DD235418A1 - METHOD FOR OBTAINING CANCER-INHIBITING MISTELEXTRACTS WITH DEFINED LACTINE CONTENT - Google Patents

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DD235418A1
DD235418A1 DD27424385A DD27424385A DD235418A1 DD 235418 A1 DD235418 A1 DD 235418A1 DD 27424385 A DD27424385 A DD 27424385A DD 27424385 A DD27424385 A DD 27424385A DD 235418 A1 DD235418 A1 DD 235418A1
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mistletoe
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extracts
cancer
molecular weight
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DD27424385A
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Inventor
Peter Ziska
Hartmut Franz
Karola Pfueller
Sonja Zschoche
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Staatl Inst Fuer Immunpraepara
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Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Gewinnung von krebshemmenden Mistelextrakten mit definiertem Lektingehalt. Das Ziel der Erfindung besteht darin, ein universell anwendbares Verfahren zu entwickeln, um Mistelextrakte mit definiertem Lektingehalt zu gewinnen. Erfindungsgemaess werden Misteln mit destilliertem Wasser extrahiert und der Rohextrakt wird mittels fraktionierender Ultrafiltration von Substanzen mit Molekuelmassen groesser als 10 000 und gegebenenfalls kleiner als 5 000 befreit, danach gegebenenfalls mit weiterem Rohextrakt in solcher Menge versetzt, dass eine optimale krebshemmende Wirkung erreicht wird und anschliessend lyophilisiert. Die Erfindung ist in der pharmazeutischen Industrie und in der medizinischen Forschung anwendbar.The invention relates to a method for obtaining carcinoid mistletoe extracts having a defined lectin content. The object of the invention is to develop a universally applicable method to obtain mistletoe extracts with a defined lectin content. According to the invention, mistletoes are extracted with distilled water and the crude extract is freed by fractional ultrafiltration of substances having molecular masses greater than 10,000 and optionally less than 5,000, then optionally added with further crude extract in such an amount that an optimal anti-cancer effect is achieved and then lyophilized , The invention is applicable in the pharmaceutical industry and in medical research.

Description

Anwendungsgebietfield of use

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Gewinnung von Mistelextrakten mit krebshemmender Wirkung, gekennzeichnet dadurch, daß der Gehalt an Lektinen definiert ist. Das Verfahren ist in der pharmazeutischen Industrie und in der medizinischen Forschung anwendbar, vorzugsweise bei der Gewinnung von Mistelextrakten, die für die Krebstherapie Anwendung finden.The invention relates to a method for obtaining mistletoe extracts with anti-cancer activity, characterized in that the content of lectins is defined. The method is useful in the pharmaceutical and medical research, preferably in the extraction of mistletoe extracts used in cancer therapy.

Charakterisierung der bekannten technischen LösungenCharacterization of the known technical solutions

Die bisher bekannten Verfahren zur Gewinnung von Mistelextrakten mit krebshemmender Wirkung basieren auf der Kenntnis, daß wäßrige Extrakte von Mistelpflanzen (lsorelR, Helixor”) oder Mistelpreßsäfte (Iscador”) krebshemmende Substanzen enthalten. Dazu gehören auch mindestens 3 verschiedene Lektine, deren Anteil in den Präparaten erheblichen Schwankungen unterliegen (P.Ziska, H. Franz, Lectine, Biology, Biochemistry, Chlinical Biochemistry 4 [19851). In höheren Konzentrationen können diese Lektine toxische, den Patienten schädigende Einflüsse haben.The hitherto known methods for obtaining mistletoe extracts with a cancer-inhibiting action are based on the knowledge that aqueous extracts of mistletoe plants (Isorel®, Helixor®) or mistletoe juice (Iscador®) contain anti-cancer substances. This also includes at least 3 different lectins whose proportion in the preparations are subject to considerable fluctuations (P.Ziska, H. Franz, Lectins, Biology, Biochemistry, Chlinical Biochemistry 4 [19851]. At higher concentrations, these lectins may have toxic, patient-damaging effects.

