NO178235B

NO178235B - Process for Microbiological Preparation of L-Carnitine

Info

Publication number: NO178235B
Application number: NO903338A
Authority: NO
Inventors: Frans Hoeks
Original assignee: Lonza Ag
Priority date: 1989-07-28
Filing date: 1990-07-27
Publication date: 1995-11-06
Also published as: FI102083B1; FI903742A0; CA2021869A1; EP0410430B1; NO903338L; EP0410430A3; AU625525B2; JPH0751071B2; DD296702A5; ATE132535T1; IE902689A1; NO178235C; CA2021869C; JPH0376591A; IL95196A; MX170707B; NO903338D0; ES2081878T3; FI102083B; EP0410430A2

Abstract

The process starts from gamma -butyrobetaine and/or crotonobetaine.

Description

Denne oppfinnelse vedrører en ny fremgangsmåte for diskontinuerlig fremstilling av L-carnitin ved mikrobiologisk utnyttelse av krotonbetain eller -y-butyrobetain i et kulturmedium som inneholder en mikroorganisme av slekten Rhizobium. L-carnitin er en for den menneskelige metabolisme essensiell substans, f.eks. for nedbrytning av fettsyrene. Syntetisk fremstilt L-carnitin anvendes derfor i farmasøytiske preparater som virkestoff mot tilsvarende mangelsykdommer. This invention relates to a new method for discontinuous production of L-carnitine by microbiological utilization of crotonbetaine or -y-butyrobetaine in a culture medium containing a microorganism of the genus Rhizobium. L-carnitine is an essential substance for human metabolism, e.g. for breaking down the fatty acids. Synthetically produced L-carnitine is therefore used in pharmaceutical preparations as an active ingredient against corresponding deficiency diseases.

Det er kjent å fremstille L-carnitin fra -Y-butyrobetain. -y-butyrobetain blir i nærvær av natrium-2-oksoglutarat, et reduserende middel, en jernionekilde og luftoksygen som hydroksylgruppedonator bragt i berøring med et hydroksylase-enzym, frigjort fra sporer av Neurospora crassa (US-PS 4 371 618) . Denne fremgangsmåten har den ulempen at den har behov for flere kofaktorer som må tilføres utenfra. Således blir i reaksjonen støkiometriske mengder av 2-oksoglutarat oksydativt dekarboksylert til suksinat. Fe<2+> er nødvendig som 02-aktiva-tor, askorbat for å holde jernionene i redusert tilstand, og katalase for"å ødelegge det skadelige H202 som oppstår i spormengder. It is known to prepare L-carnitine from -Y-butyrobetaine. -y-butyrobetaine is brought into contact with a hydroxylase enzyme, released from spores of Neurospora crassa (US-PS 4 371 618), in the presence of sodium 2-oxoglutarate, a reducing agent, an iron ion source and atmospheric oxygen as a hydroxyl group donor. This method has the disadvantage that it requires several cofactors which must be supplied from outside. Thus, stoichiometric amounts of 2-oxoglutarate are oxidatively decarboxylated to succinate in the reaction. Fe<2+> is needed as an O2 activator, ascorbate to keep the iron ions in a reduced state, and catalase to destroy the harmful H202 that occurs in trace amounts.

Lindstedt et al, [Biochemistry 6, 1262-1270 (1967), "The Formation and Degradation of Carnitin in Pseudomonas"] isolerte en mikroorganisme fra slekten Pseudomonas, som vokser med "Y-butyrobetain som C- og N-kilde. Den første reaksjonen i nedbrytnings-skjemaet var hydroksyl er ingen av "Y-butyrobetain til L-carnitin, hvorved det intermediært oppståtte L-carnitin ble fullsteridig viderekatabolisert til C02, H20 <p>g NH3. Lindstedt et al, [Biochemistry 6, 1262-1270 (1967), "The Formation and Degradation of Carnitine in Pseudomonas"] isolated a microorganism from the genus Pseudomonas, which grows with "Y-butyrobetaine as a C and N source. The first the reaction in the breakdown scheme was hydroxyl is none of "Y-butyrobetaine to L-carnitine, whereby the intermediately formed L-carnitine was fully sterically further catabolized to C02, H20 <p>g NH3.

Også denne hydroksylasen fremstilt fra bakterier vil ha de beskrevne ufordelaktige kravene til ko-faktor, dersom den skulle anvendes for fremstilling av L-carntin [Lindstedt et al, Biochemistry 16, 2181-2188 (1977), "Purification and Pro-perties of -y-Butyrobetaine Hydroxylase from Pseudomonas sp. AK 1"]. This hydroxylase produced from bacteria will also have the described disadvantageous requirements for co-factor, if it were to be used for the production of L-carnitine [Lindstedt et al, Biochemistry 16, 2181-2188 (1977), "Purification and Properties of - y-Butyrobetaine Hydroxylase from Pseudomonas sp. AK 1"].

