DD234280A5 - PROCESS FOR PREPARING A POLYPETIDE - Google Patents

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DD234280A5
DD234280A5 DD26795184A DD26795184A DD234280A5 DD 234280 A5 DD234280 A5 DD 234280A5 DD 26795184 A DD26795184 A DD 26795184A DD 26795184 A DD26795184 A DD 26795184A DD 234280 A5 DD234280 A5 DD 234280A5
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DD26795184A
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Inventor
Robert A Hallewell
Guy T Mullenbach
Original Assignee
Chiron Corp.,Us
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Abstract

Es werden Verfahren und Zusammensetzungen fuer die Herstellung von menschlicher Superoxiddismutase und ein neues Protokoll zur Verbesserung der Wirksamkeit der Expression beschrieben. Das menschliche Superoxiddismutase kodierende Gen wird isoliert und in einem Vektor in Verbindung mit einem synthetischen Linker, der fuer eine verbesserte Wirksamkeit der Translation sorgt, eingefuehrt. Der Stamm E. coli D1210 (pSODX8) wurde am 27. September 1983 bei der A.T.C.C. hinterlegt und erhielt die Zugriffsnummer No. 39453. Der Hefestamm 2150-Z-3 (pC1/1GAPSOD) sowie die E. coli-Staemme D1210 (pSOD11) und D1210 (pS2OR) wurden am 9. Mai 1984 bei der A.T.C.C. hinterlegt und erhielten die Zugriffsnummern No. 20708, 39679 bzw. 39680.Methods and compositions for the production of human superoxide dismutase and a novel protocol for enhancing the efficiency of expression are described. The human superoxide dismutase encoding gene is isolated and introduced into a vector in conjunction with a synthetic linker which provides for improved translation efficiency. The E. coli D1210 strain (pSODX8) was introduced into the A.T.C.C. deposited and received the accession no. 39453. Yeast strain 2150-Z-3 (pC1 / 1GAPSOD) and E. coli strain D1210 (pSOD11) and D1210 (pS2OR) were identified on May 9, 1984 at the A.T.C.C. deposited and received the accession no. 20708, 39679 and 39680 respectively.

Description

Anwendungsgebiet der ErfindungField of application of the invention

Die Erfindung betrifft die Herstellung eines Polypeptids, mit im wesentlichen der gleichen Aminosäuresequenz wie der menschlichen Superoxiddismutase. Die Erfindung ist insbesondere in der Medizin aber auch auf anderen Gebieten anwendbar.The invention relates to the production of a polypeptide having substantially the same amino acid sequence as human superoxide dismutase. The invention is particularly applicable in medicine but also in other fields.

Bekannte technische LösungenWell-known technical solutions

Superoxiddismutase (SOD) stellt eine Vielzahl von unterschiedlichen Enzymen dar, die in den meisten lebenden Organismen auftreten. Eine Funktion in Säugetieren besteht in der Zerstörung von Superoxid, einem Material, das in der Natur während der Phagozytose gebildet wird. Die Superoxiddismutasen werden in Familien unterteilt, und zwar auf Grundlage des Metalls, das mit dem Enzym assoziiert ist, wobei die Metalle Eisen, Mangan, Kupfer und Kupfer-Zink sein können. Superoxiddismutase, z. B. aus Rinderleber, hat klinische Verwendung gefunden, insbesondere als entzündungshemmendes Mittel für Säugetiere . einschließlich Menschen. Andere Anwendungen schließen das Abfangen von Superoxidanionen ein, die gebildet werden, wenn ein Gastorganismus verschiedenen Superoxid-induzierenden Agentien ausgesetzt wird, z. B. Strahlung, Paraquat und dergleichen; die Prophylaxe oder Therapie von bestimmten degenerativen Erkrankungen, z.B. Emphyseme; die Konservierung von Nahrungsmittel und dergleichen.Superoxide dismutase (SOD) is a variety of different enzymes that occur in most living organisms. One function in mammals is the destruction of superoxide, a material that is naturally produced during phagocytosis. The superoxide dismutases are divided into families based on the metal associated with the enzyme, which metals can be iron, manganese, copper and copper-zinc. Superoxide dismutase, e.g. B. bovine liver, has found clinical use, in particular as an anti-inflammatory agent for mammals. including humans. Other applications include the trapping of superoxide anions formed when a host organism is exposed to various superoxide inducing agents, e.g. Radiation, paraquat and the like; the prophylaxis or therapy of certain degenerative diseases, e.g. emphysema; the preservation of food and the like.

Die Aminosäuresequenz von menschlicher Erythrocyten-Cu-Zn-Superoxiddismutase wird von Jabusch et al.. Biochemistry (1980) 19: 2310-2316 und Barra et al., FEBS Letters (1980) 120:53-55 beschrieben. Rindererythrocyten-Cu-Zn-SOD wird von Steinman et al., J. Biol. Chem. (1974), 249: 7326-7338 beschrieben. Ein SOD-1-cDNS-Klon wird von Lieman-Hurwitzet al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA (1982), 79: 2808-2811 beschrieben. Bezüglich des Effektes auf die Wirksamkeit der Translation bei Veränderung der nicht übersetzten (nichttranslationierten Region oberhalb des Initiationskodons, vgl. Gheysen et al., Gene (1982) 17: 55-63; Thummel et al., J. Virol. (1981) 37: 683-697; und Matteucci und Heyneker, Nucl. Acids. ReI. (1983) 11: 3113-3121.The amino acid sequence of human erythrocyte Cu-Zn superoxide dismutase is described by Jabusch et al. Biochemistry (1980) 19: 2310-2316 and Barra et al., FEBS Letters (1980) 120: 53-55. Bovine erythrocyte Cu-Zn-SOD is described by Steinman et al., J. Biol. Chem. (1974), 249: 7326-7338. An SOD-1 cDNA clone is described by Lieman-Hurwitz et al., Proc. Natl. Acad. Be. USA (1982), 79: 2808-2811. Regarding the Effect on Translation Effect on Altering the Untranslated (Untranslated Region Above the Initiation Codon, see Gheysen et al., Gene (1982) 17: 55-63; Thummel et al., J. Virol. (1981) 37 : 683-697, and Matteucci and Heyneker, Nucl. Acids, Re., (1983) 11: 3113-3121.

Ziel der ErfindungObject of the invention

Es ist Ziel der Erfindung, stabile Quellen für physiologisch verträgliche Superoxiddismutase verfügbar zu machen, insbesondere zur Verwendung in vivo als entzündungshemmendes Mittel oder für andere therapeutische Zwecke. Für die Anwendung beim Menschen wäre es vorteilhaft, das homologe Enzym zur Verhinderung oder Minimalisierung möglicher Immunreaktionen zu verwenden.It is an object of the invention to provide stable sources of physiologically acceptable superoxide dismutase, particularly for use in vivo as an anti-inflammatory agent or for other therapeutic purposes. For human use, it would be advantageous to use the homologous enzyme to prevent or minimize possible immune responses.

Wesen der Erfindung -Essence of invention -

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, mittels rekombinanter DNS-Techniken in wirksamer Weise solche Produkte herzustellen, die die gewünschten biologischen Wirkungen der Superoxiddismutase aufweisen, z. B. immunologische und enzymatische Wirkungen.The invention has for its object to produce by means of recombinant DNA techniques in an effective manner such products having the desired biological effects of superoxide dismutase, z. B. immunological and enzymatic effects.

Erfindungsgemäß erfolgt die Produktion von Polypeptiden mit der biologischen Wirksamkeit von menschlicher Cu-Zn-Superoxiddismutase durch Herstellung der cDNS des Hauptanteils des strukturellen Gens, der Verbindungen mit einem Gemisch von Adaptern zur Schaffung von verschiedenen Sequenzen, die sich von der ribosomalen Bindungsstelle zu degenerierten Nucleotiden in der Kodierungsregion erstrecken, und die Einführung des kompletten Gens mit seinen Translationssignalen in einen Fx:.ressionsvektor. Die Transformation von Mikroorganismen führt zur wirksamen Herstellung eines kompetenten Polypeptids, das die biologische Wirksamkeit von menschlicher Cu-Zn-Superoxiddismutase zeigt. Das Gen kann weiterhin zur Kombination mit sekretorischen und Verarbeitungssignalen für die Sekretion in einem geeigneten Gastorganismus verwendet werden. Die Expression eines Polypeptids wird verbessert, und zwar unter Einschluß der Verwendung von Gemischen von Adaptern mit unterschiedlichen Sequenzen, die die Initiationsstelle für die Translation flankieren, d. h. in der Region zwischen der ribosomalen Bindungsstelle und der Initiationsstelle für die Translation und in den verschiedenen lnitiations-5'-Kodons des Polypeptids, soweit dies durch Redundanzeinschränkungen des genetischen KodesAccording to the invention, the production of polypeptides is carried out with the biological activity of human Cu-Zn superoxide dismutase by producing the cDNA of the major part of the structural gene, the compounds with a mixture of adapters to create different sequences extending from the ribosomal binding site to degenerate nucleotides in extend the coding region, and the introduction of the complete gene with its translation signals into a Fx:. The transformation of microorganisms results in the efficient production of a competent polypeptide which demonstrates the biological activity of human Cu-Zn superoxide dismutase. The gene may also be used for combination with secretory and processing signals for secretion in a suitable host organism. The expression of a polypeptide is improved, including the use of mixtures of adapters with different sequences flanking the initiation site for translation, i. H. in the region between the ribosomal binding site and the initiation site for translation and in the different initiation 5 'codons of the polypeptide, as far as this is by redundancy restrictions of the genetic code

Die neuen Polypeptide sind an ihren N-Enden acetyliert. Durch die Schaffung einer besonderen Acetylierungssignalsequenz am 5'-Ende des strukturellen Gens für ein gewünschtes Polypeptid wird die N-terminale Aminosäure acetyliert, wenn das Gen in Hefe exprimiert wird. Die Acetylierungssignalsequenz kodiert für mindestens die ersten zwei N-terminalen Aminosäuren, wobei die erste Aminosäure entweder Alanin oder Glycin und die zweite Aminosäure eine polare Aminosäure, normalerweise Threonin, Serin oder Asparaginsäure ist. Die Acetylierung von menschlicher Superoxiddismutase, hergestellt in Hefe, wird demonstriert, wobei die ersten zwei Aminosäuren Alanin bzw. Threonin sind.The new polypeptides are acetylated at their N-ends. By creating a particular acetylation signal sequence at the 5 'end of the structural gene for a desired polypeptide, the N-terminal amino acid is acetylated when the gene is expressed in yeast. The acetylation signal sequence encodes at least the first two N-terminal amino acids, wherein the first amino acid is either alanine or glycine and the second amino acid is a polar amino acid, usually threonine, serine or aspartic acid. The acetylation of human superoxide dismutase prepared in yeast is demonstrated, with the first two amino acids being alanine and threonine, respectively.

Das erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung von Polypeptiden, welche die biologischen Wirkungen von menschlicher Cu-Zn-Superoxiddismutase („hSOD") zeigen, verwendet eine DNS-Sequenz („hSOD-Gen"), die einen wesentlichen Abschnitt der Aminosäuresequenz von hSOD in Verbindung mit einer für die Expression in dem Expressionsgastorganismus optimierten Translationsinitiationsregion kodiert. Das hSOD-Gen wird in einen geeigneten Vektor für die Expression in einem Gastorganismus eingeführt, und zwar zweckmäßigerweise unter Bedingungen, die eine Sekretion gestatten, so daß der SOD-Produktausdem extrazellulären Medium gesammelt werden kann.The method of the present invention for producing polypeptides exhibiting the biological effects of human Cu-Zn superoxide dismutase ("hSOD") utilizes a DNA sequence ("hSOD gene") encoding a substantial portion of the amino acid sequence of hSOD in conjunction with a translation initiation region optimized for expression in the expression organism. The hSOD gene is introduced into a suitable vector for expression in a host organism, conveniently under conditions that allow secretion so that the SOD product can be collected from the extracellular medium.

Im folgenden bezieht sich die Acetylierung auf die Addition an das Aminoende von Polypeptiden und Proteinen, im Gegensatz zu Modifizierungen von Aminosäure-Seitenketten, z. B. Lysin, wie dies auch in der Natur beobachtet wird. Die Acetylierung von Polypeptiden und Proteinen ist aus einer Anzahl von Gründen nützlich. Wo die natürlichen Bedingungen des Polypeptids die Acetylierung einschließen, wie dies der Fall bei zytoplasmischer hSOD ist, liefern die Acetylierung einschließende Expressionsverfahren ein Produkt mit der gewünschten natürlichen Struktur und Konformation. Wo das Produkt pharmazeutische und/oder diagnostische (in vitro oder in vivo) Verwendung findet, wird das acetylierte Material die Immunogenizitätbei der Verabreichung an einen Gastorganismus und/oder beim Kontakt mit biologischen Proben verhindern oder auf ein Minimum reduzieren. Weiterhin sind acetylierte Polypeptide normalerweise stabiler und widerstandsfähiger gegenüber dem Abbau durch Proteasen und erfreuen sich somit einer größeren Lebensdauer in Zellen, Blut oder Körper- und Gewebeflüssigkeiten.In the following, acetylation refers to addition to the amino end of polypeptides and proteins, as opposed to modifications of amino acid side chains, e.g. As lysine, as is observed in nature. The acetylation of polypeptides and proteins is useful for a number of reasons. Where the natural conditions of the polypeptide include acetylation, as is the case with cytoplasmic hSOD, the acetylation-entrapping methods provide a product having the desired natural structure and conformation. Where the product finds pharmaceutical and / or diagnostic (in vitro or in vivo) use, the acetylated material will prevent or minimize immunogenicity when administered to a host organism and / or when in contact with biological samples. Furthermore, acetylated polypeptides are normally more stable and resistant to degradation by proteases and thus enjoy longer life in cells, blood or body and tissue fluids.

Das strukturelle Gen für hSOD oder andere Polypeptide schließt eine Acetylierungssignalsequenz an ihrem 5'-Ende ein, diese Signalsequenz veranlaßt einen Hefeexpressionsorganismus zur Bewirkung der Acetylierung. Die Acetylierungssignalsequenz kodiert mindestens die ersten zwei N-terminalen Aminosäuren in dem Polypeptid. Die erste Aminosäure ist entweder Alanin, Glycin oder Serin, die zweite Aminosäure dagegen ist eine polare oder aromatische Aminosäure, normalerweise Threonin, Serin, Asparaginsäure oder Phenylalanin.The structural gene for hSOD or other polypeptides includes an acetylation signal sequence at its 5 'end, this signal sequence causes a yeast expression organism to cause acetylation. The acetylation signal sequence encodes at least the first two N-terminal amino acids in the polypeptide. The first amino acid is either alanine, glycine or serine, while the second amino acid is a polar or aromatic amino acid, usually threonine, serine, aspartic acid or phenylalanine.

