DD226015A1

DD226015A1 - METHOD FOR CONTINUOUS PRODUCTION OF DEXTRAN

Info

Publication number: DD226015A1
Application number: DD26164884A
Authority: DD
Inventors: Hans-Joachim Netter; Inge Ihlo; Klaus Breyer; Dorothea Krueger; Konrad Krueger
Original assignee: Bernburg Serum Werk Veb
Priority date: 1984-04-05
Filing date: 1984-04-05
Publication date: 1985-08-14

Abstract

Die Erfindung liegt auf dem Gebiet der mikrobiologischen Synthesen. Ziel der Erfindung ist ein kontinuierliches Herstellungsverfahren fuer Dextran mit einem minimalen technologischen Aufwand sowie einer relativ hohen biologischen Sicherheit des Gesamtprozesses. Die vorliegende Erfindung ist eine kontinuierliche, in einer Verfahrensstufe ablaufende biochemische Dextransynthese. Eine saccharosehaltige Naehrloesung von p H 8-10 - bevorzugt 9 - wird einem Saeulenfermenter kontinuierlich zugespeist. Der Fermentationsverlauf erfolgt in vertikaler Richtung. Das nach der vorliegenden Erfindung erzeugte Dextran kann fuer den Einsatz in der Medizin als Blutplasmaersatzmittel sowie in den verschiedensten Bereichen der Technik als Stabilisator fuer Loesungen, Suspensionen, Emulsionen, als Verdicker und als Hilfsstoff bei der Herstellung von Filmmaterial Verwendung finden. Darueber hinaus kann es auch als Ausgangsmaterial zur Herstellung von Dextranderivaten dienen.The invention is in the field of microbiological syntheses. The aim of the invention is a continuous production process for dextran with a minimum technological effort and a relatively high biological safety of the overall process. The present invention is a continuous biochemical dextran synthesis occurring in one step of the process. A sucrose-containing nutrient solution of p H 8-10 - preferably 9 - is continuously fed to a column fermenter. The fermentation process takes place in the vertical direction. The dextran produced according to the present invention can be used for use in medicine as a blood plasma substitute and in various fields of technology as a stabilizer for solutions, suspensions, emulsions, as a thickener and as an adjuvant in the production of film material. In addition, it can also serve as a starting material for the preparation of dextran derivatives.

Description

Field of application of the invention

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur kontinuierlichen Herstellung von Dextran.The invention relates to a process for the continuous production of dextran.

Dextrane finden auf den verschiedensten Gebieten Verwendung, insbesondere in der Medizin !Blutplasmaersatzmittel) und in vielen Bereichen der Technik (Stabilisator für Lösungen, Suspensionen und Emulsionen, Verdicker, Hiifsstoff bei der Herstellung von Filmmaterial).Dextrans are used in a variety of fields, especially in medicine, blood plasma substitutes) and in many fields of technology (stabilizer for solutions, suspensions and emulsions, thickener, auxiliary in the production of film material).

Außerdem dienen Dextrane als Ausgangsmaterial von Dextranderivaten.In addition, dextranes serve as starting material of dextran derivatives.

Characteristic of the known technical solutions

Dextran wird von bestimmten Bakterienarten gebildet. Für die technische Herstellung erlangten insbesondere Stämme von Leuconostoc mesenteroides Bedeutung.Dextran is made up of certain types of bacteria. In particular, strains of Leuconostoc mesenteroides gained importance for industrial production.

Dieser Organismus bildet in saccharosehaltigen Kulturlösungen das Enzym Dextransucrase, welches den Glykosylanteil der Saccharose zu Dextran polymerisiert unter gleichzeitiger Freisetzung von Fructose.This organism forms the enzyme dextransucrase in sucrose-containing culture solutions, which polymerizes the glycosyl portion of the sucrose to dextran with simultaneous release of fructose.

Den daraus resultierenden technischen Verfahren haftet der Mangel an, daß sie diskontinuierlich betrieben werden und lange Inkubationszeiten erfordern, so daß Gesamtfermentationszeiten bis zu 48 Stunden resultieren.The resulting technical process has the deficiency of being operated discontinuously and requiring long incubation times, resulting in total fermentation times of up to 48 hours.

Hinzu kommt noch der erhebliche Zeitaufwand für Reinigungs- und Sterilisationsoperationen, die auf Grund des Chargenbetriebes erforderlich sind.In addition, there is the considerable time required for cleaning and sterilization operations, which are required due to the batch operation.

