DD201149A1

DD201149A1 - PROCESS FOR OBTAINING PECTINOLYTIC ENZYMES

Info

Publication number: DD201149A1
Application number: DD23531081A
Authority: DD
Inventors: Christine Wardsack; Friedbert Baum; Andreas Leuchtenberger; Heinz Ruttloff
Original assignee: Christine Wardsack; Friedbert Baum; Andreas Leuchtenberger; Heinz Ruttloff
Priority date: 1981-12-02
Filing date: 1981-12-02
Publication date: 1983-07-06

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Gewinnung oektinolytischer Enzyme unter Verwendung von Schimmelpilzen. Das Enzympraeparat ist zur Steigerung der Fruchtsaftausbeute, zur Fruchtsaftklaerung sowie zur Mazeration von Obst und Gemuese geeignet. Ziel der Erfindung ist die Steigerung der Enzymbildung. Die daraus abgeleitete Aufgabe besteht im Auffinden einer geeigneten Verfahrensweise. Erfindungsgemaess wird in einer 1. Kulturstufe diffuses Myzel von einem Schimmelpilz, vorzugsweise Aspergillus niger, in Submerskultur angezuechtet und dieses dann in einem oder mehreren Behaeltnissen aus sterilisierbarem Textil- oder Drahtgewebe bestimmter Durchaessigkeit von der Kulturloesung abgetrennt, wodurch es zwangsweise zu einer fuer die Enzymbildung vorteilhaften Verdichtung des Myzels kommt. Ein oder mehrere der myzelhaltigen Behaeltnisse werden zum Zwecke der Enzymproduktion in einer 2. Kulturstufe unter Verwendung von Kulturmedien ueblicher Zusammensetzung 5 bis 7 Tage bei vorgegebenen Bedingungen kultiviert. Durch Ablassen des enzymhaltigen und durch Zugabe von frischem Kulturmedium kann das Myzel fuer mehrere Fermentationen genutzt werden.The invention relates to a method for obtaining oektinolytischer enzymes using molds. The Enzympraeparat is suitable for increasing the fruit juice yield, for fruit juice clarification and for maceration of fruits and vegetables. The aim of the invention is to increase the enzyme formation. The task derived from this consists in finding a suitable procedure. According to the invention, in a first stage of culture, diffuse mycelium from a mold fungus, preferably Aspergillus niger, is cultivated in submerged culture and then separated from the culture solution in one or more sterilized textile or wire fabric sections, thereby forcibly becoming one advantageous for enzyme formation Compression of the mycelium is coming. One or more of the mycelial contents are cultured for the purpose of enzyme production in a 2nd culture step using culture media of conventional composition for 5 to 7 days under given conditions. By draining the enzyme-containing and by adding fresh culture medium, the mycelium can be used for several fermentations.

Description

235310 5 ,235310 5,

Erfinder: Christine WardsackInventor: Christine Wardsack

Dr. Andreas Leuchtenberger Prof. Dr. Heinz RuttIoffDr. Andreas Leuchtenberger Heinz Ruttoff

Verfahren zur Gewinnung pektinol/ytischer Enzyme Anwendungsgebiet der ErfindungMethod for obtaining pectinol / ytic enzymes Field of application of the invention

Die Erfin'dung betrifft ein Verfahren zur Gewinnung pektinoIytischer Enzyme unter Verwendung von Schimmelpilzen. Die nach diesem Verfahren hergestellte Enzymlösung wird in der obst- und gemüseverarbeitenden Industrie eingesetzt und dient vorrangig zur Mazeration von Obst und Gemüse. Sie ist desweiteren zur Fruchtsaftklärung und zur Steigerung der Fruchtsaftausbeute verwendbar.The invention relates to a method for obtaining pectinolytic enzymes using molds. The enzyme solution produced by this process is used in the fruit and vegetable processing industry and is used primarily for the maceration of fruits and vegetables. It is also useful for clarifying fruit juice and increasing fruit juice yield.

