DD276530A1 - Immunenzymometrisches verfahren zur quantitativen bestimmung von humanem wachstumshormon (hgh) - Google Patents

Abstract

Die Erfindung betrifft ein immunenzymometrisches Verfahren zur quantitativen Bestimmung von humanem Growth-(Wachstums)-Hormon (hGH) fuer die medizinische Diagnostik sowie fuer das biotechnologisch hergestellte rekombinante hGH z. B. bei der Prozesskontrolle. Das erfindungsgemaesse Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, dass zwei monoklonale Antikoerper gegen hGH verwendet werden, die durch ihre Reaktion mit raeumlich distinkten antigenen Determinanten charakterisiert sind. Die erste mAK gegen hGH wird an die feste Phase adsorbiert und die hGH-haltige Loesung zugefuegt. Das gebundene hGH wird nach Reaktion mit dem zweiten mAK, der enzymmarkiert ist, ueber die Enzymaktivitaet quantitativ bestimmt. Das erfindungsgemaesse Testsystem erlaubt einen quantitativen hGH-Nachweis im Bereich von 0,01 ng/ml bis 50 ng/ml. Die Gesamtdauer der Testdurchfuehrung betraegt weniger als 5 Stunden.

Description

Darlegung des Wesens der Erfindung Erfindungsgemäß wi'd zur quantitativen Bestimmung von hGH ein immunenzymometrischer Zweiseitenbindungstest

angewandt, wobei ein Paar von 2 monokonalen Antikörpern, die gegen räumlich distinkte Epitope des hGH-Moleküls gerichtetsind, eingesetzt wird:

Der erste monoklonal Antikörper wird an die Oberfläche der Näpfe von Reaktionsgefäßen aus Plasto oder einem anderen Material, vorrangig an Mikrotestplatten aus Polystyren, für den Festphasen-Immunoassay adsorbiert. In die antikörperbeschichteten Reaktionsgefäße werden die zu messenden hGH-Lösungen gegeben und inkubiert. Der zweite monoklonale Antikörper, der mit Peroxidase markiert ist, wird entweder gemeinsam mit den hGH-haltigen Lösungen

oder nach dem Entfernen dieser Lösungen getrennt inkubiert. Die Nachweisreaktion erfolgt in üblicherweise photometrisch mito-Phenyldiamin und H2O2 bzw. luminometrische mit Luminol/H₂O₂ und Verstärkerreagenz (Jodphenol, Phenylphenol).

Das Wesen der Erfindung besteht darin, daß für den Test jeweils ein Paar von monoklonalen Antikörpern zum Einsatz kommen,

die auf Grund ihrer Eigenschaften, wie Erkennung unterschiedlicher Epitope auf hGH-Molekül, Sorptionsfähigkeit an

Plastoberflächen, Affinitätskonstanten, Markierbarkeit, eine sehr empfindliche, präzise und schnelle Bestimmung des hGH

ermöglichen. Als Antikörperpaare werden Antikörper bzw. deren Fragmente oder Derivate der Zellinien

ZIM0199(A64-D/E3)und ZIM 0200 (A64E/C8) bzw.

ZIM 0289 (Il A9) und ZIM020(A64-E/B12)

verwendet, wobei der jeweils zuerst genannte zur Sorption an die feste Phase, der zweitgenannte zur Markierung verwendetwird. Als Antikörper-Enzym Konjugat werden entweder die markierten Antikörper oder deren Spaltprodukte z. B. Fab-Fragmenteeingesetzt. Zur Markierung kann jedes der bekannten Markerenzyme verwendet werden, bevorzugt jedoch Peroxydase, weildann die Nachweisreaktion bei Einsatz entsprechender Substrate, z.B. o-Phenylendiamin, p-Hydroxyphenylpropionsäure oder

Luminol, photometrisch oder fluorimetrisch oder luminometrisch erfolgen kann. Erfindungsgemäß kommen vorzugsweise stabilisierte, vorbeschichtete Mikrotestplatten zum Einsatz, wobei der sorbierte Antikörper durch Zusatz von BSA, Saccharose und woitorer Substanzen (Bakterizide, Proteasehemmer) zum letzten Waschpuffer

stabilisiert und somit eine Funktionstüchtigkeit der vorbeschichteten Platte bis zu 2 Jahren gewährleistet wird. Zur Erhöhung der