Behrens* und Mitarbeiter beschreiben eine kontinuierliche Dextransynthese in zwei Stufen, wobei in der ersten Stufe das Bakterienwachstum und die Enzymbildung erfolgt und in der zweiten Stufe die Dextranbildung stattfindet.Behrens * and coworkers describe a continuous dextransynthesis in two stages, whereby in the first stage the bacterial growth and the enzyme formation take place and in the second stage the dextran formation takes place.

Der Überlauf der I.Stufe wird mit einer Saccharoselösung gemischt und kontinuierlich in einen Fermenter eingespeist, wobei die Konzentration im Fermenterzwischen 2% und 5% gehalten wird. Der Überlauf der zweiten Stufe enthält demzufolge 2% bis 5% Saccharose. Durch kontinuierliche Zugäbe~vonSfärterdexträn^uTzweiten Stufe soll eine Lenkwirkung erzielt werden.The I.C. overflow is mixed with a sucrose solution and fed continuously into a fermenter, with the concentration in the fermenter maintained between 2% and 5%. The second stage overflow thus contains 2% to 5% sucrose. By continuous addition of dye decanter second stage, a steering effect is to be achieved.

Es wird auch die Möglichkeit erwähnt, den Gesamtprozeß in einer Stufe ablaufen zu lassen.It also mentions the possibility of running the whole process in one step.

Nachteilig bei dieser Verfahrensweise sind:The disadvantages of this procedure are:

— hoher Bedarf an Ausrüstungen infolge räumlicher Trennung der beiden Verfahrensstufen;- high demand for equipment due to physical separation of the two process stages;

— hoher Bedarf an Energie auf Grund des ständigen Mischens der Lösung während der Fermentation;High energy requirement due to the continuous mixing of the solution during the fermentation;

— hoher technologischer Aufwand zur Sicherung der biologischen Reinheit des Gesamtprozesses;- high technological effort to ensure the biological purity of the overall process;

— kein vollständiger Umsatz der Saccharose, demzufolge beträchtlicher Ausbeuteverlust.- no complete conversion of sucrose, consequently considerable yield loss.

Object of the invention

Das Ziel der Erfindung ist ein kontinuierliches Herstellungsverfahren für Dextran mit wesentlich verbesserter Umsatzrate — bezogen auf Saccharose — mit verbesserten Raum-Zeit-Ausbeuten — unter dem Aspekt eines minimalen technologischen Aufwandes sowie einer relativ hohen biologischen Sicherheit des Gesamtprozesses.The aim of the invention is a continuous production process for dextran with significantly improved conversion rate - based on sucrose - with improved space-time yields - under the aspect of a minimum technological effort and a relatively high biological safety of the overall process.

Essence of the invention

Die Fermentation von Dextran als eine durch Bakterien bewirkte enzymatische Synthese ist ein Prozeß mit verschiedenen Einflußfaktoren. Dazu gehört das Bakterienwachstum, die Bildung der Dextransucrase und die eigentliche Dextransynthese.The fermentation of dextran as a bacterial enzymatic synthesis is a process with various factors of influence. This includes bacterial growth, the formation of dextransucrase and the actual dextran synthesis.

Alle Prozesse werden durch den pH-Wert beeinflußt. Das Optimum des Bakterienwachstums und der Sucrasebildung liegt bei pH 6—8. Die optimale Dextransynthese findet bei pH 5—5,5 statt.All processes are influenced by the pH. The optimum of bacterial growth and sucrase formation is at pH 6-8. Optimal dextran synthesis takes place at pH 5-5.5.

Da ein als ideales Mischgefäß ausgebildeter kontinuierlich geführter Rührfermenter trotz pH-Regelung keine optimalen Dextranausbeuten bringt, wurde erfindungsgemäß ein Durchflußfermenter in Säulenform verwendet, bei dem sich während der Fermentation ein Konzentrationsgradient derart einstellt, daß am Zulauf 0% Dextran und am Ablauf 0% Saccharose sind.Since a continuous mixing stirred fermenter designed as an ideal mixing vessel does not give optimum dextran yields despite pH control, a flow fermenter in column form was used according to the invention in which a concentration gradient is set during fermentation such that 0% dextran is present at the feed and 0% sucrose at the feed ,

Demzufolge erfolgt eine vollständige Umsetzung der Saccharose. Da der Konzentrationsgradient erforderlich ist, ist ein Durchmischen der zu fermentierenden Lösung nicht erwünscht. Zur vollständigen Umsetzung der Saccharose zu Dextran ist der pH-Wert von 5,0 nicht zu unterschreiten.As a result, complete conversion of the sucrose takes place. Since the concentration gradient is required, it is not desirable to mix the solution to be fermented. For complete conversion of the sucrose to dextran, the pH should not be less than 5.0.

