DD275461A1 - Verfahren zur trennung von phosphatidgemischen in phosphatidklassenpraeparate - Google Patents

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Trennung von Phosphatidgemischen in Phosphatidklassenpraeparate. Erfindungsgemaess werden duennschichtchromatographisch reine Phosphatidklassenpraeparate (Phosphatidylcholin, Phosphatidylethanolamin, Phosphatidylinositol) durch Ultrafiltration an einer Membran gewonnen, wobei die Dielektrizitaetskonstante des verwendeten Loesungsmittelsystems waehrend der Trennung stufenweise unter Kontrolle bis auf einen Wert von 7,0 erhoeht wird. Die Erfindung ist in der pharmazeutischen sowie der Lebensmittelindustrie und in der Medizin anwendbar.

Description

verwendeten Lösungsmittelsystem die Dielektrizitätskonstante des verwendeten Lösungsmittelsystems auf einen Wert von 1,8 bis 4,0, bevorzugt 3,1 gebracht wird. Im Ergebnis der nachfolgenden Ultrafiltration befindet sich das Ph'osphatidylcholin im Permeat, während Phosphatidylethanolamin und -inositol im Retentat bleiben. Aus dem Permeat kann das Phosphatidylcholin in dünnschichtchromatograph'ischer Reinheit gewonnen werden. Erhöht man die Dielektrozitätskonstante durch weitere Zugabe des polaren Lösungsmittels oder Lösungsmittelgemisches auf einen Wert von 4,0 bis 7,0, bevorzugt 5,5, befindet sich im Ergebnis der nachfolgenden Ultrafiltration das Phosphatidylethanolamin im Permeat, während das Phosphatidylinositol im Retentat verbleibt. Beide Phosphatide können aus Permeat beziehungsweise Retentat in dünnschichtchromatographischer Reinheit gewonnen werden. Soll nur Phosphatidylinositol gewonnen werden, bringt man die Dielektrizitätskonstante des Lösungsmittelsystems gleich auf einen Wert von 4,0 bis 7,0 und führt dann die Ultrafiltration durch, wobei Phosphatidylinositol im Retentat verbleibt.

Während der Trennung wird die Einhaltung der Dielektrizitätskonstante kontrolliert, zum Beispiel mit einem DK-Meter. Vorteilhafterweise wird nach jeder Ultrafiltration die Membran mit dem jeweils verwendeten Lösungsmittelsystem mehrmals gespült. Für die selektive Trennung der Phosphatidgemische kommen Membranen mit einem Molekulargewichts-"cut off" von 1000 bis 100000, vorzugsweise von 5000 bis 10000, zum Einsatz. Die Trennung durch Ultrafiltration erfolgt bei absoluten Drücken von 0,1 bis 1 MPa, bevorzugt bei 0,2 bis 0,5MPa.

Überraschenderweise gelingt es, mit dem erfindungsgemäßen Verfahren dünnschichtchromatographisch reine Phosphatidklassenpräparate zugänglich zu machen. Es war aufgrund des sehr ähnlichen chemischen Aufbaus der einzelnen Phosphatidklassen nicht zu erwarten, daß eine einfache Änderung der Polarität des angewendeten Lösungsmittelsystems, gemessen über die Dielektrizitätskonstante, einen derart klaren Trenneffekt hervorruft. Das erfindungsgemäße Verfahren zeichnet sich gegenüber den säulenchromatographischen Trennverfahren, die ebenfalls zu dünnschichtchromatographisch reinen Phosphatidklassenpräparaten führen, durch einen wesentlich geringeren Material- und Zeitaufwand aus.