Ifølge US-PS 4 708 936 er det dessuten kjent å fremstille L-carnitin kontinuerlig på mikrobiologisk måte. Det har imidlertid vist seg som ufordelaktig at stammens stabilitet ved den kontinuerlige fremgangsmåten må være svært høy (mer enn 1000 timer), dessuten er det satt relativt lave grenser for produktkonsentrasjonen i mediet. Produkt/adduktforholdet er likeså relativt lavt. According to US-PS 4 708 936, it is also known to produce L-carnitine continuously in a microbiological way. However, it has been shown to be disadvantageous that the stability of the strain in the continuous method must be very high (more than 1000 hours), moreover, relatively low limits have been set for the product concentration in the medium. The product/adduct ratio is also relatively low.

EP 122794 beskriver en diskontinuerlig mikrobiologisk fremgangsmåte for fremstilling av L-carnitin ut fra krotonbetain i et vandig medium som inneholder vanlige karbon- og nitrogenkilder. Tilstedeværelsen av en ytterligere karbonkilde er ikke beskrevet. Som det går frem av eksempel 2 i denne søknaden, er den dannede L-carnitin-konsentrasjon meget beskjeden og ligger i et område mellom 0,11% (0,llg/a'l) og 0,69% (0,69 g/a'l). Følgelig er denne fremgangsmåten økonomisk sett ubrukelig. EP 122794 describes a discontinuous microbiological process for the production of L-carnitine from crotonbetaine in an aqueous medium containing common carbon and nitrogen sources. The presence of an additional carbon source is not described. As can be seen from Example 2 of this application, the L-carnitine concentration formed is very modest and lies in a range between 0.11% (0.11g/a'l) and 0.69% (0.69 g /eel). Consequently, this method is economically useless.

EP 158194 beskriver en mikrobiologisk fremgangsmåte for fremstilling av L-carnitin ut fra krotonbetain og/eller "Y-butyrobetain. Heller ikke i denne publikasjonen nevnes noen ytterligere karbonkilde, utbyttene av dannet L-carnitin er riktignok relativt gode, men L-carnitinproduksjonen stopper likevel på grunn av dårlig stamstabilitet etter 30 timers fermentering"allerede (se eksempel 4). EP 158194 describes a microbiological process for the production of L-carnitine from crotonbetaine and/or "Y-butyrobetaine. No further carbon source is mentioned in this publication either, the yields of formed L-carnitine are admittedly relatively good, but L-carnitine production still stops due to poor stem stability after 30 hours of fermentation" already (see example 4).

Denne ulempen hos EP 158194 kunne heller ikke overvinnes ved fremgangsmåten som utføres ifølge EP 194944, ved hvilken dyrkningsvæsken føres i et kretsløp for fraskillelse av celler utenfor bioreaktoren, og det tas ut fra bioreaktoren en like stor mengde cellefri løsning som det tilføres substrat til bioreaktoren. Som ved fremgangsmåten som er beskrevet i EP158194, er fermenteringsvarigheten relativt kort, og ligger på ca. 24 trmer (se eksempel 1). En videre ulempe ved denne fremgangsmåten ligger i at produkt/edukt-forhold er relativt lav (se her eksempel 2; forhold L-carnitin til butyrobetain 25g/l: 1,9 g/l = 13:1). Nor could this disadvantage of EP 158194 be overcome by the method carried out according to EP 194944, in which the culture liquid is fed in a circuit for the separation of cells outside the bioreactor, and an equal amount of cell-free solution is taken out of the bioreactor as substrate is added to the bioreactor. As with the method described in EP158194, the fermentation duration is relatively short, and is approx. 24 rods (see example 1). A further disadvantage of this method lies in the fact that the product/educt ratio is relatively low (see example 2 here; ratio L-carnitine to butyrobetaine 25g/l: 1.9 g/l = 13:1).