Bei einer Fermentation, die nicht pH-geregelt wird und deren zugespeiste gepufferte Nährlösung pH-7 besitzt, fällt der pH-Wert weit unter 5,0 ab, und es erfolgt ein unvollständiger Saccharosezusatz.In a fermentation which is not pH-controlled and whose fed buffered nutrient solution pH-7 has, the pH falls far below 5.0, and there is an incomplete addition of sucrose.

Aus diesem Grunde wird erfindungsgemäß eine gepufferte Nährlösung von pH 8-10 eingesetzt.For this reason, a buffered nutrient solution of pH 8-10 is used according to the invention.

Nach vorliegender Erfindung wird die kontinuierliche Fermentation in einer Verfahrensstufe ablaufende Dextransynthese durch Vorlegen einer Fermentationslösung, die nach einem der bekannten Verfahren hergestellt wurde, gestartet.According to the present invention, the continuous fermentation in a process step dextran synthesis by presentation of a fermentation solution, which was prepared by one of the known methods, started.

Zu dieser Fermentationsiösung wird kontinuierlich eine gepufferte Nährlösung von pH 8-10, bestehend aus 15-30%igerTo this fermentation solution is continuously a buffered nutrient solution of pH 8-10, consisting of 15-30%

* Behrens u.a. WP 34066* Behrens et al. WP 34066

iaccharoseiösung und einem Eiweißhydrolysat zudosiert. Erfindungsgemäß wird im Säulenfermenter ein pH-Gefälle erzeugt, τ dessen Bereich sowohl Bakterienwachstum, Enzymbildung als auch Dextransynthese ablaufen.sucrose solution and a protein hydrolyzate added. According to the invention, a pH gradient is generated in the column fermenter, the region of which carries out both bacterial growth, enzyme formation and dextran synthesis.

He Verweilzeit im Säulenfermenter beträgt 15-20 Stunden. Der Zusatz von Starterdextran erfolgt im Normalfall nur zu der zu leginn des Prozesses vorgelegten Nährlösung, da durch ihn das gebildete Enzym stabilisiert und die Viskosität des ^;ermenterinhalts gesenkt wird. Bei der Nährlösung, die kontinuierlich zudosiert wird, ist der Zusatz von Starterdextran nicht irforderlich, da sein Einfluß auf die Fermentation unter den Bedingungen der kontinuierlichen Fermentation viel geringer als sei der diskontinuierlichen Verfahrensweise ist.He residence time in the column fermenter is 15-20 hours. The addition of starter dextran is usually only to the leginn submitted to the process nutrient solution, since it stabilizes the enzyme formed and the viscosity of the ^; ermenter content is lowered. In the case of the nutrient solution which is metered in continuously, the addition of starter dextran is not necessary since its influence on the fermentation under the conditions of continuous fermentation is much less than that of the discontinuous procedure.

ieispiel 1 η einem Rührfermenter wird eine sterile Nährlösung mit der Zusammensetzung !0% Saccharose 1 % Starterdextran 0,5% Hefeextrakt 1% Na₂HPO₄ χ 12 H₂O nit einer aktiven Kultur von Leüconostoc mesenteroides unter sterilen Bedingungen in Verhältnis 1:10 beimpft. Zur Vermehrung Jer Bakterien und Bildung des Enzyms wird ca. 7 Std. bei pH 6 und 23—25°C fermentiert. Anschließend läßt man den pH-Wert luf 5,5 abfallen und überführt die Lösung in den Säulenfermenter. Iu dieser Fermentationslösung wird eine sterile Nährlösung der Zusammensetzung !0% Saccharose 0,5% Hefeextrakt 1%Na₂HPO₄x12H₂O -_.. JH = 9,6 continuierlich zudosiert. Der Zulauf erfolgt von unten nach oben. Die Verweilzeit im Fermenter beträgt 20 Std. Die Dextrankonzentration der überlaufenden Lösung beträgt 6,3%.1 ml of a stirred fermenter is a sterile nutrient solution having the composition: 0% sucrose 1% starter dextran 0.5% yeast extract 1% Na ₂ HPO ₄ χ 12 H ₂ O with an active culture of leuconostoc mesenteroides under sterile conditions in a ratio of 1:10 inoculated. To increase Jer Bacteria and formation of the enzyme is about 7 hours at pH 6 and 23-25 ° C fermented. Subsequently, the pH value 5.5 is allowed to drop and the solution is transferred to the column fermenter. To this fermentation solution, a sterile nutrient solution of the composition: 0% sucrose 0.5% yeast extract 1% Na ₂ HPO ₄ × 12H ₂ O-1... JH = 9.6 is metered in continuously. The inlet is from bottom to top. The residence time in the fermenter is 20 hours. The dextran concentration of the overflow solution is 6.3%.

