DD270847A7 - Verfahren zur bestimmung des glukosegehaltes von nicht-enzymatisch glukosylierten proteinen und reagenssatz zur durchfuehrung des verfahrens - Google Patents

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bestimmung des Glukosegehaltes von nicht-enzymatisch glukosylierten Proteinen, dadurch gekennzeichnet, dass man die in Zellen geschlossenen oder wasserunloeslichen Proteine mit einem ionischen oder nicht-ionischen Detergens in Loesung bringt, die Glukose unter Druck und unter Anwendung einer mindestens 1 N Saeure in Form von 5-Hydroxymethyl-furfurol abspaltet, das Reaktionsgemisch deproteinisiert, danach das 5-Hydroxymethyl-furfurol mit einer organischen Verbindung, welche mit dem Aldehyd ein farbiges Produkt bildet, kondensiert und schliesslich die Konzentration des erhaltenen Produktes spektrophotometrisch bestimmt. Die Erfindung betrifft weiterhin einen Reagenssatz zur Durchfuehrung des obigen Verfahrens, in welchem das Verhaeltnis von Natriumdodecylsulfat, Oxalsaeure, Sulfosalicylsaeure und Barbitursaeure 0,02:0,90:2,0:0,04 betraegt - auf 1 Einheit des zu bestimmenden Proteins bezogen.

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur spektrophotometrischen Bestimmung von nicht-enzymatisch glukosylierten Proteinen und einen Reagenssatz zur Durchführung dieses Verfahrens.

Proteine können an ihren reaktiven Gruppen (insbesondere an den N-Terminalen Aminogruppen und den ε-Aminogruppen der Lysin-Seitenkette) aspezifisch in Abhängigkeit vom Glukosegehalt des umgebenden Mediums mehr oder weniger Glukose binden. Dieser, sich in vivo und in vitro abspielende Vorgang ist deshalb von großer Bedeutung, weil sich bestimmte Eigenschaften der glukosylierten Proteine (z. B. die funktioneile Aktivität, immunologische charakteristische Merkmale und die Stabilität) ändern können. Die Bedeutung des in vivo Vorganges ist vor allem der im Diabetes mellitus entstandenen, erhöhten, iiicht-enzymatischen Glukosylieruny zuzuschreiben, die bei der Entstehung von späteren Komplikationen dieser Krankheit eine wesentliche Rolle spielt. Die Verfolgung des in vitro Vorganges ist für die Lagerung und Wiederanwendung von verschiedenen Proteinen, insbesondere von Flüssigkeiten biologischen Ursprungs (z. B. Blut, Milch usw.) wichtig.

Bei der Behandlung von an Diabetes mellitus laidenden Patienten und bei der Verhütung der chronischen Komplikationen ist die Kontrolle des Einstellungsgrades des Blutzuckerspiegels von grundlegender Wichtigkeit. Die aktuelle Blutzuckerspiegelmessung wird nämlich durch den täglichen Kohlenhydratverbrauch stark beeinflußt, so daß diese Messung über r*en Kohlenhydratstoffwochsel des Organismus keine zuverlässige Information liefert. Auch über die Lage der dem Versuch vorangehenden Periode werden keine Angaben geliefert. Als geeignete Kontrollmethode wird seit einigen Jahren die Bestimmung der Menge des an einer bestimmten Stelle (N-Terminal der ß-Kette) glukosylierten Hämoglobins (Hämoglobin A_!c; weiterhin H jAic genanm), d.h. der Menge der schnellen Hämoglobinkomponenten angenommen.

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Das HbAic und die anderen glukosylierten Hämoglobine werden im Laufe der postsynthetischtin Glukosylierung gebildet; ihre Menge ist dem Glukosegehalt des Blutes proportional. Diese glukosylierten Hämoglobine werden während der Lebensdauer der Erythrozyten ständig gebildet, so daß ihre Menge den durchschnittlichen Wert des etwa dreimonatigen Kohlenhydratstoffwechsels widerspiegelt. Die letztere Angabe stellt den wichtigsten diagnostischen Wert der Bestimmung dar.

