DD254028C2 - METHOD FOR CONTROLLING AND CONTROLLING MICROBIAL FABRIC CONVERSION PROCESSES - Google Patents
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Abstract
DasVerfahren dient der Kontrolle und Steuerung von aeroben oder anaeroben mikrobiellen Stoffwandlungen und kann für Produkt- und Biomassebildungsprozesse, wie Gewinnung von Gärprodukten oder Backhefe, angewendet werden. Basis der Kontrolle und Steuerung der Prozesse ist die spezifische Leistungsfähigkeit der Mikroorganismen, die eng mit dem Agglutinationsverhalten bei Zugabe agglutinationsauslösender Substanzen korreliert. Erfindungsgemäß wird die aktuelle Geschwindigkeit der Zellagglutination ermittelt, mit einem mikroorganismen- und prozeßspezifischen Optimalwert verglichen und bei Abweichungen wird dieser durch entsprechende prozeßbeeinflussende Maßnahmen korrigiert.The method is used to control and control aerobic or anaerobic microbial metabolism and may be used for product and biomass production processes, such as recovery of fermentation products or baker's yeast. The basis of the control and control of the processes is the specific performance of the microorganisms, which correlates closely with the agglutination behavior with addition of agglutination-inducing substances. According to the present invention, the current rate of cell agglutination is determined, compared with a microorganism and process-specific optimal value and in case of deviations, this is corrected by appropriate measures influencing the process.
Description
Verfahren zur mikrobiellen Stoffwandlung sind in großer Zahl bekannt und sie gewinnen zunehmend an Bedeutung. In ihnen werden höchstmögliche Produktivitäten, Produktkonzentrationen und Substratausbeuten angestrebt. Dafür gibt es eine Vielzahl mikrobiologischer, technischer und technologischer Lösungsvorschläge (z.B. neue Mikroorganismen-Stämme, höhere Biomassekonzentrationen, Verringerung der Produktinhibierung, Optimierung des technischen Systems u.a.). Da diese Mikroorganismen sehr leicht Leistungsschwankungen unterliegen, werden hohe Anforderungen an die Kontrolle und Steuerung derartiger Prozesse gestellt.Microbial conversion processes are known in large numbers and are becoming increasingly important. They aim for the highest possible productivities, product concentrations and substrate yields. There are a variety of microbiological, technical and technological solutions (for example, new microorganism strains, higher biomass concentrations, reduction of product inhibition, optimization of the technical system, etc.). Since these microorganisms are very easily subject to power fluctuations, high demands are placed on the control and control of such processes.
Ein wesentliches Kriterium für die Leistungsfähigkeit des gesamten Systems der Stoffwandlung ist die spezifische Leistungsfähigkeit der eingesetzten Mikroorganismen. Diese ist von einer großen Anzahl von biotischen und abiotischen Faktoren abhängig (pH-Wert, Temperatur, Limitationen, Inrungen u.a.) und die maximale Leistung wird nur unter optimalen Bedingungen erreicht. Darüber hinaus macht es sich aus ökonomischen Gründen erforderlich, die Mikroorganismen so oft und solange wie möglich einzusetzen, da ihre Neuanzucht zusätzliche Kosten verursacht. Mit der Verlängerung der Einsatzdauer nimmt jedoch in mikroorganismen-spezifischen Zeiträumen die Leistungsfähigkeit ab. So ist es erforderlich, ständig die spezifische Leistungsfähigkeit zu bestimmen, um Veränderungen derselben zu erkennen und rechtzeitig regelnd eingreifen zu können. Zum Beispiel wird die spezifische Produktbildungsgeschwindigkeit auf der Grundlage mehrerer Parameter, wie aktuelle Biomassekonzentration, aktuelle Produktkonzentration, Fermentorinhalt, Verweilzeit, Substratströme u. a., berechnet. Für einige dieser Parameter gibt es Meßgeräte. Insgesamt liegen die Werte aber erst nach längerer Zeit vor, und sie haben keinen aktuellen Bezug zum unmittelbaren Prozeßverlauf, so daß bei einem Absinken der spezifischen Leistung keine unmittelbare Prozeßbeeinflussung mehr möglich ist.An essential criterion for the performance of the entire system of the metabolic transformation is the specific performance of the microorganisms used. This is dependent on a large number of biotic and abiotic factors (pH, temperature, limitations, irritations, etc.) and maximum performance is achieved only under optimal conditions. In addition, for economic reasons, it is necessary to use the microorganisms as often and as long as possible since their reinvestment causes additional costs. With the extension of the duration of use but decreases in microorganism-specific periods of performance. So it is necessary to constantly determine the specific performance, in order to recognize changes of the same and to be able to intervene in a timely manner. For example, the specific product formation rate will be based on several parameters such as current biomass concentration, current product concentration, fermentor content, residence time, substrate currents, and the like. a., calculated. For some of these parameters there are gauges. Overall, the values are available only after a long time, and they have no current reference to the immediate course of the process, so that when a decrease in the specific power no direct process influence is possible.
