DD296702A5 - METHOD FOR DISCONTINUOUS MANUFACTURE OF L-CARNITINE ON A MICROBIOLOGICAL PATH - Google Patents
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- DD296702A5 DD296702A5 DD90343118A DD34311890A DD296702A5 DD 296702 A5 DD296702 A5 DD 296702A5 DD 90343118 A DD90343118 A DD 90343118A DD 34311890 A DD34311890 A DD 34311890A DD 296702 A5 DD296702 A5 DD 296702A5
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- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
- C12P13/007—Carnitine; Butyrobetaine; Crotonobetaine
Abstract
Description
Anwendungsgebiet der ErfindungField of application of the invention
Die Erfindung betrifft ein neues Verfahren zur Herstellung von L-Carnitin auf mikrobiologischem Weg.The invention relates to a novel process for the production of L-carnitine on a microbiological route.
Charakteristik des bekannten Standes der TechnikCharacteristic of the known state of the art
L-Carnitin ist eine für den menschlichen Metabolismus essentielle Substanz für z.B. den Abbau der Fettsäuren. Künstlich hergestelltes L-Carnitin wird daher in pharmaHeutischen Präparaten als Wirksubstanz gegen entsprechende Mangelkrankheiten eingesetzt.L-carnitine is a substance essential to human metabolism for e.g. the breakdown of fatty acids. Artificially produced L-carnitine is therefore used in pharmaHeutischen preparations as active substance against corresponding deficiency diseases.
Es ist bekannt, L-Carnitin aus γ-Butyrobetain herzustellen. Das γ-Butyrobetain wird in Gegenwart von Natrium-2-oxoglutarat, einem reduzierenden Agens, einer Eisenionenquelle und Luftsauerstoff als Hydroxylgruppendonator mit einem Hydroxylase-Enzym, freigesetzt aus Sporen von Neurospora crassa, in Berührung gebracht (US-PS 4371 618). Dieses Verfahren weist den Nachteil auf, eine Vielzahl von Cofaktoren zu benötigen, die extern zugeführt werden müssen. So werden in der Reaktion stöchiometrische Mengen 2-Oxoglutarat oxidativ zu Succinat decarboxyliert. Fe2+wird als O2-Aktivator benötigt, Ascorbat, um das Eisen-Ion in der reduzierten Form zu halten, und Katalase, um das in Spuren entstehende, schädliche H2O2 zu zerstören.It is known to produce L-carnitine from γ-butyrobetaine. The γ-butyrobetaine is contacted in the presence of sodium 2-oxoglutarate, a reducing agent, an iron ion source and atmospheric oxygen as a hydroxyl group donor with a hydroxylase enzyme released from spores of Neurospora crassa (U.S. Patent No. 4,371,618). This method has the disadvantage of requiring a large number of cofactors which have to be supplied externally. Thus, stoichiometric amounts of 2-oxoglutarate are oxidatively decarboxylated to succinate in the reaction. Fe 2+ is needed as an O 2 activator, ascorbate to keep the iron ion in the reduced form, and catalase to destroy the trace amount of harmful H 2 O 2 .
Lindstedt et al, (Biochemistry 6,1 262-1 270 [1967] „The Formation and Degradation of Carnitin in Pseudomonas") isolierten einen Mikroorganismus der Gattung Pseudomonas, der mit γ-Butyrobetain als C- und N-Quelle wächst. Die erste Reaktion des Abbauweges war die Hydroxylierung des γ-Butyrobetains zu L-Carnitin, wobei das intermediär entstehende L-Carnitin vollständig zu CO2, H2O und NH3 weiterkatabolisiert wurde.Lindstedt et al (Biochemistry 6.1.262-1.270 [1967] "The Formation and Degradation of Carnitine in Pseudomonas") isolated a microorganism of the genus Pseudomonas that grows with γ-butyrobetaine as C and N source Reaction of the degradation pathway was the hydroxylation of γ-butyrobetaine to L-carnitine, where the intermediate L-carnitine was completely catabolic to CO 2 , H 2 O and NH 3 further.
