DD297965A5 - Chromogene dibenzoxazepinon- und dibenzothiazepinon-enzymsubstrate - Google Patents
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Abstract
Chromogene Enzymsubstratverbindungen, enthaltend einen * oder * mit einer enzymatisch abspaltbaren Gruppe, wie dem Rest eines Zuckers, einer Carbon-, Aminosaeure, eines Peptids, von Phosphor- oder Schwefelsaeure. Die Substratverbindungen sind im allgemeinen hoch loeslich in waeszrigem Medium und nur leicht gefaerbt und erzeugen durch Enzymspaltung ein Chromogen, das eine grosze Absorptionsverschiebung und einen pKa unterhalb 7 aufweist. Diese Substrate finden Verwendung als Indikatoren zum Nachweis von Enzymanalyten und Enzymen, welche als Markierungsmittel in einer Vielzahl von Assays, einschlieszlich Immunoassays, eingesetzt werden.
Description
Hierzu 4 Seiten Zeichnungen
Die vorliegende Erfindung betrifft chromogene Verbindungen, die als optische Indikatorverbindungen in analytischen Testsystemen verwendet werden können. Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung neue chromogene tnzymsubstratverbindungen sowie deren Verwendung in analytibchen Testsystemen ?um Nachweis von Enzymen in einer flüssigen Testprobe.
Die Bestimmung von Enzymen ist auf verschiedenen Gebieten wichtig, wie der biochemischen Forschung, bei Umwelt- und Industrietestverfahren sowie medizinischen Diagnosoverfahren. Die quantitative Bestimmung von Enzymgehalten in Körperflüssigkeiten, wie Serum und Plasma, liefert dem Arzt sehr nützliche Informationen zur Diagnose von Krankheitszuständen und deren Behandlung. Zudem können Enzyme als Analyte von Interesse in biologischen Flüssigkeiten auch als Nachweisreagenzien in einer Vielzahl analytischer Systeme dienen, wie Immunoassays und Nuklsinsäurehybridisierungsverfahren.'ln diesen Systemen dienen Enzyme direkt oder indirekt als Markierungsmittel, um Eintritt und Ausmaß von Antigen-Antikörper-Bindung oder Nukleinsäurehybridisierung aufzuzeigen. Demzufolge hat der Wunsch, Enzymanalyte nachzuweisen und Enzymmarkierungen als ein diagnostisches Mittel in verschiedenen analytischen Testsystemen anzuwenden, zur Entwicklung optischer Indikatorverbindungen zur Verwendung in Nachweis und Messung der Wirksamkeit dieser Enzyme geführt. Typischerweise umfassen diese bekannten optischen Indikatorverbindungen eine nachweisbare chemische Gruppe, wie ein Fluorogen oder Chromogen, welche mit einer durch ein Enzym abspaltbaren Substratgruppe, die für das interessierende Enzym spezifisch ist, derivatisiert worden ist. Diese optischen Indikatorverbindungen zeigen ein optisches Signal, das sich von dem optischen Signal unterscheidet, das durch die abgespaltene native Form des Fluorogen oder Chromogen hervorgerufen wird. Im Prinzip spaltet das Enzym die
Indikatorverbindung, um das Fluorogen oder Chromogen in der Form eines in bestimmter Weise fluorescierenden oder gefärbten Produkts freizusetzen, um einen Wechsel der Fluoreszenz oder Farbe zu ergeben, der der Menge an vorliegendem Enzym proportional ist, welche ihrerseits mit der Menge an in einer flüssigen Testprobe vorliegendem Analyt korreliert werden kann.
Insbesondere sind Nachweis und/oder Bestimmung von Hydrolasen, d.h. Enzymen, die Hydrolysereaktionen von Estern, glycosidischen Bindungen, Peptidbindungen, anderen Kohlonstoff-Stickstoff-Bindungen und Säureanhydriden katalysieren (siehe Lehninger, Biochemistry [Worth Publishers, Inc., New York, NY, 1970] S. 148) von Interesse in Diagnose und Aufzeichnung vielfältiger Erkrankungen, wie ζ. B. die Bestimmung von Amylase und Lipase in der Diagnose von Bauchspeicheldrüstinstörungen (siehe Kaplan and Pesce, Clinical Chemistry-Theory, Analysis and Correlation [CV. Mosby Co., St. Louis, MO, 19841 Kapitel 56), die Bestimmung von N-Acetylglucosaminidase (NAG) als ein Indikator von Nierenerkrankung (siehe Price, Curr. Probl. Cli'n. Biochem. 9,150 [1979]) und der Nacr weis von Esterase als ein Indikator für Leukozyten (siehe Skjold, CHn. Chem. 31,993 [1985]). Zusätzlich zu ihrem Wert beim \ufzeigen von Erkrankungen haben Hydrolasen in jüngerer Zeit Bedeutung auf den Gebieten der Diagnostik als auch der Biotechnologie gewonnen. Beispielsweise haben alkalische Phosphatase und vorzugsweise beta-D-Galactosidase in zunehmendem Maße Anwendung als Indikatorenzyme für Enzymimmnoassays gefunden (siehe Annals of Clinical Biochemistry 16,221-240 [19791).
Demgemäß hat die Verwendung von Enzymen, wie Glycosidasen, insbesondere beta-D-Galactosidase, als Indikator-Enzymmarkierungen In analytischen Testsystemen Anlaß zur Entwicklung von Substratglycnsiden gegeben, wie Phenyl-beta-D-galactosid, o-Nitrophenyl-beta-D-galactosid und p-Nitrophenyl-beta-D-Galactosid (siehe Biochem. Z., Vol. 333, S. 209 [1960]), welche durch beta-D-Galactosidase hydrolysiert werden, um die Phenole, die im UV-Bereich photometrisch bestimmt werden, bzw. die Nitrophenole, die im kurzwelligen sichtbaren Bereich bestimmt werden, freizusetzen. EP 156,347 und US 4810636 beschreiben Glycoside von Resorufin- bzw. Acridinonderivaten, die spezifisch sind für und gespalten werden durch die besondere Glycosidase von Interesse, um nachweisbare Chromogene freizusetzen. US 3950322 beschreibt eine N-Acylneuraminsäure, die mit einsm Fluorogen dervatisiert wird, wie 4-Methyl-umbelliteron, Fluoreszein, Methylfluoreszein, Resorufin oder Umbelliferon, für den Nachweis von Neuraminidase, wobei in ähnlicher Weise durch das Enzym auf das fluorogene Substratglycosid eingewirkt wird, um das Fluorogen freizusetzen.
Die Verwendung von beta-D-Galactosiden ist auch «τ> Zusammenhang mit histochemischen Untersuchungen beschrieben wurden, wie die Naphthyl-beta-D-galactoside, beschrieben in Histochemie, Vol. 35, S. 19? und Vol. 37, S.89 (1973), und die 6-Brom-alpha-naphthylderivate davon, beschrieben in J. Biol. Chem., Vol. 195, S.239 (1952). Gemäß dieser Testsysteme werden die K^phthole, die durch die Wechselwirkung des Galactosids mit dem Enzym freigesetzt werden, mit verschiedenen Diazoniumsalzen zur Reaktion gebracht, um die entsp; echenden Azofarbstoffe zu ergeben, die dann sichtbar gemacht werden können.
Obwohl diese bekannten optischen Indikatorverbindungen zum Nachweis von Enzymanalyten und Enzymmarkierungen in einem analytischen Testsystem herangezogen werden können, verbleiben dennoch eine Anzahl von Problemen, welche die Empfindlichkeit und Genauigkeit des Assay betreffen, wie niedrige Extinktionskoeffizienten, geringe Wasserlöslichkeit, Absorptionsmaxima, die mit verschiedenen Pigmenten und anderen in biologischen Flüssigkeiten gewöhnlich vorkommenden Bestandteilen interferieren, sowie Farbverschiebungen zwischen der optischen Indikatorverbindung und dem freigesetzten Cliromogen oder Fluorogen, welche nur schwierig ohne die Verwendung komplizierter Instrumente meßbar zu erfassen sind. Demnach ist es eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, chromogene Enzymsubstratverbindungen bereitzustellen, die als optische Indikatorverbindungen in analytischen Tes.v/stemen zur genauen und empfindlichen Bestimmung von Enzymen in einer flüssigen Testprobe verwendet werden können.
Ferner ist es eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, chromogene Enzymsubstratverbindungen bereitzustellen, die als optische Indikatorverbindungen in die feste, poröse Matrix einer analytischen Testvorrichtung eingebracht werden können, um die Enzyme zu messen, die darin eingebracht oder in einer flüssigen Testprobe darauf aufgetragen worden sind. Die vorliegende Erfindung stellt neue chromogene Enzymsubstratverbindungen der Formel bereit:
Y-O
worin Y eine durch ein Enzym abspaltbare Gruppe darstellt, die ausgewählt ist, um Spezifität gegenüber einem spezifischen entsprechenden Enzym von analytischem Interesse zu übertragen, W Sauerstoff oder Schwefel ist und Rund R', die gleich oder verschieden sein können, Wasserstoff, Alkyl oder Aryl sind. Die durch ein Enzym abspaltb^re Gruppe Y ist ein Rest einer Verbindung Y-OH, die einen Enzym-spezifischen Rest enthält, der ausgewählt werden kann, um Spezifität gegenüber einer gi oßen Vielzahl von Enzymen zu übertragen, und Enzym-spezifischan Reste, wie Zucker und Derivate davon, Acylgruppen, einschließlich aliphatische und aromatische Karbonsäuren, Aminosäuren und Peptide, und anorganische Säuren, wie Phosphor- und Schwefelsäure, einschließt, jedoch nicht unbedingt auf diese eingeschränkt ist.