Die obigen Verfahren beruhen vor allem auf der Bestimmung der glukosylierten Hämoglobinkompononten, und zwar der HbA_k Komponente und sind zur Bestimmung von anderen glukosylierten Proteinen ungeeignet (L. A. Trivelli, H. M. Ranny, H.T. Lai: New England Jour, of Med. ¹971, Band 284, Seite 353). Die Mehrzahl dieser Methoden beruht auf der chromatographischen Trennung des glukosylierten Hämoglobins; es wird deshalb nicht die Gesamtmenge der an Hämoglobin gebundenon Glukose, sondern der auf das nur an der N-terminalen Aminogruppe der Seitenkette glukosylierte Hämoglobin (HbA_k) bezogene Wert angegeben. Die handelsüblichen Reagenssätze sind nur zum obigen speziellen Zweck—d. h. zur Bestimmung von HbA_tc— geeignet und sind gegenüber bestimmten Umgebungsfaktoren (z. B. Temperatur der Laboratorien/ sehr empfindlich. Die von Flückiger und Winterhalter ausgearbeitete kolorimetrische Methode (FEBS Letters 71,356 (1976]) ist im Vergleich zur chromatographischen Methode einfach und für Serienmessungen geeignet. Das Wesen dieser Methode besteht darin, daß die an den Aminogruppen der Proteine durch eine Kondensationsreaktion gebundene und einer Arrwidori-Ui.. agerung untergangene Glukose unter Einwirkung einer sauren Wärmebehandlung in Form von 5-HydroxvmGthyl-furfurol abgespalten wird, das mit Thiobarbitursäure bestimmt wird. Die Methode ist in dieser Form nur zur Bestimmung von an wasserlösliche Proteine gebundener Glukose geeignet. Nach dem ursprünglichen Verfahren wurde die Bestimmung auf das Ergebnis der chromatc^raphischen Methode kalibriert und die Methode wurde deshalb ausschließlich auf die Bestimmung von HbAi₀ abgestellt. Es wurde entgegen den obigen Feststellungen gefunden, daß diese Methode auch auf in Zellen eingeschlossene oder wasserunlösliche Proteine erweitert werden kann, foils man diese vorherig mit einem verdünnten ionischen oder nichtionischen Detergent in Lösung bringt. Die obige Erkenntnis ermöglicht die Bestimmung des Glukosegehaltes von anderen glukosylierten Proteinen außer dem Hämoglobin.

Andererseits wird die Auswertung des erfindungsgemäßen Verfahrens nicht auf die chromatographische HbA₁C Methode rückDezogen, sondern es wird ausschließlich der Extinktionskoeffizient des Glukosederivates und das Verhältnis zwischen der Entstehung und Zersetzung unabhängig vom Protein berücksichtigt.

Die Methode wird dadurch auf alle Proteine erweitert und ist zur Bestimmung der Gesamtmenge der an Proteine gebundene Glukose geeignet.

Ein weiteres neues Merkmal in unserem Verfahren liegt darin, daß eine höhere Säurekonzentration als der entsprechende, bei den bekannten Methoden übliche Wert von max. 0,6 M kombiniert mit einer unter Überdruck durchgeführten Wärmehehandlung verwendet wird. Die saure Hydrolyse kann mit Hüte einer einzigen Säure oder mit einem Gemisch von organischen oder anorganischen Säuren, gegebenenfalls in Gegenwart eines Katalysators vollzogen werden. Als Säure kann vorteilhaft Oxalsäure und als Säuregemisch eine Mischung von Oxalsäure und Essigsäure oder Oxalsäure ι .id Schwefelsäure Verwer dung finden. Als Katalysator kann z. B. HgCI₂ eingesetzt werden. Diese Ausführungsform des Verfai r ins kürzt einerseits die Zeitdauer der Bestimmung ab und führt andererseits zu in sämtlichen Fällen gut reproduzierbaren Ergebnissen.

Es wurde während unserer Versuche weiterhin gefunden, daß die bei der Deproteinierung bisher ausschließlich verwendete Trichloressigsäure durch Sulfosalicylsäure vorteilhaft ersetzt werden kann. Dieses Reagens ist viel einfacher behandelbar und bietet deshalb auch technologische Vorteile.

