mAb darstellt. Die Konzentrationen stellen 3-fach Verdünnungen eines standardisierten 'Ausgangspräparats dar. Es ist durchaus normal, dass bei diesem Test die höchste Konzentration ein schwächeres Signal gibt als die folgenden Titrationsschritte; dies hat mit der Avidität (bivalente Bindung) von mAb zu tun und spielt in den hier diskutierten Zusammenhängen keinerlei Rolle.FIG. 4a shows that the preparations used for the three new mAbs bind to human T lymphocytes comparatively well and also with a comparable titer. An experiment is shown in which freshly isolated mononuclear cells from human blood (so-called PBMC) were first treated with various dilution levels of the mAb used on ice; then it was washed and the bound mAb visualized by a fluorescent dye-labeled secondary antibody that specifically recognizes the bound mouse mAb. Using another mAb, which detects human CD4 T cells and to which a second fluorescent dye was bound, the binding of the titrated mAb could be determined selectively for CD4 T lymphocytes by electronic gating. "MFI" indicates the average fluorescence intensity, which is a measure of the amount of bound CD28-specific mAb. The concentrations represent 3-fold dilutions of a standardized 'starting preparation. It is quite normal that the highest concentration gives a weaker signal than the following titration steps in this test; this has to do with the avidity (bivalent binding) of mAb and plays no role in the contexts discussed here.
Die Figuren 4b und c vergleichen die Fähigkeiten superagonistischer human-CD28-spezifischen mAb mit jenen konventioneller CD28-spezifischer mAb - in An- und Abwesenheit eines ' TCR-Signals - frisch isolierte menschliche T-Zellen zum Wachstum zu stimulieren. Gezeigt ist wiederum ein 3H-Thymidin Einbau, wie vorstehend für die Ratte beschrieben. Für Figur 4b waren die Näpfe mit einem mAb beschichtet, der mit dem menschlichen TCR/CD3-Komplex reagiert. Es wurde also Costimulation gemessen. Man erkennt, daß die Proliferation ohne Costimulation mit einem der mAb ausbleibt (Negativkontrolle) , alle drei Antikörper sind jedoch in der Lage, die Zellteilung zu stimulieren. Für Figur 4c wurde in Abwesenheit eines TCR/CD3-spezifischen mAb gearbeitet. Nur die Antikörper 9D7 und 5. ILA konnten superagonistisch stimulieren.Figures 4b and c compare the ability of superagonistic human CD28-specific mAb with that of conventional CD28-specific mAb - in the presence and absence of a ' TCR signal - to stimulate freshly isolated human T cells to grow. A 3H-thymidine incorporation is again shown, as described above for the rat. For Figure 4b, the wells were coated with a mAb that reacts with the human TCR / CD3 complex. So costimulation was measured. It can be seen that there is no proliferation without costimulation with one of the mAbs (negative control), but all three antibodies are able to stimulate cell division. For Figure 4c was worked in the absence of a TCR / CD3 specific mAb. Only antibodies 9D7 and 5. ILA were able to stimulate superagonistically.
Nachdem das Epitop für superagonistische mAb bei der Ratte definiert ist und zwei neue superagonistische mAb mit Spezifität für menschliches CD28 isoliert worden waren, wurde überprüft, ob diese mAb an die entsprechende Stelle des menschlichen CD28-Moleküls binden. Wie aus Figur 2 ersichtlich, unterscheiden sich die CD28-Moleküle der Maus und des Menschen in zahlreichen Positionen. Aufbauend auf der Kartierung des superagonistischen Epitops bei der Ratte wurde deshalb direkt geprüft, ob sich die Bindungsstelle für das superagonistische Epitop auf menschlichem CD28 auf das CD28-Molekül der Maus durch "Transplantation" der fünf Aminosäuren dieses homologen Bereiches erreichen lässt. Die Ergebnisse sind in der Figur 5 gezeigt. Vor dem Hintergrund der homogen dargestellten Maus-Sequenz für die extrazelluläre Domäne des CD28Moleküls (Mitte) sind als Striche die ausgetauschten (Maus zu human) Aminosäurepositionen dargestellt (unten) . Die Zahlen an der Seite geben zusätzlich noch die einzelnen Positionen und Mutationen an (F60V bedeutet z.B., dass an Position 60 das Phenylalanin der Maus durch ein Valin der menschlichen Sequenz ersetzt wurde) . Daneben ist die Bindung der drei untersuchten mAb dargestellt. Wie die Abbildung zeigt, erkennen zwar alle drei mAb menschliches CD28, nur die beiden mab 9D7 und 5.11A reagieren jedoch mit dem Maus CD28-Molekül, dem die fünf Aminosäuren des menschlichen CD28 an der entscheidenden Stelle transplantiert worden waren. Angesichts der Vielfalt von Unterschieden ist diese gezielte Herstellung der Reaktivität überraschend und bestätigt in vollem Maße die aus den Experimenten mitAfter the epitope for superagonistic mAb was defined in the rat and two new superagonistic mAb with specificity for human CD28 had been isolated, it was checked whether these mAb bind to the corresponding site of the human CD28 molecule. As from Figure 2 the mouse and human CD28 molecules differ in numerous positions. Based on the mapping of the superagonistic epitope in the rat, it was therefore checked directly whether the binding site for the superagonistic epitope on human CD28 on the CD28 molecule of the mouse can be achieved by "transplanting" the five amino acids of this homologous region. The results are shown in FIG. 5. Against the background of the homogeneously represented mouse sequence for the extracellular domain of the CD28 molecule (center), the exchanged (mouse to human) amino acid positions are shown as dashes (bottom). The numbers on the side also indicate the individual positions and mutations (F60V means, for example, that at position 60 the phenylalanine in the mouse has been replaced by a valine of the human sequence). The binding of the three mAb investigated is also shown. As the figure shows, all three mAb recognize human CD28, but only the two mab 9D7 and 5.11A react with the mouse CD28 molecule, to which the five amino acids of human CD28 had been transplanted at the crucial point. In view of the variety of differences, this targeted production of the reactivity is surprising and fully confirms that from the experiments
Ratten CD28 abgeleitete Erkenntnis, dass superagonistische mAb an eine bestimmte, nämlich diese Stelle des Moleküls binden müssen.Rats CD28 derived knowledge that superagonistic mAb must bind to a specific, namely this point of the molecule.
