DD298283A5

DD298283A5 - METHOD FOR CONTROLLING THE BEGINNING OF CARBON SUBSTRATE LEADING MICROBIAL PRODUCT EDUCATIONS

Info

Publication number: DD298283A5
Application number: DD32396388A
Authority: DD
Inventors: Claus Helmke; Erhard Wolleschensky; Annette Conrad; Karin Porwol; Anneliese Schubert; Dorothea Macha; Karin Treise
Original assignee: Jenapharm Gmbh,De
Priority date: 1988-12-27
Filing date: 1988-12-27
Publication date: 1992-02-13

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Steuerung des Beginns kohlenstoffsubstratgefuehrter mikrobieller Produktbildungsprozesse nach dem Zufuetterungs- und zyklischen Zufuetterungsprinzip. Es werden Kohlenstoffsubstratimpulse mit prozeszangepaszten Substratmengen in das Kulturmedium eingetragen. Der gemessene und der beobachtete Verlauf der Verwertungsintensitaet eines jeden Substratimpulses wird zu dem prozeszspezifischen Sollprofil des Verwertungsverlaufes in Relation gesetzt. Das Verfahren wird dann weitergefuehrt, wenn die Anzahl der auftretenden Verwertungsphasen die des Sollprofiles nicht unterschritten haben, wobei die Verwertungsphasen jeweils durch Zunahme und Abnahme der Verwertungsintensitaet markiert sind. Es werden solange Substratimpulse zudosiert, wie der jeweilige Verlauf der Verwertungsintensitaet im Vergleich zum Sollprofil in der Anzahl der Verwertungsphasen und in den Relationen der Verwertungsphasenzeitspannen abweicht.{Steuerverfahren; Produktbildungsprozesse, mikrobielle; Zufuetterungsprinzip, zyklisch; Kohlenstoffsubstratimpulse; Verwertungsintensitaet; Sollprofil}The invention relates to a method for controlling the onset of carbon substrate-guided microbial product formation processes according to the feeding and cyclic Zufuetterungsprinzip. Carbon substrate pulses with process-adapted substrate amounts are introduced into the culture medium. The measured and observed course of the utilization intensity of each substrate pulse is related to the process-specific desired profile of the utilization process. The method is then continued if the number of recovery phases occurring have not fallen below those of the target profile, wherein the utilization phases are marked in each case by increasing and decreasing the utilization intensity. Substrate pulses are metered in as long as the respective course of the utilization intensity differs from the target profile in the number of utilization phases and in the relations of the utilization phase periods. Product formation processes, microbial; Zufuetterungsprinzip, cyclically; Carbon substrate pulses; Verwertungsintensitaet; Target profile}

Description

Field of application of the invention

Bevorzugtes Anwendungsgebiet sind mikrobielle Produktbildungsprozesse nach dem Zufütterungs- und zyklischen Zufütterungsprinzip, bei denen der mikrobielle Produktbildner in der Zufütterungskomponente des oder der Kohlenstoffsubstrate limitiert versorgt wird und über die definierte Versorgung mit Kohlenstoffsubstraten der Produktbildungsablauf geführt wird.Preferred fields of application are microbial product formation processes according to the feeding and cyclic feeding principle, in which the microbial product-forming agent in the feed component of the carbon substrate or substrates is supplied in a limited manner and the product formation process is conducted via the defined supply of carbon substrates.

Characteristic of the known state of the art

Bei den in der Regel mehrstufig gestalteten Prozessen zur mikrobiellen Produktbildung dienen die dem Produktbildungsabschnitt vorgelagerten Maßnahmen der Bereitstellung einer genügend großen Menge an mikrobiellem Produktbildner. Die Anzuchtstufen dienen gleichfalls der Ausprägung von Stoffwechseleigenschaften und vorteilhafter morphologisjher Eigenschaften für die Prozeßführung. Die Inbetriebnahme der mikrobiellen Produktbildung erfolgt gegenwärtig nachIn the generally multistage processes for microbial product formation, the measures upstream of the product formation section serve to provide a sufficiently large amount of microbial product formers. The cultivation stages also serve the expression of metabolic properties and advantageous morphologisjher properties for process control. Commissioning of microbial product formation is currently underway