Bekannte Verfahren zur Prozeßkontrolle und -Steuerung dienen meist der Aufrechterhaltung bestimmter Prozeßbedingungen, die vorher als besonders günstig für eine hohe Aktivität der Mikroorganismen ermittelt werden (DE-OS 1080048, DE-OS 1442076, DE-OS 1953430, DE-OS 2217909).Known methods for process control and control usually serve to maintain certain process conditions, which are previously determined to be particularly favorable for high activity of the microorganisms (DE-OS 1080048, DE-OS 1442076, DE-OS 1953430, DE-OS 2217909).
Das Ziel der gegenwärtigen Forschung konzentriert sich auf Führungsgrößen für die Prozeßregelung, die mit wichtigen Kenngrößen wie z. B. der spezifischen Produktbildungsrate korrelieren. So wurde in letzter Zeit bekannt, daß zwischen der Dehydrogenase-Aktivität und der Produktbildungsrate eine enge Korrelation besteht (WP-C 12 N/289970). Mit einem darauf basierenden Meßverfahren kann aber nur die potentielle Produktbildungsrate (z. B. das potentielle Gärvermögen bei der Ethanolproduktion) bestimmt werden.The goal of current research is focused on process control metrics, which incorporate key metrics such as: B. correlate to the specific product formation rate. Thus, it has recently been known that there is a close correlation between the dehydrogenase activity and the product formation rate (WP-C 12 N / 289970). With a measuring method based thereon, however, only the potential product formation rate (eg the potential fermentation capacity in ethanol production) can be determined.
Damit ist zwar eine Aussage über die unter bestimmten Bedingungen erreichbare Leistung der Mikroorganismen möglich, die tatsächlich im Prozeß erreichte spezifische Leistung läßt sich daraus aber nicht direkt ableiten, da diese vo einer Vielzahl weiterer Einflußgrößen abhängt. So ist die Dehydrogenase-Aktivität als Führungsgröße für die Prozeßregelung mit einer Reihe von Unsicherheitsfaktoren behaftet und eine sichere Prozeßführung nur in Einzelfällen gegeben.Although this makes it possible to make a statement about the achievable performance of the microorganisms under certain conditions, the specific power actually achieved in the process can not be derived directly from this, since this depends on a large number of further influencing variables. Thus, the dehydrogenase activity as a reference variable for the process control is subject to a number of uncertainty factors and given a safe process control only in individual cases.
Ziel der Erfindung ist die Kontrolle und Steuerung von mikrobiellen Stoffwandlungsprozessen mittels einer Methode zur schnellen und effektiven Charakterisierung des Prozeßzustandes, um unverzüglich auf Störungen des Prozesses Einfluß nehmen zu können.The aim of the invention is the control and control of microbial material conversion processes by means of a method for the rapid and effective characterization of the process state in order to be able to influence immediately disturbances of the process.
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, eine Kenngröße zu ermitteln, die mit der aktuellen spezifischen Leistungsfähigkeit der Mikroorganismen korreliert und auf deren Basis Einfluß auf den Prozeßverlauf genommen werden kann. Mikrobielle Zellen reagieren mit rezeptorspezifischen Proteinen, wie z. B. Immunseren, natürlichen Antikörpern und Lektinen, wenn auf der Zelloberfläche die entsprechenden Rezeptoren vorhanden sind. Die Reaktion läßt sich durch quantitative Bestimmung der Agglutinationsgeschwindigkeit beschreiben.The invention has for its object to determine a characteristic that correlates with the current specific performance of the microorganisms and can be taken on the basis of influence on the course of the process. Microbial cells react with receptor-specific proteins, such as. As immune sera, natural antibodies and lectins, if on the cell surface, the corresponding receptors are present. The reaction can be described by quantitative determination of the rate of agglutination.