In der vorliegenden Erfindung werden deren grundsätzliche Vorteile jus der Verwendung von Dibenzoxazepine^- und Dibenzothiazepinonchromogenen als Zwischenprodukte abgeleitet, welche mit einer geeigneten enzymatisch abspaltbaren Gruppe Y derivatisiert werden. Insbesondere wird, wenn die enzymatisch abspaltbare Gruppe Y durch ein spezifisches Enzym dafür in einer basischen Lösung, vorzugsweise von ca. pH 7,0 bis pH 10,0, abgespalten wird, eine deprotonierte Form des Chromogens freigesetzt, welche ein Absorptionsmaximum aufweist, das im wesentlichen größer ist als das Absorptionsmaximum der chromogenen Enzymsubstratverbindung der vorliegenden Erfindung, wodurch eine deutliche Absorptionsänderung hervorgerufen wird. Die deutliche Absorptionsänderung liefert ein leicht beobachtbares und nachweisbares optisches Signal, das oonau gemessen und der Menge des in einer flüssigen Testprobe vorliegenden Enzyms zugeordnet werden kann.
Fig. 1: ist ein Fließdiagramm des Syntheseweges zur Herstellung von 8-Hydroxy-11H-dibenz(b,e)(1,4)oxazepin-2-on-
Chromogenen
Fig. 2: ist ein Fließdiagramm des Syntheseweges zur Herstellung von 8-Hydroxy-11H-dibezo(b,e)(1,4)thiazepin-2-on-
Chromogenen
Fig. 3: i&t ein Fließdiagramm der Synthesewege zur Herstellung von chromogenen Enzymsubstratverbindungen der
vorliegenden Erfindung
Fig.4: ist ein Diagramm, das die Dosiswirkung in einer Testvorrichtung, die mit de η chromogenen Enzymsubstrat der vorliegenden Erfindung beaufschlagt ist, auf das Vorliegen von beta-D-Galactosidase verdeutlicht.
Die chromogenen Enzymsubstratverbindungen der vorliegenden Verbindung sind von Chromogenen mit der allgemeinen Formel abgeleitet:
(2)
Wenn W Sauerstoff ist, ist das Chromogen eine Mischung der Isomere 8-Hydroxy-11 H-dibenz(b,e)(1,4)-oxazepin-2-on und 2-Hydroxy-11H-dibenz(b,e)(1,4)-oxazepin-8-on (diese O-analogen Chromogene und deren Derivate werden hierin als Dibenzoxazepine bezeichnet). Wenn W Schwefel ist, ist das Chromogen eine Mischung der Isomere 8-Hydroxy-11H-dibenzo(b,e)(1,4)thiazepin-2-on und 2-Hydroxy-11H-dibenzo(b,e)(1,4)thiazepin-8-on (diese S-analogen Chromogene und deren Derivate werden hierin als Dibenzothiazepione bezeichnet). Das Dibenzazepinon, worin R H und R' Methyl sind, ist in der Literatur beschrieben worden (R. Hill, Journal of Bioenergetics, Vol.4, S. 229 [1973] und R. Hill, et al., New Phytology, Vol. 77, S. 1 [1976)). Die im sichtbaren Bereich liegenden Absorptionsspektren dieses Chromogens sind von T. Graan, et al.. Analytical Biochemistry, Vol. 144, S. 193 [1985] beschrieben worden, worin von einer Verschiebung von 122 nm in der Absorption (lambdamax) zwischen der protonierten und der deprotonierten Form dieses Chromogens berichtet wurde. Diese Deprotonierung erfolgte in schwach sauren Lösungen, üblicherweise von ca. pH 5,75 bis pH 6,75, und zwar an der phenolischen Hydroxylgruppe des Chromogens unter Delokalisierung der negativen Ladung des Anions über das gesamte Molekül. Im Falle der vorliegenden Enzymsubstratverbindungen (1) erzeugt die enzymatische Abspaltung des Y-Restes nach erfolgter Deprotonierung die chromogenen Spezies:
worin W, R und R' wie oben definiert sind.
Wenn die phenolische Hydroxylgruppe des Chromogens .nit einer enzymatisch abspaltbaren Gruppe derivatisiert ist, die einen Rest einer Verbindung Y-OH enthält, welcher ein Enzym-spezifischer Rest ist, sind gemäß den Lehren der vorliegenden Erfindung die sich ergebenden Verbindungen neue isomere chromogene Enzymsubstratverbindungen der allgemeinen isomeren Formel:
' -R1
-OR
worin Y die durch ein Enzym abspaltbare Gruppe darstellt und W, R und R' wie oben definiert sind (nachfolgend sollen Bezugnahmen auf Verbindungen der vorliegenden Erfindung durch die Verwendung von nur einer der beiden Isomeren in jeder der in Formeln [11 bis [4] dargestellten Strukturen den Bezug auf die andere isomere Struktur ebenfalls miteinschließen). Die isomeren Formen der vorliegenden Substratverbindungen können als eine Mischung verwendet oder durch herkömmliche Verfahren wie Chromatographie aufgetrennt werden. Die Dibenzoxazepinone, worin W O ist, sind besonders bevorzugt. Darüber hinaus ist es bevorzugt, daß R und R' aus H, Niedrigalkyl und Phenyl, einschließlich substituierte Formen davon, ausgewählt sind. Wenn einer von R und R'H oder Phenyl ist, ist es im allgemeinen bevorzugt, daß der andere nicht ebenfalls H bzw. Phenyl ist. Besonders bevorzugt sind die Dibenzoxazepinone (W = O), worin R und R', gleich oder verschieden, H oder Niedrigalkyl sind, insbesondere, worin einer von R und R'H und der andere Niedrigalkyl, z. B. Methyl, ist, oder worin beide R und R' Methyl sind. Es sollte klar sein, daß die vorliegende Erfindung die erste Verwendung der Dibenzoxazepinon- und Dibenzothiazepinon-Klassen von Chromogenen als Indikatorgruppen in chromogenen Enzymsubstraten beschreibt und demzufolge eine große Vielzahl substituierter Dibenzoxazepinon- und Dibenzothiazepinonderivate umfaßt. Es ist ersichtlich, daß die aromatischen Ringe A und B
in der Formel (4) eine Vielfalt von Substituentengruppen tragen können, ohne vom Umfang der vorliegenden Erfindung abzuweichen. Wie nachfolgend detaillierter abgehandelt, sind diese Substituentengruppen lediglich durch die Befähigung eines auf dem einschlägigen Gebiet des Standes der Technik tätigen Durchschnittsfachmanns, stabile Verbindungen herzustellen, welche die chromogenen Enzymsubstrateigonschaften der vorliegenden Erfindung aufweisen, eingeschränkt und schließen solche Gruppen ein, wie unsubstituiertes und substituiertes Alkyl, unsubstituiertes und substituiertes Aryl, Alkoxy, Aryloxy, Halogen (z.B. Fluor, Chlor, Brom), Nitro und substituiertes Amino, wie Dialkylamino. Im Zusammenhang der vorliegenden Erfindung soll „Alkyl" lineare und verzweigte Formen unsubstituierter Kohlenwasserstoffreste der allgemeinen Formel CnHjn +1, vorzugsweise des aliphatischen Typs „Niedrigalkyl", worin η 6 oder weniger ist, wie Methyl, Ethyl, n-Propyl, iso-Propyl, η-Butyl, iso-Butyl, tertiär-Butyl, n-Hexyl und dgl., wie auch substituierte Formen davon, einschlief.en.
Ferner soll im Zusammenhang der vorliegenden Erfindung „Aryl" organische Reste einschließen, abgeleitet von einem aromatischen Kohlenwasserstoffring oder Ringsystem durch Entfernen eines Wasserstoffatoms, und schließt die unsubstituierten Kohlenwasserstoffringreste, wie Phenyl und Naphthyl, sowie substituierte Formen davon ein. Für die vorliegende Erfindung schließen Arylreste jene ein, die eine oder mehrere gleiche oder verschiedene funktionelle Gruppen oder Substituenten tragen, die durch einen Fachmann ausgewählt werden können, um die chromogenen Enzymsubstratverbindungen der vorliegenden Erfindung bereitzustellen.
Wenn „Aryl" und „Alkyl" substituiert sind, soll diese Substitution insbesondere solche Gruppen oder Substituenten, wenn mono- oder polysubstituiert durch funktionelle Gruppen, einschließen, welche nicht wesentlich von den geeigneten Ausgestaltungen der vorliegenden Verbindungen wegführen. Diese funktionellen Gruppen schließen chemische Gruppen ein, die synthetisch eingeführt werden können und die stabilen und geeigneten chromogenen Enzymsubstratindikatorverbindungen der vorliegenden Erfindung ergeben. Beispiele diesor funktionellen Gruppen schließen Halogen (z. B. Fluor, Chlor, Brom), substituiertes Amino, wie Dialkylamino, Nitro, Alkoxy, Aryloxy, Alkyl und Aryl ein, sollen jedoch nicht auf diese beschränkt sein.