Die Aminosäuren können die natürlichen N-terminalen Aminosäuren sein, die normalerweise in dem zu exprimierenden Polypeptid vorhanden sind. Dies ist der Fall bei hSOD, wo die ersten zwei Aminosäuren Alanin und bzw. Threonin sind. Andere natürlich-acetylierte Proteine, die in Hefe exprimiert und acetyliert werden können, schließen die folgenden ein: Protein Quelle SignalsequenzThe amino acids may be the natural N-terminal amino acids normally present in the polypeptide to be expressed. This is the case with hSOD, where the first two amino acids are alanine and threonine, respectively. Other naturally-acetylated proteins that can be expressed in yeast and acetylated include the following: protein source signal sequence

Cytochrom C Mensch, Rhesus- GLY-ASPCytochrome C human, Rhesus GLY-ASP

Affe, HundMonkey, dog

Pferd uswHorse, etc

CythochromC Rizinus, Sesam ALA-SER CythochromC castor, sesame ALA-SER

Mung-Bohne usw.Mung bean etc.

Glutamat- .. Neurospora SER-ASNGlutamate- .. Neurospora SER-ASN

dehydrogenasedehydrogenase

Calmodulin Schwein SER-ALACalmodulin pig SER-ALA

Myosinmyosin

(leichte A 2-Kette) — . SER-PHE(light A 2 chain) -. SER-PHE

ADH Drosophila SER-PHEADH Drosophila SER-PHE

Die vorliegende Erfindung läßt sich auch für die Acetylierung von Polypeptiden und Proteinen anwenden, die nicht natürlich acetyliert sind. Die Acetylierung kann erreicht werden, indem man die Acetylierungssignalsequenz mit dem 5'-Ende des strukturellen Gens für das Polypeptid verbindet. Die Acetylierungssignalsequenz kodiert für mindestens 2 Aminosäuren (wie oben beschrieben) und kann bis zu 10 oder mehr Aminosäuren kodieren, vorzugsweise weniger als 5 Aminosäuren. Die Zugabe von weniger Aminosäuren ist normalerweise erwünscht, um eine Störung oder einen Verlust einer gewünschten Aktivität des Polypeptids zu begrenzen. Zweckmäßigerweise wird die Signalsequenz synthetisiert und mit dem strukturellen Gen verbunden, und zwar unter Verwendung bekannter Techniken.The present invention also applies to the acetylation of polypeptides and proteins that are not naturally acetylated. Acetylation can be achieved by linking the acetylation signal sequence to the 5 'end of the structural gene for the polypeptide. The acetylation signal sequence encodes at least 2 amino acids (as described above) and can encode up to 10 or more amino acids, preferably less than 5 amino acids. The addition of fewer amino acids is normally desirable to limit interference or loss of a desired activity of the polypeptide. Conveniently, the signal sequence is synthesized and linked to the structural gene using known techniques.

Als Alternative zur Zugabe der Acetylierungssignalsequenz zu dem strukturellen Gen ist es manchmal möglich, das 5'-Ende des strukturellen Gens zu modifizieren, um eine oder beide der ersten zwei Aminosäuren des Polypeptids zu substituieren. Diese Modifizierung kann mittels einer Vielzahl von üblichen Methoden erreicht werden. Zum Beispiel kann das strukturelle Gen in der Nähe seines 5'-Ende restriktioniert werden, um eine bekannte Anzahl von Nucleotiden zu entfernen. Ein synthetisches Oligonucleotid kann dann an das kohäsive Ende, das nach der Restriktion zurückbleibt, angekoppelt werden. Das Oligonucleotid stellt in der erforderlichen Weise die Basenpaare wieder her und substituiert diese, um die gewünschte Acetylierungssignalsequenz zu schaffen. Alternativ hierzu kann eine ortsspezifische Mutagenese unter Verwendung z. B. der Phage M13, verwendet werden, um eine geeignete Modifizierung an dem 5'-Ende des strukturellen Gens zu bewirken. Um hSOD herzustellen, ist es erforderlich, daß man über eine DNS-Sequenz verfügt, die für hSOD kodiert. Eine Methode zur Erreichung dieser Sequenz besteht darin, cDNS aus Messenger-RNS aus hSOD produzierenden Zellen zu klonieren. Zweckmäßigerweise werden menschliche Leberzellen zu diesem Zweck verwendet. Nach Klonierung der cDNS, wobei die DNS-Kodierungssequenz unbekannt, jedoch mindestens eine partielle Aminosäuresequenz bekannt ist, kann man dann die cDNS mit Mischungen von Proben „screenen", vobei die Proben sämtliche der möglichen Nucleotidvariationen, die für die spezielle Serie von Aminosäureresten kodieren, aufweisen.As an alternative to adding the acetylation signal sequence to the structural gene, it is sometimes possible to modify the 5 'end of the structural gene to substitute one or both of the first two amino acids of the polypeptide. This modification can be achieved by a variety of conventional methods. For example, the structural gene can be restricted near its 5 'end to remove a known number of nucleotides. A synthetic oligonucleotide can then be coupled to the cohesive end remaining after restriction. The oligonucleotide reconstitutes and substitutes the base pairs as required to provide the desired acetylation signal sequence. Alternatively, a site-specific mutagenesis using z. Phage M13, may be used to effect appropriate modification at the 5 'end of the structural gene. To produce hSOD, it is necessary to have a DNA sequence encoding hSOD. One way to achieve this sequence is to clone messenger RNA cDNA from hSOD-producing cells. Conveniently, human liver cells are used for this purpose. After cloning the cDNA, with the DNA coding sequence unknown, but at least a partial amino acid sequence known, one can then "screen" the cDNA with mixtures of samples, the samples encoding all of the possible nucleotide variations encoding the particular series of amino acid residues. respectively.

Die Auswahl der Reste, für die die Sequenz kodiert, ist in gewissem Umfang willkürlich, obwohl die ausgewählten Reste gewöhnlich ausgewählt sind, um die Anzahl von unterschiedlichen zu synthetisierenden Sequenzen zu minimieren. Für hSOD wird zweckmäßigerweise eine DNS-Sequenz verwendet, die mindestens für die Aminosäurereste 19—24 kodiert, insbesondere eine Probe mit mindestens etwa 15 Basen und nicht mehr als etwa 20 Basen, insbesondere etwa 17 Basen. Man läßt dann Restriktionsenzyme diejenigen Klone abbauen, die mit den markierten Proben zu hybridisieren scheinen, fraktioniert die DNS-Fragmente und wiederholt die Hybridisierung, insbesondere unter Verwendung einer zweiten Reihe von Proben, die zu DNS-Sequenzen hybridisieren, welche für eine unterschiedliche Reihe von Aminosäureresten in hSOD kodieren. Diese Aminosäurereste können zweckmäßigerweise 109-114 sein. Ein Klon oder mehrere können gefunden werden, die gegenüber beiden Proben positiv sind, und diese können als eire Quellefür cDNS verwendet werden, diefür mindestens einen wesentlichen Abschnitt von hSOD kodiert.The selection of residues encoded by the sequence is to some extent arbitrary, although the selected residues are usually selected to minimize the number of different sequences to be synthesized. For hSOD, a DNA sequence is preferably used which codes at least for the amino acid residues 19-24, in particular a sample with at least about 15 bases and not more than about 20 bases, in particular about 17 bases. Restriction enzymes are then allowed to degrade those clones that appear to hybridize to the labeled probes, fractionate the DNA fragments, and repeat hybridization, particularly using a second set of probes that hybridize to DNA sequences encoding a different series of amino acid residues encode in hSOD. These amino acid residues may conveniently be 109-114. One or more clones can be found which are positive to both samples, and these can be used as a source of cDNA encoding at least a substantial portion of hSOD.

Überraschenderweise wurde gefunden, daß die für hSOD veröffentlichten Aminosäuresequenzen in einer signifikanten Anzahl von Resten sich von der durch die cDNS kodierten Aminosäuresequenz unterschieden. Dort, wo sich die zwei veröffentlichtenSurprisingly, it was found that the amino acid sequences published for hSOD in a significant number of residues differed from the amino acid sequence encoded by the cDNA. Where the two published

Sequenzen unterscheiden (Jabusch et al.. Biochemistry [1980] 19: 2310-2316 und Barra et al., FEBS Letters [1980] 120:153-156), sind die richtigen Zuordnungen die folgenden: Rest 11, Asparaginsäure; Rest 17, Isoleucin; Rest 26, Asparagin; Rest 49, Glutamat; Rest 52, Asparaginsäure; Rest 53, Asparagin; Rest 92, Asparaginsäure; Rest 98, Serin (vgl. Fig. 4). Wegen der Ungewißheiten bezüglich der Wirkung auf die Translation der Trennung zwischen der ribosomalen Bindungsstelle und dem Translationsinitiationskodon, normalerweise AUG, liefert das hier behandelte Verfahren eine Technik zur Änderung des Abstandes und der die ribosomale Bindungsstelle von dem Initiationskodon trennenden Nucleotide. Gewöhnlich gibt es etwa 6-15, häufiger etwa 6-12 Nucleotide in dem Spacer zwischen der ribosomalen Bindungsstelle und dem Initiationskodon. Da die Basensequenz „stromabwärts" von der Initiationsstelle auch die Effizienz der Translation beeinflussen kann, schafft das erfindungsgemäße Verfahren auch die Möglichkeit, die Nukleotidsequenz (nicht jedoch die Länge), und zwar innerhalb der anfänglichen mehreren 5'-Kodons des Polypeptids, soweit dies durch die Redundanzeinschränkungen des genetischen Kods ermöglicht ist, zu variieren. Diese Degenerierung kann 4 Kodons, häufiger gewöhnlich 2 Kodons, „stromabwärts" von der Initiationstelle einschließen.Sequences (Jabusch et al. Biochemistry [1980] 19: 2310-2316 and Barra et al., FEBS Letters [1980] 120: 153-156), the correct assignments are the following: residue 11, aspartic acid; Residue 17, isoleucine; Residue 26, asparagine; Residue 49, glutamate; Residue 52, aspartic acid; Residue 53, asparagine; Residue 92, aspartic acid; Residue 98, serine (see Fig. 4). Because of the uncertainty of the translation effect of the separation between the ribosome binding site and the translation initiation codon, normally AUG, the method discussed here provides a technique for altering the distance and the nucleotides separating the ribosomal binding site from the initiation codon. Usually there are about 6-15, more often about 6-12 nucleotides in the spacer between the ribosomal binding site and the initiation codon. Since the base sequence "downstream" of the initiation site can also influence the efficiency of translation, the method of the invention also provides the ability to control the nucleotide sequence (but not the length) within the initial multiple 5 'codons of the polypeptide as far as this is concerned The degeneracy may include 4 codons, more commonly usually 2 codons, "downstream" from the initiation site.

Eine Vielzahl von Linkern werden hergestellt, bei denen mindestens 2 Nucleotide, gewöhnlich mindestens 3 Nucleotide, gewöhnlich mindestens 3 Nucleotide und nicht mehr als 10 Nucleotide, gewöhnlich nicht mehr als etwa 6 Nucleotide werden, so daß sie Glieder mit jedem der 4 Nucleotide, wenn sie sich innerhalb des Spacers befinden, oder 2,3 oder 4 Nucleotiden, wie durch die Redundanz des genetischen Kodes erlaubt, wenn sie sich innerhalb des strukturellen Gens für das Polypeptid befinden, einschließen. Zusätzlich werden die Linker mit unterschiedlichen Anzahlen von Nucleotiden hergestellt, so daß eine Gruppe von Linkern geschaffen wird, die sich nicht nur in der Sequenz, sondern auch in der Länge unterscheiden. Der Unterschied in der Länge kann erreicht werden, indem man Abschnitte des Trägers während der Linkersynthese entfernt, und, soweit zutreffend, die Synthese in einer anschließenden Stufe fortsetzt, so daß man Linker erhält, die eine abgestufte Anzahl von Sequenzlängen aufweisen. Gewöhnlich unterscheidet sich das Linkergemisch in der Länge durch mindestens 1 Nucleotid und um nicht mehr als über einen Bereich von 6 Nucleotiden, gewöhnlich nicht mehr als um 4 Nucleotide.A variety of linkers are prepared in which at least 2 nucleotides, usually at least 3 nucleotides, usually at least 3 nucleotides and not more than 10 nucleotides, usually not more than about 6 nucleotides, so that they are members of each of the 4 nucleotides, if are within the spacer, or include 2,3 or 4 nucleotides as allowed by the redundancy of the genetic code if they are within the structural gene for the polypeptide. In addition, the linkers are made with different numbers of nucleotides to create a group of linkers that differ not only in sequence but also in length. The difference in length can be achieved by removing portions of the support during linker synthesis and, as appropriate, continuing synthesis in a subsequent step to give linkers having a graded number of sequence lengths. Usually, the linker mixture will differ in length by at least 1 nucleotide and by no more than a range of 6 nucleotides, usually not more than 4 nucleotides.

Dies kann bequem illustriert werden, wo sich die fehlenden Basen am Ende befinden. Nach jeder Stufe wird ein Abschnitt des Trägers entfernt, und die Synthese wird mit den an den Träger gebundenen Strängen fortgeführt, wobei alle 4 Nucleotide (dNTP) in jeder Stufe'geschaffen bzw. zur Verfugung gestellt werden. Diese Einzelstränge werden dann zu einem Einzelstrang hybridisiert, der teilweise komplementär ist, wo die variable Region ein überhängendes Ende ist. Somit erhält man eine abgestufte Reihe von Linkern mit Überhängen, die sich sowohl hinsichtlich ihrer Nucleotidsequenzen als auch ihrer Längen unterscheiden. An einem geeigneten Punkt während der anschließenden Hybridisierung, der Ligation oder der Klonierungsoperation werden die Überhangregion bzw. die Überhangregionen ausgefüllt, um doppelsträngiges Material zu schaffen, das weiterer Verarbeitung zugeführt werden kann. Dies wird gewöhnlich und bevorzugt in vitro durchgeführt, z. B. unter Verwendung des Klenow-Fragmentes der DNS-Polymerase I; alternativ kann bei bestimmten Konstruktionen der Überhang als ein Einzelstrang kloniert werden, wobei das Auffüllen in vivo in dem transformierten odertransfizierten Gastorganismus erfolgt. Die Hybridisierung zu einem komplementären Strang kann erreicht werden, indem man eine 5'-Sequenz „stromaufwärts" von der variablen Nucleotidreihe vorsieht, die komplementär zu einer in derterminalen Sequenz, an die der Linker gebunden werden soll, vorhandenen Sequenz ist. Die fehlenden Basen können dann in vitro oder in vivo aufgefüllt werden.This can be conveniently illustrated where the missing bases are at the end. After each step, a portion of the support is removed and the synthesis is continued with the strands bound to the support, providing all 4 nucleotides (dNTP) in each step. These single strands are then hybridized into a single strand that is partially complementary where the variable region is an overhanging end. Thus, one obtains a graded series of linkers with overhangs that differ in both their nucleotide sequences and their lengths. At an appropriate point during the subsequent hybridization, ligation, or cloning operation, the overhang region (s) are filled to provide double-stranded material that can be applied for further processing. This is usually and preferably done in vitro, e.g. Using the Klenow fragment of DNA polymerase I; alternatively, in certain constructions, the overhang may be cloned as a single strand, with filling occurring in vivo in the transformed or transfected host organism. Hybridization to a complementary strand can be accomplished by providing a 5 'sequence "upstream" of the variable nucleotide series that is complementary to a sequence present in the terminal sequence to which the linker is to be ligated then filled in vitro or in vivo.