Proteinbindung der Plastgefäße können die Oberflächen mit Haftvermittlern, z. B. siliciumorganische Verbindungen

vorbehandelt werden (DD-WP/288647, DD-WP/305376). Zur Abdeckung unspezifischer Adsorptionsstel'en auf derantikörperbeschichteten Oberfläche der Reaktionsgefäße lassen sich NH₂-gruppenhaltige Pufferlösungen und/oderproteinhaltigen Lösungen wie z. B. Gelafusal" verwenden. Die zwischen jedem Inkubationsschritt notwendige Waschung der

Reaktionsgefäße kann mit Leitungswasser erfolgen. Erfindungsgemäß kann je nach Einsatzzweck und erforderliche Empfindlichkeit wahlweise ein Kurztest mit gemeinsamer Inkubation von hGH-haltigen Lösungen und Antikörpor-Enzym-Konjugat oder der beschriebene Zweiseitenbindungstest mit

photometrischer Nachweisreaktion (Meßbereich: 0,1 ng/ml-12,5ng/ml; Abb. 1) oder der empfindlichkeitsgesteigerte Test mitchemoluminometrischer Nachweisreaktion (Meßbereich: 0,01 ng/mM0ng/ml) bei gleicher Testdurchfüiimng angewendetwerden.

Die vorteilhaften Verfahrensmerkmale des beschriebenen immunßnzymometrischen Testes wie hohe Empfindlichkeit, kurze Testzeiton und Spezifität werden durch die erfindungsgemäß eingesetzten und ausgewählten monoklonalen Antikörperpaare

und die Nutzung der Zwcissitenbindungstcchnik, der Enzymmarkierung der monoklonalen Antikörper und der empfindlichen

Nachweisreaktionen erreicht. Dadurch ist .ein Einsatz für verschiedene Einsatzgebiete von der Produktionskontrolle bei der gentechnischen Herstellung von

hGH bis zu einem sehr empfindlichen diagnostischen Testverfahren für klinische Laboratorien möglich, was zusätzlich durch den

Wegfall von radioaktiven Tracern soinen Einsatz in beliebigen Laboratorien ohne spezielle Ausrüstung und Schutzvorrichtungen

und ohne geschultes Peiisonal ermöglicht.

Das erfindungsgemäße Testsystem erlaubt einen quanitativen hGH-Nachweis im Bereich von 0,5pmol/l-5nmol/l. Die Gesamtdauer der Testdurchführung beträgt weniger als 5 Stunden. Ausführungsbelsplele

1. Immunenzymometrische Verfahren zur Bestimmung von hGH in Mikrotestplatton mit photometrischer Auswertung

Die Mikrotestplatten dienen als Reaktionsgefäße und Meßküvette. In die einzelnen Vertiefungen werden ΙΟΟμΙ des ersten

ιΊΊύιΊο'κΰΓιαΙοΓ· Antikörpers (10 -ΕΟμς/ml in PBS-Puffer [0,01 M Phosphat, 0.15M NaCI, pH 7,4)) einpipettiert und über Nacht bei4^CC in feuchter Kammer en der OborPäche adsorbiert. Nach dom Ausgicßon werden die Vertiefungen der Mikrotestplatten mit200μΙ TBS-Puffer (0.05M TRIS, 0,2M NaCI, pH 7,4), der 10% Kälberseiur.i oder Gelafusal" und 0,1 %Tween 20 enthält, zwecks

Blockierung der noch freion proteinbindenden Stellen gefüllt und für 1 Std. bei Zimmertemperatur inkubiert und wieder

ausgegossen.

Sollen die beschic,itcten Mikrotcstplatto:. !änget. Zeit aufbewahrt werden, gibt man nochmals 200μΙ eines TBS-Puffers, der 3% Saccharose, 0,2% Rinderseri/malbumin und 0,0^r % Thiomersal enthält, zu. Nach 15min werden die MiWotestplatton durch

kräftiges Ausschlagen auf Filterpapier geleert und nach Trocknung in einer Folie eingeschweißt.

In die Vertiefungen der beschichteten Platten werden 100 ul einer Standardlösung bzw. der zu untersuchenden Probe (ggf. beide

mit TBS-Puffei mit 10% Kälberserum verdünnt) eingefüllt und für 2 Std. unter Schütteln in einer feuchten Kammer inkubiert. Die

Lösungen werden mit einer Wasserstrahlpumpe abgesaugt und die Mikrotestplatte dreimal mit Leitungswasser gewaschen.