Wenn R und/oder R' Alkyl, vorzugsweise Niedrigalkyl, sind, schließen diese Alkylgruppen, ohne jedoch darauf beschränkt zu sein, insbesondere Methyl, Ethyl, n-Propyl, iso-Propyl, η-Butyl, iso-Butyl, tertiär-Butyl, n-Hexyl, und auch substituierte Formen davon ein, einschließlich jedoch unbedingt darauf beschränkt, Benzyl, Dialkylaminomethyl, insbesondere Dimethylaminomethyl, oder Halomethyl, insbesondere Brommethyl, und dgl. Wenn R und/oder R' Aryl sind, schließen diese Arylgruppen, ohne jedoch darauf beschränkt zu sein, Naphthyl, Phenyl, p-Chlorphenyl, 2,4-Dimethoxyphenyl und dgl. ein. Die chromogenen Enzymsubstratverbindungen (1) besitzen im wesentlichen dieselben Farbeigenschaften, wie die protonierte Form des Chromogens, und zwar unabhängig vom pH der Umgebungsflüssigkeit, worauf bei Kontakt der derivatisierten chromogenen Enzymsubstratverbindung (1) mit einem geeigneten Enzym in einem Umgebungsmedium, enthaltend eine Lösung von ca. pH 6,5 bis pH 10, die enzymatisch abspaltbare Gruppe Y durch das Enzym abgespalten wird, um die dissoziierte oder deprotonierte Form des Chromogens (3) freizusetzen, die ein Absorptionsmaximum aufweist, das im wesentlichen größer als das Absorptionsmaximum der chromogenen Enzymsubstratverbindung ist, um eine deutliche Absorptionsmaximumsverschiebung zwischen den beiden Spezies hervorzurufen. Demnach sind die chromogenen Enzymsubstratverbindungen der vorliegenden Erfindung besonders geeignet in einem analytischen Testsystem, das den Nachweis eines darin angewandten, durch ein Enzym markierten Asssayreagens erfordert. Die deutlich meßbare Änderung im Absorptionsmaximum, welche zwischen dor Substratverbindung und der deprotonierten Form des Chromogens erzeugt wird., kann genau nachgewiesen, gemessen und der Menge eines in einer flüssigen Testprobe vorhandenen Analyten zugeordnet werden.
Gemäß der vorliegenden Erfindung ist die durch ein Enzym abspaltbare Gruppe Y ein Rest einer Verbindung Y-OH, enthaltend einen Enzym-spezifischen Rest, um neue chromogene Enzymsubstratverbindungen bereitzustellen, die Spezifität gegenüber einer großen Vielzahl von Enzymen verleihen, welche in der analytischen Chemie, insbesondere der klinischen Chemie, angetroffen werden, und zwar insbesondere gegenüber Hydrolasen. Die Verbindung Y-OH soll, jedoch nicht unbedingt einschränkend, Zucker und Derivate davon, Acylgruppen, einschließlich aliphatischer und aromatischer Carbonsäuren, einschließlich Aminosäuren und Peptide, sowie anorganische Säuren, wie Phosphor- und Schwefelsäuregruppen, einschließen.
Es sollte klar sein, daß es für einen Fachmann offensichtlich ist, daß die Auswahl der enzymatisch abspaltbaren Gruppe Y natürlich von dem besonderen interessierenden Enzym abhängt. Wenn beispielsweise das Enzym von Interesse eine Glycosidase ist, kann ein Glycosid hergestellt werden, in welchem die enzymatisch abspaltbare Gruppe Y der glycosidische Rest ist, der dem natürlichen Substrat für die besondere Glycosidase entspricht. Geeignete glycosidische Reste schließen, jedoch nicht einschränkend, Mono- und Oligosaccharidreste ein, die befähigt sind, in ein für ein besonderes Glycosidaseenzym spezifisches Glycosidsubstrat inkorporiert unnd durch das genannte Enzym abgespalten zu werden, wie Reste von beta-D-Galactopyranose, alpha-D-Galactopyranose, beta-D-Glucopyranose, alpha-D-Glucopyranose und alpha-D-Mannopyranose, wie auch von Aminozuckern, wie N-Acetylglucosamin und N-Acetylneuraminsäure, und ähnliche Reste. Andere geeignete Glycosidreste schließen Oligosaccharidketten von ca. 2 bis 20, vorzugsweise 2 bis 7 Monosaccharideinheiten ein, die durch alpha-1-4-glucosidische Bindungen gebunden sind, welche durch Saccharidketten spaltende Enzyme zu einem Mono- oder Oligosaccharid gebrochen werden können, das seinerseits wiederum durch eine entsprechende Glycosidase gespalten werden kann, wie beispielsweise für Reste von Maltopentose, Maltohexose und Maltoheptose.
Es sollte klar sein, daß in einigen Fällen, in denen der glycosidische Rest eine Oiigosaccharidkette, wie vorstehend beschrieben, ist, diese Kette durch das nachzuweisende Enzym zuerst modifiziert oder zu einem kürzeren Oligosaccharid oder einem Monosaccharid abgebüut wird, um eine sekundäre Substratverbindung zu erzeugen, in der die enzymatisch abspaltbare Gruppe vom Kern der Substratverbindung durch ein sekundäres Enzym abgespalten wird, wobei die sekundäre Substratverbindung dann mit dem sekundären Enzym zusammengebracht worden ist, um eine meßbare Absorptionsverschiebung, wie vorstehend beschrieben, hetvorzubringon. Wenn beispielsweise das zu bestimmende Enzym alpha-Amylase ist, wird die Oligosaccharidkette gespalten, um eine sekundäre Glycosidsubstratverbindung herzustellen, z. B. ein alpha-Glucosid oder beta-Glucosid, worin dessen sich ergebende Glycosidgruppe vom Kern der Substratverbindung durch ein sekundäres Glycosidaseenzym, z. B. alpha-Glucosidase bzw. beta-Glucosidase, abspaltbar ist.
Im Falle nicht spezifischer Esteraseenzyme ist die ei.2r r:>atisch abspaltbare Gruppe Y ein Rest einer Acylgruppe, um einen chromogenen Ester dir Formel zu ergeben:
Wenn Z Niedrigalkyl oder Aryl ist, können diese Verbindungen zum Nachweis nicht spezifischer Esteraseenzyme, wie von Cholinesierase, Acylase, Lipase und dgl., eingesetzt werden.
Die chromogenen Enzymsubstratverbindungen der vorliegenden Erfindung können auch zum Nachweis proteolytischer Enzyme, die im allgemeinen in Leukozyten aufgefunden werden, herangezogen werden. In diesen Verbindungen ist der Rest der Verbindung Y-OH ein Rest einer N-geschützten Aminosäure oder eines kurzen Peptids, beispielsweise aus ca. 2 bis 5 Aminosäureeinheiten. Beispielsweise kann Y ein Rest der N-geschützten Aminosäure N-Tosyl-L-alanin sein, wie durch die Formel dargestellt:
(6)
Es ist anzumerken, daß in der vorliegenden Erfindung auch andere Carbonsäurereste, Aminosäurereste und N-geschützte Gruppen als Äquivalente in Betracht gezogen sind, wie nachfolgend detaillierter beschrieben wird.
In ähnlicher Weise ist für den Nachweis alkalischer Phosphatase aus einer flüssigen Testprobe die enzymatisch abspaltbare Gruppe Y ein Rest der Verbindung Y-OH, worin Y-OH ein Phosphorsäureester der Formel ist:
R O Il
(7)
ι r λ ι r ν
OH
Die chromogenen Enzymsubstratverbindungen (1) der vorliegenden Erfindungg können hergestellt werden, indem man die Verbindung Y-OH, in der Y eine ausgewählte enzymatisch abspaltbare Gruppe ist, mit einem geeignet derivatisierten Dibenzoxazepinon- oder Dibenzothiazepinon-Chromogen, wie nachfolgend detaillierter beschrieben wird, unter im Stand der Technik bekannten Kondensationsreaktionsbedigungen zur Reaktion bringt. Im allgemeinen wird das geeignete Dibenzoxazepinon- oder Dibenzothiazepinon-Chromogen unter geeigneten Bedingungen mit einem reaktiven Derivat der Verbindung Y-OH, vorzugsweise einem Kohlenhydrat (Zucker) oder Kohlenhydratderivat oder einer Säure, wie vorstehend beschrieben, gekuppelt, um ein chromogenes Enzymsubstrat mit der angestrebten Stereoisometrie zu liefern. Wie oben festgestellt, werden im Rahmen der vorliegenden Erfindung auch Verbindungen mit verschiedenen Substituenten an den aromatischen Ringen A und B des in Formel (4) dargestellten Kernes in Betracht gezogen. Substituierte Äquivalente werden hergestellt durch die Verwendung geeignet derivatisierter Dibenzoxazepinone oder Dibenzothiazepinone, die gemäß bekannter Verfahren hergestellt werden können.
