DD239607A1 - METHOD FOR THE CONTINUOUS CULTIVATION OF HEEDS - Google Patents

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DD239607A1 DD27876785A DD27876785A DD239607A1 DD 239607 A1 DD239607 A1 DD 239607A1 DD 27876785 A DD27876785 A DD 27876785A DD 27876785 A DD27876785 A DD 27876785A DD 239607 A1 DD239607 A1 DD 239607A1
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Lidija I Kozlova
Olga I Velikoslavinskaja
Olga I Velikoslaviuskaja
Joachim Bauch
Herbert Gentzsch
Klaus Kammel
Guenter Heidenreich
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Petrolchemisches Kombinat
Wnii Sintesbelok Moskau
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Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Kultivierung von Hefen auf Kohlenwasserstoffen zur Erzeugung von Biomasse. Das Ziel der Erfindung, bei der Kultivierung den Rohstoffverbrauch zu senken, wird erreicht, indem eine Regulierung der Kultivierungsbedingungen durch Beeinflussung der Kohlenstoff- und Energiequelle erfolgt. Die laufende Kohlenwasserstoffkonzentration wird nach den n-Alkanen in den Grenzen von 0,6-2,2%, die Differenz zwischen Anfangs- und laufender Konzentration in den Grenzen von 0,8-1,6% und der Grad der n-Alkanutilisierung in den Grenzen von 40-70% reguliert.The invention relates to a process for the cultivation of yeasts on hydrocarbons for the production of biomass. The aim of the invention to reduce the consumption of raw materials during cultivation is achieved by regulating the culturing conditions by influencing the carbon and energy source. The current hydrocarbon concentration is after the n-alkanes in the limits of 0.6-2.2%, the difference between initial and current concentration in the limits of 0.8-1.6% and the degree of n-alkanutilization in regulated the limits of 40-70%.

Description

Anwendungsgebiet der Erfindung . . -Field of application of the invention. , -

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Kultivierung von Hefen auf Kohlenwasserstoffen zur Erzeugung von Biomasse. Die Erfindung kann in der technischen Mikrobiologie angewendet werden.The invention relates to a process for the cultivation of yeasts on hydrocarbons for the production of biomass. The invention can be applied in technical microbiology.

Charakteristik der bekannten technischen Lösungen ' ι Characteristics of the known technical solutions' ι

Bei der Kultivierung von Hefen auf Kohlenwasserstoffen erhält man Biomasse als Quelle für Eiweiß, Lipide und andere biologisch aktive Stoffe.The cultivation of yeasts on hydrocarbons yields biomass as a source of protein, lipids and other biologically active substances.

Kohlenwasserstoff als Ausgangspunkt besitzt gegenüber einertraditionellen Kohlenstoffquelle die Vorteile, daß die Kultivierung der Hefen nicht unter sterilen Bedingungen durchgeführt werden muß und das Ausgangsprodukt keiner speziellen Vorbehandlung bedarf.·Hydrocarbon as a starting point has the advantages over a traditional carbon source that the cultivation of the yeasts does not have to be carried out under sterile conditions and that the starting product does not require any special pretreatment.

Allerdings ist der Rohstoffbedarf für die Erzeugung von Biomasse sehr hoch.However, the raw material requirements for the production of biomass are very high.

Für die Bildung von 1 kg Eiweißbiomasse werden 1,2 kg und mehr Kohlenwasserstoffe verbraucht. Nach Literaturangaben verringert sich der Rohstoffverbrauch in intensiven Prozessen, in denen die Kohlenstoffquelle vorrangig für die Biomassebildung (Aufbaustoffwechsel) verbraucht wird.For the formation of 1 kg protein biomass 1.2 kg and more hydrocarbons are consumed. According to the literature, the consumption of raw materials is reduced in intensive processes in which the carbon source is consumed primarily for the formation of biomass (build-up metabolism).