Jetzt werden 10OμΙ des mit Peroxydase markierten zweiten monoklonalen Antikörpers (typische Verdünnung des Konjugates: etwa 1:8000) eingefüllt und für 1 Std. bei Zimmertemperatur und unter Schütteln in einer feuchten Kammer inkubiert. Nach mindestens 5mallgem Waschen mit Leitungswasser werden in die einzelnen Küvetten jeweils 200 μΙ einer Substratlösung, z. B.:

o-Fhenyldiamin	0,4 mg/ml
HjO2	0,015%ig
Phosphat-Zitratpuffer pH	5,0

einpipettisrt und nach etwa 15 Min. mit 50 μΙ 2,5 N H₂SO₄₂ die Farbreaktion gestoppt. Die Farbintensität in den einzelnen Küvetten wird schließlich photometrisch bei einer Wellenlänge vün 492 nm gemessen. Aus der gemessenen Extinktion kann anhand der Standardkurve der hGH-Gehalt einer Lösung ermittelt werden (Abb.1).

Sollten keine geeigneten Mikrotestplatten mit hoh&r Proteinsorption zur Verfü(j_,ng stehen, werden diese in folgender Weise vorbehandelt: Je Vertiefung werden 200 μΙ einer Lösung von 2,5% Aminopropyltriethoxysilan und 2,5% Glycidoxypropyltriethoxysilan in Ethanol gegeben und nach 30 bis 60 Minuten wieder ausgegossen. Die trockenen Mikrotestplatten können dann direkt vcwendet werden.

2. Chemiluminometrische Bestimmung von hGH (in Röhrchen)

Die Reaktion wird praktisch nach dem gleichen Schema wie im Ausführungsbeispiel 1 in Polystyren-Röhrchen durchgeführt. Die Messung kann an einem beliebigen Luminometer z. B. Autolumat der Fa. Berthold (BRD) vorgenommen werden.

Abweichend wird zur Beschichtung der Röhrchen eine Antikörperkonzentration von 10μς/ιηΙ eingesetzt und 200μΙ dosiert. Die Standard-Eichkurve überdeckt den Bereich von 0,5 bis lOOpmol/l (je 200μΙ) und die Konjugatverdünnung wird etwa 4fach höher gewählt (etwa 1:30000) und ebenfalls 200μΙ eingesetzt.

Nach der Inkubation mit dem Antikörper-Enzym-Konjugat wird 5mal mit Wasser gewaschen und anschließend 200ul Substratlösung (0,5mmol/l Na-Luminol, 1 mmol/l Jodphenol in Natriumborat-Puffer pH 3,6 nach Sörensen und Clark) in die Röhrchen dosiert. Der Reaktionsstart erfolgt mit 10μΙ 0,3%igem H₂O₂ entweder per Hand oder automatisch im Gerät. Im allgemeinen erfolgt bei luminometrischen Messungen keine Wellenlängenselektion, es wird die Phctonenzahl oder der Lichtstrom gemessen. Unter den angegebenen Bedingungen ist die Lichtemission über mindestens 30 Minuten nahezu konstant. Die Auswertung erfolgt übrr eine Eichkurve einer Standard-Verdünnungsreihe, die parallel im gleichen Tejtansatz ermittelt wurde.

Claims (3)

1. Immunenzynnometrisches Verfahren zur quantitativen Bestimmung von humanem Wachstumshormon (hGH) nach dem Zweiseitenbindungsprinzip, gekennzeichnet dadurch, daß die von den folgenden Klonen produzierten monoklonalen anti-hGH-Antikörper

Λ 64-D/E 3 (ZIM-0199) und A 64-E/C 8 (ZIM-0200)
oder

Il A 9 (ZIM-0289) und A 64-E/B12 (ZIM-0202)

paarweise eingesetzt werden, wobei man den von dem jeweils erstgenannten Klon produzierten monoklonalen Antikörper an der festen Phase absorbiert, mit der hGH-haltigen Probe inkubiert, den vom zweiten Klon des jeweiligen Paares produzierten monoklonalen Antikörper, der enzymmarkiert wurde (Antikörper-Enzym-Konjugat), hinzugefügt und die Enzymaktivität photometrisch, fluorometrisch oder luminometrisch in üblicherweise mißt.