Auch diese aus Bakterien gewonnene Hydroxylase hätte, wenn sie für die L-Carnitin-Produktion eingesetzt würde, die geschilderten nachteiligen Cofaktor-Bedürfnisse (Lindstedt et al. Biochemistry 16,2181-2188 [1977] „Purification and Properties of γ-Butyrobetaine Hydroxylase from Pseudomonas sp. AK1").Also, this bacterial-derived hydroxylase, when used for L-carnitine production, would have the detrimental cofactor needs described (Lindstedt et al., Biochemistry 16, 2181-2188 [1977], "Purification and Properties of γ-Butyrobetaine Hydroxylase" Pseudomonas sp. AK1 ").
Gemäß US-PS 4708936 ist im weiteren bekannt, L-Carnitin auf mikrobiologischem Weg kontinuierlich herzustellen. Es hat sich aber als nachteilig herausgestellt, daß die Stammstabilität beim kontinuierlichen Verfahren sehr hoch sein muß (mehr als 1 000h), außerdem sind der Produktkonzentration im Medium relativ niedrige Grenzen gesetzt. Das Produkt-Edukt-Verhältnis ist ebenfalls relativ niedrig.According to US Pat. No. 4,709,836 it is furthermore known to continuously produce L-carnitine on a microbiological route. However, it has proved to be disadvantageous that the stem stability in the continuous process must be very high (more than 1 000 h), in addition, the product concentration in the medium are set relatively low limits. The product-to-react ratio is also relatively low.
Ziel der ErfindungObject of the invention
Ziel der Erfindung ist es, ein effektiveres Verfahren bereitzustellen, das insbesondere die nachteiligen Cofaktor-Bedürfnisse bekannter Verfahren zur L-Carnitin-Produktion vermeidet.The aim of the invention is to provide a more effective method, which in particular avoids the adverse cofactor needs of known processes for L-carnitine production.
Darlegung des Wesens der ErfindungExplanation of the essence of the invention
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zu entwickeln, das es gestattet, enantioselektiv und auf mikrobiologischem Weg in hoher Ausbeute L-Carnitin aus Crotonobetain und/oder γ-Butyrobetain herzustellen. Erfindungsgemäß wird die Aufgabe durch ein Verfahren gelöst, das in einem Kulturmedium einen Mikroorganismus der Gattung Pseudomonas, Rhizobium, Agrobacterium, E.coli oder einer Hefe der Gattung Saccharomyces enthält. Dem Medium werdenThe invention has for its object to develop a method that allows to produce enantioselective and microbiological way in high yield L-carnitine from crotonobetaine and / or γ-butyrobetaine. According to the invention the object is achieved by a method which contains in a culture medium a microorganism of the genus Pseudomonas, Rhizobium, Agrobacterium, E. coli or a yeast of the genus Saccharomyces. Become the medium
γ-Butyrobetain und/oder Crotonobetain sowie Betain als C- und N-Quelle und zusätzlich eine Kohlenstoffquelle zugeführt. Nach Erreichen der maximalen L-Carnitinkonzentration wird das L-Carnitin abgetrennt.γ-Butyrobetain and / or crotonobetaine and betaine fed as C and N source and additionally a carbon source. After reaching the maximum L-carnitine concentration, the L-carnitine is separated.
Zweckmäßig werden Mikroorganismen der Gartung Rhizobium, vorzugsweise der Stamm HK 1331 b, hinterlegt am 8.2.1985 bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen (DSM), Gesellschaft für Biotechnologische Forschung mbH, Griesebachstr. 8, D - 3400 Göttingen, unter der Nr. DSM 3225, der Stamm HK13, hinterlegt am 23.1.1984 bei derselben Stelle, unter der DMS Nr. 2903 verwendet.Appropriately, microorganisms of the garden Rhizobium, preferably the strain HK 1331 b, deposited on 8.2.1985 at the German Collection of Microorganisms (DSM), Gesellschaft für Biotechnologische Forschung mbH, Griesebachstr. 8, D - 3400 Göttingen, under the number DSM 3225, the strain HK13, deposited on 23.1.1984 at the same place, used under the DMS No. 2903.
Für das Verfahren ebenso geeignet sind Mikroorganismusstämme, die gentechnologisch verändert sind.Also suitable for the process are microorganism strains that have been genetically engineered.