Bei der Herstellung der Dibenzoxazepinone (Fig. 1) werden als Ausgangsmaterialien ein 3-Hydroxyacetophenon, ein 3-Hydroxybenzophenon oder ein 3-Hydroxybenzaldehyd (8) und ein geeignetes Grignard.eagens eingesetzt, die zur Reaktion gebracht werden (Reaktion [a]), um ein substituiertes Phenol (9) zu ergeben. Alternativ dazu können das 3-Hydroxyacetophenon, 3-Hydroxybenzophenon oder der 3-Hydroxybenzyldehyd (8) unter Verwendung eines geeigneten Reduktionsmittels reduziert werden (Reaktion la1]). Das Phenol (9) wird seinerseits mit einem substituierten Benzochinon-N-chlorimin (10) zur Reaktion gebracht (Reaktion [b]), um ein funktionalisiertes Indophenol (12) zu ergeben. Dann läßt man das Indophenol (12) in einer Base zyklisieren, um die angestrebte Substratverbindung (13 und 14) zu ergeben.
Insbesondere werden die Phenole (9),gemäß des Verfahrens von Hill et al., (siehe oben) hergestellt, und zwar wenn R und R' beide Methyl oder Phenyl und A, B und C Wasserstoff sind, aus dem entsprechenden 3-Hydroxyacetophenon oder 3-Hydroxybenzophenon (8), welche mit einem Methylmagnesiumbromid-Grignardreagens bzw. Phenylmagnesiumjodid-Grignardreagens umgesetzt werden (Reaktion [a]). Es sollte angemerkt sein, daß das Grignardreagens aus einer großen Vielzahl solcher Reagentien ausgewählt sein kann, die im Stand der Technik beschrieben worden sind und, ohne unbedingt darauf eingeschränkt zu sein, Alkyl- und Aryl-Grignardreagentien, wie jene, in denen X Brom oder Jod darstellt, wie auch jene, die funktioneile Gruppensubstituenten tragen, wie-O-Alkyl (Alkoxy), -O-Aryl (Aryloxy), -Alkyl und -Aryl, einschließen. Desgleichen ist die Synthese einer Vielzahl von substituierten 3-Hydroxyacetophenonen (8), worin R Alkyl oder substituiertes Alkyl sein kann, sowie von 3-Hydroxybenzophenon (8), worin R Aryl oder substituiertes Aryl sein kann, beschrieben worden, und schließt Verbindungen der allgemeinen Formel (8) ein, worin R, A, B und C aus einer großen Vielzahl von bekannten Substituenten ausgewählt sein können. Beispielsweise können R Methyl, A und C Wasserstoff und B Brom, Chlor, Jod, Methyl oder Cyclohexyl sein (J. Med. Chem, Vol. 23, S. 738 [1980]); oder R und C können Methyl, A und B Nitro und Wasserstoff bzw. Wasserstoff und Nitro oder A und B Wasserstoff sein (Chem. Ber., Vol. 92, S. 2172 [1959]); oder R kann Methyl, A und C können Wasserstoff und B
kann Methoxy (Chem. Bar., Vol. 55B, S. 1892 (1922]) oder Cyclohexylether seil (J.Chem. Soc, S.3430 [1951]); oder R und A können Methyl, B Wasserstoff und C Nitro sein (J. Org.Chem., Vol. 14, S.397 [' 949]); oder R kann Methyl, A und B können Methoxy und C kann Wasserstoff sein (J. Prakt.Chem., Vol. 103, S.329 [1922]); oder R kann Methyl, A und C können Wasserstoff und B kann p-Hydroxyphenol sein (Hoppe-Seyler's Z. Physiol. Chem., Vol. 292, S. 58 [1953]); oder A, B und C können Wasserstoff und R Dimethylaminomethyl (Monatsh., Vol.80, S. 517 [1949]) oder Benzyl oder Phenylethyl (Medd. Norsk. Faim. Selskap., Vol.24, S.45 [1962]) oder p-Chlorphenyl (J.Chem.Soc, S.5 [1946)) oder 2,4-Dimethoxyphenyl sein (Bull.Soc.Chim.France, S. 1682 [1959]); oder R kann Brommethyl und, wenn A, B oder C Nitro sind, dann können B und C, A und C oder A und B jeweils Wasserstoff sein (Acta Univ. Szeged., Acta Phys.Chom., Vol. 9, S.48 [1963]); oder R kann Phenyl und A und C können Wasserstoff und B kann Methyl (HeIv. Chim. Acta., Vol. 29, S. 1413 [1946]) oder A und B können Methoxy und C kann Wasserstoff sein (J.0rg.Chem„Vol.24,S.952 [1959]); und dgl.
Phenole (9), in denen einer oder beide R und R' Wasserstoff sind, werden aus dem entsprechenden 3-HyJroxybenzaldehyd, 3-Hydroxyacetophenon oder 3-Hydroxybenzophenon (8) durch Reduktion (Reaktion [a']) der Carbonylg1.uppe zu einer Hydroxylgruppe unter Verwendung einer Vielzahl von Reduktionsmitteln hergestellt. Solche Reduktionsmittel sind bekannt (siehe House, Modem Synthetic Reactions, 2nd edition, W.A. Benjamin, Inc., Menlo Park, CA, 1972, S. 1-227) und schließen Lithiumhydrid, Lithiumaluminiumhydrid, Natriumborhydrid und katalytische Hydrierungen ein.
Das angestrebte Indophenol (12) wird hergestellt durch Reaktion des entsprechend substituierten Phenols (9) aus Reaktion (a) oder (a') mit einem entsprechend substituierten Bonzochinon-N-chlorimin (10) in wäßrigem Alkali (Reaktion [b]) gemäß Hill et al. (siehe oben), worin alle A-G Wasserstoff sein können, und wie allgemeiner von Gibbs et al. beschrieben in Supplement Nr. 69 to the Public Health Reports, Washington, D.C. (1928), wobei alle Substituenten D, E, F und G in der allgemeinen Struktur (10) Wasserstoff oder D Methyl und E, F und G Wasserstoff oder D, E und G Wasserstoff und F Methyl bzw. D und E Chlor oder Brom und F und G Wasserstoff sein können. Ein alternativer Syntheseweg zur Herstellung des Indophenols (12) wird auch von Corbett, J. Chem. Soc. (B), S. 1502 (197C) beschrieben, wo ein entsprechend substituiertes Phenol (9) mit einem entsprechend substituierten p-Aminophenol (11) und Sauerstoff in der Gegenwart von wäßrigem Alkali (Reaktion (c)) zur Reaktion gebracht wii d. Die Substituenten D, E, F und G des p-Aminophenols (11) sind beschrieben, wobei D, E und G Wasserstoff und F Methyl oder Chlor oder D, F und G Wasserstoff und E Methyl oder D und G Methyl und E und F Wasserstoff oder D und E Methyl oder Chlor und F und G Wasserstoff bzw. D Chlor und E, F und G Wasserstoff sein können.
Das Indophenol (12) aus Reaktion (b) oder (c) wird dann eingesetzt, um die Substratverbindungen (13) und (14) gemäß des Verfahrens von Hill et al., New Phytology, Vol. 77, S. 1 (1976) herzustellen (Reaktion [d]), wobei das Indophenol (12) in wäßriger Base, vorzugsweise in Natriumborat (Borax) über einige Tage bei Umgebungstemperatur zyklisiert wird (Stufe 2). Es sollte angemerkt sein, daß es nicht notwendig ist, die verschiedenen Zwischenprodukte aus den Stufen 1 bis 3 von Reaktion (d) zu isolieren, um genügende Ausbeuten der Substratverbindungen (13) und (14) zu erhalten. Bei der Herstellung von Dibenzothiazepinonen (Fig. 2) werden als Ausgangsverbindungen substituierte 3-Mercaptomethylphenole (16) eingesetzt, die aus den vorher beschriebenen substituierten 3-Hydroxymethylphenolen (9) über ein Zwei-Stufen-Verfahren erhalten werden, bestehend aus einer Bromierung (Reaktion [a]), um substituierte 3-Brommethylphenole (15) zu ergeben, und einer sich daran anschließenden Reaktion mit Thioharnstoff und Basenhydrolyse (Reaktion [a')). Die Phenole (16) werden ihrerseits mit einem substituierten Benzochinon-N-chlorimin (10) umgesetzt (Reaktion [b]), um ein funktionalisiertes Indophenol (17) zu ergeben. Man läßt dann das Indophenol (17) in einer Base zyklisieren, um die angestrebte Substratverbindung (18 und 19) zu ergeben.
Insbesondere sind die Synthese von 3-Hydroxybenzylbromid (15, R=FV=A=B=C=H) aus 3-Hydroxybenzylalkohol (9, R=R'=A=B=C=H) in J. Med.Chem., Vol.23, S. 1013 (1980) und seine Überführung in 3-Mercaptomethylphenol (16, R=FV=A=B=C=H) in J. Chem. Soc, Perkin I, S. 1555 (1980) beschrieben. Ganz allgemein liegt die Überführung einer Vielzahl substituierter 3-Hydroxybenzylalkohole (9) in die entsprechenden 3-Mercaptomethylphenole (16) mit diesem Verfahren oder mit anderen geeigneten Verfahren im Rahmen des im einschlägigen Stand der Technik üblichen Fachwissens. Die spezifische Natur der substituierten Benzochinon-N-chlorimine (10) und substituierten p-Aminophenole (11) ist dieselbe wie vorher beschrieben, und die verbleibenden Stufen (b), (c) und (d) sind dieselben wie vorher für die Dibenzoxazepine (13 und 14) beschrieben.