In Figur 6 ist ein dreidimensionales Modell des CD28-Moleküls gezeigt. Die neu identifizierte Bindungsregion ist hervorgehoben. Sie entspricht der eingekastelten Sequenz in Figur 2. Die extrazelluläre Domäne von CD28 gehört strukturell zur sog. Immunglobulin-Superfamilie, die sich durch zwei übereinanderliegende ß-Faltblätter als Grundstruktur auszeichnet. Die Beschriftung dieser Bänder erfolgt nach einem in der Literatur vorgegebenen Muster. Wichtig für die hier gezeigte Darstellung ist, dass die als Epitop für superagonistische CD28-spezifische mAb in Ratte und Maus identifizierte Region als "C'-D loop" bezeichnet wird. Es wurde also gezeigt, dass mAb mit Spezifität für den C'-D Loop des CD28-Moleküls superagonistische Aktivität besitzen, also im Sinne der Literaturstelle W098/54225 zur Aktivierung von T-Lymphozyten eingesetzt werden können. Die superagonistische Aktivität C'-D Loop spezifischer mAb in Ratte und Mensch zeigt, dass es dabei nicht auf die Sequenz des Epitops, sondern auf seine Lage bzw. Form ankommt .A three-dimensional model of the CD28 molecule is shown in FIG. The newly identified binding region is highlighted. It corresponds to the encased sequence in Figure 2. The extracellular The domain of CD28 belongs structurally to the so-called immunoglobulin superfamily, which is characterized by two ß-leaflets one above the other as the basic structure. These tapes are labeled according to a pattern given in the literature. It is important for the representation shown here that the region identified as an epitope for superagonistic CD28-specific mAbs in rats and mice is referred to as "C'-D loop". It has thus been shown that mAb with specificity for the C'-D loop of the CD28 molecule have superagonistic activity, that is to say can be used in the sense of literature reference W098 / 54225 for activating T lymphocytes. The superagonistic activity of the C'-D loop of specific mAbs in rats and humans shows that it is not the sequence of the epitope that matters, but its location or shape.
In den Experimenten der Fig. 7 wurde untersucht, ob erfindungsgemäße mAb nicht nur binden (siehe Figuren 3 und 5), sondern ob auch tatsächlich eine Aktivierung erfolgt. Hierfür wurden T-Tumorzellen der Maus, BW, entweder mit dem Konstrukt der Figur 3, Zeile 5, (Ratten C'-D Loop Übertragung) oder mit dem Konstrukt der Figur 5, Zeile 3, (human C'-D Loop) transfiziert . Die Aktivierung dieser Zellen wird nicht durch Zellteilung gemssen (sie proliferieren ohnehin) , sondern durch die Produktion des Zytokins IL-2. Figur 7 zeigt, daß ohne Stimulation keine IL-2 Produktion erfolgt (Negativkontrolle) . Stimulation mit einem T-Zellrezeptor-spezifischen mAb induziert IL-2 Produktion (Positivkontrolle) . Figur 7a zeigt zeigt die Ergebnisse, bei Einsatz des superagonistischen mAb JJ316 der Ratte, während Figur 7b Ergebnisse für den human C'-D Loop spezifischen mAb 5.11A zeigt. In beiden Fällen werden die jeweiligen Zelllinien zur IL-2 Produktion stimuliert. Erwartungsgemäß erfolgt die Stimulierung jedoch nicht mittels "konventioneller" CD28 spezifischer mAb, da diese nicht nur nicht an das C'-D Loop bindet, sondern das Kontrukt überhaupt nicht erkennen können, weil sie für ratten- nzw. humanspezifische Sequenzen spezifisch sind, die in dem Konstrukt nicht enthalten sind.In the experiments in FIG. 7, it was investigated whether mAb according to the invention not only bind (see FIGS. 3 and 5), but also whether activation actually takes place. For this purpose, mouse T tumor cells, BW, were either transfected with the construct of FIG. 3, line 5, (rat C'-D loop transmission) or with the construct of FIG. 5, line 3, (human C'-D loop) , The activation of these cells is not measured by cell division (they proliferate anyway), but by the production of the cytokine IL-2. FIG. 7 shows that there is no IL-2 production without stimulation (negative control). Stimulation with a T cell receptor-specific mAb induces IL-2 production (positive control). FIG. 7a shows the results when using the rat superagonistic mAb JJ316, while FIG. 7b shows results for the mAb 5.11A specific for human C'-D loop. In both cases stimulated the respective cell lines for IL-2 production. As expected, however, the stimulation is not carried out by means of "conventional" CD28-specific mAb, since these not only do not bind to the C'-D loop, but cannot recognize the construct at all, because they are used for rat or are human-specific sequences that are not included in the construct.