Im Unterschied zu den im Stand der Technik bekannten Systemen verwenden die erfindungsgemäßen Mikroorganismen das H2O und nicht das O2, als Hydroxylgruppendonator, wie durch eigene Untersuchungen unter Verwendung von H2 18O und 18O2 festgestellt werden konnte.Unlike the systems known in the art, the microorganisms of the invention utilize H 2 O and not O 2 as the hydroxyl group donor, as determined by our own studies using H 2 18 O and 18 O 2 .
Die Selektion und die Charakterisierung dieser bevorzugten Mikroorganismen sind beschrieben in der EP-A 0158194.The selection and characterization of these preferred microorganisms are described in EP-A 0158194.
Das erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung von L-Carnitin wird zweckmäßig derart ausgeführt, daß man in einer ersten sogenannten Batch-Phase produktionsfähige Biomasse erzeugt. Dazu wird auf bekannte Weise entsprechend der EP-A 0158194 einer der genannten Stämme in einem sterilisierten, vorzugsweise vitaminhaltigen Mineralmedium (KuIIa et al, Arch. Microbiol.The process according to the invention for the production of L-carnitine is expediently carried out in such a way that production-capable biomass is produced in a first so-called batch phase. For this purpose, in a known manner according to EP-A 0158194 one of the mentioned strains in a sterilized, preferably vitamin-containing mineral medium (KuIIa et al, Arch. Microbiol.
135,1 [1983]) bei 20°C bis 40°C, vorzugswise bei 30°C, bei einem zweckmäßigen pH-Wert von 6 bis 8, vorzugsweise 7, während 5 bis 80h, vorteilhaft während 15 bis 40 h, kultiviert. Dieses Medium enthält zweckmäßig 0,01 bis 10Gew.-%, vorzugsweise 0,01 bis 5Gew.-%, Cholin, Glutamat, Acetat, Dimethylglycin oder Betain als Wachstumssubstrat. Besonders bevorzugt wird Betain zusammen mit Glutamat oder einer weiteren Kohlenstoffquelle in Mengen von je 0,02 bis 5Gew.-% eingesetzt.135.1 [1983]) at 20 ° C to 40 ° C, preferably at 30 ° C, at a convenient pH of 6 to 8, preferably 7, for 5 to 80h, advantageously for 15 to 40 h, cultured. This medium suitably contains 0.01 to 10% by weight, preferably 0.01 to 5% by weight, of choline, glutamate, acetate, dimethylglycine or betaine as a growth substrate. Particularly preferably betaine is used together with glutamate or another carbon source in amounts of 0.02 to 5Gew .-%.
Des weiteren werden in der Batch-Phase die umzusetzenden Ausgangsverbindungen γ-Butyrobetain, Crotonobetain oder Gemische davon in Mengen von 0,01 bis 10Gew.-%, vorzugsweise 0,1 bis 5Gew.-%, bezogen auf das Reaktionsmedium, vorgelegt.Furthermore, in the batch phase, the starting compounds to be reacted .gamma.-butyrobetaine, crotonobetaine or mixtures thereof are initially introduced in amounts of 0.01 to 10% by weight, preferably 0.1 to 5% by weight, based on the reaction medium.
Das γ-Butyrobetain bzw. Crotonobetain kann teilweise als Hydrochloridsalz oder als freies inneres Salz vorliegen.The γ-butyrobetaine or crotonobetaine may be partially present as a hydrochloride salt or as a free internal salt.
Mit der in der Batch-Phase gezüchteten Biomasse können weitere Kulturen beimpft werden. Diese weiteren Kulturen haben zweckmäßig die gleiche Zusammensetzung wie die Vorkulturen.With the biomass grown in the batch phase further cultures can be inoculated. These other cultures suitably have the same composition as the precultures.
Beim erfindungsgemäßen Verfahren ist die in der Batch-Phase gezüchtete Biomasse Ausgangspunkt für die L-Carnitinproduktion in der sog. „fed-batch"-Phase.In the method according to the invention, the biomass grown in the batch phase is the starting point for L-carnitine production in the so-called "fed-batch" phase.