Es soll angemerkt sein, daß die Auswahl geeigneter derivatisierter Ausgangsmaterialien und eines geeigneten Grignardreagens oder Reduktionsmittels zu einer Vielzahl substituierter Phenole führt, und demgemäß ein Durchschnittsfachmann auf dem Gebiet der organischen chemischen Synthese spezifische Indophenole mit einer Vielzahl von Substituenten herstellen kann, welche in die gewünschten entsprechend derivatisierten Dibenzoxazepinone und Dibenzthiazepinone zur Verwendung als das Chromogen der chromogenen Acridinon-Enzymsubstratverbindungen der vorliegenden Verbindung überführt werden können.
Die Glycosidderivate der allgemeinen Formel (1) können gemäß auf dem Gebiet der Kohlenhydratchemie bekannter Verfahren hergestellt werden, und zwar unter Einsatz bekannter Derivate von Kohlenhydraten der Formel Y-OH, die mit einem geeigneten Chromogen zur Reaktion gebracht werden. Diese Kohlenhydratderivate, die in einigen Fällen Schutzgruppen tragen, sind kommerziell erhältlich (Aldrich Chemical Co., Milwaukee, Wl, USA; Sigma Chemical Co,, St. Louis, MO, USA) oder können gemäß bekannter Verfahren hergestellt werden (Methods in Carbohydrate Chemistry [Academic Press, 1963], Vol.2). Glycosidische Reste schließen, jedoch nicht unbedingt einschränkend, Reste von Zuckern ein, wie beta-D-Galactopyranose, alpha-D-Galactopyranose, beta-D-Glucopyranose, alpha-D-Glucopyranose, alpha-D-Mannopyranose, N-Acetylgucosamin, beta-Glucuronsäure und Neuranminsäure.
Andere geeignete glycosidische Reste schließen Reste von Oligosaccharidketten ein, die durch Saccharidketten spaltende Enzyme zu einem Mono- oder Oligosaccharid abgebaut werden können, die ihrerseits vom Kern der Substratverbindung durch die entsprechende Glycosidase direkt abgespalten werden können. Es sollte klar sein, daß diese Oligosaccharidketten Ketten aus ca. 2 bis ca. 20, vorzugsweise 2 bis 7, Monosaccharideinheiten sind, wie Maitopentose, Maltohexose oder Maltoheptose. Die Chromogene der allgemeinen Formel (2) werden mit einem Mono- oder Oligosaccharid oder einem 1 -Halogenderivat davon, worin alle Hydroxylgruppen mit einer Schutzgruppe gemäß in der Kohlenhydratchemie bekannter Verfahren substituiert sind, umgesetzt, um per-O-substituierte Glycoside zu ergeben, aus denen die Glycosidderivate der allgemeinen Formel (1) durch gemäß bekannter Verfahren durchgeführter Abspaltung der Schutzgruppen erhalten werden.
Die geeigneten Chromogene werden mit den per-O-substituierten I-Halogensacchariden, vorzugsweise in dor Gegenwart von Protonakzeptoren, wie Alkalihydroxiden oder Alkalikarbonaten, in wäßrigem Aceton oder (unter Phasentransi jrbedingungen) in einer Wasser/Chloroform- oder Wasser/Benzol-Mischung zur Reaktion gebracht. Dieses Verfahren kann ferner durchgeführt werden, indem man zuerst die Chromogene mit Alkalihydroxid oder -alkoholat in Alkalisalze oder unter Verwendung von gegebenenfalls substituierten Aminen in Ammoniumsalze überführt und dann diese mit den per-O-substituierten 1 -Halogensacchariden in dipolar aprotischen Lösungsmitteln, wie Aceton, Dimethylsulfoxid, Dichlormethan, Tetrahydrofuran oder Dimethylformamid, umsetzt. Ferner ist es bei der Synthese von per-O-substituierten Glycosiden und per-O-substituierten 1-Halogensacchariden wirkungsvoll. Additive zu verwenden, und zwar in der Form einzelner Silbersalze oder von Mischungen von Silbersalzen, wie Silberoxid, Silberkarbonat, Silberkarbonat auf Celite® (Johns-Manville Corp. Denver, CO, USA), Silbertriflat oder Silbersalicylat und/oder in der Form von einzelnen Quecksilbersalzen oder von Mischungen von Quecksilbersalzen, wie Quecksilberbromid, -cyanid, -acetat oder -oxid, und/oder einzelner Cadmiumsalze oder von Mischungen von Cadmiumsalzen, wie Cadmiumkarbonat oder Cadiniumoxid, gegebenenfalls unter Mitverwendung von Trocknungsmitteln, wie Kaliumchlorid, Molekularsieben oder Drierite® (W.A. Hammond Drierite Co., Xenia, OH, USA), in Lösungsmitteln, wie Methylenchlorid, Chloroform, Benzol, Toluol, Ethylacetat, Chinolin, Tetrahydrofuran oder Dioxan. Bei der Synthese von alpha-gebundenen Glycosiden wird das Chromogen mit einem Saccharid geschmolzen, dessen Hydroxygruppen mit einer Schutzgruppe, vorzugsweise einer Acetylgruppe in der Gegenwart einer Lewis-Säure, wie Zinkchlorid, substituiert werden (siehe Chem. Ber. 66, 378-38311933] und Methods in Carbohydrate Chemistry [Academic Press, 1967) Vol. 2, S. 345-347). Die Temperatur der Reaktion liegt vorzugsweise zwischen 80 und 130°C, bevorzugter zwischen 110 und 130°C. Die sich ergebenden per-O-substituierten Glycoside sind desgleichen neue Verbindungen. Die Entfernung der Schutzgruppen aus den per-O-substituiorten Glycosiden zur Bildung der Glycoside wird gemäß in der Kohlenhydratchemie bekannter Verfahren durchgeführt (siehe Advances in Carbohydraie Chem. 12,15711976]), wie bei den Acyl-Schutzgruppen mit Natriummethylat, Bariummethylatoder mit Ammoniak in Methanol. Geeignet als eine in der Kohlenhydratchemie üblicherweise verwendete „Schutzgruppe" ist insbesondere der Acetyl-, Benzoyl-, Benzyl- oder Trimethylsilyl-Rest.
Derivate der allgemeinen Formel (1), in denen Y der Rest einer Oligosaccharidkette von ca. 2 bis ca. 20 Monosaccharideinheiten ist, die über alpha-i-4-glucosidischo Bindungen gebunden sind, können zudem aus alpha- und beta-Chromogenglucosiden durch ein enzymatisches Verfahren hergestellt werden, welches zuerst von French, et al., J. Am. Chem. Soc. 76,2387 (1954) und später von Wallenfels, et al., Carbohydrate Research 61,359 (1978), beschrieben wurde, worin die Übertragung des Glucosids auf eine vorgebildete Polysaccharidkette durch das Enzym (1~4)-alpha-Glucan-4-glucosyltransferase (ebenfalls bekannt als Cyclomaltoduxtringlucanotransferase; EC 2.4.1.19) beinhaltet ist.
Esterderivate der allgemeinen Formel (1) können gemäß in der organischen Chemie bekannter Verfahren hergestellt werden, indem man ein entsprechendes Chromogen mit bekannten Carboxylsäurederivaten der Formel Y-OH umsetzt, worin Y=Z-C(O)- und Z wie vorstehend R und R' definiert ist. Bekannte Derivate von Carbonsäuren der Formel Y-OH schließen auch, jedoch nicht unbedingt darauf beschränkt, Aminosäurereste, vorzugsweise Reste von natürlich vorkommenden alpha-Aminosäuren in ihrer L- oder D-Form oder auch in ihrer racemischen Form, ein, wobei die Reste von Glycin, Alanin, Valin, Leucin, Isoleucin, Phenylalanin und Tyrosin bevorzugt und dabei die L-Formen davon wiederum bevorzugter sind. Jegliche freien, gegebenenfalls vorhandenen Hydroxylgruppen, können acyliert und vorzugsweise acetyliert werden. Unter den Pepidresten in diesen Definitionen von Y-OH sollen beispielsweise Aminosäuren oder Peptide aus ca. 2 bis ca. 5 Aminosäureeinheiten, wie Di-, Tri-, Tetra- und Pentapeptide, und zwar Di- und Tripeptide bevorzugt, verstanden werden, wobei die Aminosäurekomponenten davon die oben genannten Aminosäuren sind. Es sollte ebenso klar sein, daß die Aminogruppen dieser Aminosäuren oder Peptide mit in der Peptidchemie bekannten Stickstoffschutzgruppen geschützt werden können (siehe T.W. Green, Protective Groups in Organic Synthesis), (J.Wiley and Sons, New York, NY, [1981], S. 218-287), einschließlich z.B. Acyl, Oxycarbonyl, Thiocarbonyl, Sulphonyl, insbesondere p-Toluolsulphonyl (Tosyl, TS), Sulphonyl, Vinyl, Cyclohexenyl und Carbamoyl, insbesondere t-Butyl-(BOC)- und Benzyl-(CBz)-Carbamoylreste. Diese Ester können desgleichen auch hergestellt werden, indem man ein geeignetes Chromogen mit einer Carbonsäure, Aminosäure oder einem Peptid, Y-OH wie oben definiert, oder mit einem geoigneten reaktiven Derivat davon zur Reaktion bringt, und zwar gemäß in der organischen Chemie bekannter Verfahren (siehe J. March, Advanced Organic Chemistry: Reactions, Mechanism and Structure [McGraw-Hill Book Co., New York, NY, 1968] S.319-323). Die verwendeten reaktiven Derivate können beispielsweise Säurechloride oder -bromide oder gemischte Anhydride sein, die herkömmlich in der Peptidsynthese verwendet werden, wie jene mit Ethylchlorformat, oder aktive Ester, wie jene von N-Hydroxysuccinimid.