Disse ulemper ble overvunnet gjennom den foreliggende oppfinnelse ved at man utfører biotransformasjonen (omset-ningen) i nærvær av en ytterligere karbonkilde. Ifølge eksempel 1 i den foreliggende oppfinnelse, fremgår det at fermenteringsvarigheten på grunn av god stamstabilitet, kan økes betydelig (varighet ca. 150 timer) og at følgelig produkt/edukt-forhold kunne forbedres med 48:1 (L-carnitin 6,3%; butyrobetain 0,13%). Herav blir det tydelig at eduktet omsettes nesten fullstendig til produkt, hvorunder L-carnitin-konsentrasjonen til forskjell fra EP 194944 er ca. 10 ganger større. These disadvantages were overcome through the present invention by carrying out the biotransformation (the turnover) in the presence of an additional carbon source. According to example 1 in the present invention, it appears that the fermentation duration due to good stem stability can be increased significantly (duration approx. 150 hours) and that consequently the product/educt ratio could be improved by 48:1 (L-carnitine 6.3% ; butyrobetaine 0.13%). From this it becomes clear that the educt is converted almost completely to product, during which the L-carnitine concentration, in contrast to EP 194944, is approx. 10 times larger.

Det er oppgaven for den foreliggende oppfinnelse å unngå ulempene ved den kjente fremgangsmåten, og å finne en fremgangsmåte som tillater mikrobiologisk fremstilling av L-carnitin fra krotonbetain og/eller •y-butyrobetain enantio-selektivt og med høyt utbytte. It is the task of the present invention to avoid the disadvantages of the known method, and to find a method which allows the microbiological production of L-carnitine from crotonbetaine and/or y-butyrobetaine enantio-selectively and with high yield.

Oppgaven kunne løses med en fremgangsmåte ifølge patent-krav 1, hvori 0,01-10 vekt% -y-butyrobetain eller krotonbetain, samt betain som C- og N-kilde, og dessuten en ytterligere karbonkilde valgt blant glukose eller glycerol tilføres, slik at det opprettholdes et karbon-nitrogen-molforhold på 10.000:1 til større enn 5:1, og krotonbetain og/eller -y-butyrobetain tilføres, slik at konsentrasjonen i kulturmediet ligger mellom 0,005 og 5%, og at L-carnitinet fraskilles etter oppnåelse av den maksimale konsentrasjon av L-carnitin. The task could be solved with a method according to patent claim 1, in which 0.01-10% by weight of -γ-butyrobetaine or crotonbetaine, as well as betaine as C and N source, and also a further carbon source chosen from glucose or glycerol is added, as that a carbon-nitrogen molar ratio of 10,000:1 to greater than 5:1 is maintained, and crotonbetaine and/or -γ-butyrobetaine is added, so that the concentration in the culture medium is between 0.005 and 5%, and that the L-carnitine is separated after achieving the maximum concentration of L-carnitine.

Hensiktsmessig anvendes mikroorganismer av slekten Rhizobium, fortrinnsvis av stammen HK 1331b, deponert den 8.2.1985 i Deutschen Sammlung von Mikroorganismen (DSM), Gesellschaft fiir Biotechnologische Forschung mbH, Griesebachstr. 8, D-3400 Gottingen, under nummeret DSM 3225, stammen HK 13, deponert den 23.1.1984 på samme sted, under DSM-nummeret 2903. Appropriately, microorganisms of the genus Rhizobium, preferably of the strain HK 1331b, deposited on 8.2.1985 in the Deutschen Sammlung von Mikroorganismen (DSM), Gesellschaft fiir Biotechnologische Forschung mbH, Griesebachstr. 8, D-3400 Gottingen, under the number DSM 3225, strain HK 13, deposited on 23.1.1984 at the same place, under the DSM number 2903.

Til forskjell fra de systemene som er kjent i teknikkens stand anvender mikroorganismene ifølge oppfinnelsen H20, og ikke 02 som hydroksylgruppedonator, som kunne fastslås gjennom egne undersøkelser under anvendelse av H2<18>0 og <18>02. In contrast to the systems known in the state of the art, the microorganisms according to the invention use H20, and not 02 as hydroxyl group donor, which could be established through own investigations using H2<18>0 and <18>02.

Selekteringen og karakteriseringen av disse foretrukne mikroorganismene er beskrevet i EP-A 0 158 194. The selection and characterization of these preferred microorganisms is described in EP-A 0 158 194.

Fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen til fremstilling av L-carnitin utføres hensiktsmessig på den måten at man i en første såkalt batch-fase fremstiller biomasse som egner seg til produksjon. Dertil blir på kjent måte tilsvarende EP-A 0 158 194 en av de nevnte stammene kultivert i et sterilisert, fortrinnsvis vitaminholdig mineralmedium [Kulla et al, Arch. Microbiol. 135, 1 (1983)] ved 20 til 40°C, fortrinnsvis ved 30°C, ved en hensiktismessig pH-verdi på 6 til 8, fortrinnsvis 7, i løpet av 5 til 80 timer, fordelaktig i løpet av 15 til 40 timer. Dette mediet inneholder hensiktsmessig 0,01 til 10 vekt-%, fortrinnsvis 0,01 til 5 vekt-%, cholin, glutamat, acetat, dimetylglycin eller betain som vekstsubstrat. Spesielt foretrekkes anvendelse av betain sammen med glutamat eller en ytterligere karbonkilde i mengder hver på 0,02 til 5 vekt-%. The method according to the invention for the production of L-carnitine is suitably carried out in such a way that in a first so-called batch phase biomass suitable for production is produced. In addition, in a known manner corresponding to EP-A 0 158 194, one of the aforementioned strains is cultivated in a sterilized, preferably vitamin-containing mineral medium [Kulla et al, Arch. Microbiol. 135, 1 (1983)] at 20 to 40°C, preferably at 30°C, at an appropriate pH value of 6 to 8, preferably 7, during 5 to 80 hours, advantageously during 15 to 40 hours . This medium conveniently contains 0.01 to 10% by weight, preferably 0.01 to 5% by weight, choline, glutamate, acetate, dimethylglycine or betaine as growth substrate. Particularly preferred is the use of betaine together with glutamate or an additional carbon source in amounts each of 0.02 to 5% by weight.

Dessuten forefinnes i batch-fasen de utgangsforbindelsene som skal omsettes, nemlig -y-butyrobetain, krotonbetain eller blandinger derav i mengder fra 0,01 til 10 vekt-%, fortrinnsvis 0,1 til 5 vekt-%, i forhold til reaksjonsmediet. -y-butyrobetain respektive krotonbetain kan foreligge delvis som hydrokloridsalt eller som fritt indre salt. Also present in the batch phase are the starting compounds to be reacted, namely -γ-butyrobetaine, crotonbetaine or mixtures thereof in amounts from 0.01 to 10% by weight, preferably 0.1 to 5% by weight, relative to the reaction medium. -y-butyrobetaine and crotonbetaine, respectively, can exist partly as a hydrochloride salt or as a free internal salt.

Med biomassen dyrket i batch-fasen kan ytterligere kulturer innpodes. Disse ytterligere kulturene har hensiktismessig den samme sammensetningen som forkulturene. Ved fremgangsmåten ifølge opfinnelsen er den biomassen som er dyrket i batch-fasen, utgangspunkt for fremstillingen av L-carnitin i den såkalte "fed-batch"-fase. With the biomass grown in the batch phase, further cultures can be inoculated. These additional cultures conveniently have the same composition as the pre-cultures. In the method according to the invention, the biomass grown in the batch phase is the starting point for the production of L-carnitine in the so-called "fed-batch" phase.

Kulturmediet i "fed-batch11-fasen ligner i høy grad på kulturmediet i batch-fasen. llFed-batch"-fasen karakteriseres ved at adduktet krotonbetain og/eller -y-butyrobetain, betain samt en ytterligere karbonkilde blir dosert til kultur-løsningen. Som karbonkilde kan anvendes de forbindelsene som er vanlige pa fagområdet og som er kjent fra litteraturen, f.eks. for rhizobiumstammer [The prokarytoes, Chapter 67, The genus Rhizobium, Springer Verlag 1981, p. 825]. Hensikts-messige karbonkilder er f.eks. sukkere som glukose eller fruktose, sukkeralkoholer som glycerol eller organiske syrer som eddiksyre. Fortrinnsvis anvendes glukose eller glycerol. Molforholdet karbon til nitrogen (C til N) velges hensiktsmessig mellom større enn 5 mol C til 1 mol N, og 10.000 mol C til 1 mol N, fortrinnsvis mellom 10 mol C til 1 mol N, og 100 mol C til 1 mol N. Ved svært høye karbon-nitrogenforhold kan det være nødvendig å tilsette en ytterligere nitrogenkilde ved siden av betain. Som ytterligere nitrogenkilde kan dertil anvendes kjente representanter som er vanlige på fagområdet, som f.eks. ammonium. Det kan også tildoseres ytterligere næringsstoffer, som f.eks. en svovel-, en fosforkilde, sporelementer, vitaminer eller komplekse næringsstoffer, som kjøttekstrakter, gjærekstrakter eller mais-svellevann. Adduktene -y-butyrobetain eller krotonbetain tilføres hensiktsmessig slik at det i kulturmediet sikres en konsentrasjon mellom hensiktsmessig 0,005 og 5%, fortrinnsvis mellom 0,02 og 2%. Tilsetningshastigheten for karbon/nitrogenkilden er avhengig av biomassemengden i bioreaktoren. En kjent fremgangsmåte til bestemmelse av biomassekonsentrasjonen er måling av kulturløsningens tørrvekt. Tilsvarende denne tørrvekten og med hensyn til det ønskede karbon/nitrogenforholdet, blir karbonkilden og betain dosert til fermentoren med en hastighet på hensiktsmessig 0,01 til 100, fortrinnsvis på 0,1 til 10 mol karbon/kg tørrvekt i fermentoren. Det arbeides fordelaktig i et temperaturområde på 20 til 40°C ved en pH mellom 6 og 8. The culture medium in the "fed-batch11 phase is very similar to the culture medium in the batch phase. The llFed-batch" phase is characterized by the adduct crotonbetaine and/or -y-butyrobetaine, betaine and an additional carbon source being dosed to the culture solution. The compounds that are common in the field and that are known from the literature can be used as a carbon source, e.g. for rhizobium strains [The prokarytoes, Chapter 67, The genus Rhizobium, Springer Verlag 1981, p. 825]. Appropriate carbon sources are e.g. sugars such as glucose or fructose, sugar alcohols such as glycerol or organic acids such as acetic acid. Preferably glucose or glycerol is used. The molar ratio of carbon to nitrogen (C to N) is suitably chosen between greater than 5 mol C to 1 mol N, and 10,000 mol C to 1 mol N, preferably between 10 mol C to 1 mol N, and 100 mol C to 1 mol N. At very high carbon-nitrogen ratios, it may be necessary to add an additional nitrogen source in addition to betaine. As an additional nitrogen source, known representatives that are common in the field can be used, such as e.g. ammonium. Additional nutrients can also be dosed, such as e.g. a source of sulphur, a source of phosphorus, trace elements, vitamins or complex nutrients, such as meat extracts, yeast extracts or corn-swelling water. The adducts -γ-butyrobetaine or crotonbetaine are suitably added so that a concentration between suitably 0.005 and 5%, preferably between 0.02 and 2%, is ensured in the culture medium. The rate of addition of the carbon/nitrogen source depends on the amount of biomass in the bioreactor. A known method for determining the biomass concentration is measurement of the dry weight of the culture solution. Corresponding to this dry weight and with regard to the desired carbon/nitrogen ratio, the carbon source and betaine are dosed to the fermenter at a rate of suitably 0.01 to 100, preferably of 0.1 to 10 mol carbon/kg dry weight in the fermenter. It is advantageous to work in a temperature range of 20 to 40°C at a pH between 6 and 8.

