DD275120A1

DD275120A1 - Enzymimmunoassay zum nachweis von anti-tetanus-antikoerpern

Info

Publication number: DD275120A1
Application number: DD31914488A
Authority: DD
Inventors: Stephan Kiessig; Tomas Porstmann; Gabriela Prokop; Lothar Riemekasten
Original assignee: Univ Berlin Humboldt
Priority date: 1988-08-23
Filing date: 1988-08-23
Publication date: 1990-01-10

Abstract

Die Erfindung betrifft einen Enzymimmunoassay (ELISA) zum Nachweis von Anti-Tetanus-Antikoerpern, der zur Abloesung des Mausneutralisationstestes (TNT) geeignet ist. Durch die Verwendung von Tetanustoxin zur Festphasenimmobilisierung wird gegenueber Tetanustoxoid eine hoehere Korrelation zum TNT sowie eine hoehere Empfindlichkeit und Spezifitaet erreicht. Das Anwendungsgebiet der Erfindung ist die medizinische Diagnostik.

Description

Der vorgestellte ELISA ist aufgrund der einfachen Handhabbarkeit für klinisch relevante Anwendungen gut geeignet. Titerverläufe, wie dargestellt, erlauben Aussagen über den Imrr.unstatus bestimmter Untersuchungsgtuppen, Erfolge von Emmunisierungen lassen sich kontrollieren, schließlich eignet sich der Test auch insbesondere zum Screening monoklonaler Antikörper.

Ausführungsbeispiele Beispiel 1

1.1. Präparation:

Die Präparation erfolgte aus Rohtoxin zunächst durch Ultrafiltration Ober eine Membran (Abscheiuegrenze: 300000 MG) und dann über eine weitere Membran {Abscheidegrenze: 30000 MG). Der Überstand wurde mittels Gelchromatographie (Trennbereich: 10000-4 x 10*) (3cm x 108 cm, 3,8 ml/cm'/h) weiter aufgetrennt. Die Fraktionen wurden nachdem Elutions"rofil gepoolt und anschließend konzentriert.

1.2. Konjugate:

Die Enzymmarkierung von Toxin erfolgte nach Wilson und Nakane (Wilson, M. B., Nakane, P. K. (1978] In: W. Knapp, K. Holubar and G. Wick [Eds.], Immunofluorescence and .elated staining techniques [Elsev'er, Amsterdam], 215) im molaren Verhältnis von 1:4 (Tetanustoxin: POD). Ebensc wurde rronospezifisches Schaf-Anti-lgG bzw. ein monoklonaler Maus-Anti-lgG gekoppelt.

1.3. Enzymimmunoassay:

Polystyren-Mikrotestplatten wurden mit 10mg/l Antigen in 0,1 mol/ICarbonatpufferpH 9,6benetzt (δΟμΙ/Kavität). Die Inkubation erfolgte über Nacht. Nach dem Waschen mit PBS, 01 % Tv, sen 20, pH 7,2, konnten die so behandelten Platten über 6 Monate bei -20°C gelagert werden. Zur Bestimmung der unterer (UNG) und Analytischen Nachweisgrenze (ANG) wurden nach dem Auftauen und Wüschen 20fach-Bestimmungen von 4 Konzentrationen eines Standardserums im ansteigenden Teil der Bezup'kurve eingesetzt, wobei sich die Bezugskurve durch die Gleichung

y =

1 +e

-(clnx + bl

darstellen läßt (x = Konzentration, y = Extinktion). Als Verdünnungspuffer für Proben und Standard diente PBS, 0,1 % v/v

Tween 20; 5% v/v Gelatine, 2% w/v Polyethylenglycol, 1 mg/l Phenolrot, pH 7,2). Zur Messung der intraseriellen Präzision wi-rden 20fach-Bestimmungen i/on 4 verschiedenen Konzentrationen im unteren,

mittleren und oberen Boreich der Bezugsku ve durchgeführt. Anhand des Präzisionsprofils erfolgte die Bestimmung des

Meßbereiches auf den Antikörper-Konzentrationsbereich, der die Bestimmung mit einer prozentualen Abweichung von weniger

als 10% zuläßt.