Auf ähnliche Weise können anorganische Ester der allgemeinen Formel (1) gemäß in der organischen Chemie bekannter Verfahren hergestellt werden. Die bekannten Derivate anorganischer Säuren Y-OH, wie Phosphor- oder Schwefelsäure, werden mit dem Chromogen gemäß in der organischen Chemie bekannter Verfahren zur Reaktion gebracht, wie von Koller und Wolfbeis, Monatsh. 116,65 (1985) für anorganische Ester bestimmter Kumarine gezeigt.
Die chromogenen Enzymsubstratverbindungen der vorliegenden Erfindung werden in analytischen Testsystemen zur Messung der Harin vorliegenden Enzymmenge verwendet, insbesondere in analytischen Testsystemen unter Verwendung Enzymmarkierter Assayreagentien. Solche analytischen Testsysteme schließen, jedoch nicht unbedingt einschränkend, Enzym-Immunoassays ein, die im Stand der Technik als kompetitive, Sandwich- und immunometrische Verfahren bekannt sind, wobei die Menge an Enzymmarkierung in einer besonderen Fraktion davon gemessen und der Menge an nachzuweisendem Analyt aus einer flüssigen Testprobe zugeordnet werden kann.
Die Verwendung spezifischer Bindungssubstanzen, wie von Antigenen, Haptenen, Antikörpern, Lektinen, Rezeptoren, Avidin und anderen Bindungsproteinen und Polynukleotiden, die mit einem Enzym markiert sind, ist in letzter Zeit entwickelt und zur Messung von Substanzen in biologischen Flüssigkeiten angewandt worden (siehe z. B. Clin. Chem., Vol. 22, S. 1232 [1976]; U. S. Reissue Patent No. 31,006 und GB-PS 2019308). Im allgemeinen hängt eine solche Messung von der Fähigkeit einer Bindungssubstanz, z. B. eines Antikörpers oder eines Antigens, ab, an einen spezifischen Analyt gebunden zu werden, wobei ein markiertes Reagens, enthaltend diese mit einem Enzym markierte Bindungssubstanz, angewandt wird, um das Ausmaß einer solchen Bindung zu bestimmen. Typischerweise wird das Ausmaß der Bindung ermittelt, indem man die in dem markierten Reagens vorhandene Menge an Enzymmarkierung mißt, die an einer Bindungsreaktion mit dem Analyt entweder teilgenommen oder nicht teilgenommen hat, wobei die Menge an nachgewiesenem und gemessenem Enzym der Menge an in einer flüssigen Testprobe vorliegendem Analyt zugeordnet werden kann.
Die chromogenen Enzymsubstratverbindungen der vorliegenden Erfindung sind besonders geeignet in analytischen Testsystemen, wie vorstehend beschrieben, wobei eine analytische Testverrichtung verwendet wird, die eine mit der chromogenen Enzymsubstratverbindung der vorliegenden Erfindung beaufschlagte Trägermatrix umfaßt, wobei die Natur des Enzym-spezifischen Restes davon natürlich von dem besonderen nachzuweisenden Enzym abhängt. Das Material einer solchen Trägermatrix kann aus einer jeden Substanz sein, die dazu befähigt ist, die chromogene Enzymsubstratverbindung der vorliegenden Erfindung einzulagern, wie jene Materialien, die für Reagensstreifen für Lösungsanalysfen verwendet werden. Beispielsweise beschreibt US-PS 3,846,247 die Verwendung von Pilz, porösen Keramikstreifen und Glasfasergeweben oder -matten. Als Ersatzstoffe für Papier beschreibt US-PS 3552928 die Verwendung von Holzstäben, Tuch- und Schwammaterial und tonhaltigen Substanzen. Die Verwendung von Vliesen aus synthetischem Haiz und von Glasfaserfilz anstatt Papier wird in GB-PS 1369139 vorgeschlagen, und GB-PS 1349623 lehrt die Verwendung eines leicht permeablen Maschenwerks dünner Filamente als Bedeckung einer darunter liegenden Papiermatrix. Diese Referenzschrift lehrt auch, das Papier mit einem Teil eines Reagenzsystems und das Maschenwerk mit anderen, möglicherweise inkompatiblen Reagenzien zu imprägnierten. FR-PS 2170397 beschreibt die Verwendung von Trägermatrizes, enthaltend mehr als 50% Polyamidfasern. Ein weiterer Lösungsvorschlag für Trägermatrizes ist in US-PS 4046513 beschrieben, worin das Konzept von bedruckenden Reagentien auf einer geeigneten Trägermatrix Anwendung findet. US-PS 4046514 beschreibt das Verweben oder Verknüpfen von Filamenten, die Reagentien in einem reagierenden System tragen. Alle diese Vorschläge für eine Trägermatrix können in der vorliegenden Erfindung Anwendung finden, wie auch andere. Vorzugsweise umfaßt die Trägermatrix ein saugfähiges Material, wie Filterpapier, wobei eine Lösung der chromogenen Enzymsubstratverbindung der vorliegenden Erfindung angewandt wird, um die Matrix zu imprägnieren. Sie kann auch ein System umfassen, das die Assayreagentien physikalisch eingeschlossen enthält, wie polymere Mikrokapseln, die dann bei Kontakt mit der Testprobe brechen. Sie kann ein System umfarson, wobei die Assayreagentien homogen mit der Trägermatrix in einem flüssigen oder halbflüssigen Zustand, der später härtet oder sich absetzt, vereinigt werden, wodurch die Assayreagentien eingefangen werden. In einer bevorzugten Ausgestaltung stellt die Trägermatrix ein saugfähiges Material in der Form einer Zone oder einer Schicht dar, welche mit der chromogenen Enzymsubstratverbindung der vorliegenden Erfindung beaufschlagt werden, und zwar in einer Anwendung, bei der ein besonderer Assay in einer flüssigen Umgebung unter Verwendung eines im Stand der Technik bekannten unlöslichen Assayreagens durchgeführt wird, um die freie Spezies des markierten Reagens von der gebundenen Spezies des markierten Reagens physikalisch zu trennen. Gemäß dieses Assaysystems wird ein Flüssigkeitsanteil, enthaltend die freie Spezies, entfernt und auf die Trägermatrix aufgebracht, wobei die darin eingelagerte chromogene Enzymsubstratverbindung mit der Enzymmarkierung des markierten Reagens der freien Spezies aus der flüssigen Testprobe in Wechselwirkung tritt, um ein nachweisbares Signal zu ergeben, das sichtbar gemacht und/oder mit einer geeigneten Vorrichtung, wie einem Spektrophotometer, gemessen werden kann.
Desgleichen kann eins Testvorrichtung zur Anwendung gelangen, die zwei oder mehr Trägermatrices in der Form von z. B. einer oberen Schicht oder Zone und einer unteren Schicht oder Zone enthält. Die unterste Schicht einer solchen Testvorrichtung kann mit der chromogenen Enzymsubstratverbindung der vorliegenden Erfindung inkorporiert werden, wobei eine flüssige Testprobe, enthaltend einen zu bestimmenden Analyt, auf die oberste Schicht der Vorrichtung aufgebracht wird. Der eindiffundierende Ana!yt nimmt an den nötigen Bindungsreaktionen teil, um eine freie und gebundene (d. h. immobilisierte) Spezies des mit Enzym markierten Reagens darin zu erzeugen, wie vorstehend beschrieben. Demzufolge ist die so erzeugte freie Spezies des markierten Reagens frei, um in die unterste Schicht zu wandern, wo das markierte Enzym der freien Spezies die enzymatisch abspaltbare Gruppe der dort eingelagerten chromogenen Enzymsubstratverbindung der vorliegenden Erfindung spaltet, um ein meßbares, nachweisbares Signal zu liefern, wie vorstehend beschrieben.