(Gololobov, A. P., 1968, Mikrobiologische Industrie, 3. Auflage, S. 14-22) . , '(Gololobov, A.P., 1968, Microbiological Industry, 3rd Edition, pp. 14-22). , '

Gemäß SU-Urheberschein Nr. 507625 ist ein Verfahren zur Kultivierung von Mikroorganismen bekannt, dessen Ziel die Einsparung von Rohstoff ist. In bestimmten Zeitabständen wird dazu der ökonomische Koeffizient, Biomasseausbeute je verbrauchter Kohlenstoffquelle, ermittelt. Je nach der Höhe des ökonomischen Koeffizienten wird die Rohstoffkonzentration im Nährmedium korrigiert. Der Rohstoffnutzungsgrad kann durch diese Maßnahme um 5-10%erhöht werden, das heißt, es könnenAccording to SU copyright No. 507625, there is known a method of cultivating microorganisms, the purpose of which is to save raw material. At certain intervals, the economic coefficient, biomass yield per spent carbon source, is determined. Depending on the level of the economic coefficient, the raw material concentration in the nutrient medium is corrected. The raw material efficiency can be increased by this measure by 5-10%, that is, it can

5-10%Rohstoff eingespartwerden, wasjedoch immer nochzu wenig ist. : 5-10% raw material savings, which is still not enough. :

Es ist weiterhin ein Verfahren nach SU-Patent Nr.426373 bekannt, bei dem zur Kultivierung von Mikroorganismen die Kohlenstoffquelle in Abhängigkeit vom Verbrauch der Stickstoffquelle dosiert wird, die zum Alkalisieren des KulturmediumsThere is also known a method according to SU Patent No. 426373, in which, for the cultivation of microorganisms, the carbon source is metered as a function of the consumption of the nitrogen source used to alkalinize the culture medium

dient. ιserves. ι

Ein Rohstoffmehrverbrauch kann mit diesem Verfahren nicht vermieden werden, da der in Form von Ammoniumhydroxid zugeführte Stickstoff zum Alkalisieren des Kulturmediums für die Biomassebildung und für die Neutralisation der sauren Stoffwechselprodukte verbraucht wird, die durch Mikroorganismen in das Kulturmedium eingebracht werden. Bei Verschlechterung der Kultivierungsbedingungen wächst die Konzentration der sauren Stoffwechselprodukte sowie derA Mehrmehrverbrauchverbrauch can not be avoided with this method, since the supplied in the form of ammonium hydroxide nitrogen is consumed for alkalizing the culture medium for biomass formation and for the neutralization of the acidic metabolic products, which are introduced by microorganisms in the culture medium. As the culturing conditions worsen, the concentration of acidic metabolites increases, as does the

Verbrauch an Ammpniumhydroxid und in der Folge davon auch der Verbrauch an Kohlenstoffquelle. .Consumption of ammonium hydroxide and consequently the consumption of carbon source. ,

Nach SU-Urheberschein Nr.438386 ist ein Verfahren zur Kultivierung von Mikroorganismen bekannt, bei dem die Rohstoff- und Nährmediumzufuhr in Abhängigkeit vom Grad der Nichtübereinstimmung zwischen den optimalen und laufenden Konzentrationswerten des Rohstoffes im Kulturmedium durchgeführt wird. Dazu wird die laufende Rohstoffkonzentration periodisch ermittelt und in Kenntnis der optimalen Konzentration die Rohstoffzufuhr so reguliert, daß die beiden Konzentrationswerte nahezu identisch sind.According to SU Patent No. 4,338,386 a process for the cultivation of microorganisms is known in which the supply of raw material and nutrient medium is carried out as a function of the degree of mismatch between the optimum and current concentration values of the raw material in the culture medium. For this purpose, the current raw material concentration is determined periodically and, knowing the optimum concentration, the raw material supply is regulated so that the two concentration values are almost identical.

Das Verfahren gestattet zwar eine Erhöhung der Biomasseausbeute, jedoch nicht eine Verringerung des Rohstoffverbrauches.Although the method allows an increase in the biomass yield, but not a reduction in the consumption of raw materials.

Gemäß FR-Patent Nr. 1554423 ist ein Verfahren zur kontinuierlichen Kultivierung von Hefen auf einem Kohlenwasserstoffgemisch bekannt, das nicht weniger als 90% n-Alkane enthält. Zur Erhöhung des Grades der Alkanutilisierung und der Biomasseausbeute wird die Rohstoffkonzentration im Kulturmedium in einer Höhe von mindestens 0,5g/l reguliert.According to FR Patent No. 1554423, a process for the continuous cultivation of yeasts on a hydrocarbon mixture containing not less than 90% of n-alkanes is known. To increase the degree of alkanutilization and the biomass yield, the raw material concentration in the culture medium is regulated at a level of at least 0.5 g / l.