Das Kulturmedium in der „fed-batch"-Phase ist dem der Batch-Phase weitgehend ähnlich.The culture medium in the fed-batch phase is largely similar to that of the batch phase.
Die „fed-batch"-Phase ist dadurch charakterisiert, daß der Kulturlösung das Edukt Crotonobetain und/oder γ-Butyrobetain, Betain sowie eine zusätzliche Kohlenstoffquelle zudosiert wird.The "fed-batch" phase is characterized in that the educt crotonobetaine and / or γ-butyrobetaine, betaine and an additional carbon source are added to the culture solution.
Als Kohlenstoffquelle können die in der Fachwelt üblichen und z.B. für Rhizobiumstämme literaturbekannten Verbindungen eingesetzt werden (The prokaryotes. Chapter 67, The genus Rhizobium, Springer Verlag 1981, p.825).As the carbon source, those conventional in the art and e.g. for Rhizobiumstämme literature known compounds are used (The prokaryotes, Chapter 67, The genus Rhizobium, Springer Verlag 1981, p.825).
Zweckmäßige Kohlenstoffquellen sind z. B. Zucker wie Glucose oder Fructose, Zuckeralkohole wie Glycerin oder org. Säuren wie Essigsäure.Suitable carbon sources are z. As sugars such as glucose or fructose, sugar alcohols such as glycerol or org. Acids such as acetic acid.
Vorzugsweise wird Glucose oder Glycerin eingesetzt.Preferably, glucose or glycerol is used.
Das Molverhältnis Kohlenstoff zu Stickstoff (C zu N) wird zweckmäßig zwischen größer 5 Mol C zu 1 Mol N und 10000 Mol C zu 1 Mol N, vorzugsweise zwischen 10 Mol C zu 1 Mol N und 100 Mol C zu 1 Mol N, gewählt.The molar ratio of carbon to nitrogen (C to N) is suitably chosen between greater than 5 moles C to 1 moles N and 10000 moles C to 1 moles N, preferably between 10 moles C to 1 moles N and 100 moles C to 1 moles N.
Bei sehr hohen Kohlenstoff-Stickstoff-Verhältnissen kann es notwendig sein, neben dem Betain eine weitere Stickstoffquelle zuzusetzen. Als weitere Stickstoffquelle können dazu die in der Fachwelt üblichen und bekannten Vertreter wie z.B. Ammonium verwendet werden. Es können auch zusätzliche Nährstoffe, wie z. B. eine Schwefel-, eine Phosphorquelle, Spurenelemente, Vitamine oder komplexe Nährstoffe, wie Fleischextrakte, Hefeextrakte oder Maisquellwasser, zudosiert werden.At very high carbon-to-nitrogen ratios, it may be necessary to add another nitrogen source in addition to the betaine. As a further source of nitrogen, the well-known and known in the art representatives such as. Ammonium be used. There may also be additional nutrients, such as. As a sulfur, a phosphorus source, trace elements, vitamins or complex nutrients, such as meat extracts, yeast extracts or corn steep liquor, are added.
Die Edukte γ-Butyrobetain oder Crotonobetain werden zweckmäßig so zugeführt, daß im Kulturmedium eine Konzentration zwischen zweckmäßig 0,005 bis 5%, vorzugsweise zwischen 0,02 und 2%, gewährleistet ist.The educts γ-butyrobetaine or crotonobetaine are expediently supplied in such a way that a concentration of between 0.005 and 5%, preferably between 0.02 and 2%, is ensured in the culture medium.
Die Zugabegeschwindigkeit der Kohlenstoff/Stickstoffquelle ist abhängig von der Biomassemenge im Bioreaktor. Eine bekannte Methode zur Bestimmung der Biomassekonzentration ist die Messung des Trockengewichts der Kulturlösung. Diesem Trockengewicht entsprechend und im Hinblick auf das gewünschte Kohlenstoff/Stickstoffverhältnis wird die Kohlenstoffquelle und Betain mit einer Geschwindigkeit von zweckmäßig 0,01 bis 100, vorzugsweise von 0,1 bis 10 Mol Kohlenstoff pro kg Trockengewicht, im Fermenter pro Stunde dem Fermenter zudosiert.The rate of addition of the carbon / nitrogen source depends on the biomass amount in the bioreactor. A known method for determining the biomass concentration is the measurement of the dry weight of the culture solution. According to this dry weight and in view of the desired carbon / nitrogen ratio, the carbon source and betaine are metered into the fermenter at a rate of preferably from 0.01 to 100, preferably from 0.1 to 10 moles of carbon per kg of dry weight per hour in the fermenter.