Es wurde weiterhin gefunden, daß die bei den kolorometrischen Bestimmungen bisher ausschließlich verwendete Thiobarbitursäure durch sämtliche aromatischen Verbindungen ersetzt werden kann, weicht) mit der Aldehydgruppe des bei der sauren Zersetzung gebildeten 5-Hydroxymethyl-furfurols kondensieren können und dabei unter Bildung eines ausgedehnten Doppelbindungssystems (delokalisierte n-Elektronen) ein farbiges Produkt bilden. Die Barbitursäure hat sich für diesen Zweck besonders vorteilhaft erwiesen. Es wurde weiterhin gefunden, daß im Fall der mit Thiobarbitursäure durchgeführten Entwicklung die Genauigkeit der Messung erhöht werden kann, falls man die Auswertung bei 360 nm durchführt. Gegenstand der Erfindung ist also ein Verfahren zur Bestimmung des Glukosegohaltes von irgendwelchen nicht-enzym.atisch glukosylierten Proteinen durch Ausbildung von Hydroxymethyl-furfural durch saure Behandlung, Präzipitieren des EiweiPes und Farbbildung mit dem Hydroxymothylfurfural. Erfindungsgemäß geht man derart vor, daß man die in Zollen eingeschlossenen oder wasserunlöslichen Proteine mit Hilfe eines ionischen oder nichtionischen Detergent in Lösung bringt, die Glukose unter Überdruck mit mindestens 1 η Säure vorzugsweise in Gegenwart eines Katalysators in Form von 5-Hydroxymethyl-furfurol abspaltet, danach das Reaktionsgemisch deproteiniert, das 5-Hydroxymethyl-furfural mit einer ein farbiges Produkt ergebenden organischen Verbindung deproteiniert, das kondensiert, schließlich die Konzentration des erhaltenen Produktes spektrophotometrisch bestimmt.

C agenstand ist weiterhin p^:h Reagenssatz, mit welchem die Serier.messung stets mit derselben Genauigkeit durchgeführt werden kann.

Der erfindungsgemäße Reagenssatz besteht, getrennt von einander, aus 1-3 Gewichtsteilen eines ionischen oder nichtionischen Detergens, 60-120 Gewichtsteilen eines hydrolysierenden Agens, 150-250 Gewichtsteilen eines Eiweiß präzipitierenden Agens und 2-6 Gewichtsteilen einer Substanz, die mit Hydroxymethyl-furfural eine Farbreaktion ergibt. Die erfindungsgemäßen Reagenssätze enthalten als Detergens vorzugsweise Natrium-dodecyl-sulfat, als hydrolysierendes Agens vorteilhaft Oxalsäure, als Eiweiß präzipitierendes Agens vorzugsweise Sulfosalicylsöure und als mit Hvdroxymethylfurfural eine Farbreaktion ergebende Substanz vorzugsweise Barbitursäure.

Die Zusammensetzung des Reagsnssatzes kann variiert werden, weil derselbe chemische Vorgang mit verschiedenen Reagenzien durchgeführt werden kann.

Ef wurde gefunden, daß der vorteilhafteste Reagenssatz für eine Bestimmung als Detergens 2 ml eines 0,1%igen Na.'.iumdodecylsulfats, als Hydrolysierungsmittel 1 ml 1N Oxalsäure, als Deproteinierungsmittel 1 ml 2C%iger Sulfosalicylsäure und als r.iit Hydroxymethyl-furfural das farbige Produkt bilden Je Verbindung 0,5ml 0,05molare Barbit-j/säure enthält. Eine vorteilhafte Zusammensetzung des Reagenssatzes für &U Messungen ist die folgende: 100ml 0,1%iges Natriumdodecylsulfat 50ml 1N Oxalsäure

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50ml 20%ige Sulfosalicylsäure

25ml 0,05moiare Barbitursäure.

In diesem Reagenssatz optimaler Zusammensetzung ist das Verhältnis derzur Bestimmung der an Protein gebundenen Glukose notwendigen Reagenzien das folgende:

NatriumdodecylsulfatiOxalsäureiSulfosalicylsäureiBarbitursäure = 0,02:0,9:2,00:0,04.

Im Regenssatz kann die hämolysi uende Lösung anstatt Natriumdodecylsulfat auch ein anderes Detergens (z. B. Triton X100) enthalten. Die Oxalsäure kann durch 2 N Essigsäure, Schwefelsäure oder eine andere starke Säure ersetzt werden. Zur Entfernung der Proteine kann auch Trichloressigsäure dienen. In der Farbreaktion kann anstatt der Barbitursäure auch Thiobarbitursäure oder eine andere, mit Hydroxymethylfurfurol ein farbiges Produkt bildende Verbindung verwendet werden. Die Verwendung des Verfahrens wird anhand der nachstehenden Beispiele näher beschrieben, ohne den Schutzumfang auf diese Beispiele einzuschränken.