Ziel der ErfindungObject of the invention

Das Ziel der Erfindung besteht darin, ein universell anwendbares Verfahren zu entwickeln, um Mistelextrakte mit definiertem, hinsichtlich der krebshemmenden Wirkung optimierten Lektingehalt zu gewinnen.The object of the invention is to develop a universally applicable method to obtain mistletoe extracts with defined, optimized with regard to the anti-cancer effect lectin content.

Darlegung des Wesens der ErfindungExplanation of the essence of the invention

Erfindungsgemäß werden zunächst Rohextrakte gewonnen, von denen ein Teil (ca. 80-95%) anschließend durch fraktionierende Ultrafiltration nahezu lektinfrei gemacht wird. Als Material werden vorzugsweise Misteln von Süßahom oder Birke eingesetzt. Das Verfahren läßt sich auch mit Misteln von allen anderen Wirtpflanzen realisieren. Als Filter für die Ultrafiltration werden Materialien verwendet, die Substanzen mit Molekülmassen größer als 10000 nahezu ausschließen und Substanzen mit kleineren Molekülmassen passieren lassen. Getrocknete Misteln werden zerkleinert, pulverisiert und mit destilliertem Wasser unter rühren extrahiert. Der ungelöste Anteil wird durch Zentrifugation abgetrennt. Der klare Überstand (Rohextrakt) wird in eine Ultrafiltrationszelle gegeben, die mit einem Filter versehen ist, das Substanzen mit einer Molekülmasse größer als 10000 weitgehend zurückhält. Die Lösung wird unter Druck filtriert. Für besondere Zwecke ist eine anschließende Filtration mit einem Filter, das Substanzen mit einer Molekülmasse kleiner als 5000 passieren läßt, angebracht. Diese anschließende Filtration ist in den Fällen angebracht, in denen die Anwesenheit toxischer niedermolekularer Substanzen festgestellt wird. Es wird dann zum Konzentrat Rohextrakt in solcher Menge zugegeben, daß hinsichtlich der krebshemmenden Wirkung eine optimale Aktivität gewährleistet ist. Diese krebshemmende Aktivität wird durch Tierversuche bestimmt.According to the invention, crude extracts are first obtained, of which a part (about 80-95%) is subsequently made virtually free of lectin by fractional ultrafiltration. The material used is preferably mistletoes of sweetahom or birch. The method can also be implemented with mistletoe from all other host plants. As ultrafiltration filters, materials are used which almost exclude substances with molecular weights greater than 10,000 and pass substances of smaller molecular mass. Dried mistletoes are crushed, pulverized and extracted with distilled water while stirring. The undissolved portion is separated by centrifugation. The clear supernatant (crude extract) is placed in an ultrafiltration cell equipped with a filter which largely retains substances with a molecular weight greater than 10,000. The solution is filtered under pressure. For special purposes, a subsequent filtration with a filter that allows substances with a molecular weight less than 5000 pass, appropriate. This subsequent filtration is appropriate in cases where the presence of toxic low molecular weight substances is detected. It is then added to the concentrate crude extract in such an amount that with regard to the anticancer effect optimal activity is ensured. This anti-cancer activity is determined by animal experiments.