Es wird vorteilhaft in einem Temperaturbereich von 200C bis 4O0C bei einem pH zwischen 6 und 8 gearbeitet.It is advantageous in a temperature range of 20 0 C to 4O 0 C at a pH between 6 and 8 worked.
Nach Kultivierung in der „fed-batch"-Phase von in der Regel nach 25 bis 250h kann eine L-Carnitin-Konzentration in der Kultur von mehr als 6% erreicht werden.After culturing in the fed-batch phase, usually after 25 to 250 hours, an L-carnitine concentration in the culture of more than 6% can be achieved.
Nach einer Modifikation des Verfahrens ist es auch möglich, nach Beendigung der Fermentation einen Teil der Kulturlösung abzulassen und mit dem verbleibenden Teil, aufgefüllt mit neuem Kulturmedium, eine erneute „fed-batch"-Kultivierung anzufahren.After a modification of the method, it is also possible, after completion of the fermentation to drain a portion of the culture solution and to start with the remaining part, filled with new culture medium, a new "fed-batch" cultivation.
Mit diesem sog. „repeated fed-batch"-Verfahren gelingt es, die volumetrische Produktivität der Fermentation zu erhöhen.This so-called "repeated fed-batch" process succeeds in increasing the volumetric productivity of the fermentation.
Eine Entlastung der Kultur kann dadurch erreicht werden, daß man das einzusetzende γ-Butyrobetain und/oder das Crotonobetain vorgängig mittels Ionenaustauscher oder mittels Elektrodialyse entsalzt und reinigt.Relief of the culture can be achieved by desalting and purifying the γ-butyrobetaine to be used and / or the crotonobetaine beforehand by means of ion exchange or by means of electrodialysis.
Die Gewinnung des L-Carnitins aus der Kulturlösung ist z. B. aus der EP-A 195944 bekannt und kann so durchgeführt werden, daß nach Abtrennung der Biomasse durch z. B. Zentrifugieren, Ultrafiltration oder Mikrofiltration mittels einer Labor-Elektrodialyseanlage die Lösung von den geladenen Teilchen (Kationen und Anionen) befreit wird. Der Endpunkt der Entsalzung kann konduktometrisch ermittelt werden. Dabei wandern die Salze in den Konzentratkreislauf, während das L-Carnitin als inneres Salz („Betain") im Diluat-Kreislauf verbleibt. So können Ausbeuten an L-Carnitin im DiIuat nach der Entsalzung von mehr als 95% erreicht werden.The recovery of L-carnitine from the culture solution is z. B. from EP-A 195944 and can be carried out so that after separation of the biomass by z. As centrifugation, ultrafiltration or microfiltration by means of a laboratory electrodialysis plant, the solution of the charged particles (cations and anions) is released. The end point of desalination can be determined by conductometry. In the process, the salts migrate into the concentrate cycle, while the L-carnitine remains in the dilute circulation as an inner salt ("betaine"), so that yields of L-carnitine in the diIuate after desalting can be achieved by more than 95%.
Alternativ zur Elektrodialyse kann das L-Carnitin auch mittels eines stark sauren Kationenaustauschers in der H°-Form entsalzt werden (vgl. J.P.Vandecasteele, Appl. Environ. Microbiol. 39, 327 [1980]). Dabei läßt man die Lösung solange über eine lonenaustauscherkolonne fließen, bis der Ionenaustauscher erschöpft ist und L-Carnitin durchbricht. Die Anionen gehen als freie Säuren in den Durchlauf. Die Kationen bleiben auf dem Ionenaustauscher. Nach Neutralwaschen des Ionenaustauschers mit Wasser kann das L-Carnitin mit wäßriger Ammoniaklösung eluiert werden. So können Ausbeuten an L-Carnitin im ammoniakalischen Eluat von mehr als 95% erreicht werden.As an alternative to electrodialysis, the L-carnitine can also be desalted by means of a strongly acidic cation exchanger in the H ° form (compare J.P.Vandecasteele, Appl., Environ., Microbiol., 39, 327 [1980]). The solution is allowed to flow over an ion exchanger column until the ion exchanger is exhausted and breaks through L-carnitine. The anions go into the pass as free acids. The cations remain on the ion exchanger. After neutral washing of the ion exchanger with water, the L-carnitine can be eluted with aqueous ammonia solution. Thus, yields of L-carnitine in the ammoniacal eluate of more than 95% can be achieved.