Beispiel 1 Bestimmung des Glukosegehaltes vo.i nicht-enzymatisch glukosyliertem Hämoglobin

a) 3ml hepariniertes Blut werden mit 10ml physiologischer Salzlösung gewaschen, wonach zu 1 ml gewaschenen Erythrozyten2 ml einer 0,1%igen Natriumdodecylsulfatlösung zugegeben werden. Die Hämoglobinkonzentration des entstandenen

Hämolysats wird bestimmt; zu 2 ml davon wird 1 ml einer 1N Oxalsäurelösung zugegeben und die Mischung wird bei 112-115°C

und unter einem Druck von 1,6 Atm. 2,5 Stunden lang einer Wärmebehandlung unterworfen. Dem Hydrolysat wird 1 ml einer20%igen Sulfosalicylsuurelösung unter starkem Schütteln tropfenweise zugegeben (Temperatur 4O⁰C). Die entstandene

Suspension wird zentrifugiert und die Lichtabsorption der supernatanten Flüssigkeit bei 3S8nm abgelesen (E,-Wert). Zu 2ml

dieser Flüssigkeit wird 0,5ml einer 0,05molaren Barbitursäurelösung zugegeben und das Gemisch wird bei 40°C 40 Minuten langinkubiert. Die Mischung wird abgekühlt und die Lichtabsorption binnen 10 Minuten bei 398 ηm gegen eine ohne Hämolysathergestellte Blindprobe abgelesen (E₂-Wert).

Der Glukosegehalt (G) wird gemäß der folgenden Formel ausgerechnet:

G . 2,40 ^E2Q98) - °-^{3 E}1Q98) ' °·²⁰ _{χ 1Q}-2 _Mol

(F) Glukose/100 ml

Hämoglobin

(F) = Hämoglobinkonzentration (Mole/l).

Die Konstante enthält den molaren Extinktionskoeffizienten der Thiobarbitursäure, den Korrektionsfaktor des bei der sauren Zersetzung stattgefundenen 5-Hydroxymethyl-furfur J-Verlustes und die Verdünnung. Falls man die Hämoglobinkonzentration mit der Methode von Drabkin bestimmt, zu 5 ml Reagens 0,02 ml Hämolysat zufügt und

die Lichtabsorption bi 540nm mißt (Em₀), ist die Formel wie folgt:

G = 4,53 _:,_ol Glukose/100 ml

(E) Hämoglobin

Im Falne von Hämoglobin beträgt der normale Wert 7,5-12,0 Mole Glukose/100 Mole Hemoglobin.

b) Man verfährt wie im Beispiel a) mit dem Unterschied, daß man zur Bestimmung der Glukose 0,05molare Thiobarbitursäureverwendet und die Reaktion bei 443nm verfolgt.

Zur Auswertung worden die f< Igenden Formeln verwendet:

₀ . _lf5 2(^) !(<*«) - °.l» _χ ,₀-2 .,_ol

(P) Glukose/100 ml

Hämoglobin

G = 2,83 ±iz±>J _:._:ol Glukose/100 ml

() Hämoglobin

c) Man verfährt wie im Beispiel a), mit dem Unterschied, daß man die Reaktion bei dem mehr empfindlichen Wert von 360 nm verfolgt. In diesem Falle werden die folgenden Formeln verwendet:

G - 1,05 ^E2^60) " °'^{8 E}l(3&0) " °^>]Λ _{χ 10}-2 ._:ol

(F) Glukose/100 Mole

Hämoglobin

bzw.

^E2C*60) - °i8 Βι(χ£.η) " ⁰⁾¹^ G = 1,98 ² _: Mol Glukose/ICO

Hämoglobin

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Mit Rücksicht darauf, daß nach dieser Methode die an Hämoglobin gebundene Gesamtglukosemenge bestimmt wird, ist das erhaltene Ergebnis höher als der chromatographisch bestimmte oder darauf rückbezogene, international anerkannt verwendete t. Der Umrechnungsfaktor zwischen den beiden Methoden beträgt G/HbA* = 1,8.

