DD272478A1 - Verfahren zur amperometrischen bestimmung von l-glutamat - Google Patents

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur amperometrischen Bestimmung von L-Glutamat unter Verwendung von L-Glutamatoxidase und einem Biosensor. Anwendungsgebiete sind Lebensmittelindsutrie, Landwirtschaft und medizinische Diagnostik. Erfindungsgemaess wird der Messloesung ein Mediator zugesetzt oder dieser auf der Elektrode fixiert, anschliessend die Elektrode polarisiert, so dass nur der Mediator oxidiert wird, und der Strom der anodischen Oxidation des Mediators als Mass fuer die L-Glutamatkonzentration gemessen.

Description

Bei Verwendung gelöster Mediatoren taucht die L-Glutamotelektrode In eine luftgesättigte Meßlösung, In der mindestens 2,6 mmol/l Mediator eingebracht wird. In Gegenwart von Sauerstoff lauft nach L-QlutamaUugabe zur Meßlösung die enzymkatalysierte Bildung von Alphaketoglutarat und reduziertem Mediator (M,) ab

Substrat H*·"·"**·*·««·»" L-Glutamat L-Glutamat +M₀ GLOD M, + -Ketoglutarat + NH₃

Dabei kann der L-Glutamatoxldase mindestens ein L-glutamatblldendes Enzym vorgeschaltet sein, dessen Substrat dann der Analyt ist. Der elektrochemische Nachweis findet bei dem jeweiligen Oxidationspotential für M₁ statt.

_Mr Ei.kt,od. _{Mo + ne}-

Aufgrund der geringeren Überspannung für die Mediatoroxidation gegenüber der Wasseretoffperoxidation führt der Einsatz solcher Mediatoren zu einer Eihöhung der Selektivität des Biosensors. Das bedeutet eine Verminderung elektrochemischer Interferenzen. Daneben kann mit Mediatoren eine Erweiterung des Meßbereiches erreicht werden. Während die Sauerstoffkonzentration in luftgesättigten Lösungen nur 240umol/l ist, läßt sich mit Mediatoren eine die L-Glutamatoxidation nicht begrenzende Cosubstratkonzentration einstellen. Im Gegensatz zu den bekannten Verfahren der Kombination von Oxidasen mit Mediatoren gelingt es mit dem erfindungsgemäßen Verfahren, obwohl die L-Glutamatoxidäee eine hohe Affinität zu Sauerstoff hat (Km(Oa) "· 1,4 mmol/l), überraschenderweise L-Glutamat und Substanzen, die durch enzymatlsche Reaktionen in L-Glutamat umgewandelt werden, ohne Sauerstoffbeeinflussung zu messen.

Eine Vereinfachung des Verfahrens ist durch Immobilisierung des Redoxmediators direkt auf der Arbeitselektrode des L-Glutamatsensors erreichbar.

Nachfolgend soll die Erfindung an Beispielen erläutert werden.

Ausführungsbeispiele

1. Beispiel

Es werden Gelatinemembranen mit 0,75 U/cm² L-Glutamatoxldase hergestellt. Ein etwa 3 = 0 mm großes Stück dieser Membran wird zwischen zwei Dialysemembranen auf die Platinelektrode einer Einstabsauerstoffelektrode mittels Nullring fixiert. Die präparierte Elektrode taucht in 2ml einer gerührten, luftgesättigten, temperierten Grundlösung aus 0,066mol/l Phosphatpuffer, pH 7,2. Die Elektrode wird an einen Polarographen angeschlossen und die Pt-Arbeitselektrode auf +125 mV gegen Ag/ AgCI - 0,1 mol/l KCI polarisiert. Der Grundlösung werden 5mmol/l p-Benzochinon zugesetzt. Nach Einstellung des stationären Grundstromes werden 50 μΙ Eichlösung zwischen 1 und 100 mmol/l L-Glutamat addiert. Die L-Glutamatoxidation ist verbunden mit der Hydrochinonbildung. Diese wird anodisch reg' triert und korreliert mit der L-Glutarr.atkonzentration. Nach Aufnahme einer Bezugskurve wird eine Probe eingebracht. Aus der gemessenen Stromänderung kann über die Bezugskurve die L-Glutamatkonzentration der Probe ermittelt werden.

