DD248141A1

DD248141A1 - PROCESS FOR PREPARING PROTEASE-CONTAINING ENZYME CONCENTRATES

Info

Publication number: DD248141A1
Application number: DD26333584A
Authority: DD
Inventors: Joerg-Hermann Ozegowski; Peter-Juergen Mueller; Werner Koehler; Wolfgang Forberg; Harald Bocker; Dieter Gerlach
Original assignee: Adw Ddr
Priority date: 1984-05-24
Filing date: 1984-05-24
Publication date: 1987-07-29

Abstract

Das Verfahren zur Herstellung proteasehaltiger Enzymkonzentrate hat die Aufgabe, aus Kulturfiltraten von Sekundaermetabolitfermentationenvon Streptomyceten als Nebenprodukt proteasehaltige Enzymkonzentrate zu gewinnen. Diese Aufgabe wird erfindungsgemaess dadurch geloest, dass die proteasehaltigen Enzymkonzentrate bei 10%- bis 15%iger Neutralsalzkonzentration unter neutralen p H-Bedingungen und Temperaturen unter 37C an Kieselgel adsorbiert und mechanisch vom Kulturfiltrat abgetrennt werden. Das proteasehaltige Enzymkonzentrat wird anschliessend mit Puffern schwach alkalischer p H-Werte und niedriger Ionenstaerken in Gegenwart von wassermischbaren organischen Loesungsmitteln eluiert, mit Neutralsalz gefaellt und nach bekannten Methoden weiter gereinigt.The process for preparing protease-containing enzyme concentrates has the task of obtaining protease-containing enzyme concentrates as by-product from culture filtrates of secondary metabolite fermentations of streptomycetes. This object is achieved according to the invention in that the protease-containing enzyme concentrates are adsorbed on silica gel at 10% to 15% neutral salt concentration under neutral p H conditions and temperatures below 37C and are separated mechanically from the culture filtrate. The protease-containing enzyme concentrate is then eluted with buffers of weakly alkaline p H values and low ion strengths in the presence of water-miscible organic solvents, precipitated with neutral salt and further purified by known methods.

Description

Field of application of the invention

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von pröteasehaltigen Enzymkonzentraten ausThe invention relates to a process for the preparation of proteolytic enzyme concentrates

Sekündärmetabolitfermentationen. Proteasen finden vielfältige Anwendung in verschiedenen Industriezweigen, beispielsweise der Nahrungsmittelindustrie, insbesondere in der Milchwirtschaft, der fleischverarbeitenden Industrie und bei der .Sekündärmetabolitfermentationen. Proteases find a variety of applications in various industries, such as the food industry, especially in the dairy industry, the meat processing industry and the.

Bäckwarenherstellung. Weiterhin werden Proteasen im breiten Umfang für mikrobiologische und biochemische Untersuchungen eingesetzt. Die Erfindung erweitert das Spektrum der einsetzbaren eiweißabbauenden Enzyme. Bäckwarenherstellung. Furthermore, proteases are widely used for microbiological and biochemical studies. The invention extends the range of usable protein-degrading enzymes.

Characteristic of the known technical solutions

Die bekannten Konzentrierungsmethoden für Proteasen aus Kulturfiltratüberständen von Sekundärmetabolitfermentationen benutzen zumeist die Ultrafiltration (Rassulin,Yu.A., Sokovykh,V.S„ Prikl. Biochim. Mikrobiol. 17,1981,238-240; Ranke et al., Europ. J. Appl. Microbiol. Biotechnol. 11,1981,136-171), die Vakuumeinengung (Belloc, A., J.C. PaIIa, Verrier, Ann. TechnolThe known concentration methods for proteases from culture filtrate supernatants of secondary metabolite fermentations mostly use ultrafiltration (Rassulin, Yu.A., Sokovykh, VS "Prikl. Biochim., Microbiol. 17,1981,238-240; Ranke et al., Europ. J. Appl. Microbiol., Biotechnol., 11, 1881, 136-171), the vacuum concentration (Belloc, A., JC PaIIa, Verrier, Ann. Technol