Die Linker schließen innerhalb ihrer Sequenz mindestens einen Abschnitt der Region zwischen der ribosomalen Bindungsstelle und dem Initiationskodon ein, vorzugsweise die zu dem Initiationskodon proximalen Nucleotide. Der Linker kann auch das Initiationskodon und Abschnitte des strukturellen Gens, der ribosomalen Bindungsstelle sowie Basen „stromaufwärts" von der ribosomalen Bindungsstelle, die gegebenenfalls die Transkription regulierende Sequenzen enthalten können, einschließen. Gewöhnlich umfaßt der Linker mindestens etwa 5 Basen, insbesondere mindestens etwa 20 Basen, und gewöhnlich nicht mehr als 200 Basen, insbesondere nicht mehr als etwa 100 Basen. Wenn der Linker größer als etwa 35 Basen ist, wird er gewöhnlich zusammengesetzt, indem man einzelsträngige Sequenzen von etwa 10 bis 35 Basen verwendet, die mit lediglich einem Teil eines komplementären Stranges homolog sind; dadurch wird für komplementäre überlappende Sequenzen mit Überhängen gesorgt, so daß die verschiedenen Einzelstränge hybridisiert und ligiert sowie der degenerierte und/oder mit variablen Längen versehene Übergang, wie oben angegeben, aufgefüllt werden kann, um den gewünschten Linker mit kohäsiven und/oder stumpfen Enden herzustellen.The linkers include within their sequence at least a portion of the region between the ribosome binding site and the initiation codon, preferably the nucleotides proximal to the initiation codon. The linker may also include the initiation codon and portions of the structural gene, the ribosome binding site, and bases "upstream" of the ribosomal binding site, which may optionally contain transcriptional regulatory sequences. [Gew Gew] Usually, the linker will comprise at least about 5 bases, more preferably at least about 20 bases , and usually not more than 200 bases, especially not more than about 100 bases If the linker is greater than about 35 bases, it is usually assembled using single-stranded sequences of about 10 to 35 bases containing only part of one complementary overlapping sequences are provided so that the various single strands can hybridize and ligate, and the degenerate and / or variable-length transition, as noted above, can be filled to give the desired linker with cohesive and cohesive linkages / or to make blunt ends.

Wenn das strukturelle Gen eine geeignete Restriktionsstelle aufweist, gewöhnlich nicht mehr als etwa 50 Basen „stromabwärts" von dem Initiationskodon, kann ein das strukturelle Gen enthaltendes Fragment restriktioniert und mit einem komplementären kohäsiven Ende des Linkers verbunden oder zur Schaffung eines stumpfendigen Endes aufgefüllt werden, wobei das stumpfe Ende mit einem stumpfen Ende des Linkers verbunden werden kann. Der Linker wird so aufgebaut, daß gewährleistet ist, daß das strukturelle Gen vollständig ist und sich in einem lesbaren Rahmen mit dem Initiationskodon befindet.When the structural gene has an appropriate restriction site, usually not more than about 50 bases "downstream" from the initiation codon, a fragment containing the structural gene can be restricted and joined to a complementary cohesive end of the linker or filled to create a blunt end The blunt end can be joined to a blunt end of the linker The linker is designed to ensure that the structural gene is complete and in a readable frame with the initiation codon.

Wie bereits angegeben, sorgt man bei der Herstellung des Linkers dafür, daß eine Reihe von Linkern vorliegen, die eine regellose Reihe von Nucleotiden aufweisen, d. h. jedes der 4 möglichen Nucleotide in dem Kodierungsstrang (unter Berücksichtigung der oben genannten Einschränkungen durch den genetischen Kode), und die größenmäßig abgestuft sind, wobei ein Nucleotid oder mehrere, die die Region zwischen der ribosomalen Bindungssielle und dem Initiationskcdon definieren oder diesj überbrücken, fehlen. Diese Linker, die aus Einzelsträngen hergestellt werden, können mit anderen Einzel- oder Doppel-DNS-Strängen verbunden werden, um verlängerte Linker zu schaffen, die nicht nur die ribosomale Bindungsstelle, sondern Basen „stromaufwärts" von der ribosomalen Bindungsstelle einschließen. Alternativ können die Linker relativ klein sein, sie beginnen an einer Stelle innerhalb oder benachbart zu der ribosomalen Bindungsstelle und erstrecken sich „stromabwärts" zu einer Stelle an dem Initiationskodon oder innerhalb des strukturellen Gens.As previously stated, the preparation of the linker provides for a series of linkers having a random series of nucleotides, i. H. each of the 4 possible nucleotides in the coding strand (taking into account the above-mentioned limitations of the genetic code) and which are sized, with one or more nucleotides missing or defining the region between the ribosomal binding site and the initiating cation. These linkers, made from single strands, can be linked to other single or double DNA strands to create elongated linkers that include not only the ribosomal binding site but bases "upstream" of the ribosomal binding site Linkers are relatively small, starting at a site within or adjacent to the ribosomal binding site and extending "downstream" to a site on the initiation codon or within the structural gene.

Die besondere Reihenfolge zur Verbindung der verschiedenen Fragmente zur Herstellung der Verbindungen der Erfindung ist gewöhnlich nicht kritisch; zweckmäßigerweise kann das strukturelle Gen zuerst mit dem Linker verbunden werden. Diese DNS-Verbindung schließt nicht nur das strukturelle Gen, sondern auch die ribosomale Bindungsstelle und jegliche zusätzliche Nucleotide „stromaufwärts" von der ribosomalen Bindungsstelle ein. Zusätzlich können die Nucleotide und Anzahlen der Nucleotide zwischen dem ribosomalen Bindungsort und dem Initiationskodon erheblich v?niert werden. Die betreffende DNS-Verbindung wird in einem geeigneten Expressionsvektor eingeführt, der „stromaufwärts" die erforderliche Initiations-Regulationssequenzen für die Transkription aufweist, weiterhin die Beendigung der die Transkription regulierenden Sequenzen „stromabwärts" von dem Einführungsort der betreffenden DNS-Verbindung. Der Linker ist somit an seinem 5'-Ende von dieThe particular order of compounding the various fragments to make the compounds of the invention is usually not critical; Conveniently, the structural gene can first be linked to the linker. This DNA compound includes not only the structural gene, but also the ribosome binding site and any additional nucleotides "upstream" of the ribosome binding site In addition, the nucleotides and numbers of nucleotides between the ribosome binding site and the initiation codon can be significantly varied. The subject DNA compound is introduced into a suitable expression vector having the required initiation regulatory sequences for transcription "upstream" as well as terminating the transcriptional regulatory sequences "downstream" from the site of introduction of the particular DNA compound at its 5'-end of the

Initiation der Transkription regelnden Signalsequenzen und an seinem 3'-Ende mit mindestens einem Teil einer Kodierungsregion sowie die Transkription und Translatation beendenden Sequenzen flankiert. (5' und 3'- bezeichnen die Richtung der Transkription).Initiation of transcription-regulating signal sequences and flanking at its 3 'end with at least part of a coding region as well as the transcription and translational termination sequences. (5 'and 3'- indicate the direction of transcription ).

Nach der Herstellung des Plasmids oder der Virus-DNS für die Einführung in einen geeigneten Gastorganismus (dies schließt gewöhnlich bei einer geeigneten Stufe der Verfahrensschritte das Auffüllen der variablen Überhangregionen ein) wird der Gastorganismus transformiert bzw. transfiziert, sowie kloniert, die Klone werden „gestreakt", und individuelle Klone werden für die effiziente Expression selektioniert, indem man sie hinsichtlich der Produktion des gewünschten Produktes, z. B. hSOD, überprüft. Die Anzahl der zu überprüfenden Klone zur Bestimmung der unterschiedlichen Produktionsraten für das Produkt hängt ab von und ist proportional zu dem Ausmaß der Längenvariabilität sowie zu der in den synthetischen Linker eingeführten Sequenzdegeneration. Wie sich zum Beispiel aus der vorliegenden Ausführungsform ergibt, ist bei vier Längenvariablen und einer vierfachen Sequenzdegeneration bei jedem der sechs Nucleotide in dem Linker die Zahl der möglichen rekombinanten Sequenzen 5.440. Gewöhnlich werden mindestens einige hundert, vorzugsweise mehrere tausend oder mehr Klone überprüft. Die Überprüfung kann effizient durchgeführt werden, indem man Western-Blots (Entdeckung von Antikörpern bei dem Produkt) aus Gastzellkolonien oder Virusplaquen, überführt auf Nitrozellulosefilter oder andere geeignete Materialien, verwendet. Alternativ kann man die Elektrophorese einsetzen und eine Vielzahl von Bahnen vorsehen, wobei jede Bahn ein individueller Klon ist; es kann ein sofortiger und direkter Vergleich durchgeführt werden, um zu ermitteln, welche Klone am wirksamsten in der Expression sind, und zwar durch Sichtbarmachung der Intensität der Anfärbung, durch Autoradiographie oder durch Prüfung der Produktbande im Westem-Blot-Test. Diese Überprüfung wird gewöhnlich ausreichen, obwohl weitere quantitative Immunoassays oder Enzym-assays eingesetzt werden können, soweit dies erforderlich bzw. geeignet ist. Falls erwünscht, kann die aufgebaute Verbindung in einen anderen Gastorganismus überführt werden, der die Regulationssignale der Expressionsverbindung oder der durch Einführung von erforderlichen Regulationssignalen an geeigneten Stellen modififzierten Expressionsverbindung erkennt, so daß man eine wirksame Expression in einem alternativen Gastorganismus schafft. Falls erwünscht kann das hSOD-Gen mit sekretorischen Führungs- und Verarbeitungssignalen verbunden werden, um für die Sekretion und Verarbeitung des hSOD zu sorgen. In der Literatur sind verschiedene sekretorische Führungs- und Verarbeitungssignale beschrieben worden; vgl. US-PS 4336336 und 4338397 sowie die anhängigen Anmeldungen No. 522909 vom 12. August 1983 und 488857 vom 26. April 1983, auf deren wichtige Teile hier Bezug genommen wird. Von besonderem Interesse als Gastorganismen sind einzellige Mikroorganismen, sowohl Prokaryonten als auch Eukaryonten, wie zum Beispiel Bakterien, Algen, Fungi und dergleichen. Insbesondere können E. coli, B. subtilis, S. cerevisiae, Streptomyces, Neurospora als Gastorganismen verwendet werden.After preparation of the plasmid or viral DNA for introduction into a suitable host organism (this usually involves filling in the variable overhang regions at an appropriate stage of the process steps), the host organism is transformed or transfected, and cloned, the clones are "streaked" and individual clones are selected for efficient expression by checking them for the production of the desired product, eg hSOD The number of clones to be tested to determine the different production rates for the product depends on and is proportional For example, in the present embodiment, with four length variables and a four-fold sequence degeneration at each of the six nucleotides in the linker, the number of possible recombinant S's is to the extent of length variability as well as to the sequence degeneracy introduced into the synthetic linker 5,440 Usually at least a few hundred, preferably several thousand or more, clones are checked. The assay can be efficiently performed by using Western blots (detection of antibodies to the product) from host cell colonies or viral plaques transferred to nitrocellulose filters or other suitable materials. Alternatively, one may employ electrophoresis and provide a plurality of lanes, each lane being an individual clone; an immediate and direct comparison can be made to determine which clones are most effective in expression, by visualizing the intensity of staining, by autoradiography, or by testing the product band in the Westem Blot Assay. This review will usually suffice, although other quantitative immunoassays or enzyme assays may be used, as appropriate. If desired, the assembled compound can be converted to another host organism that recognizes the regulatory signals of the expression compound or the expression compound modified by introduction of required regulatory signals at appropriate sites to provide efficient expression in an alternative host organism. If desired, the hSOD gene can be linked to secretory leader and processing signals to provide hSOD secretion and processing. Various secretory guidance and processing signals have been described in the literature; see. U.S. Patent Nos. 4,336,336 and 4,338,397, and co-pending applications U.S. Pat. 522,909 of August 12, 1983 and 488857 of April 26, 1983, the important parts of which are incorporated herein by reference. Of particular interest as host organisms are unicellular microorganisms, both prokaryotes and eukaryotes, such as bacteria, algae, fungi and the like. In particular, E. coli, B.subtilis, S. cerevisiae, Streptomyces, Neurospora can be used as host organisms.

Für die Verwendung in einzelligen Mikroorganismen steht eine breite Vielfalt von Vektoren zur Verfügung, wobei diese Vektoren von Plasmiden und Viren abgeleitet sind. Die Vektoren können Einzelkopie- oder niedrige oder hohe Vielfachkopie-Vektoren sein. Die Vektoren können für die Klonierung und/oder Expression verwendet werden. In Anbetracht der einschlägigen Literatur über Vektoren, die Handelsüblichkeit zahlreicher Vektoren und sogar Katalogen, die Vektoren und ihre Restriktionskarten sowie Eigenschaften beschreiben, ist hier keine tiefgreifende Diskussion erforderlich. Es ist bekannt, daß die Vektoren normalerweise Marker einschließen, die die Selektion gestatten; diese Marker können Resistenz gegenüber cytotoxischen Agentien, Prototrophie oder Immunität schaffen. Häufig ist eine Mehrzahl von Markern vorhanden, die für unterschiedliche Eigenschaften sorgen.For use in unicellular microorganisms, a wide variety of vectors are available, these vectors being derived from plasmids and viruses. The vectors may be single copy or low or high multiple copy vectors. The vectors can be used for cloning and / or expression. In light of the pertinent literature on vectors, the commerciality of many vectors, and even catalogs describing vectors and their restriction maps and properties, no profound discussion is needed. It is known that the vectors usually include markers that allow selection; These markers can provide resistance to cytotoxic agents, prototrophy or immunity. Often, there are a plurality of markers that provide different properties.