In der Figur 9 sind Dot Plots gezeigt, bei denen jede gemessene Zelle durch einen Punkt dargestellt ist. Die phänotypische Charakterisierung der regulatorischen T-Zellen erfolgte dabei durch Kombination der Zeiloberflächenmoleküle CD4 und CD25. Hierzu werden die Zellsuspensionen mit entsprechend Fluoreszenzfarbstoff- markierten monoklonalen Antikörpern gegen CD4 bzw. CD25 • inkubiert, gewaschen und in einem Durchflußzytophotometer auf Bindung dieser Antikörper untersucht. Die gezeigten Ergebnisse wurden drei Tage nach i.p. Injektion eines costimulatorischen (Fig. 9a, JJ319) oder superagon- istischen CD28 spezifischen mAb (Fig. 9b, JJ316) erhalten. Im Falle von JJ319 sind etwa 7% der CD4 T-Zellen auch CD25 positiv (4/(50+4)), was nicht gezeigten Ergebnissen in unbehandelten Tieren entspricht. Dagegen sind nach Behandlung mit JJ316 ca. 20% CD4+CD25+ (10/(10+40)). Zudem ist das Niveau der CD25 Expression weitaus höher als im Kontrolltier. Ein solch hohes Niveau ist charakteristisch für regulatorische T-Zellen.FIG. 9 shows dot plots in which each measured cell is represented by a point. The phenotypic characterization of the regulatory T cells was carried out by combining the cell surface molecules CD4 and CD25. For this purpose the cell suspensions are incubated with corresponding fluorescent dye labeled monoclonal antibodies to CD4 or CD25 •, washed and examined these antibodies in a Durchflußzytophotometer for binding. The results shown were obtained three days after ip injection of a costimulatory (Fig. 9a, JJ319) or superagonistic CD28 specific mAb (Fig. 9b, JJ316). In the case of JJ319, about 7% of the CD4 T cells are also CD25 positive (4 / (50 + 4)), which corresponds to results not shown in untreated animals. In contrast, after treatment with JJ316, approximately 20% are CD4 + CD25 + (10 / (10 + 40)). In addition, the level of CD25 expression is much higher than in the control animal. Such a high level is characteristic of regulatory T cells.
Die Figur 10 zeigt eine phänotypische Charakterisierung in Darstellung als Histogramm. Dabei wurde in den Figuren 10a bis 10c der Marker CD45RC detektiert, eine hochmolekulare Isoform des CD45 Moleküls, welche auf naiven CD4 T-Zellen stark, auf stimulierten CD4 T-Zellen jedoch niedrig exprimiert wird. Eine niedrige Expression ist für regulatorische T-Zellen typisch. Fig. 10a zeigt, daß CD4+CD25- Zellen aus unbehandelten Tieren CD45RC mehrheitlich stark exprimieren. Dagegen findet im Falle von CD4+CD25+ Zellen aus unbehandelten Tieren starkeFIG. 10 shows a phenotypic characterization in the form of a histogram. The marker CD45RC was detected in FIGS. 10a to 10c, a high molecular isoform of the CD45 molecule, which is strong on naive CD4 T cells but low on stimulated CD4 T cells is expressed. Low expression is typical of regulatory T cells. 10a shows that CD4 + CD25 cells from untreated animals mostly express CD45RC strongly. In contrast, in the case of CD4 + CD25 + cells from untreated animals, strong ones are found
Expression nur in einer deutlichen Minderheit aller Zellen statt (Fig. 10b) . Im Falle der Behandlung mit dem superagonistischen CD28 spezifischen mAb (Fig. 10c) ist die Herunterregulierung von CD45CD45RC noch weitaus stärker ausgeprägt als im Falle der Figur 10b. Im Falle der Figuren lOd bis lOe das von regulatorischen T-Zellen konstitutiv exprimierte CD152 (CTLA-4) durch Anfärbung detektiert. Diese Anfärbung muß aufgrund der intrazellulären Lokalisation von CD152 nach Permeabilisierung fixierter Zellen durchgeführt werden und ist deshalb mit einem unspezifischen Hintergrund behaftet. Zur Kontrolle hierauf wurde eine sogenannte Isotypenkontrolle mitgefahren, i.e. es wurde eine intrazelluläre Anfärbung mit einem mAb der gleichen Immunglobulinklasse, welcher jedoch nichts spezifisch erkennen kann, durchgeführt. Der spezifische CD152 Nachweis ergibt sich dabei als Verschiebung des CD152 Histogramms gegenüber dem Isotyp-Kontrollhistogramm. Man erkennt in Fig. lOd keine Verschiebung und folglich keine CD152 Expression in den CD4+CD25- Zellen. In den unbehandelten CD4+CD25+ Zellen ist eine schwache Verschiebung (Fig. lOe) und in den JJ316 (superagonistischer CD28 spezifischer mAb) behandelten Zellen eine stärkere Verschiebung erkennbar in Übereinstimmung mit den Ergebnissen der Figuren 10a bis 10c. Im Ergebnis ist mit den Figuren 9 und 10 phänotypisch gezeigt, wie regulatorische T-Zellen identifizierbar sind, und daß superagonistische CD28 spezifische mAb in vivo regulatorische CD4 T-Zellen präferentiell vermehren bzw. induzieren.Expression took place only in a clear minority of all cells (Fig. 10b). In the case of treatment with the superagonistic CD28-specific mAb (FIG. 10c), the down-regulation of CD45CD45RC is much more pronounced than in the case of FIG. 10b. In the case of FIGS. 10d to 10e, the CD152 (CTLA-4) constitutively expressed by regulatory T cells is detected by staining. This staining has to be carried out due to the intracellular localization of CD152 after permeabilization of fixed cells and is therefore associated with an unspecific background. To check this, a so-called isotype control was carried out, ie an intracellular staining was carried out with a mAb of the same immunoglobulin class, which, however, cannot recognize anything specifically. The specific CD152 detection results as a shift of the CD152 histogram compared to the isotype control histogram. There is no shift in FIG. 10d and consequently no CD152 expression in the CD4 + CD25 cells. In the untreated CD4 + CD25 + cells, a slight shift (FIG. 10e) and in the JJ316 (superagonistic CD28-specific mAb) treated cells, a stronger shift can be seen in accordance with the results of FIGS. 10a to 10c. As a result, FIGS. 9 and 10 show phenotypically how regulatory T cells can be identified and that superagonistic CD28-specific mAb preferentially increase or induce regulatory CD4 T cells in vivo.