Die Reaktionszeit betrug 90 min bei Raumtemperatur. Nach zweimaligem Waschen wurde 90 min das peroxidasemarkierte Konjugat (anti-human-lgG-PCC, anti-human-lgM-POD oder Tetanustoxin-POD), dessen optimale Konzentration durch Vorversuche ermittelt wurde, hinzugesetzt. Danach setzte gebundenes Konjugat das Substrat (5mmol/l ortho-Phenylendiamin, 5mmol/l H₂O₂ in 0,1 mol/l Citratpuffer

pH 5,0) um. Dor Reaktionsabruch erfolg¹ e nach 25 ± 2 min mit 2mol/l H₂SO₄,0,05mol/l Na₂SC₃.

Die Messung erfolgte bichromatisch bei 92 nm und 690 nm. Als UNG galt die Konzentration, die sich vom 3s Vertrauensbereich

der Lesrwertkontrolle unterscheiden läßt. Siewird durch die Gleichung UNG = xL + 1,5(sL + si) (χ = Mittelwert des Leerwertes,sL = Streuung dor Extinktion des Leerwertes, si = Streuung der Extinktion im ansteigenden Teil der Bezugskurve] boschrieben.

Die ANG gibt an, ab welchem Bereich man zwei benachbarte Werte eindeutig voneinander unterscheiden kann. Sie läßt sich

durch die Gleichung ANG = xL + 3 (sL + si) ermitteln. Die Intraserielle Präzision ergibt sich aus den Streuungen der

Konzentrationen im Meßbereich. Beispiel 2

Auf Anti-Tetanus-Antikörper wurden Seren von 22 chronisch niereninsuffizienton Patienten und 10 klinisch gesunden Probanden vor und nach einer Boosterimpfung mit Tetanustoxoid (SSW Dresden, DDR, Kennziffer: ARp 12/17/360) untersucht. Die Seren sind prävakzinal sowie am 7. und 28.Tag postvakzinal gewonnen worden. Die Aufbewahrung bis zur Bestimmung erfolgte bei -2O⁰C.

Polystyren-Mikrotestplatten wurden mit 50μΙ Antigen je Kavität (10mg/l) in Carbonatpuffer, pH 9,55, über Nacht be) 4⁰C

benetzt.

Die zu untersuchenden Seren wurden mit PBS TPPG (PBS, 0,1 % Tween 20,2% Polyethylonglykol, 5% Gelatine, 1 mg/l Phonolrot,

pH 7,2) vordünnt und nachfolgend in der bonotzten und gewaschenen Platte für 90 min bei Raumtemperatur inkubiert. Die nach

Vorversuchen verwendeten Sorumvordünnungon lagen im Bereich von 1:61 bis 1:284. Der Antikörper-Nachwois erfolgte in Doppolbostimmungon bei jeweils zwei vors::^hiodonen Serumverdünnungon. Für die Erstellung der Bezugskurve wurde dor Standard (Human Immunglobulin Anti-Tetanus »Dossau", Charg. Nr.068/04/82, IFID, Dossau, DDR) geometrisch in PBS TPPG 1:4 über 7 Stufen von 250IE/I bis 0,061 IE/I vordünnt. Nach orneutem Waschen wurdon dio gobundonon, totanusspozifischen Antikörper bei dor Antiglobulintechnik mit einem

peroxldasemarkiertenanti-human-lgG(1 mg/l) und bei der Capturetechnik mit enzymmarkiertem Tetanustoxin (0,5mg/l) In PBS

TPPG nachgewiesen. Die Inkubation erfolgto wieder für 9OmIn bei Raumtemperatur. Bei den bisherigen wie bei den folgenden Schritten betrug das Arbeitsvolumon 5OpIJo Vertiefung. Mit PBS Tween 20 wurde gewaschen. Durch Zugabe der Substratlösung (0,1 mol/l Citratpuffer, pH 5,5,5mmol/l ortho-Ponylondiamin, 5mmol/l H₂O₂) startete die

farbbildondo Substratreaktion, die mit Stopproagons (1 mol/l H₂SO₄,0,05mol/! Na₂SOj) nach 25min beendet wurde.

Die Extinktionen wurden am Photometer mit Differenzlängenwellenmessung (Lambda = 492nm, Lambda = 690nm) ermiNelt. Die Berechnung der Antikörper-Konzentrationen anhand der Bezugskurve erfolgte rechnergestützt am Robotron BC 5120 (5).