Ausführungsbeispiel 100g getrocknete und gepulverte Mistel werden mit 500ml destilliertem Wasser 2 Stunden unter Rühren extrahiert. Anschließend wird die Suspension für 16 Stunden bei 4°C aufbewahrt. Der ungelöste Anteil wird durch Zentrifugation abgetrennt und der klare Überstand von 350ml wird in eine Ultrafiltrationszelle gegeben, die mit einem Filter versehen ist, das Substanzen mit einer Molekülmasse größer als 10000 zurückhält. Die Druckfiltration wird unter Stickstoff bei 2 Atmosphären Überdruck durchgeführt. Das Filtrat von 330 ml wird unter Verwendung eines Filters, das Substanzen mit einer Molekülmasse kleiner als 5000 passieren läßt, auf 30 ml eingeengt. Das Konzentrat wird dann mit destilliertem Wasser auf 330 ml verdünnt und erneutauf 30 ml eingeengt. Dieser Vorgang des Einengens und Verdünnens wird dreimal wiederholt. Das Konzentrat wird dann lyophilisiert. Aus 100g Pflanzenmaterial werden nach diesem Verfahren 12—15g krebshemmendes Material gewonnen. Die Bestimmung der krebshemmenden Aktivität erfolgt an Mäusen unter Verwendung von Ehrlich Ascites-Tumorzellen. 2 x 107 Zellen pro ml werden mit 20,30 und 40mg Lyophilisat pro ml für 1 Stunde bei 37°C inkubiert. Danach werden die Zellen durch Zentrifugation abgetrennt und zweimal mit isotonischer Salzlösung gewaschen. Je 1 x 107 Zellen pro 0,5 ml isotonischer Salzlösung werden weiblichen ICR-Mäusen mit einem Gewicht von 24 ± 0,5g intraperitoneal appliziert. Als Kontrolle werden Mäusen unbehandelte Zellen intraperitoneal appliziert. Jede Versuchsreihe wird mit 10 Tieren angesetzt. Nach 4 Tagen bildet sich äußerlich sichtbar in den Kontrolitieren Ascites. Die behandelten Tiere sind hach 90 Tagen noch ohne Befund.EXAMPLES 100 g of dried and powdered mistletoe are extracted with 500 ml of distilled water for 2 hours with stirring. The suspension is then stored at 4 ° C. for 16 hours. The undissolved portion is separated by centrifugation and the clear supernatant of 350 ml is placed in an ultrafiltration cell equipped with a filter which retains substances with a molecular weight greater than 10,000. The pressure filtration is carried out under nitrogen at 2 atmospheres overpressure. The filtrate of 330 ml is concentrated to 30 ml using a filter which allows substances with a molecular weight less than 5,000 to pass through. The concentrate is then diluted to 330 ml with distilled water and reconcentrated to 30 ml. This process of concentration and dilution is repeated three times. The concentrate is then lyophilized. From 100g of plant material 12-15g anti-cancer material are obtained by this method. The determination of anti-cancer activity is made in mice using Ehrlich ascites tumor cells. 2 x 10 7 cells per ml are incubated with 20, 30 and 40 mg lyophilisate per ml for 1 hour at 37 ° C. Thereafter, the cells are separated by centrifugation and washed twice with isotonic saline. 1 x 10 7 cells per 0.5 ml of isotonic saline are intraperitoneally administered to female ICR mice weighing 24 ± 0.5 g. As a control, mice are given intraperitoneally to untreated cells. Each test series is scheduled with 10 animals. After 4 days ascites is visible on the outside in the controls. The treated animals are hach 90 days still without findings.

Claims (1)