- Zeitprogramm,- Time program,

- Zeitprogramm und Kontrollanalytik zu Substratlimitationen,- Time program and control analysis for substrate limitations,

- physikalisch/chemischen Eigenschaften der Submerskulturen,- physical / chemical properties of the submerged cultures,

- mikrobiologisch/morphologischen Beurteilungen- microbiological / morphological assessments

Die Inbetriebnahmemethoden haben folgende Nachteile: The commissioning methods have the following disadvantages:

- Sie ermöglichen nur unzulänglich den Bezug auf den Entwicklungsstand der verfügbaren Biosynthesekapazität,- they insufficiently enable reference to the level of development of available biosynthetic capacity,

- Rückstände an verwertbaren Kohlenstoffquellen aus den Anzuchtphasen werden nicht definiert abgebaut,- Residues of usable carbon sources from the cultivation phases are not degraded in a defined manner,

- die Kontrolle des Substratverwertungsverhaltens fehlt,the control of the substrate utilization behavior is missing,

- Verfahrensübertragungen in andere Reaktoren und in andere Recktormaßstäbe werden nur unzureichend unterstützt.Process transfers to other reactors and to other reactor yardsticks are insufficiently supported.

- industrielle Fermentationen benutzen vorrangig komplexe Nährsubstratquellen mit Schwankungen in deren Zusammensetzung und daraus erwachsenden Anpassungsbedarf in der Prozeßführung - eine Seite, die bei Anwendung der gegenwärtigen Inbetriebnahmemaßnähmen nur mangelhafte Unterstützung erfährt,- industrial fermentations primarily use complex nutrient sources with variations in their composition and the consequent need for adaptation in process management - a side that is poorly supported by current commissioning measures;

- Prozeßanpassungen bei Nährstoff;omponenten- und/oder Zufütterungskomponentenaustausch sind unzureichend unterstützt.- Nutrient process adjustments, component and / or feed component replacement are poorly supported.

Ziel der ErfindungObject of the invention

Ziel der Erfindung ist es:The aim of the invention is:

- leistungsstarke, robuste mikrobielle Produktbildungsprozesse zu schaffen,- to create powerful, robust microbial product formation processes,

- kohlenstotfsubstratgeführte Produktbiidungen optimal vorzubereiten,optimally prepare carbon substrate-guided product preparations;

- die Reproduzierbarkeit der Fermentationen und damit deren Ökonomie zu verbessern,to improve the reproducibility of the fermentations and thus their economy,

- alle Formen von Prozeßanpassungen und -Umstellungen zu beschleunigen und unproduktive Materialaufwendungen zu reduzieren,- speed up all forms of process adjustments and conversions and reduce unproductive material costs,

- variierende Auswirkungen der Prozeßvorgeschichte störungsausgleichend für die Produktbildung zu kompensieren,to compensate for varying effects of process history in order to compensate for product formation,

- Reaktorgegebenheiten, Kulturlösungsbeschaffenheiten und Verwertungscharakteristika der Produktbildner so in die Inbetriebnahme einzubeziehen, daß das Verfahren selbstanpassenden Charakter erhält.- Include reactor conditions, Kulturlösungsbeschaffenheiten and utilization characteristics of the product formers in the commissioning so that the process receives self-adaptive character.