Cio Ermittlung der Anti-Tetanus-Antikörper-Konzentrationen der Seren mittels dieses Tests nahm das Staatliche Kontrollinstitut

für Sfiren und Impfstoffe Berlin entsprechend AB 2 der DDR vor.

Tabelle 1 Lineare Regression und Korrelationsanalyse

b«: Test auf Hypothese b = 1

a₀: Test auf Hypothese a = 0

r: Korrelationskoeffizient

+: Hypothese angenommen

-: Hypothese abgelehnt

Antigen

y = bx + a

b,

TF4	y= 1,03 χ-2,66
Td F4	y = 0,83x + 0,64
TF4Cap.	y=1,14x-3,78
TdF4Cap.	y = 0,81 χ-1,82
T408	y = 0,69 χ -0,04
T452	y = 0,85 χ-0,84
XM 30 Rot.	y = 0,71 χ + 0,04
Td 174	y = 0,79 χ-0,26
Td 178	y = 0,53 χ+ 0,80

0,89 0,84 0,85 0,90 0,94 0,90 0,89 0,91 0,87

Tabelle 2 Verfahren nach Passing & Bablok

Antigen

y = bx + a

b,

TF4 Td F4 TF4Cap

TdF4Cap

T 408 T 452

XM 30 Ret

Td 174 Td 178

y = 0,80 χ+ 0,28 y = 0,81 χ + 0,95 y = 0,73 χ+ 0,58 y = 0,50 χ+ 0,67 y = 0,61 χ+ 0,48 y = 0,62 χ + 0,54 y = 0,61 χ+ 0,14 y = 0,72x + 0,41 y = 0,45 χ + 0,73

Claims

1. Enzymimmunoassay (ELISA) zum Nachweis von Anti-Tetanus-Antikörpern, dadurch gekennzeichnet, daß Tetanustoxin zur Fostphasenimmobiüsierung eingesetzt wird.

2. Enzymimmunoassay nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß gereinigtes (präpariertes) Tetanustoxin Verwendung findet.

Anwendungsgebiet der Erfindung

Die Erfindung bezieht sich auf einen Enzymimmunoassay zum Nachweis von Anti-Tetanus-Antikörpern, der zur Ablösung der bisher üblichen Methoden zur Bestimmung neutralisierender Antikörper qegen Tetanustoxin, den Mausneutralisationstesl, geeignet ist. Das Anwendungsgebiet der Erfindung ist die medizinische Diagnostik.

Charakteristik der bekannten technischen Lösungen

Zur Bestimmung von Tetanus-Antitoxin stehen eine Reihe von Testsystemen zur Verfügung. Neben der passiven Hämagglutination und der radialen Immundiffusion ist der Toxin-Nr.utralisationstest (TNT) mit seinen Modifikationen von großer Bedeutung (Berger, U., M. Frey-Weltstein und H.Dey, Schweiz, med. Wochenschrift 111 [1981), 61-66; Ipsen, J., Z. Immun, forsch. 102 [1942], 347-368). Diese in vivo-Methode ist relativ störanfällig und sehr zeitaufwendig (Barita, M. F., M.C.Hardergree und M. Pittmann, Bull. World Health Organ. 43 (1970), 453-459). Eine der üblichen Methoden zur Bestimmung neutralisierender Antikörper gegen Tetanustoxin stellt der TNT dar (von Behring, E. A. und S. B. Kitasato, Dtsch. Med. Wochenschrift 16 [1890], 1113-1114). Großer Zeitaufwand bei geringem Probendurchsatz sowie hohe Kosten sind dabei wesentliche Nachteile (Melville-Smith, M. E., V. A. Seagrott, J. T. Watkins.Biol. Standard. 1111983), 137-144). Zum Nachweis von anti-Tetanus-Antikörpern und damit zum Beispiel für die Differenzierung von Patienten mit einer ausreichenden Immunisierung von Patienten ohne eine ausreichende Menge schützender Antikörper wurde bereits ein ELISA mit Tetanustoxoid (Td) an der festen Phase zur klinischen Nutzung empfohlen (Gentili, G., C.Pini und C.Collotti, J. Biol. Standard. 12 (19841,167-173; Layton, G.T., Med. Lab. Sei. 37 [1980), 323-329). Ambrosch et al. (Ambrosch, F., G.Wiedermann und H. Müller, ZbI. Bakt. Hyg. A 258 [1984), 173-182) konnten eine Korrelation zwischen dem TNT und eincr.i Toxoid-ELISA nachweisen.