Agric. 23,1974,205-215) oder die Fällung mit Neutralsalzen oder organischen Lösungsmitteln (Microbiol. Enzymesand Bioeonversions, ed. Rose, Academic press, 1980, S.49-114). Das DD 121 522 beansprucht ein Verfahren zur Konzentrierung und Reinigung von Enzymen aus Streptokokkenkulturfiltratlösungen, das auf einer Adsorption an Magnesiumsilikat beruht. Für die Gewinnung von Proteasekonzentraten aus KuIturfi!traten des Streptomyces hygroscopicus wird in dem Patent US 3875006 die Reinigung einer neutralen Protease beschrieben, wobei die Methode eine Konzentrierung durch Vakuumeinengung und eine Reinigung durch Aceton- und Isopropanolfällung einschließt. Diese herkömmlichen Konzentrierungsverfahren sind sehr energieaufwendig oder wie die Fällungsmethoden technisch nurfür begrenzte Mengen einsetzbar. Darüber hinaus ermöglichen sienicht die gleichzeitige Gewinnung des Antibiotikums. Das in DD 121 522 beanspruchte Adsorptionsverfahren mit Magnesiumsilikat ermöglicht bei Sekundärmetabolitfermentationen nur die Adsorption geringer Proteasemengen. Agric. 23, 19, 2075-215) or the precipitation with neutral salts or organic solvents (Microbiol.Encysand Bioeonversions, ed., Rose, Academic press, 1980, pp. 49-114). DD 121 522 claims a method for concentrating and purifying enzymes from streptococcus culture filtrate solutions based on adsorption on magnesium silicate. For the recovery of protease concentrates from cultures of Streptomyces hygroscopicus, US Pat. No. 3,875,006 describes the purification of a neutral protease, the method including concentration by vacuum concentration and purification by acetone and isopropanol precipitation. These conventional concentration processes are very energy intensive or, as the precipitation methods are technically usable only for limited quantities. In addition, they do not allow the simultaneous production of the antibiotic. The adsorption process with magnesium silicate claimed in DD 121 522 only permits adsorption of small amounts of protease in secondary metabolite fermentations.

Object of the invention

Die Erfindung beinhaltet als Ziel die Herstellung proteasehaltiger Enzymkonzentrate bei hoher Effektivität.The invention includes as target the production of protease-containing enzyme concentrates with high efficiency.

Explanation of the essence of the invention

Der Erfindung iiegt die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zu beschreiben, mit dem auf einfache Weise proteasehaltige Ehzymkonzentrate als Nebenprodukt technischer Sekundärmetabolitfermentationen von Streptomyceten gewonnen werden können.The invention iies the object to describe a method by which protease-containing enzyme concentrates can be obtained as a by-product of technical secondary metabolite fermentations of streptomycetes in a simple manner.

Eswurde in überraschender Weise gefunden, daß aus Ku Itu rf i !traten von Sekundärmetabolitfermentationen von Streptomyceten proteasehaltige Enzyme, die nach den bekannten Verfahren unter sauren wie auch bei neutralen Bedingungen entweder nur in sehr geringen Mengen oder irreversibel an feste Träger gebunden werden, zu 60% bis 80% der im Kulturfiltrat vorhandenen Enzymmenge an Kieselgel adsorbiert werden, wenn Kieselgel mit einem mittleren Porendurchmesser von 5-TDO nm, vorzugsweise ein solches mit einem mittleren Porendurchmesser von 8 nm bis 12 nm im pH-Bereich von pH 7,0 bis pH 8,0 bei Zugabe von Neutralsalz in einer Konzentration von 0,1 kg/L bis 0,15 kg/L zum Kulturfiltrat bei einer Temperatur unter 37 ⁰C zur Adsorption eingesetzt wird. Von dem mechanisch abgetrennten Adsorbat wird das proteasehaltige Enzymkonzentrat mit Puffern sehr niedriger lonenstärke (vorzugsweise Phosphat- oder Hydrogencarbonatpuffer) bei schwach alkalischen pH-Werten eluiert. Das so erhaltene Rohprodukt wird mit Neutralsalz, vorzugsweise Ammoniumsulfat, gefällt und mit an sich bekanntenIt was surprisingly found that from secondary metabolite fermentations of streptomycetes protease-containing enzymes, which are bound either only in very small amounts or irreversibly to solid carriers under acidic as well as neutral conditions, are 60% to 80% of the amount of enzyme present in the culture filtrate are adsorbed on silica gel, if silica gel with an average pore diameter of 5-TDO nm, preferably one with an average pore diameter of 8 nm to 12 nm in the pH range of pH 7.0 to pH 8 , 0 is added with the addition of neutral salt in a concentration of 0.1 kg / L to 0.15 kg / L to the culture filtrate at a temperature below 37 ⁰ C for adsorption. From the mechanically separated adsorbate, the protease-containing enzyme concentrate is eluted with buffers of very low ionic strength (preferably phosphate or bicarbonate buffer) at slightly alkaline pH's. The crude product thus obtained is precipitated with neutral salt, preferably ammonium sulfate, and known per se

Methoden, wie Phosphatfällung, DEAE-Cellulose Extraktion und Molekulargewichtschromatografie, weiter gereinigt.Methods such as phosphate precipitation, DEAE-cellulose extraction and molecular weight chromatography, further purified.

