DD283156A5 - PROCESS FOR THE PRODUCTION OF MYCOTOXIN TENUAZONIC ACID - Google Patents

PROCESS FOR THE PRODUCTION OF MYCOTOXIN TENUAZONIC ACID Download PDF

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DD283156A5
DD283156A5 DD32846389A DD32846389A DD283156A5 DD 283156 A5 DD283156 A5 DD 283156A5 DD 32846389 A DD32846389 A DD 32846389A DD 32846389 A DD32846389 A DD 32846389A DD 283156 A5 DD283156 A5 DD 283156A5
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mycotoxin
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Marina Mueller
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Adl Inst Futterproduktion
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Abstract

Die Erfindung betrifft ein mikrobiologisches Verfahren zur Herstellung des Mykotoxins Tenuazonsaeure mit Hilfe eines geeigneten Alternaria alternata-Stammes. Tenuazonsaeure wird als Standardsubstanz fuer analytische und toxikologische Untersuchungen in Einrichtungen der Human- und Veterinaermedizin, der Landwirtschaft und der Nahrungsgueterindustrie genutzt. Es ist das Ziel des Verfahrens, Tenuazonsaeure in hohen Ausbeuten durch die Kultivierung von Alternaria alternata IFP/A 374 und in hoher Reinheit zu isolieren. Es werden die Kultivierung des Alternaria-Stammes auf halbsynthetischem Fluessigmedium sowie eine effektive chromatografische Reinigung des Mykotoxins beschrieben.{Mykotoxin; Tenuazonsaeure; mikrobiologisches Verfahren; Alternaria alternata IFP/A 374; Kultivierung; Fluessigmedium; chromatografische Reinigung; Ausbeute; Reinheit; Standardsubstanz; Analytik; Toxikologie}The invention relates to a microbiological process for the production of mycotoxin Tenuazonsaeure using a suitable Alternaria alternata strain. Tenuazonic acid is used as a standard substance for analytical and toxicological examinations in institutions of human and veterinary medicine, agriculture and the food industry. It is the aim of the process to isolate tenuazonic acid in high yields by cultivating Alternaria alternata IFP / A 374 and in high purity. It describes the cultivation of the Alternaria strain on semisynthetic fluid medium and the effective chromatographic purification of mycotoxin. {Mycotoxin; tenuazonic acid; microbiological process; Alternaria alternata IFP / A 374; Cultivation; Fluessigmedium; chromatographic purification; Yield; Purity; Standard substance; analytics; Toxicology}

Description

Charakteristik des bekannten Standes der TechnikCharacteristic of the known state of the art

Für das die Erfindung betreffende mikrobiologische Verfahren unter Verwendung des hinterlegten Alternaria-Stammes konnten keine technischen Lösungen ermittelt werden. In der Fachliteratur (SCHADE, J. E., und KING, A. D.: J. Food Prot. 47 [1984], 978-995) werden der Nachweis von Tenuazonsäure mit den üblichen chemischen Extraktions- und Reinigungsverfahren beschrieben sowie eine Isolierung von Tenuazonsäure mittels nicht näher charakterisierter Alternaria-Stämme und ohne Angaben über Ausbeute und Reinheit des isolierten Mykotoxins.For the microbiological process relating to the invention using the deposited Alternaria strain, no technical solutions could be determined. In the literature (SCHADE, JE, and KING, AD: J. Food Prot. 47 [1984], 978-995), the detection of Tenuazonsäure be described with the usual chemical extraction and purification processes and isolation of Tenuazonsäure by unspecified Alternaria strains and without information about yield and purity of the isolated mycotoxin.

Ziel der ErfindungObject of the invention

Die Erfindung hat das Ziel, ein mikrobiologisches Verfahren für die Hersteilung des Mykotoxins Tenuazonsäure mittels Altei naria alternate IFP/A374 in hoher Ausbeute und Reinheit zu schaffen.The invention aims to provide a microbiological process for the production of the mycotoxin tenuazonic acid by means of Altei naria alternate IFP / A374 in high yield and purity.