Beispiel 2

Bestimmung von nicht-enzymatisch glukosylierten Proteinen des Erythrozytenmembrans

a) 10ml heparinisiertes Blut werden dreimal mit je 50ml einer physiologischen Salzlösung gewaschen, wonach der Niederschlag mit dem achtfachen Volumen einer eiskalten Hämolysierungslösung geschüttelt und 5 Minuten lang stehengelassen wird. Die Suspension wird danach zentrifugiert, die supernatante Flüssigkeit dekantiert und die zurückgebliebene Membranfraktion viermal gewaschen. Die Hämolysierungs- und Waschlösungen werden auf die in J. Physiol. 23\5,551 (1973) beschriebene Weise hergestellt. Der Proteingehalt des so erhaltenen hämoglobinfreien Membrane wird bestimmt und die Konzentration der Membransuspension auf einen, 2,5mg/ml Protein entsprechenden Wert eingestellt. Danach werden zu 2,5ml Membranfraktion 2ml 0,1%iges Natriumdodecylsulfat und 1 ml 1N Oxalsäure zugegeben und das Gemisch wird bei 112-115°C unter Druck 2,5 Stunden lang einer Wärmebehandlung unterworfen. Dem Hydrolysat wird 1 ml einer 20%igen Sulfosalicylsäurelösung zugegeben (Temperatur 4O⁰C). Die entstandene Suspension wird zentrifugiert, die Lichtabsorption der supematanten Flüssigkeit bei 398nm abgelesen (E,-Wert). Zu 2ml davon werden 0,5ml einer 0,05molaren Barbitursäurelösung zugegeben und die Mischung wird bei 40⁰C 40 Minuten lang inkubiert. Das Gemisch wird dann abgekühlt und die Lichtabsorption bei 398nm gegen eine ohne Membranfraktion hergestellte Blindprobe innerhalb von 10 Minuten abgelesen (E₂-Wert). Der Glukosegehalt (G) wird mit Hilfe der folgenden Formel ausgerechnet:

G = 2,4-0 iU-PJ χ 10 ^d Mol

(F) Glukose/100 rr.g

Protein ι

• ι

wobei (F) die Konzentration des Membranproteins (in mg/ml) ist. Die Konstante enthält den molaren Extinktionskoeffizient des Barbitursäurederivates, den Korrektionsfaktor des bei der sauren Zersetzung stattgefundenen 5-Hydroxymethyl-furfurol-Verlustes und auch die Verdünnung.

b) Die Vorbereitung des Proteins und die Glukosebestimmung wird auf die im Paragraph a) beschriebene Weise durchgeführt, mit dem Unterschied, daß zur Bestimmung des Zuckerdorivates 0,5ml einnr 0,05molaren Thiobarbitursäurelösung verwendet wird. Die Reaktion wird bei 360 bzw. 443 nm verfolgt.

Zur Auswertung der Messung werden in Abhängigkeit von der Wellenlänge die folgenden Formeln verwendet:

G = 1,05

(F) Protein

bzw.

G = I₁SO --^ ±±JZ122 χ 10 ^ Mol Glukose/ICO ng

(F) Protein

Beispiel 3

Bestimmung der Glukosylierung von Plasmaproteinen

Das Plasma wird aus dem Blut getrennt. Der Proteingehalt von Blutplasma wird bestimmt und die Proteinkonzentration auf 10mg/ml eingestellt. Zu 2 ml wird 1 ml 1N Oxalsäurelösung zugegeben und die Mischung bei 112-115⁰C unter Druck 2,5 Stunden lang einer Wärmebehandlung unterworfen. Dem Hydrolysat wird 1 ml einer 0,6molaren wäßrigen Trichloressigsäurelösung tropfenweise zugegeber, die entstandene Suspension wird zentrifugiert und die Lichtabsorption der supematanten Flüssigkeit bei 398ηm abgelesen (Ei-Wert). Zu 2 ml davon wird 0,5ml einer 0,05molaren Barbitursäurelösung zugegeben und das Gemisch bei 4O⁰C 40 Minuten lang inkubiert. Das Gemisch wird abgekühlt und die Lichtabsorption binnen 10 Minuten bei 398 gegen eine ohne Plasmaprotoin hergestellte Blindprobe abgelesen (E₂-WeH).