Die sowohl bei der Elektrodialyse wie auch mittels Ionenaustauscher anfallenden verdünnten L-Carnitin-Lösungen können entweder durch Verdampfung oder auch durch Umkehrosmose auf konzentriert und anschließend azeotrop entwässert werden. Das so anfallende L-Carnitin kann dann durch anschließende Umkristallisation aus zweckmäßig Isobutanol/Aceton, Methanol, Ethanol, n-Butanol bzw. in Kombination mit Lösungsmitteln, welche L-Carnitin wenig lösen, wie z. B. Aceton, Ethylacetat, Y-Butylacetat, Isobutylmethylketon und Acetonitril, vorzugsweise Isobutanol, und zusätzliche Aktivkohlebehandlung in reines weißes L-Carnitin übergeführt werden. Es kann gemäß diesem Verfahren L-Carnitin mit spezifischen Drehungen von [α]" —30,5 bis -31,0°, с = 1 in H2O (Literaturwert -30,9°; Strecket al, Hoppe-Seyler's Z. f. physiolog. Chem., 318 [19601,129) und einem Gehalt von mehr als 99% (HPLC) erhalten werden.The dilute L-carnitine solutions obtained both in electrodialysis and by means of ion exchangers can be concentrated either by evaporation or by reverse osmosis and then azeotropically dehydrated. The resulting L-carnitine can then by subsequent recrystallization from appropriate isobutanol / acetone, methanol, ethanol, n-butanol or in combination with solvents which dissolve L-carnitine little, such as. As acetone, ethyl acetate, Y-butyl acetate, isobutyl methyl ketone and acetonitrile, preferably isobutanol, and additional charcoal treatment are converted into pure white L-carnitine. It can according to this method L-carnitine with specific rotations of [α] "-30.5 to -31.0 °, с = 1 in H 2 O (literature value -30.9 °; Strecket al, Hoppe-Seyler's Z. Physiolog Chem., 318 [19601, 1229] and containing greater than 99% (HPLC).
Eine 0,3-l-Vorkultur des Stammes HK 1331 b wurde in folgendem Nährmedium bei 300C, pH 7,0 während 24h kultiviert:A 0.3 liter preculture of strain HK 1331 b was cultured in the following nutrient medium at 30 ° C., pH 7.0 for 24 h:
Mit der Vorkultur wurden 51 Nährmedium gleicher Zusammensetzung im Fermenter beimpft und bei 30°C, pH 7, während 24 h kultiviert. Der pH wurde durch Zugabe von 8%iger Phosphorsäure bei 7,0 konstant gehalten.With the preculture 51 nutrient medium of the same composition were inoculated in the fermenter and cultured at 30 ° C, pH 7, for 24 h. The pH was kept constant at 7.0 by addition of 8% phosphoric acid.
a) Anschließend wurde mit dem „fed-batch" Betrieb begonnen. Zwei Lösungen folgender Zusammensetzungen wurden kontinuierlich zudosiert.a) Subsequently, the fed-batch operation was started and two solutions of the following compositions were metered in continuously.