Darlegung des Wesens der ErfindungExplanation of the essence of the invention

Die Aufgabe der Erfindung besteht darin, mit Hilfe eines hochproduktiven Alternaria alternata-Stammes das Mykotoxin Tenuazonsäure herzustellen.The object of the invention is to produce the mycotoxin tenuazonic acid with the aid of a highly productive Alternaria alternata strain.

Erfindungsgemäß wird die Aufgabe dadurch gelöst, daß der Pilzstamm Alternaria alternate IFP/A374 zur Herstellung des Mykotoxins in einer Hefeextrakt/Saccharose-Bouillon bei 25°C für 28 Tage kultiviert wird.According to the invention the object is achieved in that the fungus strain Alternaria alternate IFP / A374 for the production of mycotoxin in a yeast extract / sucrose broth at 25 ° C for 28 days is cultivated.

Tenuazonsäure wird zu 70-80% ins Kulturmedium abgegeben, deshalb erfolgt die Extraktion sowohl des Flüssigmediums als auch des getrockneten Pilzmyzels mit einem organischen Lösungsmittel wie Methanol oder Chloroform. Die vereinigten Rohextrakte werden säulenchromatografisch an Kieselgel gereinigt.Tenuazonic acid is delivered to the culture medium to 70-80%, therefore, the extraction of both the liquid medium and the dried mushroom mycelium with an organic solvent such as methanol or chloroform. The combined crude extracts are purified by column chromatography on silica gel.

Tenuazonsäure ist ein voiskoses Öl, das als Kupferkomplex auskristallisiert wird (Schmelzpunkt: 170°C-175°C). Die notwendige heinheit als Standardsubstanz von S 99% wird am Hochdruckflüssigkeitschromatografen überprüft. Die Ausbeute an Tenuazonsäure mit einer Reinheit von ä99% beträgt etwa 15-30mg/100ml Kulturansatz.Tenuazonic acid is a viscous oil that crystallizes out as a copper complex (melting point: 170 ° C-175 ° C). The necessary purity as a standard substance of S 99% is checked at the high pressure liquid chromatograph. The yield of tenuazonic acid with a purity of 99% is about 15-30 mg / 100 ml culture batch.

Die nach dem beschrieber en Verfahren gewonnene Tenuazonsäure der FormelThe tenuazonic acid of the formula obtained by the process of the invention

ist durch folgende physikalisch-chemisch Daten charakterisiert:is characterized by the following physico-chemical data:

a) Molekulargewicht: 197a) Molecular weight: 197

b) Aussehen: gelbbraunes viskoses Ölb) Appearance: yellow-brown viscous oil

c) Löslichkeit: gut löslich in Aceton, Benzene, Chloroform, Ethanolc) Solubility: readily soluble in acetone, benzene, chloroform, ethanol

MeOH, acidisch (löge)MeOH, acidic (Löge)

d) UV-VIS-Spektrum: Ämax 218nm(3,70)d) UV-VIS spectrum: λmax 218 nm (3.70)

277,5nm(4,10) MeOH, neutral, basicXmax 240nm,280nm277.5nm (4.10) MeOH, neutral, basicXmax 240nm, 280nm

θ) dünnschichtchromatografische Daten Adsorbent: Kieselgelθ) Thin-layer chromatographic data Adsorbent: Silica gel

Detektion - nach Besprühen mit 1 %iger ethanolischei FeClj-Lösung zeigt sich intensive organgerote FärbungDetection - after spraying with 1% ethanolischei FeClj solution shows intensive orange red staining

- Fluoreszenzlöschung unter kurzwelligem UV-Licht Lösungsmittel: Benzene/Methanol/Eisessig90 + 5+5- fluorescence quenching under short-wave UV light solvent: benzene / methanol / glacial acetic acid90 + 5 + 5

RrWert: 0,48-0,51Rr value: 0.48-0.51

Der zur Produktion von Tenuazonsäure verwendete Alternaria alternata-Stamm IFP/A374 wurde im Zentralinstitut für Mikrobiologie und experimentelle Therapie Jena (ZIMET) unter der Bezeichnung IMET43905 hinterlegt.The Alternaria alternata strain IFP / A374 used for the production of tenuazonic acid was deposited at the Central Institute for Microbiology and Experimental Therapy Jena (ZIMET) under the name IMET43905.