Characteristic of the known technical solutions

Verschiedene Schimmelpilze, insbesondere der Gattung Aspergillus niger, sind bekannt dafür, daß sie sowohl emers als auch submers pektinoIytische Enzmy bilden. Beim Submersverfahren wird die Kulturlösung im Schüttelkolben oder im Fermentor mit Sporen oder vegetativem Myzel beimpft und durch Schütteln oder durch Belüftung und Rührung wird das Wachstum der Schimmelkultur angeregt. Während der mehrtätigen !Cultivation entwickelt sich eine diffuse Myzelmasse, die pektinoIytische Enzyme ausscheidet. Die Enzymausbeute ist bei einer solchen Myzelstruktur erfahrungsgemä£ relativ gering. Es gibt daher eine Anzahl von Verfahren,Various molds, in particular of the genus Aspergillus niger, are known to produce both emersed and submerged pectinolytic enzymes. In the submersed method, the culture solution is inoculated in the shake flask or in the fermentor with spores or vegetative mycelium and by shaking or by aeration and stirring the growth of the mold culture is stimulated. During the several days of cultivation, a diffuse mycelium mass develops, which excretes pectinolytic enzymes. The enzyme yield is relatively low with such a mycelium structure. There are therefore a number of methods

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die sich mit der Aktivitätssteigerung durch Zugabe spezieller Währmedienkomponenten oder durch Variierung der Kulturführung befassen.which are concerned with increasing activity by adding specific currency media components or by varying culture management.

Eine im Vergleich zu den zuvor mit diffuser Myzelmasse angeführten Verfahren wesentlich intensivere Bildung pektinolytischer Enzyme kann erreicht werden, wenn die .fermentation mit schwamm- bzw. pelletartigen Myzelstrukturen durchgeführt wird. A.A. Martakov und 0.P₀ Dianova (Izv. Akad. Nauk Kaz₀ SSR, Ser· Biol. 5 (6) 54-99 (196?)) erreichen diese Myzelform dadurch, daß durch kreisende Bewegung eines JXulturgefäßes ein Myzelring an der Gefäßwand entsteht bzw. sich durch Standkultur auf der Medienoberfläche eine Myzelschicht entwickelt,'die nachfolgend mittels Schütteleinrichtung submers kultiviert wird ο JiJiη Nachteil dieser Verfahrenweise ist, daß die Fermentationsgefäße zur Erhaltung der kompakten Myzelstruktur in kreisender Weise bewegt werden müssen, was im technischen Maßstab mit beträchtlichen Schwierigkeiten verbunden ist. nJine für diesen Maßstab praktikable Verfahrensvariante beschreibt ein Patent von F. Baum, A. Leuchtenberger, H. Rut loff, L·. Schiweck und Gh. lardsack (DWP 145 027; Verfahren und Vorrichtung zur Herstellung von pektinolytischen Enzymen )o Wach emerser Anzucht einer Myzeldecke von Aspergillus niger wird diese unter Verwendung eines geeigneten Nährbodens mit Hilfe einer siebartigen Vorrichtung untergetaucht und 5 bis 7 Tage belüftete Die Myzeldecke wächst zu einer schwammartigen Myzelstruktur heran, die erhöhte JSn zy mm engen produziert. Nachteil dieses Verfahrens ist eine durch den Gefäßdurchmesser beschränkte Myzeldeckengröße, die für eine gute Enzymentwicklung nur eine relativ schlechte Fermentorraumauslastung zuläßt.A significantly more intense formation of pectinolytic enzymes compared to the methods previously mentioned with diffuse mycelium mass can be achieved if the .fermentation is carried out with sponge or pellet-like mycelial structures. AA Martakov and 0.P ₀ Dianova (Izv Akad Nauk Kaz ₀ SSR, Ser · Biol. 5 (6) 54-99 (196?)) Achieve this mycelial form by circular movement of a JXultur vessel to a mycelial ring on the vessel wall a mycelium layer is formed or grown by standing culture on the media surface, which is subsequently cultivated submerged by means of a shaker. The disadvantage of this procedure is that the fermentation vessels must be moved in a circular manner to maintain the compact mycelium structure, which involves considerable difficulties on an industrial scale connected is. nJine for this scale practicable process variant describes a patent by F. Baum, A. Leuchtenberger, H. Rut loff, L ·. Schiweck and Gh. Lardsack (DWP 145 027; method and apparatus for the production of pectinolytic enzymes) o On growing a mycelium cover of Aspergillus niger, it is submerged using a suitable culture medium with the aid of a sieve-like device and ventilated for 5 to 7 days The mycelium cover grows to a sponge-like mycelium structure that produces increased JSn zy mm tight. Disadvantage of this method is limited by the vessel diameter mycelium size, which allows for a good Enzymentwicklung only a relatively poor Fermentorraumauslastung.