Das Verfahren ist durch folgende Vorteile gekennzeichnet. Es ermöglicht bei hoher Enzymausbeute eine Enzymkonzentrierung, die im Vergleich zur Einengung mit Vakuum und/oder Ultrafiltration einen geringen Aufwand an Energie und Apparaturen erfordert.The method is characterized by the following advantages. It allows for high enzyme yield enzyme concentration, which requires in comparison to the constriction with vacuum and / or ultrafiltration a small amount of energy and equipment.

Das Verfahren beeinträchtigt nicht die Gewinnung des Antibiotikums aus der Sekundärmetabolitfermentation.The method does not interfere with the recovery of the antibiotic from the secondary metabolite fermentation.

embodiments example 1

In 20 Liter einer separierten 120-stündigen Fermentation von Streptomyceshygroskopicus Stamm JA 5999-//R 27-158 in einem Medium, das Sojamehl, Glukose, Stärke und Salze enthält, werden 140g Dinatriumhydrogenphosphat eingerührt und der pH-Wert der Lösung mit 1 N Natronlauge konstant auf pH 7,2 gehalten. Zur Entfernung des dabei ausfallenden Calciumphosphates wird die Kulturfiltratlösung nochmals separiert. Anschließend werden zur Erhöhung der lonenstärke 2,4kg Neutralsalz, vorzugsweise Natriumchlorid, gelöst, wobei der pH-Wert bei 7,2 konstant gehalten wird. Zur Adsorption der Proteasen werden 1,4kg poröses Kieselgel mit einer Porengröße von 8nm bis 12nm zugegeben und eine Stunde gerührt. Danach wird das Kieselgel abzentriefugiert und über einen Filtertrocken gesaugt. Mit drei Litern 0,005 M Phosphatpuffer, pH 7,2, der 300ml Äthanol enthält, wird das proteasehaltige Enzymkonzentrat vom Kieselgel extrahiert. Man erhält etwa 60% bis 75% der proteolytischen Gesamtaktivität. Die drei Liter Rohenzymlösung werden durch Zusatz von 1,5kg Ammoniumsulfat gefällt. Die weitere Reinigung des proteasehaltigen Enzymkonzentrates erfolgt nach den an sich bekannten Methoden der Phosphatfällung, DEAE-Celluloseextraktion und der Molekulargewichtschromatografie.In 20 liters of a separate 120-hour fermentation of Streptomyces hygroscopic strain JA 5999 - // R 27-158 in a medium containing soy flour, glucose, starch and salts, 140 g of disodium hydrogen phosphate are stirred in and the pH of the solution is stirred with 1 N sodium hydroxide solution kept constant at pH 7.2. To remove the precipitated calcium phosphate, the culture filtrate solution is separated again. Then, to increase the ionic strength, 2.4 kg of neutral salt, preferably sodium chloride, are dissolved, the pH being kept constant at 7.2. To adsorb the proteases, 1.4 kg of porous silica gel with a pore size of 8 nm to 12 nm are added and stirred for one hour. Thereafter, the silica gel is centrifuged off and sucked through a filter drier. With three liters of 0.005 M phosphate buffer, pH 7.2, containing 300 ml of ethanol, the protease-containing enzyme concentrate is extracted from the silica gel. About 60% to 75% of the total proteolytic activity is obtained. The three liters of crude enzyme solution are precipitated by the addition of 1.5 kg of ammonium sulfate. The further purification of the protease-containing enzyme concentrate is carried out by the known methods of phosphate precipitation, DEAE cellulose extraction and molecular weight chromatography.

Example 2:

Gemäß Beispiel 1 wird eine Kulturlösung, die nach 140 Stunden Fermentation des Streptomyces noursei Stamm JA 3890b erhalten worden ist, aufgearbeitet. Im proteasehaltigen Enzymkonzentrat werden dabei 60% bis 80% der proteolytischen Gesamtaktivität erhalten.According to Example 1, a culture solution, which has been obtained after 140 hours fermentation of the Streptomyces noursei strain JA 3890b, worked up. The protease-containing enzyme concentrate contains 60% to 80% of the total proteolytic activity.

Example 3:

In diesem Beispiel wird ein spezielles Kulturfiltrat für das angegebene Herstellungsverfahren vorbereitet.In this example, a special culture filtrate is prepared for the specified manufacturing process.