Zusätzlich zu den Markern weisen die Vektoren ein Replikationssystem auf. Expressionsvektoren weisen zusätzlich gewöhnlich die Regulationssignale sowohl für die Initiierung als auch für die Terminierung der Transkription auf, z.B. Promoter, die Einzelpromoter oder mehrfache Tandempromoter sein können, eine mRNS-Capping-Sequenz, eine TATA-Box, Beschleuniger, Terminatoren, Polyadenylationssequenzen sowie ein Stopkodon oder mehrere, die mit dem Terminator assoziiert sind. Für die Translation liegen häufig eine ribosomale Bindungsstelle sowie ein Stopkodon oder mehrere vor, obwohl Stopkodons gewöhnlich mit einem strukturellen Gen assoziiert sind. Alternativ können diese regulatorischen Sequenzen auf einem Fragment vorliegen, das das strukturelle Gen, welches in den Vektor eingeführt ist, enthält.In addition to the markers, the vectors have a replication system. In addition, expression vectors usually have the regulatory signals for both the initiation and termination of transcription, e.g. Promoters that may be single promoters or multiple tandem promoters, a mRNA capping sequence, a TATA box, promoters, terminators, polyadenylation sequences, and one or more stop codon associated with the terminator. Often, a ribosomal binding site as well as a stop codon or more are present for translation, although stop codons are usually associated with a structural gene. Alternatively, these regulatory sequences may be on a fragment containing the structural gene introduced into the vector.

Gewöhnlich liegen eine Restriktionsstelle oder mehrere vor, die in geeigneter Weise für die Einführung des strukturellen Gens in den Expressionsvektor angeordnet sind. Nach der Einführung kann der das strukturelle Gen enthaltende Expressionsvektor in einen geeigneten Gastorganismus eingeführt werden, wobei der klonierte Gastorganismus für eine wirksame Expression von hSOD sorgt.Usually there is one or more restriction sites suitably arranged for the introduction of the structural gene into the expression vector. After introduction, the expression vector containing the structural gene can be introduced into a suitable host organism, the cloned host organism providing for efficient expression of hSOD.

In einigen Fällen können spezielle Eigenschaften für den Vektor vorgesehen werden, z. B. eine Temperaturempfindlichkeit der Expression, Operatoren oder Aktivatoren für die Regulierung der Transkription und dergleichen. Von besonderem Interesse ist die Fähigkeit, die Transkription durch exogene Maßnahmen zu kontrollieren, z. B. Temperatur, Inducer, Korepressoren und dergleichen, wobei die Transkription durch eine exogene Verbindung, gewöhnlich eine organische Verbindung, induziert oder unterdrückt werden kann.In some cases, special properties may be provided for the vector, e.g. A temperature sensitivity of expression, operators or activators for the regulation of transcription and the like. Of particular interest is the ability to control transcription by exogenous measures, e.g. Temperature, inducer, corepressors and the like, which transcription may be induced or suppressed by an exogenous compound, usually an organic compound.

Wenn das hSOD intrazellulär hergestellt wird, können die Zellen, wenn die Zellkultur eine hohe Dichte erreicht hat, isoliert werden, zweckmäßigerweise durch Zentrifugieren. Nach der Lyse wird das hSOD durch verschiedene Techniken isoliert, z. B. durch Extraktion, Affinitätschromatographie, Elektrophorese;Dialyse oder Kcrr.binationen derselben. Wenn das Produkt sekretorisch abgeschieden wird, können ähnliche Techniken bei dem Nährmedium angewendet werden, das gewünschte Produkt liegt jedoch in einem erheblich höheren Anteil des gesamten Proteins in dem Nährmedium als in dem Zellysat vor. Das gebildete hSOD hat im wesentlichen die gleiche Aminosäuresequenz wie die natürlich auftretende menschliche Superoxiddismutase und unterscheidet sich gewöhnlich um weniger als 5 Aminosäuren, insbesondere um weniger als 2 Aminosäuren. Die rekombinante hSOD (r-hSOD) zeigt im wesentlichen die gleichen biologischen Eigenschaften wie natürlich auftretende hSOD. Die biologischen Eigenschaften schließen immunologische Eigenschaften ein, wobei Antikörper, die an authentischer hSOD erzeugt wurden, über Kreuz mit r-hSOD reagieren. Bei üblichen, für hSOD verwendeten Bioasssays zeigt r-hSOD einen wesentlichen Anteil, gewöhnlich mindestens etwa 10%, vorzugsweise mindestens etwa 50%, insbesondere mindestens etwa 80%, der enzymatischen Aktivität des authentischen hSODs, jeweils bezogen auf Proteingewicht. Eine beispielhafte Assaytechnik wird von Marklund und Marklund, Eur. J. Biochem. (1974)47: 469-474, beschrieben.When the hSOD is produced intracellularly, when the cell culture has reached a high density, the cells can be isolated, conveniently by centrifugation. After lysis, the hSOD is isolated by various techniques, e.g. By extraction, affinity chromatography, electrophoresis, dialysis or combinations thereof. When the product is secreted, similar techniques can be applied to the nutrient medium, but the desired product is present in a significantly higher proportion of the total protein in the nutrient medium than in the cell lysate. The hSOD formed has essentially the same amino acid sequence as the naturally occurring human superoxide dismutase and usually differs by less than 5 amino acids, especially less than 2 amino acids. The recombinant hSOD (r-hSOD) shows essentially the same biological properties as naturally occurring hSOD. The biological properties include immunological properties where antibodies generated on authentic hSOD cross react with r-hSOD. In standard bioassays used for hSOD, r-hSOD shows a substantial proportion, usually at least about 10%, preferably at least about 50%, especially at least about 80%, of the enzymatic activity of the authentic hSOD, based on protein weight. An exemplary assay technique is described by Marklund and Marklund, Eur. J. Biochem. (1974) 47: 469-474.

Ausführungsbeispielembodiment

Die folgenden Beispiele dienen zur Erläuterung der Erfindung und sind nicht im Sinne einer Einschränkung zu verstehen.The following examples serve to illustrate the invention and are not to be understood as limiting.

In der dazugehörigen Zeichnung bedeuten:In the accompanying drawing mean:

Fig. 1: die DNS-Linkersequenz und ein Flußbild mit ihrer Verwendung; *.Fig. 1: the DNA linker sequence and a flow chart with their use; *.

Fig.2und3: Flußdiagramme der Herstellung von plot5/SOD.Figures 2 and 3 are flowcharts of the preparation of plot5 / SOD.

Fig.4: die Sequenz sowohl des Kodierungsstranges von menschlicher SOD-cDNS (5'—» 3') und das sich ergebende Translationsprodukt.Figure 4: the sequence of both the coding strand of human SOD cDNA (5'-3 ') and the resulting translation product.

Fig. 5: die Sequenz des isolierten menschlichen SOD-Gens, das in dem folgenden experimentellen Abschnitt beschrieben wird. Fig. 6: eine Restriktionskarte des isolierten menschlichen SOD-Gens, das in dem folgenden experimentellen AbschnittFig. 5: the sequence of the isolated human SOD gene described in the following experimental section. Fig. 6: a restriction map of the isolated human SOD gene shown in the following experimental section

beschrieben wirdis described

Experimenteller Teil Experimental part

Molekulare Klonierung von hSOD cDNS. Molecular cloning of hSOD cDNA.

Aus der Leber eines erwachsenen Menschen wurde eine Gesamt-RNS gewonnen, und zwar mittels der Guanidinthiocyanat/ Lithiumchlorid-Methode (Cathala et al., DNA [1983] 2:329-335). PoIyA-RNS wurde verwendet, um doppelsträngige cDNS zu synthetisieren (Maniatis et al., Molecular Cloning, 213-242, Cold Spring Harbor, 1982). Diese wurde über eine Sepharose-CL4B-Säule geschickt, um sie bezüglich cDNS größer als 350 BP anzureichern (Fiddes und Goodman, Nature [1979], 281:351-356). die cDNS wurde an der Pstl-Stelle von plot 4, eingeführt, dies ist ein pBR322-Derivat mit der folgenden, die Pstl-EcoRI-Stelle ersetzenden Sequenz:From the adult human liver, total RNA was obtained by the guanidine thiocyanate / lithium chloride method (Cathala et al., DNA [1983] 2: 329-335). PolyA-RNA was used to synthesize double-stranded cDNAs (Maniatis et al., Molecular Cloning, 213-242, Cold Spring Harbor, 1982). This was passed over a Sepharose CL4B column to enrich for cDNA greater than 350 bp (Fiddes and Goodman, Nature [1979], 281: 351-356). the cDNA was introduced at the PstI site of plot 4, this is a pBR322 derivative with the following sequence replacing the PstI-EcoRI site:

Pstl Hinfl AIuIPstl Hinfl AIu I

1 GGTGAATCCGTAATCATGGTCATAGCTGTTTCCTGTGTGAAATTGTTATCCGCTC ACGTCCACTTAGGCATTAGTACCAGTATCGACAAAGGACACACTTTAACAATAGGCGAG Hphl1 GGTGAATCCGTAATCATGGTCATAGCTGTTTCCTGTGTGAAATTGTTATCCGCTC ACGTCCACTTAGGCATTAGTACCAGTATCGACAAAGGACACACTTTAACAATAGGCGAG Hph l

MndIIAlu.1MndIIAlu.1

60 ACAATTCCACACATTATACGAGCCGATGATTAATTGTCAACAGCTCATTTCAGAATATTT TGTTAAGGTGTGTAATATGCTCGGCTACTAATTAACAGTTGTCGAGTAAAGTCTTATAAA60 ACAATTCCACACATTATACGAGCCGATGATTAATTGTCAACAGCTCATTTCAGAATATTT TGTTAAGGTGTGTAATATGCTCGGCTACTAATTAACAGTTGTCGAGTAAAGTCTTATAAA

EcoRI 20 GCCAGAACCGTTATGATGCGGEcoRI 20 GCCAGAACCGTTATGATGCGG

CGGTCTTGGCAATACTACGCCTTAACGGTCTTGGCAATACTACGCCTTAA

Für die cDNS-Einführung wurde dieOligo-dG:dC-Tailing-Methode (Maniatis et al., s.o.) verwendet. Ein E. coli-Stamm D1210 wurde mit diesem Gemisch transformiert. Die Transformanten wurden auf L-Agar selektioniert, das 10,u,g/ml Tetracyclin enthielt (Kushner, S.R. [1978] in: Genetic Engineering, Hrsg. Boyer, H.B. und Nicosia, S., [Elsevier/North Holland, Amsterdam] S. 17). Plasmid-DNS mit einer Leber -cDNS-Bibliothek wurde direkt aus ca. 62 000 rekombinanten Kolonien, plattiert bei einer Dichte von ca. 3000 Kolonien pro Petrischale mit 9cm Durchmesser, hergestellt (Maniatis et al.. Molecular Cloning, S. 86-94, Cold Spring Harbor 1982).For cDNA introduction, the oligo dG: dC tailing method (Maniatis et al., Supra) was used. An E. coli strain D1210 was transformed with this mixture. The transformants were selected on L-agar containing 10, μ, g / ml tetracycline (Kushner, SR [1978] in: Genetic Engineering, ed. Boyer, HB and Nicosia, S., [Elsevier / North Holland, Amsterdam] P. 17). Plasmid DNA with a liver cDNA library was prepared directly from approximately 62,000 recombinant colonies plated at a density of approximately 3000 colonies per 9cm diameter Petri dish (Maniatis et al., Molecular Cloning, pp. 86-94 , Cold Spring Harbor 1982).

Isolierung von r-hSOD-Klonen.Isolation of r-hSOD clones.

Der Stamm D1210 wurde mit der Leber-cDNS-Bibliothek retransformiert, wobei etwa 40000 Klone auf 9 Petrischalen mit 14cm Durchmessergezüchtet wurden. Nach Übertragung der Kolonien auf Nitrocellulosepapierund Chloramphenicolverstärkung der Plasmid- DNS wurden die Zellen lysiert und die Filter für die Hybridisierung vorbereitet (Ish-Horowicz and Burke, Nucleic Acids Research [1981] 9:2989:2998). Oligonucleotidproben wurden für das Screening durch Hybridisierung verwendet, wobei die Proben aus enzymatisch radiomarkierten, chemisch synthetisierten DNS-Molekülen, komplementär zu der die Aminosäurereste 19-24 kodierenden mRNS des Proteins, bestanden (Jabusch et al., s.o.; Barraetal., s.o.); das Gemisch hatte die folgenden Sequenzen:Strain D1210 was retransformed with the liver cDNA library, with approximately 40,000 clones grown on 9 14cm diameter Petri dishes. After transferring the colonies to nitrocellulose paper and chloramphenicol enhancement of the plasmid DNA, the cells were lysed and the filters prepared for hybridization (Ish-Horowicz and Burke, Nucleic Acids Research [1981] 9: 2989: 2998). Oligonucleotide probes were used for hybridization screening where the samples consisted of enzymatically radiolabeled, chemically synthesized DNA molecules complementary to the protein mRNA encoding amino acid residues 19-24 (Jabusch et al., Supra; Barraetal., Supra); the mixture had the following sequences:

3' TTA AAA CTT GTT TTT CT 5'3 'TTA AAA CTT GTT TTT CT 5'

GGCCCGGCCC

wobei sämtliche der angegebenen Möglichkeiten für die Kodierung der Peptidsequenz hergestellt wurden (32fache Degeneration).all of the possibilities given for the coding of the peptide sequence were established (32-fold degeneration).

Die Proben wurden mit 32P bis zu einer spezifischen Aktivität von 1-3 x 108cpm/>g markiert und vordem Einsatz mit Millipore (0,45μπι) filtriert. Die Filter wurden 6 Stunden lang bei 3O0C in 4x SSC, 2x Denhardts-Lösung, 4OmM Natriumphosphat, pH 7,5, 300μg/ml schallbehandelter (sonicated) DNS aus Lachsgonaden (Hoden) vorhybridisiert. Die Hybridisierung erfolgte 20 Stunden bei 300C in dergleichen Lösung mit einem Gehalt an 2 χ 106cprn/ml hSOD DNS-Probe (Reste 19-24). Die Filter wurden in4x SSC gewaschen, einmal 15 Minuten lang bei Raumtemperatur und zweimal 15 Minuten lang bei 30°C, trocken geblottet und mit einem Verstärkungsschirm 24 Stunden bei -7O0C autoradiographiert.The samples were labeled with 32 P to a specific activity of 1-3 x 10 8 cpm / g and filtered before use with Millipore (0.45μπι). The filters were prehybridized at 3O 0 C in 4x SSC, 2x Denhardt's solution, 4OmM sodium phosphate, pH 7.5, 300μg / ml sonicated (sonicated) DNA from Lachsgonaden (testes) for 6 hours. Hybridization was performed for 20 hours at 30 0 C in the same solution containing 2 χ 10 6 CpRn / ml hSOD DNA probe (residues 19-24). The filters were washed in4x SSC, once for 15 minutes at room temperature and twice, blotted dry for 15 minutes at 30 ° C and autoradiographed with an intensifying screen for 24 hours at -7O 0 C.