Die vorliegende Erfindung wird nun durch die folgenden Beispiele, ohne jedoch darauf eingeschränkt zu sein, verdeutlicht. Die Zahlen in den Klammern beziehen sich auf die Strukturformeln, wie sie in den Figuren und/oder der Beschreibung angegeben sind.
e-ITetra-O-acetyl-beta-D-galactopyranosyloxyJ-H-methyl-HH-dibenz(b,e)ox zepln-2-on(21) und 2-(Tetra-O-ac6tyl-beta-D-galactopyranosyloxy)-11-methyl-11H-dibenz(b,e)(1,4)-oxazepin-8-on(22)
Eine Mischung von 8-Hydroxy-11 -methyl-11 H-dibenz(b,e)(1,4)oxazepin-2-on („Methylpurpur") (20) (0,2g; 0,83mMol), hergestellt gemäß des oben genannten Verfahrens von Hill, et al., und, von Acetobromgalactose (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, USA) (0,685g; 1,66mMol) und von Silber-(l)-oxid (Ag2O) (A: ,ich Chemical Co., Milwaukee, Wl, USA) (0,425g; 1,66mMol) wurde bei Umgebungstemperatur in wasserfreiem Chinolin (6,25ml) und Ethylacetat (EtOAc) (2ml) 16 Stunden lang in einem verschlossenen Kolben vor Licht geschützt gerührt. Die Reaktionsmischung wurde in EtOAc (annähernd 40ml) verdünnt, durch Celite (Johns-ManviPe Corp., Denver, CO, USA) filtriert und mit kleinen Anteilen an 1M HCI extrahiert, bis die Extrakte sauer waren (pH = 1). Die vereinigten wäßrigen Extrakte wurden mit EtOAc (25ml) gewaschen, dann wurden die vereinigten EtOAc-Schichten mit Salzlösung (20 ml) gewaschen, mit Natriumsulfat (Na2SO14) getrocknet, filtriert und im Vakuum zur Trockne eingedampft, um einen goldgelben Schaum (0,8g) zu ergeben. Das Rohprodukt wurde an Kieselgel (100g) unter Verwendung von 7,5%igem (V:V) Aceton in Chlorovormlösungsmittel Chromatographien, und die beiden hellgelben Produktbanden (Rf = 0,28 und 0,34 auf Kieselgelplatt on, entwickelt mit Aceton/Chloroform [1:9]) wurden gesammelt, vereinigt und von Lösungsmittel befreit, um eine Mischung der Titelverbindungen als einen orangenen Schaum (9,44g; 92%) zu ergeben.
IR (KBr) cm"1 2985,1756,1641,1618,1575,1511,1437,1372,1 230,1075.
1HNMR (DMSO-de) delta: 1,4-1,7 (m, 3 H), 1,9-2,2 (m, 12 H), 4,0-4,2 (m, 2 H), 4,45-4,55 (m, 1 H), 5,1-5,4 (m, 4 H), 5,6-5,76 (m, 1 H), 5,85-5,9 (m, 1 H), 6,4-7,7 (m, 5H).
13C NMR (DMSOd8) ppm. 187,93,187,51,169,99,169,93,169,59,169,27,159,48,158,56,157,73,151,67,144,71,142,38,142,00, 140,69,137,00,136,48,134,34,134,11,130,51,130,16,125,75,125,64,116,69,116,63,113,04,112,95,110,99,107,38, 96,94,76,72, 75,03,70,76,70,16,68,19,67,34,61,59,20,52,17,62,17,23 (17 Koinzidenzbanden).
Analyse für1 | C28H29NO1; | H5,11; | N 2,45 |
berechnet: | C 58,84; | H 5,31; | N 2,29 |
gefunden: | C 58,61; | ||
8-beta-D-Qalactopyranosyloxy-11-methy!-11H-dlbenz(b,e)(1,4)oxazepln-2-on 23)und2-beta-D-Galactopyranosyloxy>11-methyM1H-dlbenz(b,eM1,4)oxazepln-8-on (24)
Eine Lösung von (21) und (22) (0,41 g; 0,72mMol) in Methanol mit HPLC-Reinheit (25ml) wurde bei Umgebungstemperatur mit Natriummethoxid (31 mg) behandelt und 1,5 Stunden lang gerührt. Die Reaktion wurde durch Zugabe von Essigsäure (annähernd 25 μΙ) gequenscht und dann im Vakuum zur Trockne eingedampft, um einen orangenen Feststoff zu ergeben. Das Rohprodukt wurde an Kieselgel (100g) unter Verwendung von 15%lgem (V:V) Methanol in Chloroformlösungsmittel chromatographiert, und die hell orengene Produktbande (Rf = 0,25 auf Kieselgelplatten, entwickelt mit Methanol:Chloroform (1:4|) wurde gesammelt und im Vakuum von Lösungsmittel befreit, um eine Mischung der Tjtelverbindungen als einen rot orangenen Feststoff zu ergeben. Vakuumtrocknung über zwei Stunden bei 64 0C ergab die analytische Probe (0,19Bg; 67%).
IR (KBr) cm"1 3328,2925, 2876,1639,1612,1 571,1 508,1384,1 245,1 219,1085,896,880,823,791.
1H NMR (DMSO-d6) delta: 1,4-1,7 (m, 3H), 3,3-3,75 (m, 7H), 4,5-4,75 (m, 5H), 5,85-5,90 (m, 1 H), 6,4-7,65 (m, 5H).
nC NMR (DMSCM6) ppm. 187,95,187,51,161,18,159,34,158,67,151,61,151,00,144,76,142,52,142,11,140,06,136,96,136,36, 134,28,-133,85,130,31,129,95,125,00,116,93,116,84,113,08,113,04,110,91,107,36,100,76,100,59,76,65,75,94,75,18,73,34, 73,24, 70,21,68,27,68,19,60,52,60,44,17,68,17,30(1 Koinzidenzbande).
Analyse für C2oN2iNOe:
berechnet: C 59,55; H 5,25; N 3,47
gefunden: C59.57; H 5,48; N 3,21
Gelöst in 5OmM Phosphatpuffer bei pH7,4, enthaltend 5mM Magnesiumchlorid (MgCI2), wies Verbindung (23) + (24) (Mischung) ein lambdam,„ von 454 nm (epsilon = 22,000) und 344 nm (epsilon = 14,000) auf. Inder Gegenwart von beta-Galactosldase wurde das Substrat zu (20) gespalten, und zwar mit einer Geschwindigkeit (Kc„) von 1,32 x 104 Mol Min"'/Mol aktives Zentrum und einem Kn, von 0,075mM.
8-Hydroxy-11,11-dimethyl-i1H-dlbenz(b,e)(1,4)oxazepln-2-on (279 und 2-Hydroxy-i 1,11-dlmethyM 1H-dibenz(b,e)(1,4)oxazepin-8-on(28)
Eine Lösung von 2-(3'-Hydroxyphenyl)-1-propanol (25) (2,20g; 14,45mMol) (hergestellt gemäß Bruce et al., J. Chem. Soc. (C], 1627 [1966]) und von Na2B4O2 · 10H2O (Borax) (28g; 73,42mMol) in H2O (200ml) wurde bei Umgebungstemperatur mit Benzochinochlorimid (26) (2,0g; 14,13mMol) (hergestellt gemäß Gibbs, et al., Supplement No.69 to The Public Health Reports, Washington, DC, [1928]) in Tetrahydrofuran (5 ml) behandelt und dann 7 Tage lang gerührt. Die Reaktionsmischung wurde dann mit 1M HCI sauer gestellt und viermal mit EtOAc (125 ml) extrahiert. Die vereinigten EtOAc-Schichten wurden mit Salzlösung (100 ml) gewaschen, getrocknet (Na2SO4), filtriert und im Vakuum zur Trockne eingedampft. Der Rückstand wurde an Kieselgel (200g) unter Verwendung von Aceton:Chloroform (1:9)-Lösungsmittel chromatographiert; die rote Produktbande (R( = 0,33) wurde gesammelt und im Vakuum von Lösungsmittel befreit, um eine Mischung der Titelverbindungen als ein rotes Pulver (72mg) zu ergeben.
IR (KBr) cm"11634,1 614,1 556,1311,1 213,1180,878.
1H NMR (DMSO-dVUmgebungstemperatur) delta: 1,52 (br.s,6H), 5,8-7,7 (v.br.m, 6H), 10,75 (br.s, 1 H).
Ή NMR (DMSO-de/100°C) delta: 1,53 (s, 6H), 2,98 (v.br.s, 1 H) (OH), 6,13 (ör.s, 1 H), 6,57 (br.d,.) = 9,3Hz, 1 H, 6,66 (br.s, 1 H), 6,73 (v.br.d., J = 9,1 Hz, 1 H), 7,28 (d, J = 9,3Hz, 1 H), 7,44 (d, J = 9,0Hz, 1 H).
EIMS, m/e (relative Intensität) *55 (M+, Basis), 240 (14,8), 226 (44,3), 212 (41,8), 2,10 (23,7), 198 (26,8), 184 (30,3).