Etter kultivering i "fed-batch11-fasen som regel etter 25 til 250 timer kan det oppnås en konsentrasjon av L-carnitin i kulturen på mer enn 6%. After cultivation in the "fed-batch11" phase, usually after 25 to 250 hours, a concentration of L-carnitine in the culture of more than 6% can be achieved.

Etter en modifikasjon av fremgangsmåten er det også mulig etter avslutning av fementeringen å ta ut en del av kultur-løsningen og starte opp en ny "fed-batch"-kultivering med den gjenværende delen, fylt opp med nytt kulturmedium. After a modification of the method, it is also possible after the fermentation has ended to take out part of the culture solution and start a new "fed-batch" cultivation with the remaining part, filled up with new culture medium.

Med denne såkalte "repeated fed-batch"-fremgangsmåten lykkes det & forhøye den volumetriske produktiviteten for fermenteringen. With this so-called "repeated fed-batch" method, it succeeds & increases the volumetric productivity of the fermentation.

En avlastning av kulturen kan oppnås ved at man på for-hånd avsalter og renser det -y-butyrobetain og/eller det krotonbetain som skal anvendes ved hjelp av ionebyttere eller ved hjelp av elektrodialyse. Gjenvinningen av L-carnitin fra kulturløsningen er kjent f.eks. fra EP-A 195 944 og kan gjennomføres ved at løsningen etter fraskilling av biomassen ved f.eks. sentrifugering, ultrafiltrering eller mikro-filtrering blir befridd for de ladede partiklene (kationer og anioner) ved hjelp av et laboratorie-elektrodialyseanlegg. Sluttpunktet for avsaltingen kan bestemmes konduktometrisk. Derved vandrer saltene inn i konsentratkretsløpet, mens L-carnitin forblir i diluat-kretsløpet som et indre salt ("betain"). Således kan oppnås utbytter av L-carnitin i diluatet på mer enn 95% etter avsaltingen. A relief from the culture can be achieved by first desalting and purifying the -y-butyrobetaine and/or the crotonbetaine to be used with the help of ion exchangers or with the help of electrodialysis. The recovery of L-carnitine from the culture solution is known, e.g. from EP-A 195 944 and can be carried out by the solution after separation of the biomass by e.g. centrifugation, ultrafiltration or micro-filtration is freed from the charged particles (cations and anions) by means of a laboratory electrodialysis plant. The end point of the desalination can be determined conductometrically. Thereby, the salts migrate into the concentrate circuit, while L-carnitine remains in the dilute circuit as an internal salt ("betaine"). Thus, yields of L-carnitine in the diluate of more than 95% can be achieved after desalting.