Ausführungsbeispiele Beispiel 1 (Phosphatidanreicherung)

2 bis 3g eines handelsüblichen Sojalecithins mit einem Phosphatidgehalt von 68,1 % werden in 25ml des entsprechenden Gemisches (Hexan/Aceton-Verhältnis siehe Tabelle 1) aus Hexan und Aceton gelöst und T Stunde bei 25*C gerührt. Anschließend werden die Phosphatide durch langsame Zugabe von Aceton gefällt. Zur Abtrennung des Niederschlages wird bei 2000U/min zentrifugiert. Der Phosphatidgehalt der Proben wurden über die Phosphatidbestimmung nach HURST in modifizierter Form (FRANZKE, Cl., E. HOLLSTEIN u. P. BRANDT, Lebensmittel-Ind. 19,1972, Seite 347) ermittelt und unter Anwendung des Faktors 25,44 auf den Lecithingehalt umgerechnet. Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 dargestellt.

Tabelle 1: Phosphatidanreicherung durch Behandlung mit Hexan-Aceton-Gemischen unterschiedlicher Zusammensetzung

Versuchs-Nr.	Hexan/Aceton-Volumenverhältnis	Phosphatidgehalt <%>
1	90/10	76
2	90/10	75
3	70/30	84
4	70/30	78
5	50/50	94
6	50/50	95"
7	50/50	95
8	40/60	75«
9	Säulenchromatographie nach	84
10	ROUSER31, modifiziert	94

1 nach zweimaliger Waschung.

2 Lecithin beginnt bereits im Lösungsmittelsystem 2u verkleben.

3 ROUSER, G-.G.KRITCHEWSKY, A.YAMAMOTO, G.SIMON, CGATTLa-S-BAUMANN, Methods in enzymology 14,1969, Seite 272-318.

Versuch-Nr.9 folgende Elutionsmittel werden nacheinander verwendet: je 100 ml Chloroform, Chloroform/Methanol (90/10), Chloroform/Methanol (50/50), Chloroform/Methanol (10/90); die Chloroformphase wird verworfen,

Versuch-Nr. 10 folgende Elutionsmittel werden nacheinander verwendet: 100ml Chloroform, 150ml Aceton, je 100ml

Chloroform/Methanol (90/10), Chloroform/Methanol (50/50), Chloroform/Methanol (10/90); Chloroform- und Acetonphase werden verworfen.

Beispiel 2

Bei dem eingesetzten Phosphatidgemisch handelt es sich um ein nach Beispiel 1, Versuchs-Nr.7, angereichertes handelsübliches Sojaphosphatidpräparat, aus dem eine 1%ige Phosphatid-n-Hexan-Lösung hergestellt wird. Das Phosphatidgemisch hatte folgende Zusammensetzung: 40,9% Phosphatidylcholin, 26,4% Phosphatidylethanolamin, 27,7% Phosphatidylinositol und 5% Neutralfettbestandteile. Zur Anwendung kommt eine Celluloseacetatmembran UF120 des VEB Zellstoff· und Zellwollewerke Wittenberge in einer AMICON-Rührzelle Typ 402. Die Ergebnisse der selektiven Trennung eines Phosphatidgemisches an einer semipermeablen Membran unter Erhöhung der Dielektrizitätskonstante, die mittels DK-Meter überprüft wird, sind in Tabelle 2 dargestellt.

Tabelle 2: Stufenweise Fraktionierung eines Phosphatidgemisches

ρ = 0,15MPa, Ausgangslösung: 100 ml 1%ige Phosphatid-n-Hexan-Lösung

Fraktion Lösungsmittelsystem Dielektrizi

tätskonstante

Zusammensetzung

(dünnschichtchro-

matographisch)

1. Permeat 2XIOOmI Spülungen

n-Hexan

1,9

2. Permeat (100 ml), danach 2 χ 100 ml Spülungen

n-Hexan/lsopropanol (80/20 Vol.-%)

3,1

72%

28%

Phosphatidylcholin Neutralfettbestandteile

3. Permeat (100ml),danach2x100ml Spülungen

n-Hexan/lsopropanol

(50/50 Vol.-%) 5,5

99,8% Phosphatidylethanolamin¹'

4. Retentat

19%

81%

Phosphatidyl· ethanolamin Phosphatidylisositol

1 unter Berücksichtigung der Nachweisgrenze der Phosphorbestimmung.