Die spezifische Leistungsfähigkeit vieler industriell genutzter Mikroorganismen ist in einem wesentlichen Umfang abhängig von Transportvorgängen zwischen Zellinnerem und dem umgebenden Medium. Substrateintritt und Produktaustritt, und damit verbunden spezifische Umsatzgeschwindigkeiten sowie das Inhibierungsverhalten, werden stark beeinflußt von der Beschaffenheit der Zelloberfläche.The specific performance of many industrially used microorganisms depends to a significant extent on transport processes between the cell interior and the surrounding medium. Substrate entry and product leakage, and associated specific turnover rates and inhibition behavior, are strongly influenced by the nature of the cell surface.
Es wurde gefunden, daß zwischen der unter standardisierten Bedingungen ermittelter. Aggiutinationsgeschwindigkeit der Mikroorganismen mit den rezeptorspezifischen Proteinen und der spezifischen Leistungsfähigkeit derselben eine enge Korrelation besteht. - .It has been found that between the determined under standardized conditions. Agglutination rate of microorganisms with the receptor-specific proteins and the specific performance of the same is a close correlation. -.
Verändert sich auf Grund von beispielsweise Alterungserscheinungen der Zellen oder anderen Einflüssen, wie suboptimalen Fermentationsparametern (pH-Wert,Temperatur u.a.), Limitationen, Inhibierungen, die spezifische Leistungsfähigkeit der Mikroorganismen, so ändert sich ebenfalls die Agglutinationsgeschwindigkeit.If, for example, aging phenomena of the cells or other influences, such as suboptimal fermentation parameters (pH, temperature, etc.), limitations, inhibitions, change the specific performance of the microorganisms, the rate of agglutination also changes.
Erfindungsgemäß wurde die Aufgabe so gelöst, daß das durch die Reaktion von agglutinationsausiösenden Substanzen mit der Zellwand der eingesetzten Mikroorganismen verursachte Agglutinationsverhalten als direktes Maß für die aktuelle spezifische Leistungsfähigkeit der Mikroorganismen gewählt wird, indem die Geschwindigkeit der Zellagglutination ermittelt und mit einem mikroorganismen- und prozeßspezifischen Optimalwert verglichen wird. Dieser Optimalwert ist ein für den jeweiligen Mikroorganismus und den Prozeß spezifischer Wert, der unter optimalen Bedingungen erreicht wird und der der unter diesen Bedingungen maximal realisierbaren spezifischen Leistungsfähigkeit entspricht.According to the invention, the object has been achieved in that the agglutination behavior caused by the reaction of agglutinin-causing substances with the cell wall of the microorganisms used is selected as a direct measure of the actual specific performance of the microorganisms by determining the rate of cell agglutination and having a microorganism- and process-specific optimal value is compared. This optimum value is a specific value for the particular microorganism and the process, which is achieved under optimum conditions and which corresponds to the maximum achievable specific performance under these conditions.
Als agglutinationsauslösende Substanzen werden Immunseren, natürliche Antikörper oder Lektine eingesetzt. Bei Prozessen zur aeroben Biomassezüchtung oder zur aeroben bzw. aneroben Produktbildung wird eine Verfahrensführung angestrebt, die auf die Konstanz der prozeßspezifischenOptimalwerte gerichtet ist.As agglutination-inducing substances immune sera, natural antibodies or lectins are used. In processes for aerobic biomass breeding or for aerobic or anerobic product formation, a process management is aimed at, which is directed to the constancy of the process-specific optimal values.
In Abhängigkeit von den rezeptorspezifischen Proteinen, die zur Agglutination eingesetzt werden, kann der spezifische Optimalwert ein Maximum oder ein Minimum sein.Depending on the receptor-specific proteins used for agglutination, the specific optimal value may be a maximum or a minimum.