-2- 298 Darlegung des Wesens der Erfindung-2- 298 Explanation of the nature of the invention

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, für kohlenstofflimitierte mikrobielle Produktbildungsprozesse ein Verfahren zur Steuerung des Beginns der kohlenstoffsubstratgeführten Produktbildungen zu schaffen, indem das Verwertungsverhalten des Produktbildners kontrolliert geführt und auf die prozeßspezifischen Verwertungserford jrnisse eingestellt wird. Dabei soll im Komplex der erforderliche Ausprägungsgrad des mikrobiellen Stoffverwertungsvermögens und die Beseitigung von Kohlenstoffresiduen au» den Anzuchtphasen des mikrobiellen Produktbildners erreicht werden. Es ist somit die Aufgabe der Steuerung, für prozeßgerechte Übergänge vcn den Anzuchtphasen der mikrobiellen Produktbildner zu den Produktbildungsphasen zu sorgen und dieses in konzentrierter Sicht für die Kohlenstoffsubstratverwertung zu gestalten. Überraschenderweise bilden diese Maßnahmen zur Verwertungsprofilierung darüber hinaus den Ausgangspunkt fü drastisch leistungsgesteigerte Produktbildungsabläufe und damit für Ertragssteigerungen in der Produktausbeute der Fermentationen. Die verwendeten biotechnologischen Reaktoren für den aseptischen Betrieb besitzen Einrichtungen zur Zuführung des oder der Kohlenstoffsubstrate und zur Messung und/oder Beobachtung des Verlaufes der Verwertungsintensität. Erfindungsgemäß werden zur Lösung der Aufgabe Kohlenstoffsubstratimpulse in das Kulturmedium eingetragen, deren Substratmengen prozeßangepaßt gewählt werden, so daß sich im Verlaufsprofil der Verwertungsintensität deutlich ausgeprägte Verwertungsphasen abzeichnen. Verwertungsphasen sind jeweils durch Zunahme und Abnahme der Verwertungsintensität markiert. Die Maßnahmen zur Steuerung basieren auf dem Vergleich zwischen dem aktuell gemessenen Verlauf und den Merkmalen des prozeßzugeordneten Sollverlaufes der Verwertungsintensität, der die Struktur des Verwertungsverhaltens der Produktbildungskultur repräsentiert, die keine sich störend auswirkenden Kohlenstoffsubstratquellen enthält. Ergibt es sich, daß der gemessene Intensitätsverlauf bei der Verwertung eines Substratimpulses verglichen mit dem Sollverlauf eine geringere Anzahl von Verwertungsphasen enthält, dann müssen die Operationen zur Steuerung des Beginns der Produktbildung abgebrochen werden, da nicht alle Substratbestandteile einer Verwertung unterzogen werden, und es müssen die vorgelagerten Maßnahmen zur Ausprägung der Stoffverwertung komplettiert werden. Ein solches Erscheinungsbild ist nur in Havariefällen zu ei warten, es muß aber unbedingt behandelt werden, da sonst in der Folge störende Substratpufferungen resultieren. Die Subsn^mpulse sind solange zu wiederholen, wie es gegenüber dem Sollprofil zusätzliche Verwertungsphasen gibt Und wie verlängerte Verwertungsphasen auftreten. Mit der Impulsfolge werden in kontrollierter Form Substratpuffer im Kulturmedium abgebaut, sodaß das Verwertungsverhalten auf das Sollverhalten zugeführt wird.The invention has for its object to provide for carbon-limited microbial product formation processes, a method for controlling the beginning of the carbon substrate-guided product formations controlled by the recycling behavior of the product-forming out and adjusted to the process-specific Verwertungserford. In the complex, the required degree of expression of the microbial material utilization capacity and the elimination of carbon residues from the growing phases of the microbial product-forming agent is to be achieved. It is thus the task of the controller to provide process-appropriate transitions from the growth phases of the microbial product formers to the product formation phases and to design this in a concentrated view for the carbon substrate utilization. Surprisingly, these recovery profiling measures also provide the starting point for dramatically enhanced product formation processes and thus yield increases in the product yield of the fermentations. The biotechnological reactors used for aseptic operation have means for feeding the carbon substrate or substrates and for measuring and / or monitoring the course of the utilization intensity. According to the invention, carbon substrate pulses are introduced into the culture medium to solve the problem, the substrate amounts of which are selected to be adapted to the process, so that markedly distinct utilization phases become apparent in the profile of the utilization intensity. Recycling phases are marked in each case by an increase and decrease in the utilization intensity. The measures for the control are based on the comparison between the currently measured course and the characteristics of the process-associated desired course of the utilization intensity, which represents the structure of the utilization behavior of the product-forming culture, which contains no interfering carbon substrate sources. If it is found that the measured intensity course in the utilization of a substrate pulse contains a lower number of utilization phases compared to the desired course, then the operations for controlling the start of product formation must be discontinued, since not all substrate components are subjected to recovery, and the preceded measures for the expression of material recycling are completed. Such an appearance is only to wait in case of an accident to egg, but it must be treated necessarily, otherwise result in the consequence disturbing substrate buffering. The subsumes are to be repeated as long as there are additional utilization phases compared to the target profile and how prolonged utilization phases occur. With the pulse train substrate buffer are degraded in a controlled manner in the culture medium, so that the recovery behavior is fed to the desired behavior.