Der Glukosegehalt (G) wird auf die im Beispiel 1 a) beschriebene Weise ausgerechnet.

Auch bei der Messung von Plasmaproteinen kann zur Bestimmung des abgespalteten Glukosederivates die Thiobarbitursäurereaktion Verwendung finden. In diesem Falle werden zu 2ml der supematanten Flüssigkeit 0,5ml einer 0,05molaren Thiobarbitursäurelösung 7ugegeben. Zur Auswertung werden die Extinktionswerte bei 443 nm abgelesen und die obigen Formeln zur Auswertung verwendet.

Beispiel 4

Bestimmung des Glukosegehaltes von nicht-enzym.viisch glukosyMertem Albumin Das Plasma wird aus Blut durch Zentrifugieren getrennt. Der pH-Wert des Plasmas wird mit einer 2molaren Salzsäurelösung auf 6,9 eingestellt. Der Mischung werden unter Rühren 15% Polyäth·, imglykol in Form einer 50%igen wäßrigen Lösung tropfenweise zugegeben. Die erhaltene Suspension wird 20 Mi luven lang gerührt, zentrifugiert und der pH-Wert der supematanten Lösung wird auf 4,6 eingestellt. Nach Zugabe von 9% festem Polyäthylenglykol innerhalb einer Stunde wird das lemisch weitere 30 Minuten lang gerührt. Der Niederschlag wird durch Zentrifugieten entfernt und in einem Tropfen destillierten Vassers gelöst. Die Lösung wird auf eine, mit Acetatpuffer (pH 5,2) in Aequilibrum gebrachte QAE-Sephadex-Säule (20 χ 1,6cm) aufgebnch» Das Polyäthylenglykol wird durch Waschen entfernt und das Albumin mit einem Acetatpuffer (pH4,8) eluiert. Der Glukosegehalt uer Albuminlösung wird bestimmt und zu 2 ml davon wird 1 ml einer 1N Oxalsäurelösung gegeben. Das Gemisch wird bei 112-115°C unter Druck 2,5 Stunden lang einer Wärmebehandlung unterworfen. Dem Hydrolysat wird 1 ml einer 20%igen

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Sulfosalicylsaurelösung (Temperatur 4O⁰C) zugefügt, die erhaltene Suspension wird zentrifugiert und die Lichtabsorption der supernatanten Flüssigkeit bei 338nm abgelesen (Ε,-Wert). Zu 2n-.i davon wird 0,5ml einer 0,05molaren Barbitursäurelösung zugegeben und die Mischung wird bei 40°C 40 Minuten lang inkubiert. Das Gemisch wird gekühlt und die Lichtabsorption bei 398nm innerhalb von 10 Minuten gegen eine ohne Albumin hergestellte Blindprobe abgelesen (E₂-Wert). Der Glukosegehalt (G) wird gemäß der folgenden Formel ausgerechnet:

- 2 40 2Q98) ' 1Q98) - °:_² _{χ 10}-2

' Glukose/100 mg

Albumin _f

wobei (A) die Albuminkonzentration in mg/ml bedeutet.

Die Konstante enthält den molaren Extinktionskoeffizienten des Barbitursäurederivates, den Korrektionsfaktor des bei der

sauren Zersetzung stattgefundenen 5-Hydroxymethyl-furfurol-Verlustes auch die Verdünnung.

Beispiel 5 Bestimmung der Glukosylierung von Immunoglobulinen Aus gerinnungsgehemmten Blut wird das Plasma abgetrennt. Die Immunoglobuline werden nach Ausfällung mit Rivanol durch Chromatographie an OAE-Sephadex gereinigt. Zu 2 ml einer 5%igen Immunoglobulinlösung wird 1 ml einer Säuremischung zugegeben (1N Oxalsäure + 1 N Essigsäure, oder

1N Oxalsäure + 1N Schwefelsäure). Die Hydrolyse wird bei 100⁰C eine Stunde lang durchgeführt und das Protein durch Zugabevon 1 ml 0,6molarer Sulfosalicylsäure ausgefällt. Der entstandene Niederschlag wird bei 1500 Umdrehungen per Minutezentrifugiert und zu 2 ml der supernatanten Flüssigkeit wird 0,5 ml einer 0,054molaren Rezorcin, 2x10~³molaren CuSO₄ Lösungzugegeben. (Vor Zugabe der Reagenzien wird die Lichtabsorption der supernatanten Flüssigkeit bei 405 nm bestimmt [Ei-Wert]).