Ziel der Erfindung

Es ist das Ziel der Erfindung, den TNT zur Bestimmung neutralisierender Antikörper gegen Tetanustoxin zu ergänzen und der medizinisch-diagnostischen Praxis eine neue Methode zum Nachweis von anti-Tetanus-Antikörpern zur Verfügung zu stellen.

Darlegung des Wesens der Erfindung

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein neues Verfahren zum Nachweis von anti-Tetanus-Antikörpern in Gestalt eines Enzymimmunoassays (ELISA) zu entwickeln. Die Aufgabe wurde durch den Einsatz von gereinigtem Tetanustoxin an der festen Phase eines ELISA gelöst. Überraschenderweise hat sich gezeigt, daß die Verwendung von Tetanustoxin zur. Festphasenimmobilisierung zum Nachweis von spezifischen Antikörpern geeignet ist und gegenüber dem Tetanustoxoid-ELISA vor allem den Vorteil der besseren Korrelation zum TNT aufweist sowie gleichzeitig eine höhere Empfindlichkeit und Spezifität beim Nachweis gestattet. (Tab. 1). Mit dom gereinigten (präpariertem) Antigen werden bei den erfindungsgemäßen Verfahren die besten Ergebnisse erzielt. Als Nachweismethoden eignen sich sowohl Antiglobulin- als auch Capturetechniken (Bosworth, J.M., A.A. Brimfield, J.A. Naylor und K.W. Hunter, J. Immunol. Meth. 62 [1983), 331-336). Die Korrelationsanalyse allein zeigt unabhängig vom Festphasenantigen eine weitgehende Übereinstimmung der Werte aus TNT und ELISA an (Tab. 1). Eine genauere Aussage ergibt sich aus dem Anstieg der Ausgleichsgeraden (Passing, H., W. Bablok, J. Clin. Chem. Clin. Biochem. 21 [1983], 709-720). Bestimmt man in beiden Methoden den annähernd gloichon Antikörper-Gohalt jo Serum, weicht der Anstieg b nicht signifikant von 1 ab. Dies traf unter don Bedingungen von Passinn & Bablok nur für präpariertes Tetanustoxin (T F4) mit b = 0,80 zu (Tab. 2). Alle anderen Antigene wiesen eine signifikante Abweichung von b = 1 auf (Tab. 2). Da Anstieg b in diesen Fällen kleiner 1 ist, wird boi Verwendung dieser Antigene im ELISA ein höherer Anti-Tetanus-Antikörper-Gehalt als im TNT bestimmt.

Das präparierte Antigen T F4 wurde sowohl in der Antiglobulin· als auch in der Capture-Tnchnik getostet. Dabei fand sich die bessere Korrelation zum TNT mit dor AntiglobulinVariante. Mit ihr kann in Abhängigkeit vom verwendeten Konjugat gezielt IgG und IgM nachgewiesen worden. Da neutralisierende Anti-TetanusAntikörper nur dor Klasse G angehören (Ourth, D. D. und A. B. Mac Donald, Immunology 33 (1977), 807 -815), läßt sich auf diese Weise oino hoho Spezifität erzielen. Beim Capture-Test speziell in der Brückenvariante werden die im Onrum simultan vorhandenon Anti-Tetanus-Antikörper der Klassen G und M (Kioßig, S. T„ S. Jahn, T. Porstmann und R. v. Boehr, Allerg. Immunol. 33 (1987), 79 - 8/) gleichzeitig erfaßt, so daß eine signifikante Abweichung von b - 1 und a - C resultiert (Tab. 2), da nur Antikörper der Klasse G neutralisierend wirken können (Ourth, D. C. et al, a.a.O.). Die klassenspezifische Capture-Technik wurde nicht in diese Untersuchungen einbezogen, da Voruntersuchungen eine zu geringe Empfindlichkeit aufgewiesen hatten.