In der Figur 11 wurden CD4+CD25+ Zellen durch elektronische Zellsortierung entweder aus unbehandelten Ratten (Fig. 11a) oder aus mit JJ316 behandelten Ratten (Fig. 11b) isoliert und in 96 Napfplatten gemäß dem Stand der Technik kultiviert. Zellvermehrung wurde durch 3H Thymidineinbau zwischen Tag 2 und 3 der Kultivierung gemessen. " (-) " bedeutet keine Stimulierung, Kostimulation bedeutet Stimulation mit einem nicht-superagonistischen CD28 spezifischen mAb (JJ319) sowie mit dem TCR-spezifischen R73, und JJ316 zeigt die superagonistische Stimulation. Sowohl Fig. 11a als auch 11b zeigen, daß regulatorische T-Zellen schlecht auf Kostimulation, jedoch gut auf Stimulation mit einem superagonistischen CD28 spezifischen mAb reagieren. Stimulation mit erfindungsgemäß eingesetzten mAb zeigt also auch in Zellkultur eine beachtliche Vermehrung regulatorischer T-Zellen.In FIG. 11, CD4 + CD25 + cells were isolated by electronic cell sorting either from untreated rats (FIG. 11a) or from rats treated with JJ316 (FIG. 11b) and cultured in 96 well plates according to the prior art. Cell proliferation was measured by 3H thymidine incorporation between days 2 and 3 of cultivation. "(-)" means no stimulation, costimulation means stimulation with a non-superagonistic CD28 specific mAb (JJ319) as well as with the TCR specific R73, and JJ316 shows the superagonistic stimulation. Both Figures 11a and 11b show that regulatory T cells react poorly to costimulation, but well to stimulation with a superagonistic CD28 specific mAb. Stimulation with mAb used according to the invention thus shows a considerable increase in regulatory T cells even in cell culture.
Figur 13 zeigt eine Darstellung entsprechend Figur lOf, jedoch nach in vitro Stimulation mit superagonistischen CD28 spezifischen mAb (JJ316) . Man erkennt eine noch stärker nachweisbare CD152 Expression.FIG. 13 shows a representation corresponding to FIG. 10f, but after in vitro stimulation with superagonistic CD28-specific mAbs (JJ316). An even more detectable CD152 expression can be seen.
In der Figur 13 ist die inhibitorische Funktion regulatorischer T-Zellen auf CD4+CD25- T-Zellen, welche als Indikatorzellen für den suppressorischen Effekt dienen, dargestellt. Als Stimulus für die CD4+CD25- T-Zellen wurde Kostimulation (R73 + JJ319) verwendet. Gemessen wurde der 3H Thymidineinbau zwischen Tag 2 und 3 der Kultivierung. CD25+ bedeutet elektronisch sortierte CD4+CD25+ T-Zellen aus drei Tage zuvor mit superagonistischen CD28 spezifischen mAb (JJ316) behandelten Tieren. CD25- steht für die Indikatorzellen. CD25+/CD25- bedeutet in Fig. 13a, daß beide Zellpopulationen zu gleichen Teilen miteinader gemischt wurden. Man erkennt, daß die CD25+ Zellen auf Kostimulation nicht mit Proliferation reagieren. Zudem wird zusätzlich die Proliferation von Indikatorzellen unterdrückt. In der Figur 13b ist eine Titration der regulatorischen T-Zellen durch Mischung mit Indikatorzellen in verschiedenen Mengenverhältnissen dargestellt. Man erkennt, daß selbst bei einem Verhältnis regulatorischer zu Indikatorzellen von 1:16 noch Suppression zu beobachten ist. Dies zeigt die hohe Effektivität der mit erfindungsgemäß verwendeten mAb stimulierten regulatorischen Zellen.FIG. 13 shows the inhibitory function of regulatory T cells on CD4 + CD25 T cells, which serve as indicator cells for the suppressive effect. As a stimulus for the CD4 + CD25- T cells were used for costimulation (R73 + JJ319). The 3H thymidine incorporation was measured between days 2 and 3 of the cultivation. CD25 + means electronically sorted CD4 + CD25 + T cells from animals treated three days earlier with superagonistic CD28-specific mAb (JJ316). CD25- stands for the indicator cells. CD25 + / CD25- in Fig. 13a means that both cell populations were mixed together in equal parts. It can be seen that the CD25 + cells do not respond to costimulation with proliferation. In addition, the proliferation of indicator cells is suppressed. FIG. 13b shows a titration of the regulatory T cells by mixing them with indicator cells in different proportions. It can be seen that suppression can still be observed even when the ratio of regulatory to indicator cells is 1:16. This shows the high effectiveness of the regulatory cells stimulated with mAb used according to the invention.
Figur 14 zeigt einen Vergleich der Reaktionen humaner CD4+CD25- T-Zellen (naive Zellen) zu CD4+CD25+ T-Zellen (regulatorische Zellen) in Antwort auf Kostimulation (anti-CD3 + konventionelle anti-CD28 mAb) bzw. auf human-spezifische superagonistische CD28 spezifische mAb (9D7 und 5.11A). Die Versuche entsprechen jenen, wie vorstehend für die Ratte beschrieben. Von links beginnend zeigen die ersten drei Gruppen unstimulierte Kontrollen (kein 3H Thymidineinbau) . Es handelt sich dabei um die gesamten CD4+ T-Zellen, dann die durch Sortierung gewonnene CD25- Fraktion und schließlich die durch Sortierung gewonnene CD25+ Fraktion, "med" bedeutet Medium. Hieran schließen sich zwei Gruppen an, bei welchen superagonistisch stimuliert wurde (9D7 und 5.11A). Man erkennt, daß die regulatorischen T-Zellen auf die Stimulation mit superagonistischen CD28 spezifischen mAb im Vergleich zur Gesamtpopulation der CD4+ Zellen und ihrer CD25- Fraktion besser reagieren. Die letzte Dreiergruppe zeigt die Ergebnisse der konventionellen Kostimulation. Hier ist demgegenüber die Reaktion der ungetrennten T-Zellen sowie der CD25- Fraktion eher besser.FIG. 14 shows a comparison of the reactions of human CD4 + CD25 T cells (naive cells) to CD4 + CD25 + T cells (regulatory cells) in response to costimulation (anti-CD3 + conventional anti-CD28 mAb) or to human specific superagonistic CD28 specific mAb (9D7 and 5.11A). The experiments correspond to those described above for the rat. Starting from the left, the first three groups show unstimulated controls (no 3H thymidine incorporation). These are the entire CD4 + T cells, then the CD25 fraction obtained by sorting and finally the CD25 + fraction obtained by sorting, "med" means medium. This is followed by two groups, in which was stimulated superagonistically (9D7 and 5.11A). It can be seen that the regulatory T cells react better to the stimulation with superagonistic CD28-specific mAbs compared to the total population of the CD4 + cells and their CD25 fraction. The last group of three shows the results of conventional costimulation. In contrast, the reaction of the unseparated T cells and the CD25 fraction is rather better.