Mit dem Verfahren wird eine Alkanutilisierung aus dem Kohlenwasserstoffgemisch von 90-95% und eine Biomasseausbeute von 80-90% mit den in den Prozeß eingebrachten n-Alkanen erreicht. Bei dem Verfahren besteht der Nachteil, daß der spezifische Rohstoffverbrauch sehr hoch ist, mindestens 1,1-1,2kg auf 1 kg Biomasse.The process achieves an alkanutilization from the hydrocarbon mixture of 90-95% and a biomass yield of 80-90% with the n-alkanes introduced into the process. In the process, there is the disadvantage that the specific consumption of raw materials is very high, at least 1.1-1.2 kg per 1 kg of biomass.

Ziel der Erfindung · - The aim of the invention · -

Das Ziel der Erfindung ist es, bei der Kultivierung von Hefen den Rohstoffverbrauch zu senken.The aim of the invention is to reduce the consumption of raw materials in the cultivation of yeasts.

Darlegung des Wesens der ErfindungExplanation of the essence of the invention

Die technische Aufgabe, die der Erfindung zugrunde liegt, besteht darin, eine Regulierung der Kultivierungsbedingungen durch Beeinflussung der Kohlenstoff- und Energiequelle vorzunehmen, um den spezifischen Rohstoffverbrauch zu senken. Die technische Aufgabe der Erfindung wird durch Regulierung der laufenden Kohlenwasserstoffkonzentration nach den n-Alkanen im Kulturmedium in den Grenzen von 0,6-2,2%, der Differenz zwischen Anfangs- und laufender Konzentration der n-Alkane in den Grenzen 0,8-1,6% sowie des Grades der n-Alkanutilisierung in den Grenzen von 40-70% gelöst.The technical problem underlying the invention is to regulate the culturing conditions by influencing the carbon and energy source in order to reduce the specific consumption of raw materials. The technical object of the invention is achieved by regulating the current hydrocarbon concentration according to the n-alkanes in the culture medium within the limits of 0.6-2.2%, the difference between the initial and the current concentration of n-alkanes in the limits of 0.8-2.2%. 1.6% and the degree of n-alkanutilization within the limits of 40-70%.

Hefen der Gattung Candida, Torulopsis, Endomyces Hansenula und andere werden nach einem kontinuierlichen Verfahren unter Belüftung auf einem Kohlenwasserstoffgemisch utilisiert, das 5-95% n-Alkane enthält. Das wäßrige Nährmedium enthält Stickstoff-, Phosphor-, Kalium- und Magnesiumverbindungen sowie die Spurenelemente Eisen, Zink, Mangan und Kupfer.Yeasts of the genus Candida, Torulopsis, Endomyces Hansenula and others are utilized in a continuous process with aeration on a hydrocarbon mixture containing 5-95% n-alkanes. The aqueous nutrient medium contains nitrogen, phosphorus, potassium and magnesium compounds as well as the trace elements iron, zinc, manganese and copper.

Die Kultivierung der Hefen erfolgt in Rührfermentoren unter folgenden Prozeßparametern:The cultivation of the yeasts takes place in stirred fermentors under the following process parameters:

Temperatur des Mediums: 29-42 0CTemperature of the medium: 29-42 0 C

pH-Wert des Mediums: 3,0-5,5pH of the medium: 3.0-5.5

Intensität der Belüftung: 80-120 Nm3rrV1 Intensity of ventilation: 80-120 Nm 3 rrV 1

Durchflußrate des Mediums: 0,15-0,35rT1 Flow rate of the medium: 0.15-0.35rT 1

Der Grad der n-Alkanutilisierung wird nach der FormelThe degree of n-alkanutilization is calculated according to the formula