Analyse für C16H13NO3 1A H2O: berechnet: C69,35; H 5,24; N 5,39 gefunden: C 69,54; H 5,26; N 5,38
e-ITetra-O-acotyl-beta-D-galactopyranosyloxyJ-i l,11-iJimethyl-11H-dibenz(b,e)(1,4)oxazepln-2-on (29)und2-(Tetra-O-acetylbeta-D-galactopyranosyloxyl-IUI-dlmathyl-IIH-dibe.izlb.eKi^loxazepin-e-on (30) Eine Mischung von (27) und (28) (0,103g; 0,4rniv1ol), Acetobromgalactose (0,333g; 2Aeq) und Silber-(l)-oxid (Ag2O) (0,188g; 2Aeq) wurde bei Umgebungstemperatur in wasserfreiem Chinolin (7ml) und EtOAc (2ml) 18 Stunden lang in einem verschlossenen Kolben vor Licht geschützt gerührt. Die Reaktiunömischung wurde mit EtOAc (annähernd 40ml) verdünnt, durch Celito filtriert und dreimal mit 1,0M HCI (jeweils 30 ml) extrahiert. Die vereinigten wäßrigen Extrakte wurden mit EtOAc (40 ml) extrahiert, dann wurden die vereinigten EtOAc-Schichten mit Salzlösung (40nr I) gewaschen, getrocknet (Na2SO4), filtriert und im Vakuum zur Trockne eingedampft. Das Rohprodukt wurde an Kieselgel (93g) unter Verwendung von Aceton Chloroform (7:93)-Lösungsmittel chromatographiert, und die beiden gelben Produktbanden (Rf = 0,38 und 0,43 an Kicselgelplatten, entwickelt in Aceton:Chloroform [ 1:9]) wurden gesammelt, vereinigt und von Lösungsmittel im Vakuum befreit, um eine Mischung der Titelverbindungen als einen orangenen Schaum (0,216g; 92%) zu ergeben.
IR (KBr) cm"11750,164C, 1615,1 573,1368,1260,1070,955,898.
1H NMR (CDCI3) delta: 1,45-1,70 (m, 6 H), 2,0-2,2 (m, 12 H), 4,08-4,26 (m, 3 H), 5,10-5,20 (m, 2 H), 5,45-5,55 (m, 2 H), 6,00-7,70 (m,
13CNMR(CDCI3) ppm. 188,82,188,50,170,25,170,04,169,94,169,26,159,31,158,00,156,55,151,67,151,63,150,56,146,45,145,38, 141,78,140,19,137,11,136,59,135,11,130,70,129,46,129,31,126,22,124,96,115,33,115,28,113,81,112,76,109,03,98,54,98,42, 00,14,79,78,71,29,70,57,68,32,66,73,61,42,26,44,26,23,20,56 (17 Koinzidenzbanden).
8-beta-0-Galactopyranosyloxy-11,11-dimethyl-11H-dibenz-(b,e)(1,4)-oxazopln-2-on (31)und2-beta-D-Galactopyranosyloxy-11,11-dimethyl-11H-dibenz(b,e)(1,4)-oxBzepin-8-on(32)
Eine Lösung von (29) und (30) (0,21 g; 0,358mMol) in Methanol mit HPLC-Reinheit (20ml) wurde bei Umgebungstemperatur mit Natriummethoxid (22mg) behandelt und über einige Stunden gerührt. Die Reaktionsmischung wurde durch Zugabe von Essigsäure (23μΙ) gequenscht und dann im Vakuum zur Trockne eingedampft. Das Rohprodukt wurde an Kieselgel (60g) unter
Verwendung von Methanol in Chloroform (15:85)-Lösungsmittel chromatographiert, und die orangene Pi oduktbande (R( = 0,23 an Kieselgelplatten, entwickelt mit MethanohChloroform [1:4|) wurde gesammelt und im Vakuum von Lösungsmittel befreit, um die Titelverbindung als ein rotorangenes Pulver <.u ergeben (0,12g; 80%).
IR (KBr) cm"' 3416,2926,1634,1612,1567,1 503,1 385,1292,1227,1074,889.
1HNMR (DMSO-de)delta: 1,45-1,65(m,6H),3,30-3,75(m,6H)..4,5 (v, br.d, J = 1,4Hz, 1 H),4,68(br.q., J - = 6,7Hz, 1 H),4,91 (v.br.s, 1 H), 4,99 (t, J = 6,9 Hz, 1 H), 5,23 (v.br.s, 1 H), 5,9-7,7 (rn, 6 H).
13C NMR (DMSO-de) ppm. 107,91,187,76,161,47,159,68,156,35,150,61,150,31,146,25,145,62,141,99,140,91.138 '.S, 137,23, 136,20,134,09,130,33,129,19,124,75,116,15,114,69,113,32,113,01,108,65,100,58,100,42,80,72,79,99,76,00,75,78,73,30 73,24,70,19,68,26,68,17,60,52,60,38,28,01 (4 Koinzidenzbanden).
Analyse WrC21H23NO8 · 1-VjH2O: berechnet: C56,75; H 5,90; N3,15 gefunden: C 56,16; H 5,82; N 3,14
Es wurde eine Testvorrichtung hergestellt, die gegenüber dem Vorliegen von beta-Galactosidase in einer Testprobe empfindlich ist. Die Vorrichtung umfaßte ein kleines rechteckiges Stück Filterpapier, angebracht an einem Ende eines länglichen Streifens aus Polystyrolfilm. Das Papier wurde mit verschiedensn Ingredienzien, einschließlich (23) und (24), einem Puffer und anorganischem Salz, imprägniert. Ein ca. 5cm breiter Streifen von Whatman-R4-FiltBrnapier wurde in eine wäßrige Lösung getaucht, die das folgende enthielt:
0,6M NaEpps-Puffer (pH = 8,4) 4,OmM MgCI2
Das Papier wurde dann über Nacht an Luft getrocknet. Als nächstes wurde das Papier in eine DMF-Lösung getaucht, enthaltend: 15mM(23) + (24)
Das Papier wurde dann in Luft bei 50 bis 8O0C getrocknet. Es wurde ein gelbes Testpapier erhalten.
Das Stück aus dem getrockneten, imprägnierten Papier wurde in ein Rechteck von 0,254cm χ 1,016cm geschnitten und an einem Ende eines axial orientierten Polystyrolstreifens von 0,254 cm x 8,25cm angebracht. Die Anbringung des Papiers auf den Streifen erfolgte unter Verwendung eines doppelseitigen Doppelklebebandes (3 M Company).
Es wurden Lösungen von beta-D-Galactosidase in Kaliumphosphat/zitrat-Puffer von pH 6,4 mit 0,025,0,05,0,075,0,10,0,125 und 0,15 IU/ml hergestellt. Drei analytische Testvorrichtungen wurden in jede Testlösung getaucht. Die jeweiligen Analyseteststreifen wurden dann in einen SERALYZER'-Reflexionsphotometer (Miles, Inc., Elkhart, IN, USA) gegeben, und es wurde die Reflexion von Licht aus dem Teststreifen, enthaltend das freigesetzte Chromogen (20), bei 590 nm nach 70 bis 90 Sekunden gemessen, wobei die Reflexionswerte davon gegen die jeweiligen Testprobenlösungskonzentrationen aufgetragen wurden, um eine lineare Dosisabhängigkeit erkennen zu geben, wie in Fig.4 dargestellt.
Die vorliegende Erfindung ist vorstehend im einzelnen beschrieben und dargelegt worden. Es sollte klar sein, daß viele Variationen und Abänderungen der Erfindung vorgenommen werden können, ohne von ihrem Inhalt und Umfang abzuweichen.
Claims (10)
- -1- 297 965 Patentansprüche:1. Chromogene Enzymsubstratverbindung der Formel:oderworin Y eino durch ein Enzym abspaltbare Gruppe darstellt, W O oder S ist und R und R', die gleich oder Verschieden sein können, Wasserstoff, Alkyl oder Aryl sind.
- 2. Verbindung gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß W O ist.
- 3. Verbindung gemäß Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß R und R', die gleich oder verschieden sein können, H, Niedrigalkyl oder Phenyl sind, und wobei vorzugsweise R und R' nicht beide H oder Phenyl sind.
- 4. Verbindung gemäß jedem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß Y ein Rest einer Verbindung Y-OH ist, enthaltend einen Enzym-spezifischen Rest, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Zuckern und Derivaten davon, aliphatischen und aromatischen Carbonsäuren und Phosphorsäure.
- 5. Verbindung gemäß Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß einer von R und R' H und der andere Niedrigalkyl sind, und wobei vorzugsweise einer von R und R'H und der andere Methyl, oder R und R' beide Methyl sind.
- 6. Verbindung gemäß Anspruch 4 oder 5, dadurch gekennzeichnet, daß der genannte Enzymspezifische Rest ein Zucker oder ein Derivat davon ist, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus alpha-D-Galactose, beta-D-Galactose, alpha-D-Glucose, beta-D-Glucose, alpha-D-Mannose, N-Acetylglucosamin und N-Acet Ineuraminsäure.
- 7. Verbindung gemäß jedem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß der genannte Enzym-spezifische Rest eine Oligosaccharidkette von ca. 2 bis ca. 20 Monosaccharideinheiten ist.
- 8. Verbindung gemäß jedem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß der genannte Enzym-spezifische Rest ein(e) N-geschützte Aminosäure oder Peptid von ca. 2 bis ca.5 Aminosäureeinheiten, vorzugsweise N-Tosyl-L-alanin, ist.
- 9. Verbindung gemäß jedem der Ansprüche 1 bis3, dadurch gekennzeichnet, daß der genannte Enzym-spezifische Rest Phosphorsäure ist.
- 10. Verwendung derVerbindung eines jeden der Ansprüche 1 bis 9 zur Bestimmung eines besonderen Enzyms, das zur Abspaltung der genannten durch das Enzym abspaltbaren Gruppe befähigt ist.
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