Das Reaktionsgemisch wird 15 Minuten lang bei 100⁰C erhitzt. Nach Abkühlen wird die Lichtabsorption bei 405nm wieder

abgelesen (E₂-Wert).

Glukosegehalt (G) = 37,6 (E₂-E,-0,1) Mol/100 Mole Beispiele Bestimmung der Glukosylierung von Hämoglobin Zu 1 ml von mit einer physiologischen Salzlösung gewaschenen Erythrozyten werden 2 ml einer 0,1 %igen Natriumdodecylsulfatlösung zugegeben. Die Konzentration des Hämolysats wird bestimmt (Hb). Zu 2 ml davon wird 1 ml einer

1 N Oxalsäure—10~⁴molaren HgCI₂ Lösung zugefügt und die Mischung wird eine Stunde lang bei 100⁰C erhitzt. Di>s Protein wirdmit 1 ml einer 20%igen Sulfosalicylsäurelösung ausgefällt und durch Zentrifugieren entfernt. Die Lichtabsorption dersupernatanten Flüssigkeit wird bei 442nm bestimmt (Ei). Zu 2 ml davon wird 0,5ml einer 0,05molaren Thiobarbitursäureiösiingzugegeben. Die Mischung wird bei 4O⁰C 40 Minuten lang inkubiert und die Lichtabsorption erneut bestimmt (E₂-Wert).

ρ-Ξ, X 0,8-0,1 ~

χ 10"^ Mol /100 Mole

Hb (Mole/1)

Beispiel 7 Schnellverfahren zur Bestimmung des Glukosegehaltes von nicht-enzymatisch glukosyliertem Hämoglobin bei niedriger Tempbratur Mit Heparin gerinnungsgehemmtes Blut wird mit einer physiologischen Salzlösung so lange gewaschen bis die supernatante Flüssigkeit proteinfrei wird. 1 ml von gewaschenen Erythrozyten v/erden mit 2 rrl ?iner 0,1%igen Natriumdodecylsulfatlösung

zweimal gefroren und auftauen gelassen. Die Konzentration dar entstandener: Här.ioglobinlösung wird bestimmt, zu 2 ml dieser

Lösung werden dann 1 ml 0,3N Schwefelsaure und 0,1 ml 10"⁴M HgCI₂ Lösung zugefügt und das Gemisch wird 30 Minuten lang

bei 40⁰C stehengelassen. Der Proteingehalt der Lösung wird mit 1 ml 0,6molarer Sulfosalicylsäure ausgefällt, und der gebildete

Niederschlag durch lOminutiges Zentrifugieren bei 1500 Umdrehungen per Minute entfernt. Die Lichtabsorp'^n der kLren

supernatanten Flüssigkeit wird bei 443nm bestimmt (E₁-WeH). Zu 2 ml der Lösung wird 0,5 ml einer 0,05molaren

Thiobarbitursäurelösung zugegeben. Die Lösung wird 40 Minuten lang bei 40^JC stehengelassen. Nach Abkühlung wird die Lichtabso. /tion innerhalb von 10 Minuten bei 443 nm erneut bestimmt (Ej-Wert). Glukosegehalt:

E- - 3,xO,8 - 0,06 _o

G = 1,38 · — 10"^ Mol Glukose/100 Mole Hb

Hb (Moie/1)

Beispiel 8 Bestimmung de/Glukosylierung von Hämoglobin Die Erythrozyten wurden nrm physiologischer Salzlösung dreimal gewaschen, dann gab man zu 2 ml des Sedimentes 3,5 ml einer

0,1%igen Natrium-dodecylsulfat-Lösung. Die Hämoglobin-Konzentration wurde bestimmt, und die Hämoglobin-Konzentrationdes Hämolysats (Hb%) wurde durch Verdünnung mi' riiiüertem Wasser auf einen Wert zwischen 9,0 und 11 ,Og/100 mleingestellt.