Bereiche auf den Masterplatten, die verdoppelten positiven Signalen entsprachen, wurden in L-Brühe und Plasmid-DNS, hergestellt durch die Miniscreen-Methode (Maniatis et al.. Molecular Cloning, 178,368-369, Cold Spring Harbor 1982) überführt. Diese DNS wurde mit Pstl geschnitten und der Southem-Blot-Analyse unterworfen (Southern, J. MqI. Biol. [1975], 98:503-517), wobei anfänglich mit den zuvor markierten Proben (Aminosäureresten 19-24) hybridisiert wurde, und anschließend mit zusätzlichen radiomarkierten Proben, abgeleitet von Arninosäureresten 109-114 mit den folgenden Sequenzen (alle mögliche Variationen, 72fache Degeneration), vorliegend als ein Gemisch:Regions on the master plates that corresponded to duplicated positive signals were transferred to L broth and plasmid DNA prepared by the Miniscreen method (Maniatis et al., Molecular Cloning, 178, 368-369, Cold Spring Harbor, 1982). This DNA was cut with PstI and subjected to Southern blot analysis (Southern, J. MqI. Biol. [1975], 98: 503-517), initially hybridizing with the previously labeled probes (amino acid residues 19-24), and subsequently with additional radiolabeled samples derived from Arninoic Acid residues 109-114 with the following sequences (all possible variations, 72 fold degeneracy) present as a mixture:

3' CTA GTA ACA TAA TAA CC 5' G G GG G T T3 'CTA GTA ACA TAA TAA CC 5' G G GG G T T

Ein Plasmidpool (pSOD1) enthielt einen cDNS-Einsatz von 520BP, der mit beiden Proben hybridisierte. Nach Reinigung der Kolonie wurde Plasmid-DNS aus diesem Klon hergestellt und nach der Methode von Maxam und Gilbert (Proc. Natl. Acad. Sei. USA [1977] 74:560-564) mit den aus Fig. 4 ersichtlichen Ergebnissen sequenziert. Der hSODcDNS-Klon pSOD1 stellt dieOne plasmid pool (pSOD1) contained a 520BP cDNA insert that hybridized to both samples. After purification of the colony, plasmid DNA was prepared from this clone and sequenced according to the method of Maxam and Gilbert (Proc Natl. Acad. Sei. USA [1977] 74: 560-564) with the results shown in FIG. The hSODcDNS clone pSOD1 represents the

Kodierungsregion für die Aminosäuren 10-153 von hSOD, ein einzelnes Translationsstopkodon und eine 3' nichttranslatierte Region dar. In der Konstruktion des Expressionsvektors ist die Basensequenz der die Aminosäuren 1-9 kodierenden Region daher abgeleitet von der publizierten Aminosäuresequenz des hSOD (Jabusch et al., s.o.; Barra et al., s.o.) und chemisch als ein Teil des variablen Linkersegmentes (siehe unten) synthetisiertCoding region for amino acids 10-153 of hSOD, a single translation stop codon and a 3 'untranslated region. In the construction of the expression vector, the base sequence of the amino acid 1-9 coding region is therefore derived from the published amino acid sequence of the hSOD (Jabusch et al. , so; Barra et al., supra) and synthesized chemically as part of the variable linker segment (see below)

Konstruktion des Plasmids plot5- (vgl., Fig. 2 und 3). Construction of plasmid plot5- (cf., Figures 2 and 3).

Das Plasmid ploti, enthaltend einen hybriden trp-lac („tac")-Promoter (DeBoer et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA [1983] 80:21-25) wurde durch Gelisolierung des 180B.P. HgiA-Tagl-Fragmentesdes ptrpLI (Edman et al.. Nature [1981] 291:503-506) und des 58BP Hpall-EcoRI-Fragmentes aus pKB268 (Backman and Ptashne, Cell [1978] 13:65—71) sowie Ligation dieser Fragmente zu pBR322, abgebaut mit Pstl und EcoRI, konstruiert. Das erhaltene Plasmid wurde verwendet, um den Stamm D1210zu transformieren, und Klone wurden bezüglich derTetracyclinresistenzselektioniert. Das Plasmid plot3 wurde durch Gelisolierung des 155BP Fnu4Hi-EcoRI-Fragmentes von ploti, enthaltend den tac-Promoter, wobei die Fnu4HI-Stelle unter Verwendung des Klenow-Fragmentesder DNS-Polymerase I („pol I K" oder „pol. Kien.") endpassend gemacht wurde, und aus dem 18BPEcORl-Pstl-Polylinker-Fragment von πΑΝ7 der folgenden Sequenz:The plasmid ploti containing a hybrid trp-lac ("tac") promoter (DeBoer et al., Proc Natl Acad., USA, 1983: 80: 21-25) was isolated by gel isolation of 180B.P. Tgl fragment of ptrpLI (Edman et al., Nature [1981] 291: 503-506) and the 58Bp Hpall-EcoRI fragment from pKB268 (Backman and Ptashne, Cell [1978] 13: 65-71) and ligation of these fragments The resulting plasmid was used to transform strain D1210 and clones were selected for tetracycline resistance Plasmid plot3 was isolated by gel isolation of the 155BP Fnu4Hi-EcoRI fragment from ploti containing the tac promoter wherein the Fnu4HI site was made end-fitting using the Klenow fragment of DNA polymerase I ("pol IK" or "pol.kien."), and from the 18BPEcORI PstI polylinker fragment of πΑΝ7 of the following sequence:

EcoRI HindlllEcoRI HindIII

51 AATTCCCGGGGATCCGTCGACCTGCAGATCTCTAGA5 1 AATTCCCGGGGATCCGTCGACCTGCAGATCTCTAGA

3' GGGCCCCTAGGCAGCTGGACGTCTAGAGATCTTCGA3'GGGCCCCTAGGCAGCTGGACGTCTAGAGATCTTCGA

IlIl

Sail Pstl Sai l Pst l

konstruiert.constructed.

Diese Fragmente wurden mit Gel-gereinigtem, mit EcoRI abgebautem pBR322 ligiert, unter Verwendung von pol IK endpassend gemacht, worauf sich der Abbau mit Pstl und die Gel reinigung anschloß. Dieses Ligationsgemisch wurde verwendet, um den Stamm D1210 zu transformieren, wobei die Selektion auf L-Agar-Platten, enthaltend 10^g/ml Tetracyclin, erfolgte. Das Plasmid plot5 wurde hergestellt, indem man zunächst ein Plasmid mit dem 7rAN7-Polylinker als eine EcoRI-Pvull-Substitution in pBR322 konstruierte. Hierfür wurde das Plasmid πΑΝ7 mit Hindlll abgebaut und durch Auffüllen mit pol I K endpassend gemacht, und ein synthetisches, selbstkomplementäres Pvull-Linkermolekül (d(5'-CCAGCTGG-3')) wurde mit dem oben modifizierten Plasmid 77AN7 ligiert. Nach dem Abbau mit EcoRI und Pvull wurde das erhaltene 44BP-Polyklinker-Fragment (mit 4basigen Überhängen) gelisoliert und zu pBR322 als eine EcoRI-Pvull-Substitution kioniert.These fragments were ligated with gel-purified Eco RI degraded pBR322, mated using pol IK followed by digestion with Pst I and gel purification. This ligation mixture was used to transform strain D1210, selecting for L agar plates containing 10 ^ g / ml tetracycline. Plasmid plot5 was prepared by first constructing a plasmid with the 7rAN7 polylinker as an EcoRI-Pvull substitution in pBR322. For this purpose, the plasmid πΑΝ7 was degraded with HindIII and made fit by filling with pol I K, and a synthetic, self-complementary Pvull linker molecule (d (5'-CCAGCTGG-3 ')) was ligated with the above-modified plasmid 77AN7. After digestion with EcoRI and Pvull, the resulting 44BP polyclinker fragment (with 4 base overhangs) was gel isolated and cloned into pBR322 as an EcoRI-Pvull substitution.

Das Plasmid plot3 wurde mit EcoRI abgebaut. Nach Phenol-Chloroform-Extraktion und Ethanolausfällung wurden die vorstehenden 5'-Enden durch Behandlung mit S 1-Nuclease endpassend gemacht (Palmiter, Biochemistry [1974] 13:3606-3615; Hallewell and Emtage, Gene [1980] 9:27-47. Nach Phenol-Chloroform-Extraktion und Ethanolausfällung wurde die DNS mit CIaI abgebaut und durch pol I K endpassend gemacht, und das 237BP-Fragment, das den tac-Promoter enthielt, durch präparative Polyacrylamidgelelektrophorese isoliert. Dieses endpassende tac-Promoter-Fragment wurde dann an der Pvull-Stelle des pBR322-Polylinker-Plasmids (vgl. Fig.3) eingeführt, und es wurden Klone erhalten, in denen der tac-Promoter die Transkription in Richtung auf das /3-Lactamase-Gen von pBR322 richteteThe plasmid plot3 was degraded with EcoRI. After phenol-chloroform extraction and ethanol precipitation, the 5 'ends above were made end-to-end by treatment with S 1 nuclease (Palmiter, Biochemistry [1974] 13: 3606-3615; Hallewell and Emtage, Gene [1980] 9: 27-47 After phenol-chloroform extraction and ethanol precipitation, the DNA was digested with CIaI and made final by pol IK, and the 237BP fragment containing the tac promoter was isolated by preparative polyacrylamide gel electrophoresis This tac-promoter tail fragment was then ligated the Pvull site of the pBR322 polylinker plasmid (see Fig. 3) was introduced, and clones were obtained in which the tac promoter directed transcription toward the / 3-lactamase gene of pBR322

Konstruktion von plot5-Derivaten, die r-hSOD exprimieren. Construction of plot5 derivatives expressing r-hSOD.

Die synthetischen DNS-Moleküle F(26), C(16), B(31), D(11), E (13) und 4(24) gemäß Fig. 1 wurden durch die Phosphoramiditmethode synthetisiert. Der Einzelstrang 4(24) wurde unter Verwendung sämtlicher vier Basen an jedem Ort, wo X angegeben ist, hergestellt. Weiterhin wurde Siliciumdioxid aus der Synthese des 24meren herausgenommen, so daß einzelsträngige 21 mere, 22mere und 23mere zusätzlich zu den 24meren erhalten wurden. Nach der Entfernung von dem Siliciumdioxidträger wurden die vier Mischungen in geeigneten Anteilen kombiniert, um für äquimolare Mengen eines jeden der möglichen Einzelstränge zu sorgen. Diese Mischung wurde als ein einziges Produkt in den nachfolgenden Schritten behandelt. Die Moleküle F(26), C(16), B(31) und D(11) wurden in äquimolaren Mengen zusammengemischt, 10//,g wurden unter Verwendung von T4-Poiynucleotidkinase phosphoryliert. Nach Phenol-Ether-Extraktion wurden die zusätzlichen nicht-phosphorylierten « synthetischen DNS-Moleküle 4(24) und E(13) zugegeben, so daß alle Fragmente äquimolar waren. Die äquimolare Mischung enthielt 13/ig DNS in 133/xl eines 0,3x Kinase-Puffers.Synthetic DNA molecules F (26), C (16), B (31), D (11), E (13), and 4 (24) shown in FIG. 1 were synthesized by the phosphoramidite method. Single strand 4 (24) was prepared using all four bases at each location where X is given. Further, silica was taken out of the synthesis of the 24mer to give single-stranded 21mers, 22mers and 23mers in addition to the 24mers. After removal from the silica support, the four mixtures were combined in appropriate proportions to provide equimolar amounts of each of the possible single strands. This mixture was treated as a single product in the subsequent steps. Molecules F (26), C (16), B (31) and D (11) were mixed together in equimolar amounts, 10%, g were phosphorylated using T4 polynucleotide kinase. After phenol-ether extraction, the additional non-phosphorylated synthetic DNA molecules 4 (24) and E (13) were added so that all fragments were equimolar. The equimolar mixture contained 13 μg of DNA in 133 / μl of a 0.3x kinase buffer.

Nach dem Abkühlen durch Kühlen bei gleichmäßiger Geschwindigkeit von 70°C auf 200C innerhalb von 60 Minuten wurden die Einzelstränge zusammenligiert, und zwar mit T4-Ligase in 200/xl Ligationsmischung bei 14°C innerhalb von 4 Stunden; anschließend wurde mit Phenol-Chloroform extrahiert, mit Ethanol ausgefällt und die 5'-Enden von 4(24) und E(13) unter Verwendung von T4-Polynucleotidkinase phosphoryliert (Maniatis et al., s.o.). Es wurde die präparative Polyacrylamidgelelektrophorese verwendet, um das vollständig ligierte 53BP-Material mit 5'- und 3'-Überhängen zu isolieren. Das oben genannt gereinigte Fragmentgemisch wurde dann an das 460BPTagl-Pstl-Segment der hSOD cDNS ligiert, wie in Fig. 1 gezeigt. Dieses Segment war seinerseits konstruiert worden, indem man da 454BPTagl-Alul hSOD-Fragment isolierte, es mit pol I Kendpasoend machte und es in plot5 zwischen seinen EcoRI und Sall-Stellen einführte (vgl. Fig. 3), welches in ähnlicher Weise endpassend gemacht worden war. Nach der Herstellung der Plasmid-DNS aus dieser Rekombinante wurde das 460BP Tagl-Pstl hSOD-Fragment durch präparative Polyacrylamidgelelektrophorese isoliert. Nach der Extraktion und Ausfällung wurde das 515BP-Fragment, das sich bei dem Vereinen des synthetischen Fragmentes mit dem 460BP Tagl-Pstl-hSOD-Fragmentes ergab, mit pol I K(525-528BP) aufgefüllt und anschließend mit Sail abgebaut; das erhaltene 519-522BP hSOD-Fragment wurde mit Polyacrylamidgelelektrophorese isoliert. Dieses Fragment wurde anschließend in plot5 eingeführt, welches mit mit Pvull und Sail abgebaut und anschließend mit alkalischer Phosphatase behandelt worden war. Die erhaltenen Plasmide wurden verwendet, um den Stamm D1210 zu transformieren. Nach der Transformation des Stammes D1210 erhaltene Rekombinanten wurden auf L-Agar mit einem Gehalt von 100 /xg/ml Ampicillin selektioniert, wobei ein Satz von Klonen (Bezeichnung plot5/SOD) mit variabler SOD-Expression erhalten wurdeAfter cooling by cooling at a uniform rate from 70 ° C to 20 0 C within 60 minutes, the single strands were ligated together with T4 ligase in 200 / ml ligation mix at 14 ° C within 4 hours; then phenol-chloroform was extracted, ethanol precipitated, and the 5 'ends of 4 (24) and E (13) phosphorylated using T4 polynucleotide kinase (Maniatis et al., supra). Preparative polyacrylamide gel electrophoresis was used to isolate the fully ligated 53BP material with 5 'and 3' overhangs. The above-purified fragment mixture was then ligated to the 460BPTagl-PstI segment of hSOD cDNA as shown in FIG. This segment, in turn, was constructed by isolating 454BPTagl-Alul hSOD fragment, making it kendpasoend with pol I, and inserting it into plot5 between its EcoRI and Sall sites (see Figure 3), which similarly made end-fitting had been. After preparation of the plasmid DNA from this recombinant, the 460BP TagI-PstI hSOD fragment was isolated by preparative polyacrylamide gel electrophoresis. After extraction and precipitation, the 515BP fragment resulting from combining the synthetic fragment with the 460BP TagI-PstI hSOD fragment was filled in with pol IK (525-528BP) and then digested with Sail; the resulting 519-522BP hSOD fragment was isolated by polyacrylamide gel electrophoresis. This fragment was then introduced into plot5, which was digested with Pvull and Sail and subsequently treated with alkaline phosphatase. The resulting plasmids were used to transform strain D1210. Recombinants obtained after transformation of strain D1210 were selected on L-agar containing 100 / g / ml ampicillin to yield a set of clones (plot5 / SOD) with variable SOD expression

r-hSOD-Expression und plotö/SOD-Plasmid-Selektion. r-hSOD expression and ploto / SOD plasmid selection.