Erfindungsanspruch:Invention claim: Verfahren zur Gewinnung von krebshemmenden Mistelextrakten mit definiertem Lektingehalt, dadurch gekennzeichnet, daß man Misteln von allen Bäumen, vorzugsweise Birke und Süßahorn, mittels destilliertem Wasser extrahiert, den Rohextrakt mittels fraktionierender Ultrafiltration von allen Substanzen mit Molekülmassen von größer als 10000 und gegebenenfalls kleiner als 5000 befreit, danach gegebenenfalls weiteren Rohextrakt in solcher Menge zugibt, daß eine optimale krebshemmende Wirkung erreicht wird, und lyophilisiert.Method for obtaining mistletoe-extracting mistletoe extracts having a defined lectin content, characterized in that mistletoe is extracted from all trees, preferably birch and sweet maple, by means of distilled water, the crude extract is freed by fractional ultrafiltration from all substances having molecular masses greater than 10,000 and optionally less than 5,000 then optionally adding further crude extract in such amount as to achieve an optimal anticancer effect and lyophilized. Anwendungsgebietfield of use Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Gewinnung von Mistelextrakten mit krebshemmender Wirkung, gekennzeichnet dadurch, daß der Gehalt an Lektinen definiert ist. Das Verfahren ist in der pharmazeutischen Industrie und in der medizinischen Forschung anwendbar, vorzugsweise bei der Gewinnung von Mistelextrakten, die für die Krebstherapie Anwendung finden.The invention relates to a method for obtaining mistletoe extracts with anti-cancer activity, characterized in that the content of lectins is defined. The method is useful in the pharmaceutical and medical research, preferably in the extraction of mistletoe extracts used in cancer therapy. Charakterisierung der bekannten technischen LösungenCharacterization of the known technical solutions Die bisher bekannten Verfahren zur Gewinnung von Mistelextrakten mit krebshemmender Wirkung basieren auf der Kenntnis, daß wäßrige Extrakte von Mistelpflanzen (lsorelR, Helixor") oder Mistelpreßsäfte (lscadorR) krebshemmende Substanzen enthalten. Dazu gehören auch mindestens 3 verschiedene Lektine, deren Anteil in den Präparaten erheblichen Schwankungen unterliegen (P.Ziska, H.Franz, Lectine, Biology, Biochemistry, Chlinical Biochemistry 4[1985]). In Höheren Konzentrationen können diese Lektine toxische, den Patienten schädigende Einflüsse haben.The previously known methods for obtaining mistletoe extracts with anticancer activity are based on the knowledge that aqueous extracts of mistletoe plants (Isorel R , Helixor ") or mistletoe juices (lscador R ) contain anticancer substances, including at least 3 different lectins, the proportion of which in the Subject to considerable variation (P.Ziska, H. Franz, Lectins, Biology, Biochemistry, Chlinical Biochemistry 4 [1985]). In higher concentrations, these lectins may have toxic, patient-damaging effects. Ziel der ErfindungObject of the invention Das Ziel der Erfindung besteht darin, ein universell anwendbares Verfahren zu entwickeln, um Mistelextrakte mit definiertem, hinsichtlich der krebshemmenden Wirkung optimierten Lektingehalt zu gewinnen.The object of the invention is to develop a universally applicable method to obtain mistletoe extracts with defined, optimized with regard to the anti-cancer effect lectin content. Darlegung des Wesens der ErfindungExplanation of the essence of the invention Erfindungsgemäß werden zunächst Rohextrakte gewonnen, von denen ein Teil (ca. 80-95%) anschließend durch fraktionierende Ultrafiltration nahezu lektinfrei gemacht wird. Als Material werden vorzugsweise Misteln von Süßahorn oder Birke eingesetzt. Das Verfahren läßt sich auch mit Misteln von allen anderen Wirtpflanzen realisieren. Als Filter für die Ultrafiltration werden Materialien verwendet, die Substanzen mit Molekülmassen größer als 10000 nahezu ausschließen und Substanzen mit kleineren Molekülmassen passieren lassen. Getrocknete Misteln werden zerkleinert, pulverisiert und mit destilliertem Wasser unter rühren extrahiert. Der ungelöste Anteil wird durch Zentrifugation abgetrennt. Der klare Überstand (Rohextrakt) wird in eine Ultrafiltrationszelle gegeben, die mit einem Filter versehen ist, das Substanzen mit einer Molekülmasse größer als 10000 weitgehend zurückhält. Die Lösung wird unter Druck filtriert. Für besondere Zwecke ist eine anschließende Filtration mit einem Filter, das Substanzen mit einer Molekülmasse kleiner als 5000 passieren läßt, angebracht. Diese anschließende Filtration ist in den Fällen angebracht, in denen die Anwesenheit toxischer niedermolekularer Substanzen festgestellt wird. Es wird dann zum Konzentrat Rohextrakt in solcher Menge zugegeben, daß hinsichtlich der krebshemmenden Wirkung