Alternativt til elektrodialyse kan L-carnitin også avsaltes ved hjelp av en sterkt sur kationbytter i H+<->form [sammenlign J.P. Vandecasteele, Appl. Environ. Microbiol. 39, 327 (1980)]. Derved lar man løsningen flyte så lenge over en ionebytterkolonne at ionebytteren blir mettet, og L-carnitin bryter igjennom. Anionene går som frie syrer i gjennomløpet. Kationene blir tilbake på ionebytteren. Etter nøytralvasking av ionebytteren med vann kan L-carnitin elueres med vandig ammoniakkløsning. Således kan det oppnås utbytter av L-carnitin i det ammoniakalske eluatet på mer enn 95%. De fortynnede L-carnitinløsningene som fremkommer ved elektro-dialysen og også ved hjelp av ionebyttere, kan oppkonsentreres enten ved inndamping eller også ved omvendt osmose, og deretter avvannes azeotropisk. As an alternative to electrodialysis, L-carnitine can also be desalted using a strongly acidic cation exchanger in H+<-> form [compare J.P. Vandecasteele, Appl. Environment. Microbiol. 39, 327 (1980)]. Thereby, the solution is allowed to flow over an ion exchange column for so long that the ion exchanger becomes saturated, and the L-carnitine breaks through. The anions pass through as free acids. The cations remain on the ion exchanger. After neutral washing of the ion exchanger with water, L-carnitine can be eluted with an aqueous ammonia solution. Thus yields of L-carnitine in the ammoniacal eluate of more than 95% can be achieved. The diluted L-carnitine solutions produced by electrodialysis and also by means of ion exchangers can be concentrated either by evaporation or by reverse osmosis, and then dewatered azeotropically.

Det således fremstilte L-carnitin kan deretter overføres ved påfølgende omkrystallisering hensiktsmessig fra isobutanol/aceton, metanol, etanol, n-butanol, henholdsvis i kombinasjon med løsningsmidler som løser L-carnitin lite, som f.eks. aceton, etylacetat, 'Y-butylacetat, isobutylmetylketon og acetonitril, fortrinnsvis isobutanol, og ytterligere aktivkullbehandling, til rent hvitt L-carnitin. Det kan ifølge denne<*> fremgangsmåten oppnås L-carnitin med en spesifikk dreining på [a]V -3 0,5 til -31,0°, c=l i H20 [litteratur-verdi -30,9°; Strack et al., Hoppe-Seyler's Z.f-physiolog. Chem., 318 (1960), 129] og et innhold på mer enn 99% (HPLC). The L-carnitine thus produced can then be transferred by subsequent recrystallization appropriately from isobutanol/acetone, methanol, ethanol, n-butanol, respectively in combination with solvents that dissolve L-carnitine little, such as e.g. acetone, ethyl acetate, 'Y-butyl acetate, isobutyl methyl ketone and acetonitrile, preferably isobutanol, and further activated carbon treatment, to pure white L-carnitine. According to this<*> procedure, L-carnitine can be obtained with a specific rotation of [a]V -3 0.5 to -31.0°, c=1 in H20 [literature value -30.9°; Strack et al., Hoppe-Seyler's Z.f physiolog. Chem., 318 (1960), 129] and a content of more than 99% (HPLC).

Eksempel 1 Example 1

En 0,3 liter forkultur av stammen HK 1331b ble kultivert i følgende næringsmedium ved 30<9>C, pH 7,0 i løpet av 24 timer: Sammensetning av nærinqsmediet A 0.3 liter pre-culture of the strain HK 1331b was cultivated in the following nutrient medium at 30<9>C, pH 7.0 during 24 hours: Composition of the nutrient medium

Bufferlgsnina Mq- Ca- Fe- løsning Sporelementløsnin<g>Buffer solution Mq- Ca- Fe- solution Trace element solution<g>

Vitaminløsnin<g>Vitamin solution<g>

5 liter næringsmedium med den samme sammensetningen ble innført i fermentoren med forkulturen, og dyrket ved 30°C, pH 7, i løpet av 24 timer. pH ble holdt konstant på 7,0 ved tilsetning av 8%-ig fosforsyre. a) Deretter begynte man med "fed-batch"-driften. To løs-ninger med følgende sammensetning ble kontinuerlig tildosert. 5 liters of nutrient medium with the same composition were introduced into the fermenter with the pre-culture, and grown at 30°C, pH 7, during 24 hours. The pH was kept constant at 7.0 by adding 8% phosphoric acid. a) Then the "fed-batch" operation began. Two solutions with the following composition were continuously dosed.