2. Beispiel

Auf ein Stück einer L-Giutamatoxidasemembran wie in Beispiel 1 werden 4 μΙ Asparaginase mit Glutaminaseaktivität, getropft. Anschließend wird dieses Bienzymsystem zwischen zwei Dialysemembranen gelegt und wie In Beispiel 1 behandelt. Zur . Eichung der Glutamlnetektrode werden der Grundlösung die 5 mmol/l p-Benzochinon enthält, Glutaminstandardlösungen zugesetzt. Glutamin wird durch Glutaminase zu L-Glutamat und NH₃ umgesetzt. L-Glutamat wird unter Hydrochinonbildung in der L-Glutamatoxidasemembran oxidiert. Die Messung der Proben, auch mit unterschiedlichem Sauerstoffpartialdruck, beispielsweise Fermantatlonslösungen, erfolgt wie in Beispiel 1.

3. Beispiel

Eine Kohlenstoffelektrode wird elektrochemisch aktiviert (min 1V gegen gesättigte Kalomelelektrode (GKE)). Anschließend werden 5-1 ΟμΙ L-Glutamatoxidase (2U/mg; 10ing/ml) auf die Spitze aufgetropft und angetrocknet. Nach dem Abspülen der überschüssigen Oxidase wird diese Enzymelektrode in 5 ml der gerührten Meßvorlage (Phosphatpuffer, 0,066mol/l, pH 7,2) getaucht und gegen eine GKE auf +20OmV polarisiert. In diese Vorlage werden 10rnmol/l Dichlorphenolindophenol (DCPIP) eingebracht. Nach I.-Glutamatzugabe wird die Bildung des reduzierten DCPIP polarographisch verfolgt, auf einem Schreiber aufgezeichnet und als Maß für die Konzentration an L-Glutamat ausgewertet.

4. Beispiel

Eine Kohlenstoffelektrode wird analog Beispiel 3 vorbehandelt und mit Glutamatoxidase beladen sowie gewaschen. Mit der auf +30OmV polarisierten Elektrode kann in einer Meßvorlage, die 5mmol/l Ferrocendicarbonsäure enthält L-Glutamat wie im Beispiel 3 gemessen werden. Bei Verwendung einer mit Ferrocensäure beladenen Kohlenstoffelektrode wird nach L-Glutamatoxidasebindung der auf +30OmV polarisierte Sensor in eine Meßlösung getaucht und L-Glutamat bestimmt.

Claims (3)

1. Verfahren zur amperometrischen Bestimmung von L-Glutamat und Substanzen, die enzymatisch in L-Glutamat umgewandelt werden können unter Verwendung von L-Glutamatoxldase und einem Biosensor auf dem gegebenenfalls mindestens ein weiteres glutamatbildendes Enzym fixiert ist, dadurch gekennzeichnet, daß man der Meßlösung einen Mediator zusetzt oder diesen auf der Elektrode fixiert, anschließend die Elektrode polarisiert, daß nur der Mediator oxidiert wird und der Strom der anodischen Oxidation des Mediators als Maß für die L-Glutamatkonzentration gemessen wird.

2. Verfahren nach Punkt 1, dadurch gekennzeichnet, daß als Mediatoren für die L-Glutamatoxidation p-Benzochinon, Ferrocendicarbonsäure, Meldola Blau und Dichlorphenolindophenol verwendet werden.

3. Verfahren nach Punkt 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Konzentration des gelösten Elektronenakzeptors mindestens 2,5mmol/l beträgt.

Anwendungsgebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Konzentrationsbestimmung von L-Glutamat und Substanzen, die durch enzymatlsche Reaktionen in L-Glutamat umgewandelt werden können. Das Verfahren kann in der Lebensmitteilindustrie, Landwirtschaft und medizinischen Diagnostik angewendet werden.