Im Ergebnis ist sowohl für Ratten T-Zellen als auch im humanen System belegt, daß superagonistische CD28 spezifische mAb regulatorische T-Zellen besser induzieren bzw. vermehren als konventionelle Kostimulation. Weiterhin ist belegt, daß dies auch im intakten Organismus verifiziert werden kann.As a result, it is proven both for rat T cells and in the human system that superagonistic CD28-specific mAbs induce or increase regulatory T cells better than conventional costimulation. It is also proven that this can also be verified in the intact organism.
In Figur 15 ist der Krankheitsverlauf der aktiven EAN unter Behandlung mit verschiedenen mAb dargestellt. Verwendet wurden 7-8 Wochen alte weibliche LEW Ratten erhältlich vom Charles River Laboratories (Sulzfeld, Deutschland) . Die Tiere wurden mit einem synthetischen Peptid immunisiert, welches einem Teil des Myelinproteins P2, das periphere Nervenfasern umhüllt, entspricht (Aminosäuren 53-78 des bovinen P2 Proteins, 50μl einer 0,5mg/ml Lösung, Inokulation in den Fußballen) . Nach ca. 10 Tagen entwickelt sich eine progressive Lähmung, welche nach einem standardisierten Scoring (King et al., Exp Neurol, 87:9-19 (1985) quantifiziert werden kann. Figur 15a zeigt eine präventive Therapie mit superagonistischen CD28 spezifischen mAb (JJ316) und Figur 15b Behandlung mit konventionellen mAb (JJ319) . Die Applikation erfolgte in lmg/Tier Dosen i.p. entweder am Tag der P2 Immunisierung (DO), am Tag 12 (D12) , i.e. nach Beginn der Symptome, oder an beiden Tagen. Die verschiedenen Gruppen umfaßten 3 bis 6 Tiere. Ein Vergleich der Figuren 15a und 15b zeigt, daß die Behandlung mit superagonistischen CD28 spezifischen mAb deutlich wirksamer ist ist als eine Behandlung mit konventionellen mAb.FIG. 15 shows the course of the disease of the active EAN under treatment with various mAbs. 7-8 week old female LEW rats available from Charles River Laboratories (Sulzfeld, Germany) were used. The animals were immunized with a synthetic peptide which corresponds to a part of the myelin protein P2 which surrounds peripheral nerve fibers (amino acids 53-78 of the bovine P2 protein, 50μl of a 0.5mg / ml solution, inoculation in the balls of the feet). After about 10 days, progressive paralysis develops, which can be quantified according to standardized scoring (King et al., Exp Neurol, 87: 9-19 (1985). Figure 15a shows preventive therapy with superagonistic CD28-specific mAbs (JJ316 15b Treatment with conventional mAb (JJ319) The application was carried out ip in lmg / animal doses either on the day of the P2 immunization (DO), on day 12 (D12), ie after the onset of symptoms, or on both days. The different groups included 3 to 6 animals. A comparison of FIGS. 15a and 15b shows that treatment with superagonistic CD28-specific mAb is significantly more effective than treatment with conventional mAb.
Figur 16 zeigt Ergebnisse entsprechend der Figur 15, jedoch bei einer prophylaktischen Behandlung, d-7 ist Behandlung 7 Tage vor der Immunisierung, d-21 21 Tage vor der Immunisierung. Es ist erkennbar, daß ein resistenter Status durch Vermehrung regulatorischer T-Zellen bei Behandlung innerhalb einer Woche vor Immunisierung ereichbar ist, jedoch nicht bei Behandlung 3 Wochen vor der Immunisierung.FIG. 16 shows results corresponding to FIG. 15, but with a prophylactic treatment, d-7 being treatment 7 days before the immunization, d-21 21 days before the immunization. It can be seen that a resistant status can be achieved by increasing regulatory T cells when treated within a week before the immunization, but not when treated 3 weeks before the immunization.