Betain 100 gBetaine 100 g
Glucose 135gGlucose 135g
mitWasserauf 11with water on 11
Kohlenstoff/Stickstoffverhältnis 10,3:1Carbon / nitrogen ratio 10.3: 1
Zusammensetzung des γ-ButyrobetainzulaufsComposition of the γ-butyrobetaine feed
γ-Butyrobetain 300 gγ-Butyrobetaine 300 g
mit Wasser auf 1 Iwith water to 1 l
Die Lösung mit der Kohlenstoff- und der Stickstoffquelle wurde mit einer Geschwindigkeit von 4,5ml/h zudosiert. Das entsprach einer spezifischen Zulaufgeschwindigkeit von 4 Mol C/kg Trockengewicht/h am Anfang der „fed-batch"-Phase. Das Trockengewicht wurde auf übliche Weise bestimmt (г. B. Appl. Microbiol. Biotechnol. 28 [19881109т.). Die Konzentration an γ-Butyrobetain und L-Carnitin wurde mittels HPLC bestimmt. Die γ-Butyrobetainlösung wurde derart zudosiert, daß die γ-Butyrobetainkonzentration im Fermenterzwischen 0,05 und 0,5Gew.-% lag. 150h nach der Inokulierung des Fermenters wurde eine L-Carnitinkonzentration von 6,4% und eine Konzentration von nicht umgesetztem γ-Butyrobetain von 0,29% erreicht. Dies entsprach einem 95%igen Umsatz von γ-Butyrobetain.The solution with the carbon and the nitrogen source was added at a rate of 4.5 ml / h. This corresponded to a specific feed rate of 4 mol C / kg dry weight / h at the beginning of the "fed-batch" phase The dry weight was determined in a customary manner (eg Appl. Microbiol Biotechnol 28 [19881109]) Concentration of γ-butyrobetaine and L-carnitine was determined by HPLC, The γ-butyrobetaine solution was metered in such that the γ-butyrobetaine concentration in the fermenter was between 0.05 and 0.5% by weight, 150 hours after inoculation of the fermenter became L Carnitine concentration of 6.4% and a concentration of unreacted γ-butyrobetaine of 0.29%, corresponding to a 95% conversion of γ-butyrobetaine.
b) Entsprechend a) und mit derselben Zusammensetzung des Kohlenstoff/Stickstoffzulaufs und des γ-Butyrobetainzulaufs wurde der „fed-batch"-Betrieb aufgenommen.b) According to a) and with the same composition of the carbon / nitrogen feed and the γ-butyrobetaine feed, the fed-batch operation was started.
Die Lösung mit der Kohlenstoff- und der Stickstoffquelle wurde mit einer Geschwindigkeit von 4,5ml/h zudosiert. Das entsprach einer spezifischen Zulaufgeschwindigkeit von 4 Mol C/kg Trockengewicht/h am Anfang der „fed-batch"-Phase. Das Trockengewicht wurde auf übliche Weise bestimmt (z.B. Appl. Microbiol. Biotechnol. 28 [1988] 109f.). Die Konzentration an γ-Butyrobetain und L-Carnitin wurde mittels HPLC bestimmt. Die γ-Butyrobetainlösung wurde derart zudosiert, daß die γ-Butyrobetainkonzentration im Fermenterzwischen 0,05 und 0,15Gew.-% lag. 155h nach der Inokulierung des Fermenters wurde eine L-Carnitinkonzentration von 6,3% und eine Konzentration von nicht umgesetztem γ-Butyrobetain von 0,13% erreicht. Dies entsprach einem 98%igen Umsatz von γ-Butyrobetain.The solution with the carbon and the nitrogen source was added at a rate of 4.5 ml / h. This corresponded to a specific feed rate of 4 mol C / kg dry weight / h at the beginning of the "fed-batch" phase The dry weight was determined in a customary manner (eg Appl. Microbiol Biotechnol 28 [1988] 109f.) The γ-butyrobetaine solution was metered in such that the γ-butyrobetaine concentration in the fermenter was between 0.05 and 0.15% by weight, and 155 hours after inoculation of the fermenter an L-carnitine was determined by HPLC. Reached carnitine concentration of 6.3% and a concentration of unreacted γ-butyrobetaine of 0.13%, corresponding to a 98% conversion of γ-butyrobetaine.