• . s . . '•. s. , '

bestimmt. Dabei bedeutencertainly. Mean

π = Grad der n-Alkanutilisierung ,π = degree of n-alkanutilization,

S0 = Anfangskonzentration der Kohlenwasserstoffe S = laufende n-Alkankonzentration Die Anfangskonzentration S0 wird so geregelt, daß die Differenz S0-S in den Grenzen 0,8-1,6% liegt und der Grad der n-Alkanutilisierung in den Grenzen 40-70%. Unter diesen Bedingungen beträgt der spezifische Paraffinverbrauch 0,6-0,8 kg/kg Hefetrockensubstanz, das bedeutet, daß er 1,5-bis 2mal niedriger als bei bekannten Verfahren ist.S 0 = initial concentration of hydrocarbons S = current n-alkane concentration The initial concentration S 0 is controlled so that the difference S 0 -S in the limits of 0.8-1.6% and the degree of n-alkanutilization in the limits 40th -70%. Under these conditions, the specific paraffin consumption is 0.6-0.8 kg / kg of yeast dry matter, which means that it is 1.5 to 2 times lower than in known methods.

Aysführungsbeispiele : "Sample Execution Examples: "

Das Verfahren wird an 6 Beispielen näher erläutert.The process is explained in more detail by 6 examples.

Beispiel 1example 1

Hefen der Gattung Candida guilliermondii wurden in einem Fermentor mit einer Betriebsfüllung von 20kg unter Rühren und Belüften auf einem Kohlenwasserstoffgemisch kultiviert, das 12% n-Alkane enthielt.Yeasts of the genus Candida guilliermondii were cultured in a fermentor with a working load of 20 kg with stirring and aerating on a hydrocarbon mixture containing 12% n-alkanes.

Das Nährmedium hatte folgende Zusammensetzung in %: *The nutrient medium had the following composition in%: *

Kohlenwasserstoffgemisch in Umrechnung aufHydrocarbon mixture converted to

n-Alkane 3,6 (S0)n-alkanes 3,6 (S 0 )

Ammoniumhydroxid (25%) 1,7Ammonium hydroxide (25%) 1.7

Phosphorsäure (70%) 0,22Phosphoric acid (70%) 0.22

Magnesiumsulfat 0,07Magnesium sulfate 0.07

Eisenchlorid 0,0022Iron chloride 0.0022

Zinksulfat 0,002Zinc sulfate 0.002

Mangansulfat 0,008Manganese sulfate 0.008

Kupfersulfat 0,0014Copper sulfate 0.0014

Wasser bis 100 kgWater up to 100 kg

Ammoniumhydroxid wurde gleichzeitig zum Alkalisieren des Mediums eingesetzt.Ammonium hydroxide was used simultaneously to alkalinize the medium.

Der Kultivierungsprozeß wurde mit folgenden Parametern geführt:The cultivation process was conducted with the following parameters:

pH-Wert 4,0-4,2pH 4.0-4.2

Medientemperatur 32-34 0CMedia temperature 32-34 0 C

Intensität der Belüftung lOONI-rT^kg"1 Intensity of ventilation lOONI-rT ^ kg " 1

Durchflußrate 0,2 h"1-Flow rate 0.2 h " 1 -

Die laufende n-Alkankonzentration im Kulturmedium betrügThe current n-alkane concentration in the culture medium was cheating

S - 2,15 % So - S · 396 - 2,Ί5 « 1s45 %S - 2,15 % So - S · 3 9 6 - 2, Ί5 «1s45%

^» ^x^; # 100 β 40,5 % ^ »^ X ^; # 100 β 40.5 %

Die Produktivität des Prozesses betrug 5kg h~'-t"1 Biomasse und der spezifische n-Alkanverbrauch 0,58kg/kg Hefetrockensubstanz.The productivity of the process was 5kg h ~ '-t " 1 biomass and the specific n-alkane consumption 0.58kg / kg yeast dry matter.

Seispiel 2 ' aExample 2 'a

Hefen der Gattung Candida guilliermondii wurden in einem Fermentor mit einer Betriebsfüllung von 751 unter Rühren und Belüften auf einem Kohlenwasserstoffgemisch, das 21% n-Alkane enthielt, kultiviert.Yeasts of the genus Candida guilliermondii were cultured in a fermentor with a feedstock of 751 with stirring and aeration on a hydrocarbon mixture containing 21% n-alkanes.