Danach wurden 1,5ml Schwefelsäure-arsenat-Lösung (0,01 Mol Dinatrium- hydrogen-arsenat in 0,3η Schwefelsäurelösung) zu 3,0ml des 1 !ämolysats gegeben, das Gemisch wurde geschüttelt und eine Stunde auf dem siedenden Wasserbad inkubiert. Danach wurde die Lösung auf 30-4O⁰C gekühlt und 1,5ml 40%ige Trichloressigsäure-Lösung tropfenweise zugegeben, währenddem das Gemisch mit einem Vibrator gerührt wurde. Die Lösung wurde filtriert, und 0,5ml 0,025 M Thiobarbitursäure-Lösung (Lösungsmittel: 0,01 η Natriumhydroxy-Lösung) wurde zu 2,0 ml des Filtrats gegeben. Das Gemisch wurde vermischt, 40 Minuten bei 4O⁰C inkubiert, dann auf 20°C gekühlt. Die Lichtabsorption des Musters (E) wurde binnen 30 Minuten bei 443nm abgelesen. Die Menge des glykolysierten Hämoglobins (HbAJ wurde aus den gemessonen Werten folgenderweiße berechnet:

HbA_Ic<

0,006 χ Hb, %

Claims (12)

1. Verfahren zur Bestimmung des Glukosegehaltes von nicht-enzymatisch glukosylierten Proteinen durch saure Wärmebehandlung, durch Ausbildung von Hydroxymethyl-furfural, Präzipitieren des Eiweißes, dann Farbbildung mit dem Hydroxymethyl-furfural, dadurch gekennzeichnet, daß man die in Zellen eingeschlossenen oder wasserunlöslichen Proteine mit einem ionischen oder nichtionischen Detergens in Lösung bringt, die Glukose unter Druck und unter Anwendung einer mindestens 1N Säure, vorzugsweise in Gegenwart eines Kata'ysators in Form von 5-Hydroxymethyl-furfurol abspaltet, das Reaktionsgemisch deproteinisiert, danach das 5-Hydroxymethykfurfurol mit einer organischen Verbindung, welche damit ein farbiges Produkt bildet, kondensiert und schließlich die Konzentration des erhaltenen Produktes spektrophotometrisch bestimmt.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als Detergens Natriumdodecylsulfatverwendet. (Priorität: I.Oktober 1982.)

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß man die saure Hydrolyse unter einem Druck von 0,12-0,2at. — vorteilhaft 0,15-0,i7at. — mit einer Oxalsäurelösung durchführt.

4. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß man die saure Hydrolyse in Gegenwart eines Katalysators, vorzugsweise Quecksilber(ll)-chlorid, durchführt.

5. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß man die saure Hydrolyse in Gegenwart eines Katalysators, vorzugsweise Dinatrium-hydrogen-arsenat, durchführt.

6. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß man die saure Hydrolyse mit einem Säuregemisch durchführt.

7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-3, dadurch gekennzeichnet, daß man die Deproteinisierung mit Sulfosalicylsäure durchführt.

8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-5, dadurch gekennzeichnet, daß man als mit dem 5-Hydroxymeihyl-furfural ein farbiges Produkt bildende organische Verbindung Barbitursäure verwendet.

9. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß man die spektrophotometrische Bestimmung bei 398 nm durchführt.

10. Reagenssatz zur Bestimmung des Glukosegehaltes von auf nicht anzymatischem Wege glykosylierten Eiweißen, dadurch gekennzeichnet, daß es voneinander getrennt aus 1-3 Gewichtsteilen ionischem oder nichtionischem Detergens, 60-120 Gewichtsteilen hydrolysierendem Agens, 150-250 Gewichtsteilen mit Hydroxymethyl-furfural eine Farbreaktion ergebender Substanz besteht.

11. Reagenssatz nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß es als Detergens Natriumdodecylsulfat, als hydrolysierendes Agens Oxalsäure, als deptroteinierendes Mittel Sulfosalicylsäure und als mit Hydroxymethylfurfural eine Farbreaktion ergebende Substanz Barbitursäure enthält.

12. Reagenssatz zur Durchführung des Verfahrens nach einem der Ansprüche 1-7, dadurch gekennzeichnet, daß es aus 2 Gewichtsteilen Natriumdodecylsulfat, 90 Gewichtsteilen Oxalsäure, 200 Gewichtsteilen Sulfosalicylsäure und 4 Gewichtsteilen Barbitursäure bestcnt.