Sammensetningen av karbon- nitrogentilløpet The composition of the carbon-nitrogen supply

Sammensetningen av - y- butyrobetaintilløpet Løsningen med karbon- og nitrogenkilden ble dosert inn med en hastighet på 4,5 ml/time. Det tilsvarte en spesifikk tilløpshastighet på 4 mol C/kg tørrvekt/time ved begynnelsen av "fed-batch"-fasen. Tørrvekten ble bestemt på vanlig måte (f.eks. Appl." Microbiol. Biotechnol. 28 (1988) 109f) . Konsentrasjonen av -Y-butyrobetain og L-carnitin ble bestemt ved hjelp av HPLC. -y-Butyrobetainløsningen ble dosert slik at -y-butyrobetainkonsentrasjonen i fermentoren lå mellom 0,05 og 0,5 vekt-%. 150 timer etter inokuleringen av fermentoren ble oppnådd en konsentrasjon av L-carnitin på 6,4%, og en konsentrasjon av uomsatt -y-butyrobetain på 0,29%. Dette tilsvarte en 95%-ig omsetning av -y-butyrobetain. b) Tilsvarende a) og med den samme sammensetningen av karbon/nitrogentilløpet og av -y-butyrobetaintilløpet ble "fed-batch"-driften startet. Løsningen med karbon- og nitrogenkilden ble dosert inn med en hastighet på 4,5 ml/time. Det tilsvarte en spesifikk tilløpshastighet på 4 mol C/kg tørr-vekt/time ved begynnelsen av "fed-batch"-fasen. Tørrvekten ble bestemt på vanlig måte (f.eks. Appl. Microbiol. Biotechnol. 28 (1988) 109f) . Konsentrasjonen av -y-butyro-betain og L-carnitin ble bestemt ved hjelp av HPLC. -y-Butyrobetain-løsningen ble innført på den måten at konsentrasjonen av "Y-butyrobetain i fermentoren lå mellom 0,05 og 0,15 vekt-%. 155 timer etter inokuleringen av fermentoren oppnåddes en L-carnitinkonsentrasjon på 6,3% og en konsentrasjon av uomsatt "Y-butyrobetain på 0,13%. Dette tilsvarte en omsetning på 98% av "Y-butyrobutain. The composition of the -γ-butyrobetaine feed The solution with the carbon and nitrogen source was metered in at a rate of 4.5 ml/hour. This corresponded to a specific feed rate of 4 mol C/kg dry weight/hour at the beginning of the "fed-batch" phase. The dry weight was determined in the usual way (e.g. Appl." Microbiol. Biotechnol. 28 (1988) 109f). The concentration of -Y-butyrobetaine and L-carnitine was determined by HPLC. The -y-Butyrobetaine solution was dosed so that The -γ-butyrobetaine concentration in the fermenter was between 0.05 and 0.5% by weight. 150 hours after the inoculation of the fermenter, a concentration of L-carnitine of 6.4% was achieved, and a concentration of unreacted -γ-butyrobetaine of 0 .29%. This corresponded to a 95% conversion of -y-butyrobetaine. b) Corresponding to a) and with the same composition of the carbon/nitrogen feed and of the -y-butyrobetaine feed, the "fed-batch" operation was started. The solution with the carbon and nitrogen source was metered in at a rate of 4.5 ml/hour. This corresponded to a specific inflow rate of 4 mol C/kg dry weight/hour at the beginning of the "fed-batch" phase. The dry weight was determined in the usual manner (e.g. Appl. Microbiol. Biotechnol. 28 (1988) 109f). The concentration of -γ-butyro-betaine and L-carnitine was determined by d using HPLC. The -y-Butyrobetain solution was introduced in such a way that the concentration of "Y-butyrobetain in the fermenter was between 0.05 and 0.15% by weight. 155 hours after the inoculation of the fermenter, an L-carnitine concentration of 6.3% was achieved and a concentration of unreacted Y-butyrobetaine of 0.13%. This corresponded to a turnover of 98% of "Y-butyrobutain.

Isolering av L- carnitin Isolation of L-carnitine

Rent L-carnitin kunne isoleres fra den løsningen som inneholdt 64 g/liter L-carnitin, 2,9 g/liter "Y-butyrobetain og uorganiske salter, tilvarende fremgangsmåten i EP-A 195 944. Etter rensetrinnet ved omkrystallisering kunne oppnås 56,3 g (88%) hvitt L-carnitin, HPLC > 99%, spesifikk dreining av a<2>D<5><->30,9°, (c=l, H20) . Pure L-carnitine could be isolated from the solution containing 64 g/liter L-carnitine, 2.9 g/liter "Y-butyrobetaine and inorganic salts, following the method in EP-A 195 944. After the purification step by recrystallization, 56 could be obtained, 3 g (88%) white L-carnitine, HPLC > 99%, specific rotation of a<2>D<5><->30.9°, (c=1, H20) .