Object of the invention

Das Ziel der Erfindung besteht darin, durch eine spezielle Verfahrensweise zur Gewinnung pektinoIytischer Enzyme mit Aspergillus niger Enzymaktivitäten zu erzielen, die wesentThe aim of the invention is to achieve by a special procedure for obtaining pectinIytischer enzymes with Aspergillus niger enzyme activities, the essential

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lieh über den Ausbeuten mit diffusem Myzel liegen und geräte technische Probleme, die bei Verwendung von schwammartigen Myzelstrukturen entstehen, zu vermeiden.lie over the yields with diffuse mycelium and devices technical problems that arise when using spongy mycelial structures to avoid.

Explanation of the "essence of the invention

Im Gegensatz zu bekannten Submersverfahren, die mit dif-v fusem Myzel arbeiten, besteht das Wesen des erfindungsgemäßen Verfahrens darin, daß angezüchtetes diffuses Myzel mechanisch verdichtet und dadurch überraschender Weise zu einer wesentlichen höheren Enzymproduktion veranlaßt wird. Gegenüber anderen Verfahren, die mit schwammartigen Myzelstrukturen arbeiten, zeichnet sich die gefundene Prinzip» lösung dadurch aus, daß sie mit relativ einfachen Mitteln im technischen Maßstab unter Verwendung von herkömmlichen Rührfermentoren oder auch Spezialfermentoren realisierbar ist und, daß durch Einsatz von Behältnissen aus einem für das Kulturmedium durchlässigen inerten Material, mit vorzugsweise poröser, poriger oder gewebter Struktur, insbesondere aus einem inerten Gewebe, die Myzeldichte reproduzierbar so einstellbar ist, daß der Schimmelpilz zu einer noch höheren Enzymsynthese veranlaßt wird.In contrast to known submersed methods which work with dif-fusem mycelium, the essence of the method according to the invention consists in mechanically compacting cultivated diffuse mycelium and thereby surprisingly inducing a substantially higher enzyme production. Compared to other processes that work with sponge-like mycelial structures, the principle solution found is characterized by the fact that it can be implemented with relatively simple means on an industrial scale using conventional stirring fermentors or special fermentors and that by using containers made of one for the Culture medium permeable inert material, preferably with porous, porous or woven structure, in particular of an inert tissue, the mycelial density is reproducibly adjustable so that the mold is induced to an even higher enzyme synthesis.

Nach dem erfindungsgemäßen Verfahren wird zur Herstellung .von pektinolytischen Enzymen mittels Schimmelpilzen, insbesondere solchen der Gattung Aspergillus, vorzugsweise der Art Aspergillus niger, zunächst zu einem Nährmedium , üblicher Zusammensetzung aus Sporen unter Belüftung und Rührung bei 28 bis 32 ⁰C über 2 bis 3 Tage diffuses Myzel angezüchtet ("U Kulturstufe )_o Dieses diffuse Myzel wird anschließend unter Verwendung eines oder mehrerer Behältnisse aus einem für das Kulturmedium durchlässigen inertem Material, vorzugsweise aus Gewebe, von der Nährlösung abgetrennt, wodurch eine Verdichtung erfolgte Das in den Behältnissen befindliche verdichtete Myzel wird -dann in einer 2. Kulturstufe mit frischer Nährlösung gleicher oder anderer Zusammensetzung wie das Anzuchtmedium in an" sich bekannter Weise zum Zwecke der Enzymproduktion weiter kultiviert.The process according to the invention is used for the production of pectinolytic enzymes by means of molds, in particular those of the genus Aspergillus, preferably of the species Aspergillus niger, first to a nutrient medium, usual composition of spores under aeration and stirring at 28 to 32 ⁰ C for 2 to 3 days diffuse mycelium grown ( "U culture stage) _o This diffuse mycelium is then separated using one or more containers made of a material permeable to the culture medium inert material, preferably of fabric, of the nutrient solution, whereby a compression carried out and situated in the containers compacted mycelium is -then in a 2nd culture stage with fresh nutrient solution of the same or different composition as the growing medium cultivated in a "known manner for the purpose of enzyme production on.