eine optimale Aktivität gewährleistet ist. Diese krebshemmende Aktivität wird durch Tierversuche bestimmt.According to the invention, crude extracts are first obtained, of which a part (about 80-95%) is subsequently made virtually free of lectin by fractional ultrafiltration. Mistletoes of sweet maple or birch are preferably used as the material. The method can also be implemented with mistletoe from all other host plants. As ultrafiltration filters, materials are used which almost exclude substances with molecular weights greater than 10,000 and pass substances of smaller molecular mass. Dried mistletoes are crushed, pulverized and extracted with distilled water while stirring. The undissolved portion is separated by centrifugation. The clear supernatant (crude extract) is placed in an ultrafiltration cell equipped with a filter which largely retains substances with a molecular weight greater than 10,000. The solution is filtered under pressure. For special purposes, a subsequent filtration with a filter that allows substances with a molecular weight less than 5000 pass, appropriate. This subsequent filtration is appropriate in cases where the presence of toxic low molecular weight substances is detected. It is then added to the concentrate crude extract in such an amount that with regard to the anticancer effect optimal activity is ensured. This anti-cancer activity is determined by animal experiments. Ausführungsbeispielembodiment 100g getrocknete und gepulverte Mistel werden mit 500ml destilliertem Wasser 2 Stunden unter Rühren extrahiert. Anschließend wird die Suspension für 16 Stunden bei 4°C aufbewahrt. Der ungelöste Anteil wird durch Zentrifugation abgetrennt und der klare Überstand von 350ml wird in eine Ultrafiltrationszelle gegeben, die mit einem Filter versehen ist, das Substanzen mit einer Molekülmasse größer als 10000 zurückhält. Die Druckfiltration wird unter Stickstoff bei 2 Atmosphären Überdruck durchgeführt. Das Filtratvon 330 ml wird unter Verwendung eines Filters, das Substanzen mit einer Molekülmasse kleiner als 5000 passieren läßt, auf 30 ml eingeengt. Das Konzentrat wird dann mit destilliertem Wasser auf 330 ml verdünnt und erneutauf 30 ml eingeengt. Dieser Vorgang des Einengens und Verdünnens wird dreimal wiederholt. Das Konzentrat wird dann lyophilisiert. Aus 100g Pflanzenmaterial werden nach diesem Verfahren 12—15g krebshemmendes Material gewonnen. Die Bestimmung der krebshemmenden Aktivität erfolgt an Mäusen unter Verwendung von Ehrlich Ascites-Tumorzellen. 2 χ 107 Zellen pro ml werden mit 20,30 und 40 mg Lyophilisat pro ml für 1 Stunde bei 37°C inkubiert. Danach werden die Zellen durch Zentrifugation abgetrennt und zweimal mit isotonischer Salzlösung gewaschen. Je 1 χ 107 Zellen pro 0,5 ml isotonischer Salzlösung werden weiblichen ICR-Mäusen mit einem Gewicht von 24 ± 0,5g intraperitoneaI appliziert. Als Kontrolle werden Mäusen unbehandelte Zellen intraperitoneal appliziert. Jede Versuchsreihe wird mit 10 Tieren angesetzt. Nach 4 Tagen bildet sich äußerlich sichtbar in den Kontrolltieren Ascites. Die behandelten Tiere sind nach 90 Tagen noch ohne Befund.100 g of dried and powdered mistletoe are extracted with 500 ml of distilled water for 2 hours with stirring. The suspension is then stored at 4 ° C. for 16 hours. The undissolved portion is separated by centrifugation and the clear supernatant of 350 ml is placed in an ultrafiltration cell equipped with a filter which retains substances with a molecular weight greater than 10,000. The pressure filtration is carried out under nitrogen at 2 atmospheres overpressure. The filtrate of 330 ml is concentrated to 30 ml using a filter which allows substances with a molecular weight less than 5,000 to pass through. The concentrate is then diluted to 330 ml with distilled water and reconcentrated to 30 ml. This process of concentration and dilution is repeated three times. The concentrate is then lyophilized. From 100g of plant material 12-15g anti-cancer material are obtained by this method. The determination of anti-cancer activity is made in mice using Ehrlich ascites tumor cells. 2 × 10 7 cells per ml are incubated with 20.30 and 40 mg lyophilisate per ml for 1 hour at 37 ° C. Thereafter, the cells are separated by centrifugation and washed twice with isotonic saline. 1 × 10 7 cells per 0.5 ml of isotonic saline are administered to female ICR mice weighing 24 ± 0.5 g intraperitoneally. As a control, mice are given intraperitoneally to untreated cells. Each test series is scheduled with 10 animals. After 4 days, ascites is externally visible in the control animals. The treated animals are after 90 days still without findings.
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