Ausfuhrungsbeispielexemplary Die Erfindung soll nachstehend an einem Ausführungsbeispiel näher erläutert werden.The invention will be explained in more detail below using an exemplary embodiment. Je 100ml einer 2%igen Yeastextraktlösung mit Zusatz von 4% Saccharose werden in 500-ml-Standkolben bei 1210C sterilisiert.100ml of a 2% Yeastextraktlösung with addition of 4% sucrose are sterilized in 500 ml flat bottom flask at 121 0 C. Jeder Kolben wird mit einer Sporensuspension einer 7 Tage alten Einsporkultur von Aiternaria alternate IFP/A374, die aufEach flask is paired with a spore suspension of a 7 day old Einsporkultur of Aiternaria alternate IFP / A374 Kartoffel-Dextrose-Agar angezogen wurde, beimpft. Die Kolben werden als Standkultur 28 Tage bei 250C inkubiert.Potato dextrose agar was inoculated. The flasks are incubated as standing culture for 28 days at 25 0 C. Anschließend wird das Pilzmyzel durch Filtrieren vom Flüssigmedium getrennt und bei 50°C getrocknet.Subsequently, the fungal mycelium is separated by filtration from the liquid medium and dried at 50 ° C. Das Kulturmedium wird mit 2 NH3PO4 auf einen pH-Wert von 2 eingestellt und anschließend mit dem 1 'Machen VolumenThe culture medium is adjusted with 2 NH 3 PO 4 to a pH of 2 and then with the 1 'Make volume Chloroform extrahiert. Die organische Phase wird dann mit dem gleichen Volumen einer 5%igen wäßrigen NaHCO3-LösungExtracted chloroform. The organic phase is then filled with the same volume of 5% aqueous NaHCO 3 solution

versetzt und extrahiert. Die wäßrige Phase wird nochmals auf pH 2 eingestellt und anschließend mit Hexan extrahiert. Dieseorganische Phase wird über Na]SO4 getrocknet und bis zur Trockne eingeengt.staggered and extracted. The aqueous phase is adjusted again to pH 2 and then extracted with hexane. This organic phase is dried over Na] SO 4 and concentrated to dryness.

Das getrocknete und gemahlene Pilzmyzel wird mit Chloroform/Methanol/Ameisensäura(94 + 3 + 3)4 Stunden extrahiert undThe dried and ground mushroom mycelium is extracted with chloroform / methanol / formic acid (94 + 3 + 3) for 4 hours and

anschließend filtriert. Das Filtrat wird mit derrvgleichen Volumen 5%iger NaHCOaLösung extrahiert. Die wäßrige Phase wird aufpH2 eingestellt und mit Hexan extrahiert. Die gewonnene organische Phase wird mit dem Rohextrakt der Extraktion desthen filtered. The filtrate is extracted with the same volume of 5% NaHCOa solution. The aqueous phase is adjusted to pH2 and extracted with hexane. The recovered organic phase is mixed with the crude extract of the extraction of

Kulturmediums vereinigt.Culture medium united. Für die anschließende säulenchromatografische Reinigung wird das verwendete Kieselgel 60 (0,063-O,2mm) mit OxalsäureFor subsequent column chromatographic purification, the silica gel used is 60 (0.063-0.2mm) with oxalic acid

präpariert (5g Oxalsäure/95g Kiesolgtl). 200-800mg Tenuazonsäure-Rohextrakt werden an 20g aktiviertem Kieselgel in einer300mm χ 23 mm Säule gereinigt. Zuerst wird die Säule mit 75ml Toluol gewaschen, anschließend wird als Elutionsmittel einprepared (5 g oxalic acid / 95 g Kiesolgtl). 200-800mg Tenuazonic acid crude extract is purified on 20g activated silica gel in a 300mm χ 23mm column. First, the column is washed with 75 ml of toluene, followed by elution