In 20 Liter eines separierten Kulturfiltrates aus 120-200 Stünden alten Streptomycin-Fermentationen mit Streptomyces griseus, die Sojaextraktionsschrot, Glucose und anorganische Salze als Substrate verwendeten, werden 140g Dinatriumhydrogenphosphat eingerührt und danach unter Konstanthaltung des pH-Wertes auf pH 7,2 200g CaCI₂ χ 6H₂O eingerührt. Das ausfallende Calciumphosphat wird separiert. Zur Entfernung von färbenden Substanzen werden in das separierte Filtrat 200g Bentonit (Tonmineral) eingerührt und nach 30 Minuten Rühren der Feststoffanteil durch erneute Separation entfernt. Anschließend werden dem Filtrat zur Erhöhung der lonenstärke 2,4kg NaCI zugesetzttZurjAdsorption der Proteasen werden in die so behandelte Kulturfiltratlösung 1,6-2kg poröses Kieselgel mit einer Porengröße von 8-12 nm eingerührt. Nach 20 Minuten Rühren wird das Kieselgel abzentrifugiert und mit4L0,05M CaCI₂-Lösung pH 6,0 gewaschen. Zur Desorption der Proteasen wird das Kieselgel Adsorbat in 3-4 Liter 0,05 M Glycin-Puffer, pH 9,0, der 0,05M CaCI enthält, eingerührt und der pH-Wert mit Natronlauge auf pH 9,0 korrigiert. Nach 10 Minuten Rühren wird das Kieselgel abzentrifugiert und anschließend trockengesaugt. Die erhaltenen 3-4L Rohenzymlösung werden dann zur Fällung der Proteasen mit 1,5-2kg Ammoniumsulfat versetzt. Es werden etwa 40-50% der mit Ammoniumsulfat fällbaren proteolytischen Aktivität der Kulturfiltratlösung gewonnen. Die weitere Reinigung erfolgt nach einem speziellen Verfahren.In 20 liters of a separated culture filtrate from 120-200 hours old streptomycin fermentations with Streptomyces griseus, the soybean meal, glucose and inorganic salts used as substrates, 140g disodium hydrogen phosphate are stirred and then while maintaining the pH to pH 7.2 200g CaCl ₂ χ 6H ₂ O stirred. The precipitated calcium phosphate is separated. To remove coloring substances, 200 g of bentonite (clay mineral) are stirred into the separated filtrate and, after stirring for 30 minutes, the solids content is removed by renewed separation. Then 2.4 kg NaCl are added to the filtrate to increase the ionic strength. The adsorption of the proteases is stirred into the thus treated culture filtrate solution 1.6-2 kg porous silica gel having a pore size of 8-12 nm. After stirring for 20 minutes, the silica gel is centrifuged off and washed with 4 L 0.05 M CaCl ₂ solution pH 6.0. For desorption of the proteases, the silica gel adsorbate in 3-4 liters 0.05 M glycine buffer, pH 9.0, containing 0.05M CaCl, stirred and the pH adjusted with sodium hydroxide to pH 9.0. After stirring for 10 minutes, the silica gel is centrifuged off and then sucked dry. The resulting 3-4L crude enzyme solution is then added to precipitate the proteases with 1.5-2kg of ammonium sulfate. About 40-50% of the ammonium sulfate-precipitable proteolytic activity of the culture filtrate solution is recovered. Further purification is carried out according to a special procedure.

Example 4:

Gemäß Beispiel 1 wird eine Kulturlösung, die nach beendeter Fermentation des Streptomyces rimousus erhalten wird, aufgearbeitet. Im proteasehaltigen Enzymkonzentrat werden dabei 40 bis 60% der proteolytischen Gesamtaktivität erhalten.According to Example 1, a culture solution, which is obtained after completion of fermentation of Streptomyces rimousus, worked up. The protease-containing enzyme concentrate contains 40 to 60% of the total proteolytic activity.

Claims

Invention claim:

λ) Process for the preparation of proteolytic enzyme concentrates as a byproduct of
Secondary metabolite fermentations with streptomycetes, characterized in that

- After addition of neutral salt in concentrations of 0.1 kg / L to 0.15 kg / L porous silica gel having a mean pore diameter of 5nm to 100nm at pH values in the range of pH 7.0
added to the culture filtrate for adsorption to pH 8.0 and at temperatures below 37 ° C.
becomes,

- Then the adsorbate is mechanically separated from the filtrate and the protease-containing
Enzyme concentrate with buffers of very low ionic strength at low alkaline pH values
is eluted and

- Finally, the resulting crude product precipitated with neutral salt and known per se
Methods further purified.

21 Method according to item 1, characterized in that

- For adsorption porous silica gel with a mean pore diameter of 8nm to 12nm

- for the elution phosphate buffer

- for precipitation ammonium sulfate
is used.