Ausführungsbelsplel

Das Verfahren zur Steuerung der Inbetriebnahme der Produktbildung wird am Beispiel einer Penicillinfermontation demonstriert. Die Fermentation wird in Form einer Submerskultur in einem 3-m³-Rührkessel durchgeführt. Als mikrobieller Produktbildner kommt eine Selektante von Penicillium crysogenum zum Einsatz. Dessen Selektion und Anzucht erfolgt über Lyophilkonserve, Emersanzucht in Petrischalen, Eprouvettenkulturen mit Streßmedien, Schüttelkulturen, Gerste-Reis-Kultur, durchläuft zwei Impffermentationsstufen und als Produktbildungskultur die primäre Wachstumsphase. Anschließend erfolgt die Fermentation auf der Basis unlimitierter Sauerstoffversorgung und limitierter Versorgung mit Kohlenstoffsubstrat. Die Sauerstoffzufuhr erfolgt über Belüftung und Rührung, miteinander Rührgeschwindigkeit von 135 U/Min, und einem Luftdurchsatz von 1,6Nm³. Ferner wird der Prozeß bei einem pH-Wert von 6,5 und einer Fermentationstemperatur von 25^CC geführt. Diese Werte bleiben in der Phase der Produktbildungsinbetriebnahme unverändert. Als einziges Kohlenstoffsubstrat wird Saccharose zudosiert. Dafür steht an der Fermentationsanlage eine Nachdosierungseinrichtung zur Verfügung, die Zudosierungen unter aseptischen Bedingungen ermöglicht. Die Saccharose wird als wäßrige Lösung (450g Saccharose in 11 Lösung) zugeführt. Als weitere Zudosierungen sind während der Fermentationsphase Ammonsulphat, Ammoniak und Phenylessigsäure erforderlich, die zu Konzentrationskorrekturen in der Kulturlösung dienen. Diese Zugaben werden durch Wertermittlungen aus der Kulturiösungsanalytik geführt, die den Prozeß begleitet. Die Beobachtung des Verlaufes der Verwertungsaktivität erfolgt mit Hilfe eines pO₂-Sensors in der Kulturlösung. Dabei wird eine Verstärkung der Verwertungsaktivität durch Verringerung des pO₂-Wertes, eine Abschwächung der Verwertungsaktivität durch Erhöhung des pO₂-Wertes ausgewiesen. Eine direkte Messung der Verwertungsaktivität wird nicht vorgenommen. Die Kohlenstoffsubstratimpulse bestehen aus Saccharoselösung, die von der Beschaffenheit des Zufütterungssubstrates ist. Zur Anwendung kommen 61-lrnpulse, die über die Nachdosierungseinrichtung der Fermentationsanlage in die Kulturlösung eingetragen werden. Die Produktbildungsinbetriebnahrne erfolgt zur 30. Fermentationsstunde. Das Sollprofil des Verwertungsverlaufes besteht aus 2 Verwertungsphasen von jeweils gleicher Dauer, bei einer zulässigen Abweichung von ±5%. Die Verwertung des ersten Substratimpulses liefert 3 Verwertungsphasen und hat eine Gesamtverwertungsdauer von 2 Stunden. Die Verwertung des 2. Impulses erfolgt mit einer um 50% verlängerten Verwertungsphase im Vergleich zur ersten. Erst der 3.Substratimpuls liefert einen Verwertungsverlauf, der den Sollvorgaben gerecht wird. Mit ihm ist dann das Ende der Inbetriebnahme der Produktbildung erreicht.The procedure for controlling the commissioning of product formation is demonstrated using the example of penicillin mounting. The fermentation is carried out in the form of a submerged culture in a 3 m ³ stirred tank. The microbial product-forming agent used is a selectin of Penicillium crysogenum. Its selection and cultivation takes place via Lyophilkonserve, Emersan breeding in Petri dishes, Eprouvettenkulturen with stress media, shake cultures, barley-rice culture, goes through two Impffermentationsstufen and product culture as the primary growth phase. Subsequently, the fermentation takes place on the basis of unlimited oxygen supply and limited supply of carbon substrate. The oxygen is supplied through aeration and