Stufengradient von Methylenchlorid/Aceton von 100 + 0 nach 90 + lOmitje 100ml eingesetzt. Eswerden Fraktionen zuje15mlStep gradient of methylene chloride / acetone from 100 + 0 to 90 + lOmitje 100ml used. There will be fractions zuje15ml

gesammelt und dünnschichtchromatografisch auf Tenuazonsäure untersucht. Alle Tenuazonsäure enthaltenen Fraktionenwerden vereinigt und zur Trockne eingeengt. Zur stabilen Lagerung wirdTenuazonsäure als Kupferkomplexsalz auskristallisiert.collected and examined by thin-layer chromatography on Tenuazonsäure. All fractions containing tenuaconic acid are combined and concentrated to dryness. For stable storage, toluene acid is crystallized out as a copper complex salt.

Dazu wird Tenuazonsäure in Methanol aufgenommen (etwa 100 mg/ml MeOH) und mit einer 2%igen wäßrigen Kupfer(ll)-acetat-For this purpose, tenuazonic acid is taken up in methanol (about 100 mg / ml MeOH) and treated with a 2% aqueous copper (II) acetate Lösung (0,5mol equivalent) versetzt. Es wird zweimal aus Methanol/Wasser (1 + 1) umkristallisiert. Kupfertenuazonat liegt dannSolution (0.5 mol equivalent). It is recrystallized twice from methanol / water (1 + 1). Copper uazonat lies then

in Form hellgrüner kurzer Nadeln (Schmelzpunkt: 1720C) vor. Der Reinheitsgrad wird hochdruckflüssigkeitschromatografischbei einer Wellenlänge von 280 nm ermittelt.in the form of light green short needles (melting point: 172 0 C) before. The degree of purity is determined by high pressure liquid chromatography at a wavelength of 280 nm.

Claims (1)

Verfahren zur Herstellung des Mykoloxins Tenuazonsäure, dadurch gekennzeichnet, daß der Mikroorganismus Alternaria alternate IFP/A374 in flüssigem Nährmedium, bestehend aus Hefeextrakt und Saccharose, als Standkultur bei 250C während eines Zeitraumes von 28 Tagen kultiviert wird und das dabei gebildete Mykotoxin Tenuazonsäure sowohl aus dem Myzel als auch aus dem Kulturfiltrat extrahiert, nachfolgend mit den üblichen Methoden konzentriert, säulenchormatografisch gereinigt und in sein stabiles Kupfersalz überführt wird.A process for the preparation of the Mykoloxins tenuazonic acid, characterized in that the microorganism Alternaria alternate IFP / A374 in liquid culture medium consisting of yeast extract and sucrose, is cultured as standing culture at 25 0 C over a period of 28 days and the mycotoxin thus formed tenuazonic acid both extracted from the mycelium as well as from the culture filtrate, subsequently concentrated by the usual methods, purified by column chromatography and converted into its stable copper salt. Anwendungsgebiet der ErfindungField of application of the invention Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung ds Mykotoxins Tenuazonsäure, das als Standardsubstanz für analytische Untersuchungen mykotoxitiverdächtiger Nahrungs- und Futtermittel und für toxikologische Untersuchungen benötigt wird.The invention relates to a method for the production of the mycotoxin tenuazonic acid, which is needed as a standard substance for analytical investigations of mykotoxitiverdächtiger food and feed and for toxicological studies.
DD32846389A 1989-05-10 1989-05-10 PROCESS FOR THE PRODUCTION OF MYCOTOXIN TENUAZONIC ACID DD283156A5 (en)

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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2006079275A1 (en) * 2005-01-28 2006-08-03 Nanjing Agricultural University Biological control of weeds using the metabolites of alternaria alternata

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* Cited by examiner, † Cited by third party
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