So wird die Agglutinationsgeschwindigkeit von beispielsweise einem Fermentationsprozeß entnommenen Mikroorganismenzellen durch Zugabe einer spezifischen agglutinationsausiösenden Substanz sofort quantitativ bestimmt. Daraus lassen sich aufgrund der engen Korrelation aktuelle Werte für die spezifische Leistungsfähigkeit der Mikroorganismen ableiten.Thus, the agglutination rate of, for example, a fermentation process microorganism cells removed by the addition of a specific agglutination trioxide immediately determined quantitatively. From this, due to the close correlation, current values for the specific performance of the microorganisms can be derived.
Verringert sie sich, so läßt sich dies sofort anhandder Agglutinationsgeschwindigkeit feststellen, und auf der Basis dieses Signals ist es möglich, unverzüglich regulierend auf den Prozeß einzuwirken, indem z. B. die Aktivität der Biomasse durch Regenerierung oder partiellen Austausch wieder auf ihren spezifischen Optimalwert gebracht wird.If it decreases, this can be determined immediately on the basis of the rate of agglutination, and on the basis of this signal it is possible to regulate the process without delay, for example by controlling the process. B. the activity of the biomass is brought by regeneration or partial replacement back to their specific optimal value.
Des weiteren ist auf der Basis der bestimmten Agglutinationsgeschwindigkeit eine Entscheidung darüber möglich, innerhalb welcher Abweichung vom festgelegten Regelwert beispielsweise eine Regenerierung der Biomasse überhaupt noch sinnvoll ist.Furthermore, on the basis of the determined agglutination rate, a decision is possible within which deviation from the specified control value, for example, a regeneration of the biomass is still useful.
Auch für Batch-Prozesse stellt dieses Signal eine wesentliche Führungsgröße dar. So kann hiermit z. B. der Zeitpunkt bestimmtwerden, von dem ab aufgrund der zu geringen spezifischen Leistungsfähigkeit eine Weiterführung nicht mehr effektiv ist. Unnütze Verlängerungen der Fermentationszeiten, die auch zu Ausbeuteverlusten führen, lassen sich damit vermeiden. Die Erfindung soll mit folgenden Beispielen näher erläutert werden.This signal is also a key variable for batch processes. Thus, z. For example, the point in time at which a continuation is no longer effective due to the low specific performance is determined. Unnecessary extensions of the fermentation times, which also lead to losses in yield, can thus be avoided. The invention will be explained in more detail with the following examples.
In einem Rührfermentor mit einem Arbeitsvolumen von 5I wurde ein Backhefestamm der Art Saccharomyces cerevisiae aerob mit Glucose als Kohlenstoff quelle gezüchtet. Die Glucosezufuhr wurde so gesteuert, daß die extrazelluläre Ethanolkonzentration unter 3g/l lag. Das Nährmedium enthält alle notwendigen mineralischen Nährstoffe sowie Vitamine in Form von Hefeextrakt für einen Hefezuwachs von ca. 10g Hefetrockensubstanz (HTS)/1. Die Impfhefekonzentration betrug ca. 1 g HTS/1. Die Fermentationsparameter waren: pH = 4,5T = 33°C, Belüftungsrate = 501/l.h.In a Rührfermentor with a working volume of 5I, a Backhefestamm the species Saccharomyces cerevisiae aerobically bred with glucose as a carbon source. The glucose feed was controlled so that the extracellular ethanol concentration was below 3 g / L. The nutrient medium contains all necessary mineral nutrients as well as vitamins in the form of yeast extract for a yeast increase of approx. 10g yeast dry substance (HTS) / 1. The Impfhefekonzentration was about 1 g HTS / 1. The fermentation parameters were: pH = 4.5T = 33 ° C, aeration rate = 501 / l.h.
Es wurde die Geschwindigkeit der Agglutination der Backhefe im Verlauf der Reaktion ihrer Zellwand mit Linsenlektin innerhalb von 10 Minuten nach der Entnahme aus dem Fermentor bestimmt. In Abb. 1 sind die Ergebnisse graphisch dargestellt, und zwar neben der Agglutinationsgeschwindigkeit 1, die Ethanolkonzentration 2, die Substratkonzentration 3 und die Biomassekonzentration 4 in Abhängigkeit von der Versuchsdauer.The rate of agglutination of the baker's yeast during the reaction of its cell wall with lentil lectin was determined within 10 minutes after removal from the fermentor. In Fig. 1 the results are shown graphically, in addition to the agglutination rate 1, the ethanol concentration 2, the substrate concentration 3 and the biomass concentration 4 as a function of the duration of the experiment.