2. Verfahren nach Anspruch 1, gekennzeichnet dadurch, daß die Inkubation mit der hGH-haltigers Probe und das Hinzufügen des Antikörper-Enzym-Konjugates nacheinander oder gleichzeitig durchgeführt werden.

3. Verfahren nach Anspruch 1, gekennzeichnet dadurch, daß die monoklonalen Antikörper als Fab-Fragmente oder als Derivate eingesetzt werden.

Hierzu 1 Seite Zeichnung

Anwendungsgebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Durchführung von quantitativen Bestimmungen von humanem Wachstumshormon in Lösungen, daß für die medizinische Diagnostik und für die Prozeßkontrolle bei der biotechnologischen Herstellung von rekombinantem hGH benötigt wird.

Charakteristik des bekannten Standes der Technik

hGH ist ein Polypeptidhormon, das in der Hypophyse gebildet wird und das Körperwachstum reguliert. Regulationsstörungen in der hGH-Bildung bzw. -Ausschüttung führen zu Minderwuchs. Die Therapie des Minderwuchses erfolgt durch Substitution des hGH, wobei zunehmend gentechnisch hergestellte Produkte eingesetzt werden. Für die Diagnostik und eine effektive Therapie sowie für die Produktionskontrolle boi der gentechnischen Herstellung von Rekombinant hGH ist ein empfindliches, quantitatives und schnelles Bestimmungsverfahren für hGH erforderlich. Bisherige Testsysteme zum hGH-Nachweis beruhen in erster Linie auf konventionellen Radioimmunoassays (RIA) mit polyklonalen Antiseren (z. B. hGH-RIA Sebnitz IDDR]; hGH-RIA Kit der Fa.Cambrigde Medical Diagnostics IUSA)). Polygonale Antikörper habon den Nachteil, daß ihre Herstellung zu Antikörpergemischen unterschiedlicher Quantität und Qualität führt. Unter diesem Gesichtspunkt wurden von verschiedenen Herstellern die polyklonalen Antikörper im RIA durch monoklonal Antikörper ersetzt (z. B. F. Gomez, G. Pirens, C. Schaus, J. Closset, G. Hennen J. Immunoassay 5,145-157 11984); R. Aston, L. Cooper, A. Holder, l.lvanji, M.Preece Molec. Immunol. 22,271-275 [1985]). Besonders vorteilhaft sind dabei immunometrische Tests nach dem Zweiseitenbindungsprinzip, die gegenüber kompetitiven Bindungstests eine erhöhto Empfindlichkeit und Präzision garantieren (z.B. Sucrosep™ immunoradiometric assay hGH der Fa.Boots-Celltech Diagnostics Ltd. (Englandl; hGH Tandem-R Kit der Fa. Hybritoch Europa S.A. IBolgien)). Trotz dieser verbesserten Qualitätsparametor haftet den immunoradiometrischen Tests dir Nachteil des Umgangs mit Radioaktivität und der relativ kurzen Verwendungszeit der Testkits an. Diese Nachteile können durch Verwendung nichtradioaktiver Marker (Enzyme/Fluorogene) umgangen worden. Solche Tests wurden von verschiedenen Aukiron beschrieben (S.Hashida, E.lshikawa Anal. Leiters 18,1143-1155 (1985); T.Torrosani, E. Schuster, B. Dinesen, R. HMg), jedoch kommen dabei nur polygonale Antikörper zum Einsatz. Von dor Fa. Nordisk Gentofte A/S (Produkt) wird kommerziell ein immunoenzyniometi ischer Testkit zur Bestimmung von hGH auf Basis eines polyklonalen AS vom Meerschweinchen angeboten. Ein entsprechender Test mit luminometrischer Messung wurde von WEEKS beschrieben (!.Weeks CCA 159,139-145 (1966)).

oder es gehen nichtstandardisierbare Testbestandteile wie polyklonale Antikörper ein.

Ziel der Erfindung

Die Erfindung hat das Ziel, ein Testverfahren zur Verfügung zu stellen, mit dem hGH quantitativ, schnei! und präzise mit hchor Empfindlichkeit und ohne den Einsatz von Radioaktivität bestimmbar ist.