Figur 17 beruht auf einer Vorgehensweise, wie bei Figur 15, jedoch Behandlung mit JJ316 am Tage 0 sowie 4. Figur 17a zeigt den Krankheitsverlauf entsprechend der Darstellung der Figur 15a. Die Figur 17b zeigt elekrophysikalische Eigenschaften, nämlich Geschwindigkeit der Reizleitung als direkter klinischer Parameter für die Schädigung des Ischiasnerves. Die Messungen wurden entsprechend der Literaturstellen Adlkofer et al, . Nat Genet, 11:274-280 (1995) und Heininger et al . , Ann Neurol, 19:44-49 (1986) durchgeführt. Man erkennt den pathologischen Befund anhand der Kontrollgruppen insbesondere in der Verlängerung der Nl und F-Latenzen (siehe Tage 0 und 12, offene Symbole) . Demgegenüber bleiben die Latenzen im Falle der mit superagonistischen CD28 spezifischen mAb (JJ316) behandelten Tieren zwischen Tag 0 und Tag 12 nahezu unverändert (gefüllte Symbole) . Nicht dargestellt sind ergänzende Untersuchungen, mit histologischem Nachweis der T-Zellinfiltration in Dünnschichten der Nerven. Der Nachweis der T-Zellen erfolgt mit einem für diese Technik geeigneten mAb, nämlich B115 und Färbung der T-Lymphozyten. Die Zellkerne wurden andersfarbig gegengefärbt. In Vergleichsversuchen wurde festgestellt, daß in der nicht behandelten Kontrollgruppe eine höhere Zahl von T-Zellen infiltriert waren als in der mit einem superagonistischen CD28 spezifischen mAb (JJ316) behandelten Gruppe, was auf eine Suppression durch regulatorische T-Zellen durch Einsatz erfindungsgemäßer mAb hindeutet.FIG. 17 is based on a procedure as in FIG. 15, but treatment with JJ316 on day 0 and 4. FIG. 17a shows the course of the disease in accordance with the illustration in FIG. 15a. FIG. 17b shows electrophysical properties, namely the speed of the conduction as a direct clinical parameter for the damage to the sciatic nerve. The measurements were carried out according to the literature Adlkofer et al. Nat Genet, 11: 274-280 (1995) and Heininger et al. , Ann Neurol, 19: 44-49 (1986). The pathological findings can be seen in the control groups, particularly in the prolongation of the N1 and F latencies (see days 0 and 12, open symbols). In contrast, the latencies in the case of animals treated with superagonistic CD28-specific mAb (JJ316) remained almost unchanged between day 0 and day 12 (filled symbols). Complementary examinations are not shown, with histological evidence of T cell infiltration in thin layers of the nerves. The T cells are detected using a mAb suitable for this technique, namely B115 and staining of the T lymphocytes. The cell nuclei were counterstained in a different color. In comparative experiments it was found that a higher number of T cells were infiltrated in the untreated control group than in the group treated with a superagonistic CD28-specific mAb (JJ316), which indicates suppression by regulatory T cells by using mAb according to the invention.
Ebenfalls nicht gezeigt sind Experimente, in denen die isolierenden Myelinscheiden angefärbt wurden. Behandlung mit superagonistischen CD28 spezifischen mAb zeigte ein gesundes Bild, während die Kontrollgruppe Demyelinisierung, i.e. Zerstörung der isolierenden Myelinschichten, zeigte.Experiments in which the isolating myelin sheaths were stained are also not shown. Treatment with superagonistic CD28 specific mAb showed a healthy picture, while the control group demyelination, i.e. Destruction of the insulating myelin layers, showed.
In der Figur 18 sind Ergebnisse einer Therapie der passiven oder adoptiv-Transfer EAN (AT-EAN) dargestellt. Diese wird nicht durch Immunisierung mit dem Nervenantigen, wie vorstehend beschrieben, induziert, vielmehr erfolgt eine intravenöse Injektion eines autoreaktiven CD4+ T-Zellklons mit Spezifität für das P2 Myelinantigen (8xl0Λ6, Zelllinie G7) gemäß der Literaturstelle Stienekemeier et al . , Brain, 122:523-535 (1999) . Figur 18a zeigt den Krankheitsverlauf einer Kontrollgruppe, bei Behandlung mit JJ316 am Tag 1 (dl) und bei Behandlung am Tag 3 (d3) . Beachtlich ist, daß selbst nach Beginn der Krankheitssymptome, i.e. Behandlung am Tag 3, die Krankheit gestoppt werden kann. In der Figur 18b ist für die drei Gruppen die Infiltration der Nerven mit T-Zellen quantifiziert worden und man erkennt, daß in der Kontrollgruppe dies zur Schädigung des Nerven führt. Dagegen sind die T-Zellzahlen bei Behandlung mit erfindungsgemäß eingesetzten mAb erheblich niedriger aufgrund der Induktion regulatorischer T-Zellen.FIG. 18 shows results of a therapy of passive or adoptive transfer EAN (AT-EAN). This is not induced by immunization with the nerve antigen, as described above, but rather an intravenous injection of an autoreactive CD4 + T cell clone with specificity for the P2 myelin antigen (8xl0 Λ 6, cell line G7) according to the Stienekemeier et al. , Brain, 122: 523-535 (1999). FIG. 18a shows the course of the disease in a control group, in the case of treatment with JJ316 on day 1 (dl) and in the case of treatment on day 3 (d3). It is remarkable that even after the onset of the symptoms of the disease, ie treatment on day 3, the disease can be stopped. In Figure 18b the infiltration of the nerves with T cells has been quantified for the three groups and it can be seen that this leads to nerve damage in the control group. In contrast, the T cell numbers when treated with mAb used according to the invention are considerably lower due to the induction of regulatory T cells.