Die Geschwindigkeit der Agglutination steigt zunächst an, bis die Biomasse 2 eine Konzentration von ca. 10 HTS/I erreicht hat. Ab diesen Zeitpunkt ist eine Abnahme zu verzeichnen, und zwar infolge Auszehrung der Nährlösung und Auftreten von Nährstofflimitation.The rate of agglutination initially increases until the biomass 2 has reached a concentration of about 10 HTS / I. From this point in time, there is a decrease due to nutrient depletion and the occurrence of nutrient limitation.
Der Punkt A kennzeichnet das Minimum in der Agglutinationskurve und den Zeitpunkt von Nährstoffgaben in den Fermentor.Point A indicates the minimum in the agglutination curve and the timing of nutrient additions to the fermentor.
Nach Komplettierung der Nährstoffversorgung und Aufhebung der Limitationsbedingungen nimmt die Geschwindigkeit der Agglutination bis auf einen Maximalwert B wieder zu.After completion of the nutrient supply and abolition of Limitationsbedingungen the speed of agglutination increases up to a maximum value B again.
Es wurde die Triebkraft der Backhefe an den Punkten a und B nach TGL 25111/05 bestimmt. Die Zuordnung der Meßwerte zur jeweiligen Agglutination zeigt die Korrelation zwischen beiden Größen:The driving force of baker's yeast was determined at points a and B according to TGL 25111/05. The assignment of the measured values to the respective agglutination shows the correlation between the two variables:
Tabelle 1: Korrelation zwischen Agglutination und Triebkraft von BackhefeTable 1: Correlation between agglutination and driving force of baker's yeast
Hefe Triebkraft AgglutinationsgeschwindigkeitYeast motive agglutination rate
mlCO2/110min. (ΔΕ/min.)mlCO 2 / 110min. (ΔΕ / min.)
A 51 0,14A 51 0.14
B 87 0,17B 87 0.17
Im oben beschriebenen Rührfermentor wurde jeweils nach entsprechender aeroben Anzucht und unter Verwendung der angezüchteten Backhefe als Gärhefe gemäß Qualität A bzw. B (siehe Beispiel 1) nacheinander zwei diskontinuierliche ethanolische Gärungen durchgeführt.In the Rührfermentor described above, in each case after appropriate aerobic cultivation and using the cultivated baker's yeast as fermentation yeast according to quality A or B (see Example 1) successively two discontinuous ethanolic fermentations carried out.
Vor Beginn der Gärungen werden jeweils die Belüftung unterbunden, die Restluft durch CO2-Begasung aus dem Reaktor verdrängt, portionsweise 135 g Glucose/I sowie Nährstoffe für ein Hefezuwachs von ca. 10 g HTS/I in den Fermentor gegeben. In Tabelle 2 sind die wichtigsten Ergebnisse der beiden Gärprozesse zusammengestellt:Before the start of the fermentation each aeration is suppressed, the residual air displaced by CO 2 gassing from the reactor, added in portions 135 g of glucose / I and nutrients for a yeast increase of about 10 g HTS / I in the fermenter. Table 2 summarizes the most important results of the two fermentation processes:
Tabelle 2: Ergebnisse zweier Gärprozesse mit Hefen unterschiedlicher Start-AgglutinationTable 2: Results of two fermentation processes with yeasts of different start agglutination
Die Ergebnisse beider Beispiele machen den Vorteil der Meßgröße Agglutinationsgeschwindigkeit und ihre Eignung als Prozeßführungsgröße deutlich: Eine hohe Agglutinationsgeschwindigkeit garantiert sowohl eine hohe Triebkraft als auch eine hohe Gäraktivität und kurze Gärdauer während des Gärprozesses. Eine geringe Agglutinationsgeschwindigkeit signalisiert suboptimale aerobe Anzucht- bzw. Gärbedingungen und die Notwendigkeit von Prozeßkorrekturen wie gegebenenfalls einen Hefeaustausch im Gärprozeß.The results of both examples demonstrate the advantage of the measured variable agglutination rate and its suitability as a process variable: A high agglutination rate guarantees a high driving force as well as a high fermentability and short fermentation time during the fermentation process. A low agglutination rate signals sub-optimal aerobic seed conditions and the need for process corrections, such as, if necessary, yeast replacement in the fermentation process.