Reines L-Carnitin konnte aus der Lösung, welche 64g/l L-Carnitin, 2,9g/l γ-Butyrobetain und anorganische Salze enthielt, entsprechend dem Vorgehen aus der EP-A 195944 isoliert werden. Nach der Reinigungsstufe durch Umkristallisation konnten 56,3g (88%) weißes L-Carnitin, HPLC > 99%, spez. Drehung a£5 -30,9°, (c = 1, H2O) erhalten werden.Pure L-carnitine could be isolated from the solution containing 64 g / L L-carnitine, 2.9 g / L gamma-butyrobetaine and inorganic salts according to the procedure of EP-A 195944. After the purification step by recrystallization 56.3 g (88%) of white L-carnitine, HPLC> 99%, spec. Rotation a £ 5 -30.9 °, (c = 1, H 2 O) can be obtained.
300ml des im Beispiel 1 beschriebenen Nährmediums, das anstelle des γ-Butyrobetains 2g/l Crotonobetain enthielt, wurde mit dem Stamme HK 1331 b angeimpft und bei 30°C, pH 7, während 24h kultiviert.300 ml of the culture medium described in Example 1, which contained 2 g / l crotonobetaine instead of the γ-butyrobetaine, was inoculated with the strain HK 1331 b and cultured at 30 ° C, pH 7, for 24 h.
M it der Vorkultur wurde 51 Nährmediumwiein Beispiel 1 beimpft und bei 300C, bei pH 7,0 während 24 h kultiviert. Durch Zugabe von 8%iger Phosphorsäure wurde der pH bei 7,0 konstant gehalten. Anschließend wurde mit dem „fed-batch"-Betrieb begonnen. Wie in Beispiel 1 beschrieben wurde die Kohlenstoff- und Stickstoffquelle sowie eine Lösung nachstehender Zusammensetzung kontinuierlich zudosiert.In the preculture, 51 broth was inoculated as in Example 1 and cultured at 30 ° C. at pH 7.0 for 24 hours. By adding 8% phosphoric acid, the pH was kept constant at 7.0. Subsequently, the fed-batch operation was started as described in Example 1, the carbon and nitrogen source and a solution of the following composition was added continuously.
Zusammensetzung des CrotonobetainzulaufsComposition of the crotonobetaine feed
Crotonobetain 300 gCrotonobetaine 300 g
mitWasserauf 1 Iwith water to 1 l
Die Lösung mit der Kohlenstoff- und der Stickstoffquelle wurde mit einer Geschwindigkeit von 4,5ml/h zudosiert. Das entsprach einer spezifischen Zulaufgeschwindigkeit von ca. 4 Mol C/kg Trockengewicht/h am Anfang der „fed-batch"-Phase. Die Muster wurden auf derselben Art und Weise, wie beschrieben im Beispiel 1, behandelt und analysiert. Der Crotonobetainzulauf wurde derart zudosiert, daß die Crotonobetainkonzentration im Fermenter zwischen 0,05 und 0,5Gew.-% lag. 150 h nach der Inokulierung des Fermenters wurde eine L-Carnitinkonzentration von 6,1 % und eine Konzentration von nichtumgesetztem Crotonobetain von 0,17 % erreicht. Dies entsprach einem 95%igen Umsatz von Crotonobetain.The solution with the carbon and the nitrogen source was added at a rate of 4.5 ml / h. This corresponded to a specific feed rate of about 4 mol C / kg dry weight / h at the beginning of the "fed-batch" phase The samples were treated and analyzed in the same manner as described in example 1. The crotonobetaine feed became such The concentration of crotonobetaine in the fermenter was between 0.05 and 0.5% by weight, and 150 hours after the inoculation of the fermenter an L-carnitine concentration of 6.1% and a concentration of unreacted crotonobetaine of 0.17% were reached. This corresponded to a 95% conversion of crotonobetaine.
Reines L-Carnitin konnte aus der Lösung, welche 61 g/l L-Carnitin, 1,7g/l Crotonobetain und anorganische Salze enthielt, entsprechend der EP-A 195944 aufgearbeitet werden.Pure L-carnitine could be worked up from the solution containing 61 g / L L-carnitine, 1.7 g / L crotonobetaine and inorganic salts according to EP-A 195944.
Nach der Umkristallisation konnten 52g (86%) weißes L-Carnitin mit den gleichen Spezifikationen wie in Beispiel 1 erhalten werden.After recrystallization, 52 g (86%) of white L-carnitine having the same specifications as in Example 1 were obtained.
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