Für die Analyse der gesamten E. coli-Proteine durch SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese wurden Übernachtkulturen 30fach in 1 ml L-Brühe verdünnt und unter Schütteln bei 37°C 90 Minuten lang bis zu einem O.D.650 von etwa 0,2 gezüchtet. IPTG (Isopropylthiogalactosid) wurde bis zu einer Endkonzentration von 2 mM zugegeben, und die Kulturen wurden weitere 3 StundenFor analysis of total E. coli proteins by SDS-polyacrylamide gel electrophoresis, overnight cultures were diluted 30-fold in 1 ml L broth and cultured with shaking at 37 ° C for 90 minutes to an OD 650 of approximately 0.2. IPTG (isopropyl thiogalactoside) was added to a final concentration of 2mM and cultures were further 3 hours

inkubiert. Nach dem Zentrifugieren wurde das Zellpellet erneut in 50/xl eines Puffers für die Gelbeschickung suspendiert (Laemmli, Nature [1970] 227:680—685) und durch 3fache Wiederholung des folgenden Verfahrens lysiert: 1 Minute einfrieren, 2 Minuten kochen, 10 Sekunden wirbeln (Vortexing).incubated. After centrifugation, the cell pellet was resuspended in 50 μl of a gel-loading buffer (Laemmli, Nature [1970] 227: 680-685) and lysed by repeating the following procedure 3 times: freeze for 1 minute, cook for 2 minutes, vortex for 10 seconds (vortexing).

Nach der Auflösung durch Elektrophorese (Laemmli, s.o.) wurden die Porteinbanden mit Coomasie-Blau angefärbt und die Menge der von jedem Klon produzierten SOD abgeschätzt; diese Ergebnisse wurden anschließend bestätigt unter Verwendung von Western-Blots mit Antikörpern gegenüber authentischer menschlicher SOD. Über dreihundert Klone wurden analysiert, sie zeigten Ausmaße derSOD-Expression, die zwischen wenig oder null bis zu geschätzten Mengen von 5-10% des gesamten löslichen Zellproteins schwankten. Ergebnisse für sechs der über dreihundert Klone sind in Tabelle 1 wiedergegeben, zusammen mit der besonderen Sequenz für das DNS-Molekül 4(24), bestimmt nach der Methode von Maxam and Gilbert, S.O. Tabelle 1: Sequenz und Menge der SOD-Produktion in E. coliAfter dissolution by electrophoresis (Laemmli, supra), the porte bands were stained with Coomasie Blue and the amount of SOD produced by each clone estimated; these results were subsequently confirmed using Western blots with antibodies to authentic human SOD. Over three hundred clones were analyzed, showing levels of SOD expression that varied between low or zero to estimated levels of 5-10% of total soluble cell protein. Results for six of the over three hundred clones are presented in Table 1, along with the particular sequence for DNA molecule 4 (24), as determined by the method of Maxam and Gilbert, S.O. Table 1: Sequence and amount of SOD production in E. coli

Sequenze:Sequenze: ATG GCXATG GCX ACXACX ungefähres Gewichtapproximate weight Klonclone 5'-XXXX5'-XXXX AA GG Prozent des GesamtproteinsPercent of total protein pSODX8pSODX8 AACAAACA TT GG 5%5% pSOD11pSOD11 GTATGTAT AA AA 10%10% pSODx16pSODx16 ACATACAT AA AA 5%5% pSOD5pSOD5 AATCAATC TT TT 10%10% pSOD16pSOD16 ATTTATTT AA GG 10%10% pSOD18pSOD18 AACTAACT 7,5%7.5%

Prüfungen auf r-hSODTests on r-hSOD

Für Enzym assay werden, wie vorstehend beschrieben, 100ml-Kulturen induziert. Lösliche Zellextrakte wurden hergestellt, indem Zellpellets 10 χ 20 Sekunden mit einem gleichen Volumen von Glasperlen (Braun AG; Durchmesser 0,45-0,5mm) und einem gleichen Volumen von Assaypuffer (5OmM Triscacodylat, pH 8.2, ImM Diethylentriaminpentaessigsäure) in einem 1,5ml Mikrozentrifugenrohr bei 40C durch Verwirbelung (Vortexing) behandelt wurden. Zellbruchstücke wurden pelletiert, indem man das Röhrchen eine Minute in einer Mikrozentrifuge (Beckmann) rotieren ließ. Die überstehende Flüssigkeit wurde gegen den Assaypuffer, enthaltend 1 mM jeweils Zinksulfat und Kupfersulfat, 4 Stunden lang 4°C dialysiert.For enzyme assay, as described above, 100ml cultures are induced. Soluble cell extracts were prepared by treating cell pellets for 10χ 20 seconds with an equal volume of glass beads (Braun AG, diameter 0.45-0.5 mm) and an equal volume of assay buffer (50 mM triscacodylate, pH 8.2, ImM diethylenetriaminepentaacetic acid) in a 1, 5ml microcentrifuge tube at 4 0 C by vortexing. Cell debris were pelleted by rotating the tube for one minute in a microcentrifuge (Beckmann). The supernatant was dialyzed against the assay buffer containing 1 mM each of zinc sulfate and copper sulfate at 4 ° C for 4 hours.

Die SOD-Assays wurden mit der Pyrogallolmethode durchgeführt (Marklund and Marklund, s.o.). In den Reaktionsmischungen wurden 0,2mM Pyrogallol in Assaypuffer verwendet, und die Reaktionsgeschwindigkeiten wurden über eine 5-Minuten-Periode unter Verwendung eines Hewlett-Packard 8450-Spektrophotometers bei 420 nm bestimmt. Es wurden vier verschiedene Assayproben hergestellt: lösliche E. coli-Extrakte; authentische hSOD; und jeweils eine der vorherigen Proben, vorinkubiert mit Kaninchenantikörpern gegenüber authentischer hSOD. Jede Probe wurde in einer Küvette eine Minute bei 25°C vor der Zugabe des Pyrogallol und der Prüfung bei 25CC inkubiert. Die Antikörperproben wurden 10 Minuten bei Raumtemperatur in Assaypuffer mit 5μΙ Antikörper präinkubiert. Diese Bedingungen erwiesen sich als ausreichend, um 100 ng reiner hSOD zu inaktivierenThe SOD assays were performed by the pyrogallol method (Marklund and Marklund, supra). In the reaction mixtures, 0.2 mM pyrogallol in assay buffer was used and reaction rates were determined over a 5 minute period using a Hewlett-Packard 8450 spectrophotometer at 420 nm. Four different assay samples were prepared: soluble E. coli extracts; authentic hSOD; and one each of the previous samples preincubated with rabbit antibodies to authentic hSOD. Each sample was incubated in a cuvette for one minute at 25 ° C before adding the pyrogallol and the test at 25 C C. The antibody samples were preincubated for 10 minutes at room temperature in assay buffer with 5μΙ antibody. These conditions were found to be sufficient to inactivate 100 ng of pure hSOD

Die folgende Tabelle 2 zeigt die Ergebnisse für einen der untersuchten Klone (pSOD x 8): The following Table 2 shows the results for one of the investigated clones (pSOD x 8):

Tabelle 2: Enzymatische Aktivität von menschlichem Cu-Zn SOD, hergestellt in E. CoIi (Stamm D1210 [pSODX8]) Enzymherstellung SOD-Einheiten/mg ProteinTable 2: Enzymatic activity of human Cu-Zn SOD made in E. coli (strain D1210 [pSODX8]) Enzyme production SOD units / mg protein

reines menschliches Cu-Zn SOD 15,384pure human Cu-Zn SOD 15,384

pSODX8 Proteinextrakt 3,017pSODX8 protein extract 3.017

pSODX8 ProteinextraktpSODX8 protein extract

vorinkubiert mit antimenschlichem 685pre-incubated with anti-human 685

SOD-Antikörperaus Kaninchen plot5-Proteinextrakt 470SOD antibody from rabbit plot5 protein extract 470

plot 5-Proteinextraktplot 5 protein extract

vorinkubiert mit antimenschlichem 485pre-incubated with anti-human 485

SOD-Antikörperaus KaninchenRabbit SOD antibodies

Diese Daten zeigen, daß annähernd 15% des gesamten löslichen Zellproteins hSOD waren (unter der Voraussetzung, daß die reine menschliche Cu-Zn SOD, die als Vergleich verwendet wurde, vollständig aktiv war). Zusammengenommen mit den elektrophoretischen Daten (siehe oben), die anzeigen, daß 5-10% des gesamten löslichen Zellproteins als hSOD wanderten, hat es den Anschein, daß eine erhebliche Fraktion, vermutlich ein überwiegender Anteil des produzierten hSOD, aktiv ist. Die korrekte Sequenz des klonierten Gens wurde nach der Methode von Maxam und Gilbert, s.o., bestimmt. Zusätzlich wurden die ersten 12 Aminosäuren an dem N-Ende durch automatisierten Edman-Abbau bestimmt. Die ermittelte Sequenz der Aminosäuren war die folgende:These data indicate that approximately 15% of the total soluble cell protein was hSOD (provided that the pure human Cu-Zn SOD used as a control was fully active). Taken together with the electrophoretic data (see above) indicating that 5-10% of total soluble cell protein migrated as hSOD, it appears that a substantial fraction, presumably a predominant portion of the hSOD produced, is active. The correct sequence of the cloned gene was determined by the method of Maxam and Gilbert, supra. In addition, the first 12 amino acids at the N-terminus were determined by automated Edman degradation. The determined sequence of the amino acids was the following:

ALA-THR-LYS-ALA-VAL-(CYS)-VAL-LEU-LYS-GLY-ASp-GLY-ALA-THR-LYS-ALA-VAL (CYS) -Val-Leu-Lys-Gly-Asp-Gly

Der erste ermittelte ALA-Rest war in einer molaren Konzentration etwa gleich derjenigen des Eingabepeptids vorhanden; dies zeigt die Abwesenheit eines blockierten Aminoendes an. Dr-: CYS-Rest wurde durch die verwendete Methode Cer Aminosäureanalyse nicht gefunden, auf seine Anwesenheit wurde jedoch aufgrund der Nucleotidsequenz geschlossen. Somit wurde das (N-Formyl-)-methionin aus dem bakteriellen Expressionsprodukt entfernt, und das Material wies die korrekten Aminosäuresequenzen auf, d.h. identisch mit denjenigen, diefürzytoplasmische hSOD-Reste 1-10 beschrieben wurden, wobei jedoch der N-terminale ALA-Rest nicht azetyliert war. Weiterhin wanderte das in E. coli produzierte Polypeptid langsamer als das natürliche Protein in der 1 % Agarosegelelektrophorese (pH 8.6), die Unterschiede in der Ladung mißt (Corning Universal Electrophoresefilm, angefärbt gemäß Clausen, Immunochemical Technique, S. 530-531), auch dies zeigt das Fehlen des Acetylierung. Zusätzlich zeigen Analysen der Trypsinpeptide sowohl bei dem bakteriellen hSOD-Polypeptid und dem gereinigten, authentischen (acetylierten) natürlichen Protein, daß alle Trypsinpeptide identisch sind, mit der Ausnahme des N-terminalen Peptids, das unterschiedlich wandert, d. h. mit einer Ladung, die für ein Peptid ohne N-Acetylgruppe zu erwarten ist.The first ALA residue determined was present in a molar concentration about equal to that of the input peptide; this indicates the absence of a blocked amino end. Dr-: CYS residue was not found by the method Cer amino acid analysis used, but its presence was deduced due to the nucleotide sequence. Thus, the (N-formyl) methionine was removed from the bacterial expression product and the material had the correct amino acid sequences, ie, identical to those described for cytoplasmic hSOD residues 1-10, but with the N-terminal ALA residue was not acetylated. Furthermore, the polypeptide produced in E. coli also migrated slower than the natural protein in 1% agarose gel electrophoresis (pH 8.6), which measures differences in charge (Corning Universal Electrophoresis stained according to Clausen, Immunochemical Technique, pp. 530-531) this shows the absence of acetylation. In addition, analyzes of the trypsin peptides in both the bacterial hSOD polypeptide and the purified, authentic (acetylated) natural protein show that all trypsin peptides are identical, with the exception of the N-terminal peptide, which migrates differently, ie, with a charge corresponding to a Peptide without N-acetyl group is to be expected.

Expression in Hefe.Expression in yeast.