stirring, each stirring speed of 135 rev / min and an air flow rate of 1.6 nm. ³ Further, the process is carried out at a pH of 6.5 and a fermentation temperature of 25 ^C C. These values remain unchanged during the product commissioning phase. Sucrose is added as the only carbon substrate. For this purpose, a replenishment device is available at the fermentation plant, which allows metering under aseptic conditions. The sucrose is supplied as an aqueous solution (450 g of sucrose in 11 solution). As further additions ammonium sulphate, ammonia and phenylacetic acid are required during the fermentation phase, which serve to concentration corrections in the culture solution. These additions are guided by valuations from cultural analysis, which accompanies the process. The observation of the course of the utilization activity is carried out with the aid of a pO ₂ sensor in the culture solution. An increase in the utilization activity is indicated by a reduction in the pO ₂ value, a weakening of the utilization activity by an increase in the pO ₂ value. A direct measurement of the utilization activity is not made. The carbon substrate pulses consist of sucrose solution, which is of the nature of the feed substrate. 61 pulses are used, which are entered into the culture solution via the post-dosing device of the fermentation plant. The Produktbildungsinbetriebnahrne takes place at the 30th fermentation hour. The target profile of the utilization process consists of 2 utilization phases of the same duration, with an allowable deviation of ± 5%. The utilization of the first substrate pulse provides 3 utilization phases and has a total utilization time of 2 hours. The second impulse is used with a 50% longer utilization phase compared to the first one. Only the 3.Substratimpuls provides a recovery course that meets the target specifications. With him then the end of commissioning of the product formation is achieved.

Claims

1. A method for controlling the onset of carbon substrate-guided microbial product formations, characterized in that in microbial product formation processes according to the Zufütterungs- and the cyclic Zufütterungsprinzip carbon substrate pulse are entered into the culture medium and the measured and the observed course of the utilization intensity of each substrate pulse to the process-specific nominal profile of the utilization course in Relation is set and the commissioning of the microbial product formation is continued if the number of recovery phases occurring have not fallen below the target profile, whereby utilization phases are marked in each case by increasing and decreasing the utilization intensity, and for commissioning as long as substrate pulses are dosed as the respective Course of the utilization intensity compared to the target profile in the number of exploitation phases and in the relations of the utilization phase periods from differs.

2. The method according to claim 1, characterized in that as observation variables for assessing the course of the utilization intensity digitally and / or analogously evaluated measuring devices for hydrogen ion concentration and / or dissolved oxygen partial pressure and / or oxygen content in the exhaust air and / or carbon dioxide in the exhaust air and / or out Sizes inferred from these sizes, which contain at least one of the aforementioned sizes, are used.

3. The method according to claim 1 or 2, characterized in that in the culture medium and / or as feed substrates nutrient substrates are used, which are all or partly of a complex nature.