Das Nährmedium hatte folgende Zusammensetzung in %:The nutrient medium had the following composition in%:

Kohlenwasserstoffgemisch umgerechnet aufHydrocarbon mixture converted to

n-Alkane 2,6 <SO)n-alkanes 2,6 <S O )

Ammoniumhydroxid (25%) 1,21Ammonium hydroxide (25%) 1.21

Phosphorsäure (74%) 0,15Phosphoric acid (74%) 0.15

Kaliumchlorid 0,096Potassium chloride 0.096

Magnesiumsulfat 0,056Magnesium sulfate 0.056

Eisensulfat , 0,0035Iron sulfate, 0.0035

Zinksulfat 0,0062Zinc sulfate 0.0062

Mangansulfat 0,0014Manganese sulfate 0.0014

Wasser bis 100 kgWater up to 100 kg

Der Kultivierungsprozeß wurde mit folgenden Parametern geführt:The cultivation process was conducted with the following parameters:

pH-Wert · 4,0-4,2 'pH value 4.0-4.2 '

Medientemperatur 32-34°CMedia temperature 32-34 ° C

Intensität der Belüftung 87Nm3-t~1-h~1 Intensity of aeration 87Nm 3 -t ~ 1 -h ~ 1

Durchflußrate 0,2h"1 Flow rate 0.2h " 1

Die laufende n-Alkankonzentration im Kulturmedium betrugThe current n-alkane concentration in the culture medium was

So - S « 296 - 1,05 - 1*55 % So - S «2 9 6 - 1.05 - 1 * 55 %

.100 β 60 ,%. .100 β 60 ,%.

Die Produktivität des Prozesses betrug 4,0kg-t~1-h~1 Biomasse und der spezifische Paraffinverbrauch 0,78kg/kg Hefetrockensubstanz. ; The productivity of the process was 4.0kg-t ~ 1 -h ~ 1 biomass and the specific paraffin consumption was 0.78kg / kg yeast dry matter. ;

Beispielsexample

Hefen der Gattung Candida guilliermondii wurden analog zu Beispiel 2 kultiviert.Yeasts of the genus Candida guilliermondii were cultured analogously to Example 2.

Der Unterschied bestand darin, daß die Konzentration des Kohlenwasserstoffgemisches im Nährmedium berechnet auf n-Alkane S0 = 2,1 % betrug.The difference was that the concentration of the hydrocarbon mixture in the nutrient medium calculated on n-alkanes S 0 = 2.1%.

Dabei waren ^__— ,There were ^ __-,

S « Ο,63 % So - S .- 1947V%S «Ο, 63 % So - S .- 1 9 47 V %

m loo β 70 % m loo β 70 %

Die Produktivität des Prozesses betrug 4,0kg-t~1-h~1 Biomasse und der spezifische Paraffinverbrauch 0,73kg/kg Hefetrockensubstanz. . -.The productivity of the process was 4.0kg-t ~ 1 -h ~ 1 biomass and the specific paraffin consumption was 0.73kg / kg yeast dry matter. , -.

Beispiel 4Example 4

Hefen der Gattung Candida Salmonicola wurden analog Beispiel 1 kultiviert.Yeasts of the genus Candida Salmonicola were cultured analogously to Example 1.

Der Unterschied bestand darin, daß für die Kultivierung ein Kohlenwasserstoffgemisch verwendet würde, das 42% n-AlkaneThe difference was that a hydrocarbon mixture containing 42% n-alkanes was used for the cultivation

enthielt. »contained. »

Weitere Prozeßparameter waren:Further process parameters were:

Anfangskonzentratiori S0 = 2,6%Initial concentration S 0 = 2.6%

pH-Wert 3,8-4,0pH 3.8-4.0

MedientempWatur 34-36°C 'Media Temp 34-36 ° C '

Intensität der Belüftung 1-20Nlkg"1-h"1. .'Intensity of ventilation 1-20Nlkg " 1 -h" 1 . . '

Durchflußrate 0,25 h~1 Flow rate 0.25 h ~ 1

Dabeiwaren: ----—" ~-— These were: ----- "~ -

So - S .1,3 % . " ; .. . . .· ' ;So - S .1,3%.   "; ... ..."

^ m |a| β 100 β 50 % ^ m | a | β 100 β 50 %

Die Produktivität des Prozesses betrug ökgt"1^"1 Biomasse und der spezifische Paraffinverbrauch 0,65 kg/kg Hefetrockensubstanz. 'The productivity of the process was " 1 ^" 1 biomass and the specific paraffin consumption 0.65 kg / kg yeast dry matter. '

Beispiel 5Example 5

Hefen Torulopsis utilis wurden analog zu Beispiel 1 kultiviert. ,Yeasts Torulopsis utilis were cultured analogously to Example 1. .