Für den Transfer des r-hSOD-Gens auf einen Hefevektor wurden die plot5/SOD-Plasmidklone bezüglich eines Ncol-Restriktionsortes an dem 5'-Ende der Kodierungsregion überprüft. Für diese Plasmide, bei denen die variablen Nucleotide inFor the transfer of the r-hSOD gene to a yeast vector, the plot5 / SOD plasmid clones were checked for an Ncol restriction site at the 5 'end of the coding region. For these plasmids, where the variable nucleotides in

5'-Stellung zu dem ATG-Initiationskodon CC sind, schafft die Sequenz CCATGG eine Ncol-Stelle. Die Klone wurden geprüft, und sin Klon wurde ausgewählt und phSOD bezeichnet.5 'to the ATG initiation codon CC, the sequence CCATGG creates an Ncol site. The clones were tested and a clone was selected and designated phSOD.

Das Plasmid phSOD wurde mit Ncol und Sail abgebaut; es wurde ein 55OBP-Fragment erhalten, das ein nichttranslatiertes Nucleotid am 5'-Ende und die gesamte Kodierungsregion für hSOD einschloß. pPGAP (ein Hefeexpressionsvektor, der den GAP-Promotor trägt, hergestellt wie unten beschrieben) wurde mit Ncol und Sail abgebaut, gefolgt von einer Behandlung mit alkalischer Phosphatase und dem Sall-Ncol-Fragment, substituiert für das Ncol-Sall-Fragment in pPGAP zur Bildung von pPGAPSOD.The plasmid phSOD was digested with Ncol and Sail; a 55OBP fragment was obtained which included an untranslated nucleotide at the 5 'end and the entire hSOD coding region. pPGAP (a yeast expression vector carrying the GAP promoter prepared as described below) was digested with Ncol and Sail, followed by treatment with alkaline phosphatase and the Sall-Ncol fragment substituted for the Ncol-Sall fragment in pPGAP Formation of pPGAPSOD.

Der BamHI-Abbau von pPGAPSOD führte zu einem 2kb-Fragment, das gel-isoliert wurde und an der BamHI-Stelle von pC1 /1 und pC1/1 GAL4/370 eingeführt wurde, wobei die Plasmide pC1 /1GAPSOD bzw. pC1 /1GALGAPSOD erhalten wurden.BamHI digestion of pPGAPSOD resulted in a 2kb fragment that was gel-isolated and introduced at the BamHI site of pC1 / 1 and pC1 / 1 GAL4 / 370, with plasmids pC1 / 1GAPSOD and pC1 / 1GALGAPSOD, respectively were.

Das Plasmid pC1 /1 ist ein Derivat des pJDB219 (Beggs, Nature [1978] 275:104), in dem die Region, die dem bakteriellen Plasmid pMB9 in pJDB219 entspricht, durch pBR322 in pC1 /1 ersetzt ist. Für die Herstellung eines Expressionsvektors mit sekretorischen und Verarbeitungssignalen, vgl. U.S.-Anmeldung Nr. 522,909. Das Plasmid pC1 /1GAL4/370, ein regulierbarer Hefeexpressionsvektor, der die GAL1/GAL10-Regulierungsregion enthält (kontrolliert durch das GAL4-Genexpressionsprodukt) wird wie im folgenden beschrieben erhalten.Plasmid pC1 / 1 is a derivative of pJDB219 (Beggs, Nature [1978] 275: 104) in which the region corresponding to the bacterial plasmid pMB9 in pJDB219 is replaced by pBR322 in pC1 / 1. For the preparation of an expression vector with secretory and processing signals, cf. U.S. Application No. 522,909. Plasmid pC1 / 1GAL4 / 370, a regulatable yeast expression vector containing the GAL1 / GAL10 regulatory region (controlled by the GAL4 gene expression product), is obtained as described below.

Die Plasmide pC1 /1GAPSOD und pC1 /1GALGAPSOD werden in den Hefestamm 2150-2-3 (erhältlich von Lee Hartwell, University of Washington) transformiert, wie dies vor kurzem beschrieben wurde (Hinnen et al. Proc. Natl. Acad. Sei. USA [1978] 75:1929-1933), wobei die Ergebnisse der Expression in der folgenden Tabelle 3 wiedergegeben sind.Plasmids pC1 / 1GAPSOD and pC1 / 1GALGAPSOD are transformed into yeast strain 2150-2-3 (available from Lee Hartwell, University of Washington) as recently described (Hinnen et al., Proc. Natl. Acad [1978] 75: 1929-1933), the results of expression being given in Table 3 below.

Tabelle 3: Expression von menschlichem SOD im Hefestamm 2150Table 3: Expression of human SOD in yeast strain 2150

Plasmid Kohlenstoffquelle . SOD2 Plasmid carbon source. SOD 2

μ/mg Proteinμ / mg protein

pC1/1 g,L1 0pC1 / 1 g, L 1 0

pCl/1 GAPSOD 148pCl / 1 GAPSOD 148

pC1/1 GALGAPSOD g,L 0,4pC1 / 1 GALGAPSOD g, L 0.4

gal 68gal 68

1 Alle Kulturen gezüchtet in Minus-Leucin-Medium mit 2% Milchsäure, 3% Glycerin mit oder ohne 2% Galactose zur spaten logarithmischen oder frühen stationären Phase 1 All cultures grown in minus leucine medium with 2% lactic acid, 3% glycerol with or without 2% galactose for late logarithmic or early stationary phase

2 bestimmt durch RIA.: 2 determined by RIA. - :

Die hSOD-Spiegel wurden unter Verwendung eines Standard-Radioimmunoassays mit iodiertem authentischen hSOD als Standard gemessen. Die konstitutive Synthese aus dem GAP-Promoterführt zu sehr hohen Niveaus der hSOD-Produktion in der Größenordnung von 10-30% des gesamten Zellproteins. Die Induktion mit Galactose arbeitet fast ebenso gut und ergibt etwa 7% des Zellproteins als hSOD.HSOD levels were measured using a standard radioimmunoassay with iodinated authentic hSOD as the standard. The constitutive synthesis from the GAP promoter results in very high levels of hSOD production on the order of 10-30% of the total cell protein. Induction with galactose works almost equally well and gives about 7% of the cell protein as hSOD.

Wenn hSOD bei diesen hohen Niveaus gebildet wird, ist es gewöhnlich erforderlich. Zink- und Kupferionen dem Produktprotein als prosthetische Gruppe zuzusetzen, um die volle enzymatische, i.e. katalytische Wirksamkeit wieder herzustellen, z. B. durch Dialyse gegen 1 mM-Lösungen von sowohl Zink- als auch Kupfersulfat. Alternativ können Zink- und/oder Kupferionen in zehn Züchtungsmedien gegeben werden; dieses Verfahren schafft auch ein Mittel für die Selektierung für Stämme, die hohe Spiegel an hSOD bilden und/oder den Verlust von Plasmidvektoren, die hSOD in sonst nicht-selektiven Medien exprimieren, vermeiden.When hSOD is formed at these high levels, it is usually required. Add zinc and copper ions to the product protein as a prosthetic group to give the full enzymatic, i.e. restore catalytic activity, eg. By dialysis against 1 mM solutions of both zinc and copper sulfate. Alternatively, zinc and / or copper ions may be added in ten culture media; this method also provides a means of selection for strains that form high levels of hSOD and / or avoid the loss of plasmid vectors that express hSOD in otherwise non-selective media.

Konstruktion von pPGAP.Construction of pPGAP.

pGAP1,ein Plasmid, das durch Insertion eines Hindlll-Fragmentes enthaltend das GAPDH-Gen GAP49 (Holland and Holland, J. Biol. Chem. [1979] 254: 5466-5474), eingesetzt an der Hindlll-Stelle des pBR322, hergestellt worden war, wurde mit Hinfl abgebaut, es wurde ein 500 BP-Fragment isoliert. Das Fragment wurde mit Bal31 zurückgeschnitten, um etwa 50 oder 90 BP zu entfernen, daran schloß sich eine Ligation mit Hindlll-Linkern und ein Abbau mit Hindll! an. pBR322 wurde mit Hindll! abgebaut, gefolgt von einer Behandlung mit alkalischer Phosphatase, dann wurde das etwa 450 oder 410 BP-Fragment eingeführt; um pGAP128zu schaffen.pGAP1, a plasmid prepared by insertion of a HindIII fragment containing the GAPDH gene GAP49 (Holland and Holland, J. Biol. Chem. [1979] 254: 5466-5474) inserted at the HindIII site of pBR322 was mined with Hinfl, a 500 BP fragment was isolated. The fragment was cut back with Bal31 to remove about 50 or 90 bp, followed by ligation with HindIII linkers and digestion with Hindlll! on. pBR322 was with Hindll! degraded, followed by treatment with alkaline phosphatase, then the about 450 or 410 bp fragment was introduced; to create pGAP128.

pGAP128 wurde mit Hindill abgebaut, das Fragment endpassend mit dem Klenow-Fragment und dNTPs gemacht und das erhaltene 450 BP-Fragment durch Gelelektrophorese isoliert. Dieses Fragment wurde in plotö, abgebaut mit Smal, eingeführt, welches mit alkalischer Phosphatase behandelt worden war, wobei man das Plasmid plot5pGAP128 erhielt, das etwa -400 bis +27BP des GAPDH-Promoters und die Kodierungsregion enthielt.pGAP128 was digested with HindIII, the fragment made end-fitting with the Klenow fragment and dNTPs, and the resulting 450 bp fragment isolated by gel electrophoresis. This fragment was introduced into ploto digested with SmaI which had been treated with alkaline phosphatase to give the plasmid plot5pGAP128 containing about -400 to + 27BP of the GAPDH promoter and the coding region.

Der Hefeexpressionsvektor pPGAP, der einen Polyrestriktionsstellenlinker zwischen der GAPDH-Terminator und einer kurzen Promoterregion aufweist, wurde wie folgt hergestellt. Das Plasmid plot5pGAP128 wurde mitBamHI undTagl abgebaut, wobei man ein annähernd 390BP BamHI-Tagl-Fragment mit den -400 bis -26 BP des GAPDH-Promoters erhielt. Das BamHI-Tagl-Fragment wurde mit einem synthetischen Fragment, enthaltend -25 bis -1 BP des GAPDH-Promoters und verschiedene Restriktionsstellen einschließlich Ncol, sowie mit der folgenden Sequenz ligiert: CGA2TA3(CA)3TA3CA3CACCATG3A2T2CGt2AG2 The yeast expression vector pPGAP, which has a poly-restriction site linker between the GAPDH terminator and a short promoter region, was prepared as follows. Plasmid plot5pGAP128 was digested with BamHI and Tagl to give an approximately 390Bp BamHI-TagI fragment with the -400 to -26 bp of the GAPDH promoter. The BamHI-Tagl fragment was ligated with a synthetic fragment containing -25 to -1 BP of the GAPDH promoter and various restriction sites including NcoI, as well as the following sequence: CGA 2 TA 3 (CA) 3 TA 3 CA 3 CACCATG 3 A 2 T 2 CGt 2 AG 2

T2AT3(GT)3AT3GT3GTGGTAC3T2A2GCA2TC2AGCtT 2 AT 3 (GT) 3 AT 3 GT 3 GTGGTAC 3 T 2 A 2 GCA 2 TC 2 AGCt

Dabei erhielt man ein BamHI-Sall-Fragment, das mit BamHI und Sail abgebaut wurde und zum Ersatz des BamHI-Sall-Fragmentes von mit BamH! SJI abgebautem pBR322, behandelt mit alkalischer Phosphatase, verwendet würde. Nach der Ligation wurde das Plasmid pGAPNRS erhalten, das mit BamHI und Sail abgebaut wurde, wobei man ein 400BP BamHI-Sall-Fragment erhielt, das gelisoliert wurde. Dieses Fragment wurde mit einem 900 BP Sall-BamHI-Fragment ligiert, welches die GAPDH-Terminatorregion und ein kurzes Segment einer 3'-kodierenden Region enthielt, und das erhaltene 1,4KB BamHI-BamHI-Fragment wurde mit BamHI abgebaut. Das Sall-BamHI-GAPDH-Terminatorfragment wurde erhalten durch Abbau von pGAP2 mit Sail und BamHI, ein Plasmid, hergestellt durch Insertion eines etwa 3,3 KB-BamHI-Fragmentes enthaltend das GAPDH-Gen GAP49 (Holland und Holland, s. o.), an die BamHI-Stelle von pBR322. Die Plasmide pGAP2 und pGAP1 wurden wie folgt erhalten: Eine Hefegenbibliothek wurde hergestellt, indem Fragmente, erhalten nach teilweisem Abbau von Gesamthefe-DNS mit der RestriktionsendonukleaseSau3A in Lambda-Phagen Charon 28 (Blattner et al., Science *1977] 196:161-169) eingeführt wurden. Die Phagenbibliothek wurde mit DNS, komplementärzu der Hefe-GAPDH-mRNS, geprüft, und das Hefe-GAPDH-Gen von einem dieser Klone wurde subkloniert, und zwar entweder als ein etwa 3,3 KB BamHI-Fragment an dem BamHI-Ort des pBR322 (pGAP-2), oder als ein etwa 2,1 KBHindlll-Fragment an dem Hindlll-Ort von pBR322 (pGAP-1).This gave a BamHI-Sall fragment which was digested with BamHI and Sail and to replace the BamHI-Sall fragment of with BamH! SJI degraded pBR322, treated with alkaline phosphatase, would be used. After ligation, the plasmid pGAPNRS was obtained, which was digested with BamHI and Sail to give a 400Bp BamHI-SalI fragment which was gel isolated. This fragment was ligated with a 900 bp SalI-BamHI fragment containing the GAPDH terminator region and a short segment of a 3'-coding region, and the resulting 1.4Kb BamHI-BamHI fragment was digested with BamHI. The SalI-BamHI-GAPDH terminator fragment was obtained by digesting pGAP2 with Sail and BamHI, a plasmid prepared by insertion of an approximately 3.3 kb BamHI fragment containing the GAPDH gene GAP49 (Holland and Holland, supra) the BamHI site of pBR322. Plasmids pGAP2 and pGAP1 were obtained as follows: A yeast library was prepared by recovering fragments obtained after partial degradation of total yeast DNA with the restriction endonuclease Sau3A in lambda phage Charon 28 (Blattner et al., Science * 1977] 196: 161-169 ) were introduced. The phage library was probed with DNA complementary to the yeast GAPDH mRNA, and the yeast GAPDH gene from one of these clones was subcloned, either as an approximately 3.3 kb BamHI fragment at the BamHI site of pBR322 (pGAP-2), or as an about 2.1 kbHllIII fragment at the HindIII site of pBR322 (pGAP-1).

pBR322 wurde mit EcoRI und Sail abgebaut, die Termini wurden mit stumpfen Enden versehen und mit BamHI-Linkern ligiert, gefolgt von einem Abbau mitBamHI. Das BamHI-BamHI-3,8KB-Fragment wurde gelisoliert, durch Selbstligation rezirkularisiert,pBR322 was digested with EcoRI and Sail, the termini were blunt-ended and ligated with BamHI linkers, followed by digestion with BamHI. The BamHI-BamHI 3.8Kb fragment was gel isolated, re-circularized by self ligation,

kloniert und pBRA RI-SaI bezeichnet. Das 1,4KB-BamHI-BamHI-Fragment wurde in den BamHI-abgebauten, mit alkalischer Phosphatase behandelten pBRA R1-Sal-Vektor eingeführt, wobei man das Plasmid pPGAP mit etwa 5,3 KB erhielt, das in einer dem ampr entgegengesetzten Richtung orientiert war.cloned and designated pBRA RI-SaI. The 1.4 kb BamHI-BamHI fragment was inserted into the BamHI-digested, treated with alkaline phosphatase pbra R1-Sal vector to give the plasmid pPGAP of about 5.3 kb in the opposite direction amp r was oriented.