Charakteristik des bekannten Standes der Technik

Es sind Biosensoren mit immobilisierter L-Glutamatoxidase, die für die Bestimmung von L-Glutamat und Substanzen, die in L-Glutamat umgewandelt v/erden können, beschrieben. Dabei dient die amperometrische Registrierung des Sauerstoffverbrauchs bzw. die Wasserstoffperoxidbildung als Maß für die Konzentration (EP 0097949, DD 7.995320). Sauerstoffmessungen sind jedoch sehr temperaturempfindlich und wechselnder Sauerstoffpartialdruck des Probenmaterials beeinträchtigt die Meßqualität. Die Oxidation von Wasserstoffperoxid vollzieht sich an der Platinelektrode bei einem Potential von +60OmV gegen eine Silber/Silberchlorid-Bezugselektrode. Bei diesem Potential sind eine Reihe von Substanzen, die im Probenmaterial vorhanden sein können ebenfalls oxidierbar und erzeugen dadurch falsche Meßwerte. Es ist weiterhin bekannt, daß einige Flavinenzyme, wie Glucoseoxidase, Alkoholoxidase oder Glyceroloxidase, Redoxmedlatoren wie Ferrocenderivate, p-Benzochinon, Phenazinmethosulphat, Dichlorphenolindophenol oder Ferrocyanid an Stelle von Sauerstoff als Elektronenakzeptor verwenden. Enzymelektroden mit solchen Mediatoren sind unter Einsatz dieser Enzyme konstruiert worden (DE 2243962, US 42241 ?G, APF. Turner in The World Biotech Report 1, Online Publications Pinner, Middlesex 1985, pp. 181-192). Diese Elektroden arbeiten bei einem niedrigerem Potential, als es für die Wasserstoffperoxidation notwendig ist, und sind dadurch weniger störanfällig für Interferenzen. Die Verwendung solcher Mediatoren blieb bisher nur auf wenige Enzyme * beschränkt (APF. Turner siehe oben). Die Mediatoren werden dabei entweder in die Meßlösung eingebracht oder liegen teilweise in ungelöster Form zwischen semipermeabler Membran und elektrochemischem Sensor vor oder sind an den elektrochemischen Sensor gebunden. Als deutlicher Mangel ist für diese Sensoren die Abhängigkeit der Empfindlichkeit vom Sauerstoffpartialdruck nachgewiesen worden (P.Schläpfer, W.Mindt und P.H.Racine, Clin. Chim. Acta 57 (1974) 283). Eine präzise Messung ist deshalb nur unter sauerstofffreien Bedingungen möglich. Für L-Glutamatoxidase ist bisher nur Sauerstoff als Elektronenakzeptor bekannt.

Ziel der Erfindung

Ziel der Erfindung ist es, ein Verfahren zu entwickeln, daß es gestattet, mittels eines Biosensors L-Glutamat und Substanzen, die durch enzymatische Reaktionen in L-Glutamat umgewandelt werden können unabhängig vom Sauerstoffpartialdruck über einen weiten Konzentrationsbereich interferenzarm zu messen.

Darlegung des Wesens der Erfindung

Das Verfahren zur Bestimmung von L-Glutamat und Substanzen, die durch enzymatische Reaktionen in L-Glutamat umgewandelt werden können unter Verwendung von L-Glu'.amatoxidase und einem Biosensor auf dom gegebenenfalls mindestens ein weiteres glutamatbildendes Enzym fixiert ist, ist erfindungsgemäß gekennzeichnet durch die Zugabe eines Mediators (Elektronenakzeptors) in nicht begrenzender Konzentration. Die Arbeitselektrode des Biosensors wird durch Anlegen einer geringen Überspannung derart polarisiert, daß der reduzierte Mediator oxidiert wird jedoch nicht Wasserstoffperoxid. Dabei muß die Meßlösung nicht sauerstofffrei sein. Der Mediator wird entweder in die Meßlösung gegeben oder auch direkt auf der Elektrodenoberfläche aufgebracht und zwar zwischen Elektrode und immobilisiertem Enzym. Als Arbeltselektroden kommen die üblichen Materialien, wie Kohlenstoffe, Platin oder Gold zur Anwendung. Für die durch L-Glutamatoxidase katalysierte Gfutamatoxidation werden als Mediatoren p-Benzochinon, Ferrocendicarbonsäure, Meldola Blau und Dichlorphenolindophenol eingesetzt.