Im oben beschriebenen Rührfermentor wurde mit einem Gärhefestamm der Art Saccharomyces cerevisiae, seine maximale Agglutinationsgeschwindigkeit von 0,18ЛЕ/тіп (Extinktionsänderung je Minute) eine kontinuierliche Gärung mit Heferückhaltung durchgeführt. Die Bestimmung der Agglutinationsgeschwindigkeit erfolgte analog Beispiel 1.In the above-described Rührfermentor was carried out with a Gärhefestamm the species Saccharomyces cerevisiae, its maximum agglutination of 0.18ЛЕ / тіп (extinction change per minute), a continuous fermentation with Heferückhaltung. The determination of the agglutination rate was carried out analogously to Example 1.
Zur Heferückhaltung war der Fermentor mit einem Membranmodul ausgerüstet, das stetig ein hefefreies, ethanolhaltigesFiltrat lieferte, während eine Saccharoselösung entsprechend einer Verdünnungsrate von D = 0,25 h"1 in den Fermentor dosiert wurde. Die Saccharoselösung enthielt alle erforderlichen Nährstoffe und Vitamine, sowie Saccharose in einer Konzentration von 158g RS/i. Die Hefekonzentration betrug 30g HTS/I und blieb mit Hilfe einer speziellen Regelungstechnik während des Prozesses konstant. Der pH-Wert betrug 4,5 und die Temperatur 33°C.For Heferückhaltung the fermentor was equipped with a membrane module yielded a yeast-free, ethanolhaltigesFiltrat steadily as a sucrose solution corresponding to a dilution rate of D = 0.25 h "1 was metered into the fermentor. The sucrose solution contained all the necessary nutrients and vitamins, and sucrose at a concentration of 158 g RS / i The yeast concentration was 30 g HTS / I and remained constant during the process with the aid of a special control technique, the pH was 4.5 and the temperature 33 ° C.
In Abb. 2 ist der Verlauf der Biomassekonzentration 2 der Agglutinationsgeschwindigkeit 1, der Ethanolkonzentration 3 und der spezifischen Ethanolsyntheserate 4 dargestellt.FIG. 2 shows the course of the biomass concentration 2 of the agglutination rate 1, the ethanol concentration 3 and the specific ethanol synthesis rate 4.
Die Gärparameter konnten über einen Zeitraum von 116h konstant gehalten werden. Zwischen der 116. und 117. h war eine Abnahme der Agglutinationsgeschwindigkeit zu verzeichnen, die zum Anlaß genommen wurde die gesamte Hefemasse im Fermentor zum Zeitpunkt C gegen Frischhefe mit einer Agglutinationsgeschwindigkeit von 0,18ДЕ/тіп auszutauschen.The fermentation parameters could be kept constant over a period of 116h. There was a decrease in the rate of agglutination between days 116 and 117, which was used as an opportunity to exchange all of the yeast in the fermentor at time C for fresh yeast at an agglutination rate of 0.18De / тСп.
Die dem Fermentor entnommene Gärhefe wurde einem Regenerierungsfermentor zugeführt, wo mit Hilfe aerober Bedingungen und einer Nährlösungsdosierung in Abhängigkeit von der Prozeßführungsgröße Agglutination, die Hefe mit dem Ergebnis regeneriert wurde, daß die gemessene Agglutinationsgeschwindigkeit am Ende der Behandlung einen Wert von 0,135ΔΕ/min aufwies. Die Gärhefe konnte mit einer guten Gäraktivität einem weiteren analogen Gärprozeß zugeführt werden.The fermentation yeast taken from the fermentor was fed to a regeneration fermenter where, with the aid of aerobic conditions and nutrient solution dosing, depending on the process variable agglutination, the yeast was regenerated, with the result that the measured agglutination rate at the end of the treatment was 0.135ΔΕ / min. The fermentation yeast could be fed with a good fermentation activity to another analog fermentation process.
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