Der Unterschied bestand darin, daß die n-Alkankonzentration irh Nährmedium S0 = 4,5% betrug und die DurchflußrateThe difference was that the n-alkane concentration in nutrient medium S 0 = 4.5% and the flow rate

0,25h"1. ,0.25h " 1. ,

Dabeiwaren:Here goods:

So - S 405 - 2*8 1ST $So - S 4 0 5 - 2 * 8 1 S T $

. 100 38 % , 100 38 %

Die Produktivität des Prozesses betrug 3,3kgt '-h 1 Biomasse und der spezifische Paraffinverbrauch 1,29kg/kg Hefetrockensubstanz.The productivity of the process was 3,3kgt '-h 1 biomass and the specific paraffin consumption 1,29kg / kg yeast dry matter.

Beispiel 6 .Example 6.

Hefen der Gattung Candida guilliermondii wurden analog zu Beispiel 2 kultiviert. Der Unterschied bestand darin, daß die Durchflußrate des Mediums 0,17 h~1 betrug. Dabeiwaren: _j -——___^Yeasts of the genus Candida guilliermondii were cultured analogously to Example 2. The difference was that the flow rate of the medium was 0.17 h -1 . The goods were: _j ---___ ^

" " S.« O955 %:-, . T^- . . So - S 2?6..« 0955 2»05 % "" S. «O 9 55 %: -,. T ^ -. , So - S 2 ? 6 .. «0 9 55 2» 05 %

iU^ . 100 «<s 79 iU ^. 100 "<s 79

Die Produktivität des Prozesses betrug 2,2kg-t~1-h"1 Biomasse und der spezifische Paraffinverbrauch 1,59kg/kg Hefetrockensubstanz.The productivity of the process was 2.2kg-t ~ 1- h " 1 biomass and the specific paraffin consumption 1.59kg / kg yeast dry matter.

Auf diese Art und Weise beträgt bei der Regulierung der laufenden n-Alkankonzentration im Kulturmedium (S) in den Grenzen von 0,6-2,2%, der Differenz der Anfangs- und der laufenden n-Alkankonzentration (S0-S) in den Grenzen von 0,8-1,6% und des Grades der n-Alkanutilisierung in den Grenzen von 40-70% der spezifische n-Alkanverbrauch 0,6-0,8 kg/kg Hefetrockensubstanz; d. h., der n-Alkanyerbrauch liegt um 1,5- bis 2mal niedriger als bei bekannten Verfahren.In this way, in the regulation of the current n-alkane concentration in the culture medium (S) in the limits of 0.6-2.2%, the difference of the initial and the current n-alkane concentration (S 0 -S) in the limits of 0.8-1.6% and the degree of n-alkanutilization in the limits of 40-70% of the specific n-alkane consumption 0.6-0.8 kg / kg yeast dry matter; ie, the n-alkane consumption is 1.5 to 2 times lower than in known processes.

Claims (1)

. ν ; :. ' · . ., . .. . . .-1- 239 607  , ν; :. '·. .,. ... , 1-1 239 607 Erfindungsanspruch:Invention claim: Verfahren zur kontinuierlichen Kultivierung von Hefen unter aeroben Bedingungen bei Anwesenheit der notwendigen Nährstoffquellen auf einem Kohlenwasserstoffgemisch, das n-Alkane enthält, gekennzeichnet dadurch, daß die laufende Kohlenwasserstoffkonzentration in den Grenzen von 0,6-2,2% nach den n-Alkanen, die Differenz zwischen Anfangs- und laufender Konzentration in den Grenzen von 0,8-1,6% und der Grad der n-Alkanutilisierung aus dem Kohlenwasserstoffgemisch in den Grenzen von 40—70% reguliert wird. , ' .A process for the continuous cultivation of yeasts under aerobic conditions in the presence of the necessary nutrient sources on a hydrocarbon mixture containing n-alkanes, characterized in that the current hydrocarbon concentration in the limits of 0.6-2.2% after the n-alkanes, the Difference between initial and current concentration in the limits of 0.8-1.6% and the degree of n-alkanutilization from the hydrocarbon mixture is regulated in the limits of 40-70%. , '.
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