In den Experimenten der Figuren 19 bis 22 ist schließlich belegt, dass mittels erfindungsgemäßer monoklonaler Antikörper expandierte CD4+CD25+++ T-Zellen auch nach der Expansion ihre funktionellen Eigenschaften, z.B. die Unterdrückung der Proliferation "konventioneller" T-Zellen, aufrecht erhalten können. Zu diesem Zwecke wurden aus humanen peripheren mononukleären Zellen (PBMC) die CD4+ T-Zellen mittels Magnetseparation gereinigtFinally, in the experiments of FIGS. 19 to 22, it is demonstrated that CD4 + CD25 +++ T cells expanded by means of monoclonal antibodies according to the invention also have their functional properties, e.g. the suppression of the proliferation of "conventional" T cells. For this purpose, the CD4 + T cells were purified from human peripheral mononuclear cells (PBMC) by means of magnetic separation
(negative Depletion von CD8+, CDllb+, CD16+, CD19+, CD36+ und CD56+ Zellen; Reinheit 95%) . Diese Zellen wurden dann mit einem CD25-spezifischen Antikörper und nachfolgend einem PE-konjugierten Sekundärantikörper beladen, in CD4+CD25+++ und CD4+CD25- T-Zellen sortiert (siehe Figur 19) und nach Zugabe von an Dyna-beads gekoppelten erfindungsgemäßen monoklonalen Antikörpern (hulG4) und Interleukin 2 (IL-2) kultiviert (Tag 0) . Am Tag 5 erfolgte eine Färbung der expandierten Zellen mit anti-CD4 und anti CD-25 an der Zelloberfläche, sowie intracellulär mit anti-CTLA-4 und Ki-67. Am Tag 6 erfolgte eine Trennung der Beads von den kultivierten Zellen und Entfernung des IL-2 durch wiederholtes Waschen, gefolgt von 2-tägiger Kultur nur in Medium. Die zwei Subpopulationen vermehrten sich innerhalb von 8 Tagen um das zehnfache (siehe Figur 20) . Die verstärkte Expression des Proteins CTLA-4 in den expandierten CD4+CD25+++ Zellen (siehe Figur 21) ist bereits indiziell dafür, dass diese Zellen ihren regulatorischen Phänotyp beibehalten hatten. Dies wurde anschließend wie folgt durch eine funktioneile Charakterisierung verifiziert.(negative depletion of CD8 +, CDllb +, CD16 +, CD19 +, CD36 + and CD56 + cells; purity 95%). These cells were then loaded with a CD25-specific antibody and subsequently a PE-conjugated secondary antibody, sorted into CD4 + CD25 +++ and CD4 + CD25-T cells (see FIG. 19) and after addition of monoclonal antibodies according to the invention coupled to Dyna-beads ( hulG4) and interleukin 2 (IL-2) cultivated (day 0). On day 5, the expanded cells were stained with anti-CD4 and anti CD-25 on the cell surface, and intracellularly with anti-CTLA-4 and Ki-67. On day 6, the beads were separated from the cultured cells and the IL-2 was removed by repeated washing, followed by culture in medium only for 2 days. The two subpopulations increased tenfold within 8 days (see Figure 20). The increased expression of the protein CTLA-4 in the expanded CD4 + CD25 +++ cells (see FIG. 21) is already an indication that these cells are theirs regulatory phenotype. This was then verified by functional characterization as follows.
Syngene periphere mononukleäre Zellen aus heparinisiertem Vollblut wurden gewonnen und mit dem Fluoreszenz-Farbstoff CFSE (Carboxy Fluorescein Diacetat Succininmidy Ester) markiert. Diese Zellen dienten als Indikatorzellen. Sie wurden zunächst mit anti CD3 und anti CD28 Antikörpern drei Tage lang stimuliert. Mit jeder Zellteilung halbierte sich die Intensität der Markierungsmesswerte dieser IndikatorZeilen (siehe Figur 22a) . In unabhängigen Ansätzen wurden am Tag 8 expandierte CD4+CD25+++ bzw. CD4+CD25- T-Zellen mit den CFSE markierten Indikatorzellen in Verhältnis 1:1 bzw. 1:5 gemischt und kokultiviert (Stimulation mit anti-CD3 mAK, Klon HIT3a, Endkonzentration 0,1 μg/ml, sowie anti-CD-28 mAK, Klon CD28.2, Endkonzentration 0,05 μg/ml). Figur 22b zeigt, dass die Anzahl der Zellteilungen in den Indikatorzellen durch die Anwesenheit der expandierten CD4+CD25+++ T-Zellen stark reduziert wurde, während die CD4+CD25- T-Zellen nur einen geringen Effekt zeigten. Somit ist belegt, dass die mit erfindungsgemäßen monoklonalen Antikörpern expandierten regulatorischen CD4+CD25+++ T-Zellen nach wie vor in der Lage waren, die Proliferation anderer "normaler" T-Zellen zu unterdrücken. Tabelle I: Bindung von anti-Ratten CD28 mAb an Maus- und Ratten CD2S und verschiedene CD28 Mutanten.Syngeneic peripheral mononuclear cells from heparinized whole blood were obtained and labeled with the fluorescent dye CFSE (carboxy fluorescein diacetate succinin midy ester). These cells served as indicator cells. They were initially stimulated with anti CD3 and anti CD28 antibodies for three days. With each cell division, the intensity of the marker measurement values of these indicator lines was halved (see FIG. 22a). In independent approaches, on day 8, expanded CD4 + CD25 +++ or CD4 + CD25-T cells were mixed with the CFSE-labeled indicator cells in a ratio of 1: 1 or 1: 5 and co-cultivated (stimulation with anti-CD3 mAb, clone HIT3a, final concentration 0.1 μg / ml, and anti-CD-28 mAb, clone CD28.2, final concentration 0.05 μg / ml). Figure 22b shows that the number of cell divisions in the indicator cells was greatly reduced by the presence of the expanded CD4 + CD25 +++ T cells, while the CD4 + CD25-T cells showed only a slight effect. It is thus proven that the regulatory CD4 + CD25 +++ T cells expanded with monoclonal antibodies according to the invention were still able to suppress the proliferation of other "normal" T cells. Table I: Binding of anti-rat CD28 mAb to mouse and rat CD2S and various CD28 mutants.
mAb Maus CD28 Ratten CD28 mCD28, S62P m/rCD28 A64V, E65G Mval269ImAb mouse CD28 rats CD28 mCD28, S62P m / rCD28 A64V, E65G Mval269I
Kontr .Control
JJ316 +++ +++ JJ319 +++ +++JJ316 +++ +++ JJ319 +++ +++
5S28 ++ ++5S28 ++ ++
5S38.17 +++ +++5S38.17 +++ +++
5S247 +++ +++5S247 +++ +++
5G40/3 +++ +++ 5G87 ++ ++5G40 / 3 +++ +++ 5G87 ++ ++
5G111 ++ ++5G111 ++ ++
5S35 +++ +++ 5S35 +++ +++

Claims

Patentansprüche : Claims:
1. Verwendung eines CD28-spezifischen superagonistischen monoklonalen Antikörpers (mAb) oder einer Mimikriverbindung hierzu, zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Induktion und/oder Vermehrung regulatorischer T-Zellen in vitro und/oder in vivo.1. Use of a CD28-specific superagonistic monoclonal antibody (mAb) or a facial expression compound therefor, for producing a pharmaceutical composition for inducing and / or multiplying regulatory T cells in vitro and / or in vivo.