Example 2

Eine sterile Nährlösung der Zusammensetzung 20% SaccharoseA sterile nutrient solution of the composition 20% sucrose

0,5% Hefeextrakt ·0.5% yeast extract ·

2% Na₂HPO₄ x 12H₂O '2% Na ₂ HPO ₄ x 12H ₂ O '

wird zu der im Beispiel 1 genannten, im Säulenfermenter befindlichen Fermentationslösung kontinuierlich zugespeist; Der Zulauf erfolgt von unten nach oben in 4 gleichen Teilströmen. Die Dextrankonzentration der ablaufenden Lösung beträgt 6,2%.is continuously fed to the mentioned in Example 1, located in the column fermenter fermentation solution; The feed takes place from bottom to top in 4 equal partial streams. The dextran concentration of the effluent solution is 6.2%.

Example 3

Zu der unter Beispiel 1 genannten Fermentationslösung wird eine sterile Nährlösung der Zusammensetzung 20% Saccharose 0,5% HefeextraktTo the fermentation solution mentioned under Example 1 is a sterile nutrient solution of the composition 20% sucrose 0.5% yeast extract

2% Na₂HPO₄ x 12H₂O pH = 9,0 kontinuierlich zudosiert. Der Zulauf erfolgt von oben nach unten mit einer Verweilzeit von 20 Stunden. Die Dextrankonzentration der anfallenden Fermentationslösung beträgt 6,2%.2% Na ₂ HPO ₄ x 12H ₂ O pH = 9.0 continuously added. The feed is from top to bottom with a residence time of 20 hours. The dextran concentration of the resulting fermentation solution is 6.2%.

Example 4

Zu einer unter Beispiel 1 genannten Fermentationslösung wird eine sterile Nährlösung der Zusammensetzung 20% Saccharose 0,5% Hefeextrakt 2% Na₂HPO₄ x 12H₂O pH = 9,0 kontinuierlich über 4 Teilströme zudosiert. Die Dextrankonzentration der anfallenden Lösung beträgt 6,2%.To a fermentation solution mentioned in Example 1, a sterile nutrient solution of the composition 20% sucrose 0.5% yeast extract 2% Na ₂ HPO ₄ x 12H ₂ O pH = 9.0 is metered in continuously over 4 partial streams. The dextran concentration of the resulting solution is 6.2%.

Example 5

Zu einer unter Beispiel 1 genannten Fermentationslösung wird eine sterile Nährlösung der Zusammensetzung 20,0% Saccharose 0,5% HefeextraktTo a fermentation solution mentioned in Example 1 is a sterile nutrient solution of the composition 20.0% sucrose 0.5% yeast extract

2% Na₂HPO₄X 12H₂O pH = 9,0 kontinuierlich zudosiert, wobei mehrere Säulenfermenter hintereinander geschaltet sind. Die Dextrankonzentration der anfallenden Fermentationslösung beträgt 6,3%.2% Na ₂ HPO ₄ X 12H ₂ O pH = 9.0 continuously added, with several column fermenters connected in series. The dextran concentration of the resulting fermentation solution is 6.3%.

Example 6

2% Na₂HPO χ 12 H₂O pH = 9,0 kontinuierlich zudosiert, wobei 1-10% der ausfermentierten Lösung wieder dem Säulenfermenter am Einlauf zugeführt wird. Die Dextrankonzentration der anfallenden Fermentationslösung beträgt 6,2%.2% Na ₂ HPO χ 12 H ₂ O pH = 9.0 added continuously, wherein 1-10% of the ausfermentierten solution is fed back to the column fermenter at the inlet. The dextran concentration of the resulting fermentation solution is 6.2%.

Claims

claims:

1. A process for the continuous synthesis of dextran, characterized in that a sucrose-containing nutrient solution is continuously fed to a fermentation solution located in a Säuienfermenter and prepared by conventional methods and the resulting pH gradient in the fermenter is controlled so that it is larger at the end of the column than 4.8.

2. The method and claim 1, characterized in that the nutrient solution fed contains buffer substances and has a pH of 8-10 - preferably 9-.

3. The method according to claim 1, characterized in that the feeding of sucrose-containing nutrient solution and / or buffer substance takes place in several levels.

4. The method according to claim 1, characterized in that the fermentation takes place in the vertical direction.

5. The method according to claim 1 and 4, characterized in that several Säuienfermenter are connected in series.

6. The method according to claim 1, characterized in that the last column third or from the column outlet a partial flow - preferably 1-10% of the flow - is returned to the column inlet.

7. The method according to claim 1, characterized in that bacterial growth, enzyme formation and dextran synthesis take place continuously in a spatial unit.