Eksempel 2 Example 2

300 ml av næringsmediet beskrevet i Eksempel 1, som istedenfor "Y-butyrobetain inneholdt 2g/liter krotonbetain, ble innpodet med stammen HK 1331b, og kultivert ved 30°C, pH 7, i løpet av 24 timer. 300 ml of the nutrient medium described in Example 1, which instead of "Y-butyrobetaine contained 2g/liter crotonbetaine, was inoculated with the strain HK 1331b, and cultivated at 30°C, pH 7, during 24 hours.

Med forkulturen ble 5 liter næringsmedium innpodet som i Eksempel 1, og kultivert ved 30"C, ved pH 7,0, i løpet av 24 timer. Ved tilsetning av 8%-ig fosforsyre ble pH holdt konstant ved 7,0. Deretter ble 11 fed-batch"-driften begynt. Som beskrevet i Eksempel 1 ble karbon- og nitrogenkilden kontinuerlig innført, sammen med en løsning med følgende sammensetning: With the pre-culture, 5 liters of nutrient medium were inoculated as in Example 1, and cultivated at 30°C, at pH 7.0, within 24 hours. By adding 8% phosphoric acid, the pH was kept constant at 7.0. 11 fed-batch" operation begun. As described in Example 1, the carbon and nitrogen source was continuously introduced, together with a solution with the following composition:

Sammensetnin<g> av krotonbetaintilløpet Composition<g> of the croton betaine feed

Løsningen med karbon- og nitrogenkilden ble dosert inn med en hastighet på 4,5 ml/time. Det tilsvarte en spesifikk tilløpshastighet på ca. 4 mol C/kg tørrvekt/time i begynnelsen av "fed-batch"-fasen. Prøvene ble behandlet og analysert på den samme måten som beskrevet i Eksempel 1. Tilløpet av krotonbetain ble dosert inn på den måten at konsentrasjonen av krotonbetain i fermentoren lå mellom 0,05 og 0,5 vekt-%. 150 timer etter inokuleringen av fermentoren ble det oppnådd en konsentrasjon av L-carnitin på 6,1% og en konsentrasjon av uomsatt krotonbetain på 0,17%. Dette tilsvarte en omsetning The solution with the carbon and nitrogen source was metered in at a rate of 4.5 ml/hour. This corresponded to a specific inflow rate of approx. 4 mol C/kg dry weight/hour at the beginning of the "fed-batch" phase. The samples were processed and analyzed in the same way as described in Example 1. The supply of croton betaine was dosed in such a way that the concentration of croton betaine in the fermenter was between 0.05 and 0.5% by weight. 150 hours after the inoculation of the fermenter, a concentration of L-carnitine of 6.1% and a concentration of unreacted crotonbetaine of 0.17% were obtained. This corresponded to a turnover

på 95% av krotonbetain. of 95% of croton betaine.

Isolering av L- carnitin Isolation of L-carnitine

Rent L-carntin kunne opparbeides fra den løsningen som inneholdt 61 g/liter L-carnitin, 1,7 g/liter krotonbetain og uorganiske salter, tilsvarende EP-A 195 944. Etter omkrystal-1iseringen 52 g (86%) hvitt L-carnitin kunne oppnås med de samme spesifikasjonene som i Eksempel 1. Pure L-carnitine could be worked up from the solution containing 61 g/litre L-carnitine, 1.7 g/litre crotonbetaine and inorganic salts, corresponding to EP-A 195 944. After the recrystallization 52 g (86%) of white L- carnitine could be obtained with the same specifications as in Example 1.

Claims

.-r 1. Process for discontinuous production of L-carnitine by microbiological utilization of crotonbetaine or

■y-butyrobetaine in a culture medium containing a microorganism of the genus Rhizobium, characterized in that 0.01-10% by weight •y-butyrobetaine or crotonbetaine, as well as betaine as a C and N source, and furthermore a further carbon source selected from glucose or glycerol is added, so that a carbon-hydrogen molar ratio of 10,000:1 to greater than 5:1, and crotonbetaine and/or γ-butyrobetaine are added, so that the concentration in the culture medium is between 0.005 and 5%, and that the L-carnitine is separated after reaching the maximum concentration of L-carnitine.

2. Method according to claim 1, characterized in that the rate of addition of betaine and the carbon source is between 0.01 and 100 mol carbon/kg dry weight in the fermenter/hour.