Beispiel 3

Es wird eine 1%ige Lösung des nach Beispiel 1, Versuchs-Nr. 7 angereicherten handelsüblichen Sojaphosphatjdpräparates über eine Celluloseacetatmembran UF120 des VEB Zellstoff- und Zellwollewerke Wittenberge in einer AMICON-Rührzelle, Typ 402 durch stufenweise Erhöhung der Polarität des Lösungsmittelsystems fraktioniert. Es kommt das gleiche Phosphatidgemisch wie in Beispiel 2 zum Einsatz.

Tabelle 3: Stufenweise Fraktionierung eines Phosphatidgemisches

ρ = 0,06MPa, Ausgangslösung: 100ml 1%ige Phosphatidlösung in n-Hexan/lsopropanol (90/10 Vol.-%)

Fraktion	Dielektrizitäts konstante	Zusammensetzung (dünnschichtchromatographisch)
1 Hexan/Isopropanol (90/10 Vol.-%) 150 ml Durchlauf	2,2	Sterole, Sterolverbindungen, Phosphatidylchotin, Spuren Phosphatidylethanolamin
2 Hexan/Isopropanol (80/20 Vol.-%) 100 ml Durchlauf 200 ml Spülen	3,1	Spuren Sterolverbindungen Phosphatidylcholin
3 Hexan/Isopropanol (50/50 Vol.-%) 100 ml Durchlauf 200 ml Spülen	5,5	Phosphatidylethanolamin (dünnschichtchromatographisch rein)

4 Retentat

Phosphatidylinositol

(dünnschichtchromatographisch

rein)

Beispiel 4 Es kommt das gleiche Phosphatidgemisch wie in Beispiel 2 zum Einsatz. Tabelle 4: Stufenweise Fraktionierung eines Phosphatidgemisches

ρ = 0,1 MPa, Ausgangslösung: 100ml 1%ige Phosphatidlösung in n-Hexan/lsobutanol (90/10 Vol.-%)

Fraktion	Dielektrizi tätskonstante	Zusammensetzung (dünnschichtchromatographisch)
1 Hexan/Isobutanol 300ml Spülung (90/10Vol.-%)	2,5	Neutralfettbestandteile, Phosphatidylcholin (Spuren Phosphatidylethanolamin)
2 Hexan/Isobutanol (82/18Vol.-%) 100 ml Durchlauf	3,1	Phosphatidylcholin (dünnschichtchromatographisch rein)

Claims (3)

1. Verfahren zurTrennung von Phosphatidgemischen in Phosphatidklassenpräparate, ausgehend von angereicherten Phosphatidgemischen, die in einem unpolaren Lösungsmittel oder in einem Gemisch aus mehreren unpolaren Lösungsmitteln oder in einem Gemisch aus einem oder mehreren unpolaren Lösungsmitteln und einem oder mehreren polaren Lösungsmitteln mit einer Dielektrizitätskonstante bis maximal 2,5 aufgenommen werden, die Phosphatidmicellen durch Ultrafiltration abgetrennt werden und die Membran mehrmals mit dem Lösungsmittelsystem gespült wird, gekennzeichnet dadurch, daß während der Trennung des Phosphatidgemisches die Dielektrizitätskonstante des Lösungsmittelsystems durch Zugabe eines polaren Lösungsmittels unter Kontrolle stufenweise auf 7,0 erhöht wird.

2. Verfahren nach Anspruch 1, gekennzeichnet dadurch, daß als unpolares Lösungsmittel ein Alkan, beispielsweise Hexan, und als polares Lösungsmittel ein Alkohol, beispielsweise Isopropanol oder Isobutanol verwendet wird.

3. Verfahren nach Anspruch 1 und 2, gekennzeichnet dadurch, daß zur Abtrennung des Phosphatidylcholin vom Phosphatidylethanolamin und vom Phosphatidylinositol die Dielektrizitätskonstante des Lösungsmittelsystems auf einen Wert von 1,8 bis 4,0, bevorzugt 3,1, und zur Trennung des Phosphatidylethanolamins vom Phosphatidylinositol auf einen Wert von 4,0 bis 7,0, bevorzugt 5,5 gebracht wird.

Anwendungsgebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Trennung von Phosphatidgemischen in Phosphatidklassenpräparate, die in der Lebensmittelindustrie, der pharmazeutischen Industrie, in der Medizin sowie in der biochemischen Forschung angewendet werden können.

Charakterisierung des bekannten Standes der Technik

Die Anreicherung einer bestimmten Phosphatidklasse beziehungsweise die Gewinnung reiner Phosphatidklassenpräparate kann durch Extraktionsverfahren (PARDUN, H., Fette, Seifen, Anstrichmittel 86,1984, Seite 55-62) oder durch Säulenchromatographie nach mehreren Vorreinigungsschritten (COLACCICO, G., J. Lipid Res. 8,1967, Seite 513) erfolgen. Diese Verfahren gestatten allerdings nur relativ geringe Anreicherungsgrade oder erfordern einen hohen Zeit- und Materialaufwand. In der EP 0049914 wird ein Verfahren beschrieben, in dem die Komponenten aus einem Gemisch abgetrennt werden, das Stoffe in einem unpolaren Lösungsmittel gelöst enthält, die Micellen bilden. Dazu wird ein geeignetes Lösungsmittelsystem verwendet, um die selektive MicellbiJdung zu steuern. An semipermeablen Membranen wird mittels Druck das Gemisch in Permeat und Retentat getrennt. Dabei werden bestimmte Komponenten im Permeat und/oder Retentat angereichert. Hierbei gelingt es, Phosphatidylcholin durch Anwendung verschiedenster Lösungsmittelgemische und Membranen im Permeat anzureichern. Die besten Ergebnisse mit 65%iger Anreicherung des Phosphatidylcholins werden bei Einsatz von Hexan mit 10% Ethanolzusatz als Lösungsmittelsystem erhalten. Das Präparat ist noch durch Phosphatidylethanolamin, Phosphatidsäure und Sterolglycoside verunreingt. Die Darstellung dünnschichtchromatographisch reiner Phosphatidklassenpräparate kann nicht gezeigt werden.

Ziel der Erfindung

Ziel der Erfindung ist es, dünnschichtchromatographisch reine Phosphatidklassenpräparate, ausgehend von Phosphatidgemischen, zeit- und kostensparend, zur Verwendung in der Lebensmittelindustrie, der pharmazeutischen Industrie, in der Medizin sowie in der biochemischen Forschung verfügbar zu machen.

Darlegung des Wesens der Erfindung

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zur Trennung von Phosphatidgemisch'en zu. entwickeln, das zu dünnschichtchromatographisch reinen Phosphatidklassenpräparaten führt und sich durch einen geringen Material- und Zeitaufwand auszeichnet.

Erfindungsgemäß wird diese Aufgabe dadurch gelöst, daß das angereicherte Phosphatidgemisch in einem unpolaren Lösungsmittel oder in einem Gemisch aus mehreren unpolaren Lösungsmitteln oder in einem Gemisch aus einem oder mehreren unpolaren Lösungsmitteln und einem oder mehreren polaren Lösungsmitteln mit einer Dielektrizitätskonstante bis maximal 2,5 aufgenommen wird, die Phosphatidmicellen durch Ultrafiltration abgetrennt werden und die Membran mehrmals mit dem Lösungsmittelsystem gespült wird, wobei während derTrennung die Dielektrizitätskonstante des Lösungsmittelsystems durch Zugabe eines polaren Lösungsmittels oder Lösungsmittelgemisches unter Kontrolle stufenweise auf 7,0 erhöht wird. Als unpolares Lösungsmittel wird ein Alkan, beispielsweise Hexan, als polares Lösungsmittel ein Alkohol, beispielsweise Isopropanol oder Isobutanol, verwendet. Zur Abtrennung des Phosphatidylcholins vom Phosphatidylethanolamin und Phosphatidylinositol wird so verfahren, daß durch Zugabe eines plaren Lösungsmittels oder Lösungsmittelgemisches zum