2. Verwendung insbesondere nach Anspruch 1 zur Behandlung und/oder Prophylaxe von Autoimmunerkrankungen und/oder Entzündungsreaktionen.2. Use in particular according to claim 1 for the treatment and / or prophylaxis of autoimmune diseases and / or inflammatory reactions.
3. Verwendung insbesondere nach Anspruch 1 zur Behandlung des Guillian-Barre-Syndroms (GBS) oder der chronischen demyelinisierenden Polyneuropathie (CDP) .3. Use in particular according to claim 1 for the treatment of Guillian-Barre syndrome (GBS) or chronic demyelinating polyneuropathy (CDP).
4. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei der mAb herstellbar ist indem ein nichtmenschliches Säugetier mit CD28 oder einer Teilsequenz hieraus, insbesondere dem C'-D Loop, immunisiert wird, wobei aus dem nichtmenschlichen Säugetier Zellen entnommen und aus den Zellen Hybridomzellen hergestellt werden, und wobei die so erhaltenen Hybridomzellen mit der Maßgabe selektiert werden, daß in deren Kulturüberstand mAb enthalten sind, die an CD28 superagonistisch binden.4. Use according to one of claims 1 to 3, wherein the mAb can be produced by immunizing a non-human mammal with CD28 or a partial sequence thereof, in particular the C'-D loop, cells being removed from the non-human mammal and hybridoma cells from the cells are prepared, and the hybridoma cells thus obtained are selected with the proviso that their culture supernatant contains mAb which bind to CD28 superagonistically.
5. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei die Mimikriverbindung erhältlich ist in einem Screeningverfahren, wobei eine prospektive Mimikriverbindung oder eine Mischung von prospektiven Mimikriverbindungen einem Bindungsassay mit CD28 oder einer Teilsequenz hieraus, insbesondere dem C'-D-Loop, unterworfen werden, und wobei an CD28 oder an die Teilsequenz hieraus bindende Wirksubstanzen selektiert werden, ggf. gefolgt von einem Assay zur Prüfung auf superagonistische Stimulation von mehreren bis allen Untergruppen der T-Lymphozyten.5. Use according to one of claims 1 to 4, wherein the facial expression compound is obtainable in one Screening method, in which a prospective mimicriver compound or a mixture of prospective mimicriver compounds are subjected to a binding assay with CD28 or a partial sequence thereof, in particular the C'-D loop, and wherein active substances which bind to CD28 or the partial sequence are selected, optionally followed from an assay to test for superagonistic stimulation of several to all subgroups of T lymphocytes.
6. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei der mAb erhältlich ist aus Hybridomzellen, wie hinterlegt unter den DSM Nummern DSM ACC2531 (mAb: 9D7 bzw. 9D7G3H11) oder DSM ACC2530 (mAb: 5. ILA bzw. ' 5.11A1C2H3) .6. Use according to one of claims 1 to 5, wherein the mAb is obtainable from hybridoma cells, as deposited under the DSM numbers DSM ACC2531 (mAb: 9D7 or 9D7G3H11) or DSM ACC2530 (mAb: 5th ILA or ' 5.11A1C2H3) ,
7. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 10, wobei der mAb oder die Mimikriverbindung eine oder mehrere der7. Use according to any one of claims 1 to 10, wherein the mAb or the Mimikriververbindung one or more of
Sequenzen Seq.-ID 9, 11, 13 und/oder 15, oder eine oder mehrere Sequenzen Seq.-ID 10, 12, 14 und/oder 16, oder eine oder mehrere Sequenzen 18 und/oder 19, oder hierzu homologe Sequenzen enthält.Sequences SEQ ID 9, 11, 13 and / or 15, or one or more sequences SEQ ID 10, 12, 14 and / or 16, or one or more sequences 18 and / or 19, or sequences homologous thereto ,
8. Verfahren zur Behandlung oder Prophylaxe einer Erkrankung nach Anspruch 2 oder 3, wobei entweder8. A method for the treatment or prophylaxis of a disease according to claim 2 or 3, wherein either
einem Patienten eine pharmazeutische Zusammensetzung enthaltend einen CD28-spezifischen superagonistischen monoklonalen Antikörper oder eine Mimikriverbindung hierzu und galenisch hergerichtet für eine definierte und angewandte Darreichungsform, beispielsweise i.v. Injektion, verabreicht wird, odera patient a pharmaceutical composition containing a CD28-specific superagonistic monoclonal antibody or a facial expression compound and galenically prepared for a defined and applied dosage form, for example iv injection, is administered, or
einem Patienten eine Körperflüssigkeit, insbesondere Blut, enthaltend T-Lymphozyten oder Vorläuferzellen hierzu entnommen wird, die Körperflüssigkeit, ggf. nach einer Aufbereitungsverfahrensstufe, mit einem CD28-spezifischen superagonistischen monoklonalen Antikörper oder einer Mimikriverbindung hierzu versetzt wird und die so behandelte Körperflüssigkeit dem Patienten wieder dargereicht, beispielsweise i.v. injiziert, wird. A body fluid, in particular blood, containing T-lymphocytes or progenitor cells is taken from a patient for this purpose, the body fluid, if necessary after a processing step, is mixed with a CD28-specific superagonistic monoclonal antibody or a facial expression compound, and the body fluid treated in this way is again presented to the patient , for example iv injected.
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