Konstruktion von GAL-enthaltenden, regulierten Plasmiden.Construction of GAL-containing Regulated Plasmids.

Das Plasmid pLGSD5 wird wie von Guarente et al., (1982), s.o., beschrieben hergestellt. Das Plasmid wird wie folgt bearbeitet:The plasmid pLGSD5 is prepared as described by Guarente et al., (1982), supra. The plasmid is processed as follows:

Nach der Restriktion mitXhol wurden die Überhänge mit dem Klenow-Fragment der DNS-Polymerase I („Klenow-Fragment") aufgefüllt, mit EcoRI-Linkern (GGAATTCC) ligiert und anschließend vollständig mit EcoRI und Sau3A abgebaut, wobei man ein 370BP-Fragment erhielt, das durch Gelelektrophorese isoliert wurde. Es enthielt die Intergensequenz zwischen den GAU- und GAL10-Genen der Hefe und liefert die GAL4-Regulationssequenz der GAL1-und GAL10-Gene.After restriction with Xhol, the overhangs were filled in with the Klenow fragment of DNA polymerase I ("Klenow fragment"), ligated with EcoRI linkers (GGAATTCC) and then completely digested with EcoRI and Sau3A to give a 370BP fragment , which was isolated by gel electrophoresis, contained the intergene sequence between the GAU and GAL10 genes of yeast and provides the GAL4 regulatory sequence of the GAL1 and GAL10 genes.

Dieses Fragment wurde in pBR322 eingeführt, das vollständig mit EcoRI und BamHI abgebaut worden war, gefolgt von einer Behandlung mit alkalischer Phosphatase zur Verhinderung der Oligomerisierung. Man erhielt das Plasmid pBRGAL4.This fragment was introduced into pBR322 which had been completely digested with EcoRI and BamHI, followed by treatment with alkaline phosphatase to prevent oligomerization. The plasmid pBRGAL4 was obtained.

Das Plasmid pBRGAL4 wurde vollständig mit Sau3A abgebaut, die Überhänge wurden mit dem Klenow-Fragment aufgefüllt, und die erhaltenen stumpfendigen Fragmente mit Sall-Linkern (CGTCGACG) ligiert. Daran schloß sich ein Abbau mit Sail und Xhol an. Das erhaltene 370 BP-Fragment wurde durch Gelelektrophorese isoliert. Dieses Fragment weist die Original-370 BP-Hefe-GAL4-Regulatorsequenz mit Xhol- und Sall-Termini auf.The plasmid pBRGAL4 was completely digested with Sau3A, the overhangs were filled in with the Klenow fragment, and the resulting blunt-ended fragments were ligated with Sall linkers (CGTCGACG). This was followed by a mining with Sail and Xhol. The obtained 370 BP fragment was isolated by gel electrophoresis. This fragment has the original 370 bp yeast GAL4 regulatory sequence with XhoI and SalI termini.

Das Fragment wurde anschließend in das Plasmid plot5 kloniert. plot5 wurde hergestellt, indem man das 40 BP-Polylinkerfragment der folgenden SequenzThe fragment was then cloned into plasmid plot5. plot5 was prepared by adding the 40-BP polylinker fragment of the following sequence

EcoRI BamHI BgIII Xbal HindlllEcoRI BamHI BglII XbaI HindIII

BgIIBglI

5' AATTCCCGGGGATCCGTCGACCTGCAGATCTCTAGAAGCTTCAG 3' GGGCCCCTAGGCAGCTGGACGTCTAGAGATCTTCGAAGTC5 'AATTCCCGGGGATCCGTCGACCTGCAGATCTCTAGAAGCTTCAG 3' GGGCCCCTAGGCAGCTGGACGTCTAGAGATCTTCGAAGTC

111 I111 I

Smal Sail Pstl PvuII Sma l Sai l Pst l Pvu II

in pBR322 als eine EcoRI-Pvull-Substitution einführte, gefolgt von einer Insertion des trp-lac-Promotors (Russell and Bennett, Gene [1982] 20:231-245) an den Pvull-Ort unter auf die Polylinker-Sequenz orientierter Transkription, plotö wurde vollständig mit Sail abgebaut, gefolgt von einer Behandlung mit alkalischer Phosphatase. Das 370 BP-Fragment wurde in plot5 eingeführt, wobei man das Plasmid plot5GAL4/370 erhielt. Dieses Plasmid wurde dann vollständig mit BamHI und Sail abgebaut, um das individuelle Fragment, verlängert durch 6BP des Polylinkerfragments, zu reproduzieren. Dieses Fragment wurde dann mit pC1/1 ligiert, das vollständig mit BamHI und Sail, gefolgt von einer Behandlung mit alkalischer Phosphatase zur Verhinderung der Rezirkularisierung, abgebaut worden war. Das erhaltene Plasmid wurde pC1/1GAL4/370 bezeichnet. Das BamHI-Sall-Fragment ist in dem pBR322-Abschnitt des Vektors pC1/1 angeordnet.in pBR322 as an EcoRI-Pvull substitution, followed by insertion of the trp-lac promoter (Russell and Bennett, Gene [1982] 20: 231-245) to the Pvull site under polylinker sequence-oriented transcription, plotö was completely degraded with sail, followed by treatment with alkaline phosphatase. The 370 bp fragment was introduced into plot5 to give plasmid plot5GAL4 / 370. This plasmid was then digested to completion with BamHI and Sail to reproduce the individual fragment extended by 6BP of the polylinker fragment. This fragment was then ligated with pC1 / 1, which had been completely digested with BamHI and Sail, followed by treatment with alkaline phosphatase to prevent recircularization. The resulting plasmid was designated pC1 / 1GAL4 / 370. The BamHI-Sall fragment is located in the pBR322 portion of the vector pC1 / 1.

Das in Hefe hergestellte phSOD-Polypeptid erwies sich als identisch mit dem natürlichen menschlichen Protein. Die Migration von in Hefe hergestellter hSOD war identisch mit dem Protein sowohl bei der Polyacrylamidgelelektrophorese (mit oder ohne Natriumdodecylsulfat) als auch in der Agarosegelelektrophorese (s.o.). Wenn man weiterhin hochgereinigtes Hefepolypeptid zwölf Zyklen eines Edman-Abbaus unterwirft, ist die Sequenz die gleiche wie die für das menschliche Protein (Reste 1-10), hergestellt in E. coli wie oben beschrieben, berichtete. Das Meßniveau ist jedoch lediglich 5 bis 10% des erwarteten Niveausauf molarer Basis, bezogen auf Proteininput. Dieses verminderte Meßniveau zeigt, daß die N-terminale Aminosäure blockiert ist, d.h. wahrscheinlich acetyliert.The yeast-produced phSOD polypeptide was found to be identical to the natural human protein. Migration of yeast-produced hSOD was identical to protein in both polyacrylamide gel electrophoresis (with or without sodium dodecyl sulfate) and in agarose gel electrophoresis (supra). Further, subjecting highly purified yeast polypeptide to twelve cycles of Edman degradation, the sequence is the same as that reported for the human protein (residues 1-10) produced in E. coli as described above. However, the measurement level is only 5 to 10% of the expected level on a molar basis, based on protein input. This reduced level of measurement indicates that the N-terminal amino acid is blocked, i. probably acetylated.

Das Ergebnis wurde durch Vergleichsanalysen von Trypsinpeptiden, abgeleitet von Hefe-produziertem hSOD und authentischem acetyliertem menschlichen Material, bestätigt, die zeigen, daß alle erwarteten Trypsinproteine in den zwei Proben einschließlich derjenigen der N-terminalen Verbindung identisch sind. Dies zeigt die Anwesenheit von acetyliertem N-terminalem ALA in dem HefeexpressionsproduktThe result was confirmed by comparative analyzes of trypsin peptides derived from yeast-produced hSOD and authentic acetylated human material, showing that all expected trypsin proteins in the two samples, including those of the N-terminal compound, are identical. This demonstrates the presence of acetylated N-terminal ALA in the yeast expression product

Isolierung des menschlichen SOD-Gens Isolation of the human SOD gene

Zur Isolierung des menschlichen SOD-Gens wird eine Bakteriophagen-Lambda-Bibliothek, die das menschliche Genom wiedergibt (R. Lawn et al. [1978] Cell 15: 1157-1174) mit einer radiomarkierten DNS-Probe, hergestellt aus dem menschlichen SOD cDNS, geprüft. Es wurden eine Million Phagenplaquen geprüft, und 13 positiv hybridisierende Plaquen wurden gereinigt. Die Restriktionsendonuclease-Analyse der Phagen-DNS zeigt, daß mindestens 5 verschiedene Gene auftreten. Dies legt nahe, daß es andere SOD-Verwandte Gene und Genprodukte gibt. Ein Kandidat für ein solches Gen ist die kürzlich entdeckte extrazelluläre Cu/Zn SOD (S. Marklund, [1982] Proc. Natl. Acad. Sei. USA 79: 7634-7638). Zur Unterscheidung des authentischen zytoplasmischen Cu/Zn-SOD-Gens von den verwandten Genen verwendeten wir synthetische DNS-Proben ö'-AATGCTTCCCCACACC-S' und 5'-CTCAGTTAAAATGTCTGTTtG-S', dip den Aminosäureresten 19-26 bzw. den Nucleotiden " P3—213 3' von dem Terminatorkodon in der 3'-untranslationierten Region entsprechen. Lediglich eine der 13 genomischen DNS hybridisierte mit diesen Proben; dies zeigt an, daß es das authentische menschliche zytoplasmische SOD-Gen ist. Dies wurde durch DNS-Sequenzanalyse der N-terminalen Region bestätigt, wie sich aus Figur 5 ergibt, in der die Aminosäuresequenz, bestimmt durch Proteinsequenzierung, bestätigt wird. Dies zeigt auch, daß kein Präprotein für SOD existiert, da 9 Nucleotide 5' von dem Initiator-Methionin-Kodon ein in-frame-Terminationskodon existiert. Wie sich aus Figur 5 ergibt, enthält das menschliche Cu/Zn-SOD-Gen intervenierende Sequenzen. Die Karte des SOD-Gens gemäß Figur 6 zeigt, daß es mehr als eine intervenierende Sequenz gibt.To isolate the human SOD gene, a bacteriophage lambda library representing the human genome (R. Lawn et al. [1978] Cell 15: 1157-1174) is prepared with a radiolabelled DNA probe prepared from human SOD cDNA , checked. One million phage plaques were tested and 13 positive hybridizing plaques were purified. Restriction endonuclease analysis of phage DNA reveals that at least 5 different genes occur. This suggests that there are other SOD-related genes and gene products. One candidate for such a gene is the recently discovered extracellular Cu / Zn SOD (S.Marklund, [1982] Proc. Natl. Acad. See, USA 79: 7634-7638). To distinguish the authentic cytoplasmic Cu / Zn-SOD gene from the related genes, we used synthetic DNA samples δ'-AATGCTTCCCCACACC-S 'and 5'-CTCAGTTAAAATGTCTGTTtG-S', dip amino acid residues 19-26 and the nucleotides " P Only one of the 13 genomic DNA hybridized to these probes, indicating that it is the authentic human cytoplasmic SOD gene, as identified by DNA sequence analysis of the 3'-untranslated region N-terminal region is confirmed, as can be seen from Figure 5, in which the amino acid sequence determined by protein sequencing is confirmed, which also shows that no preprotein for SOD exists because 9 nucleotides 5 'of the initiator methionine codon are in As can be seen in Figure 5, the human Cu / Zn SOD gene contains intervening sequences The map of the SOD gene of Figure 6 shows that there is more than one intervening There is a sequence.

Claims (5)

Erfindungsanspruch:Invention claim: (1) einen Promoter,(1) a promoter, 1. Verfahren zur Herstellung eines Polypeptids mit im wesentlichen der gleichen Aminosäuresequenz wie der menschlichen Superoxiddismutase, gekennzeichnet dadurch, daß das Polypeptid in E. coli oder S. cerevisiae hergestellt wird.A process for producing a polypeptide having substantially the same amino acid sequence as the human superoxide dismutase, characterized in that the polypeptide is produced in E. coli or S. cerevisiae. (2) eine ribosomale Bindungsstelle,(2) a ribosome binding site, 2. Verfahren nach Punkt !,gekennzeichnet dadurch, daß der Mikroorganismus eine für ihn funktioneile DNS enthält, die in „Stromabwärts"-Richtung der Transkription folgende Strukturen aufbaut:2. The method according to item!, Characterized in that the microorganism contains a DNA which is functional for him and which builds up the following structures in the "downstream" direction of the transcription: 3. Verfahren nach Punktk2. gekennzeichnet dadurch, daß der Abstand zwischen derribosomalen Bindungsstelle und dem Initiationskodon durch Schaffung verschiedener DNS-Brücken zwischen der Bindungsstelle und dem Initiationskodon, die sich in Länge und Zusammensetzung unterscheiden, optimiert wird, und man für die optimale Expression selektiert.3. Procedure according to Punktk2. characterized in that the distance between the ribosome binding site and the initiation codon is optimized by creating different DNA bridges between the binding site and the initiation codon that differ in length and composition, and selecting for optimal expression. (3) ein Initiationskodon,(3) an initiation codon, (4) ein strukturelles Gen einer menschlichen Superoxiddismutase in einem Leserahmen mit dem Initiationskodon und einem Stopkodon an dem 3'-Ende, und(4) a structural gene of a human superoxide dismutase in a reading frame with the initiation codon and a stop codon at the 3 'end, and (5) einem Transkriptionsterminator.(5) a transcription terminator. 4. Verfahren nach Punkt 2. gekennzeichnet dadurch, daß man die DNS mit einem Replikationssystem für die extrachromosomale Replikation und Stabilisierung verbindet.4. Method according to item 2, characterized in that the DNA is linked to a replication system for extrachromosomal replication and stabilization. HierzuFor this 5 Seiten Zeichnungen5 pages drawings
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