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Die Nährlösung beinhaltet Kohlenhydrat- und Stickstoffquellen sowie verschiedene Salze ο Es sind dies vorzugsweise 0,1 bis 0,5 % Pektin, 4 bis 7 % Glucose oder Saccharose, 0,5 bis 1 % M₄NO₃, 0,1 bis 0,75 % KH₂PO₄ sowie 0,03 % NaCl, MgSO₄, FeSO₄ und CaCO-. Pektin und Zucker können auch durch 4 % Zuckerrüben oder Rübenschnitzelextrakt unter Zusatz von 1 bis 5 % Glucose oder Saccharose ersetzt werden.The nutrient solution contains carbohydrate and nitrogen sources as well as various salts o These are preferably 0.1 to 0.5 % pectin, 4 to 7% glucose or sucrose, 0.5 to 1% M ₄ NO ₃ , 0.1 to 0, 75% KH ₂ PO ₄ and 0.03% NaCl, MgSO ₄ , FeSO ₄ and CaCO 2. Pectin and sugar can also be replaced by 4% sugar beet or beet pulp extract with the addition of 1 to 5% glucose or sucrose.

Die zum Abtrennen und Verdichten sowie zur spateren Kultivierung des Myzels erforderlichen Behältnisse müssen eine gewisse Durchlässigkeit besitzen und sterilisierbar sein; Zweckmäßig ist die Anwendung eines Textil- oder VpA-Gewebes.The containers required for separating and compacting and for later culturing the mycelium must have a certain permeability and be sterilizable; It is expedient to use a textile or VpA fabric.

Wesentlich ist, daß die Durchflußzeit durch das durchlässige Behältnis für 8 ml Fermentationslösung durch 1 cm Fläche des entsprechenden .Materials nicht weniger als 2 see. and nicht mehr als 16 see· beträgt.It is essential that the flow through the permeable container for 8 ml of fermentation solution through 1 cm area of the corresponding .Materials not less than 2 see. and not more than 16 see.

Erfindungsgemäß wird die in einer 1. Kulturstufe gebildete Myzeltrockenmasse von 0,2 bis 0,5 S> bezogen auf 100 ml Medium, auf ein Medienvolumen von 1 'bis 2 ral verdichtet. Die Enzyrabildung in der 2. Kulturstufe erfolgt über 3 bis 7 Tage bei 28 bis 32 ⁰C unter Rühren und Belüften. Erforderlichenfalls ist ein mehrmaliger Austausch (3 bis 5 aal) der pektinolytisch aktiven Fermentationslösung gegen frisches Nährmedium nach 3 bis 7 Tagen durchführbar. Die zum Aufnehmen, Verdichten und späteren Kultivieren des Myzels erforderliche Anzahl und Größe der Behältnisse kann nach der Fermentationsgröße variiert werden,» Die Erfindung ist in den folgenden Aüsführungsbeispielen näher erläuterteAccording to the invention, the mycelium dry mass formed in a 1st culture stage is compressed from 0.2 to 0.5 S, based on 100 ml of medium, to a volume of 1 to 2 liters. The Enzyrabildung in the 2nd culture stage is carried out for 3 to 7 days at 28 to 32 ⁰ C with stirring and aerating. If necessary, a repeated exchange (3 to 5 eel) of the pectinolytic active fermentation solution against fresh nutrient medium after 3 to 7 days feasible. The number and size of the containers required for receiving, compacting and later cultivating the mycelium can be varied according to the size of the fermentation. The invention is explained in more detail in the following examples

Ausführungsbeispiele., Beispiel 1 Exemplary embodiments ., Example 1

In 200 ml Kulturflaschen werden 50 ml Kulturmedium (50 g · Glucose; 1 g Pektin; 7,5 S NH₄NO₃; 5 g KH₂PO₄; 0,3 g FeSO₄ O; 0,3 g MgSO₄ ο 7H₂O; 0,3 g CaCO₃; 0,3 g NaNO₃ aufIn 200 ml culture flasks add 50 ml of culture medium (50 g · glucose, 1 g pectin, 7.5% NH ₄ NO ₃ , 5 g KH ₂ PO ₄ , 0.3 g FeSO ₄ O, 0.3 g MgSO ₄ o 7H ₂ O, 0.3 g CaCO ₃ , 0.3 g NaNO ₃

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1000 ml Aqua desto,pH 4,5) mit 0,5 ml einer Sporensuspension (1 χ 10 Sporen/ml) des Stammes*Aspergillus niger beimpft und 3 Tage lang bei 30 ⁰C und 220 U/min geschüttelt« Das angezüchtete Myzel aus einem Schüttelkolben wird von1000 ml of water the more, pH 4.5) with 0.5 ml of a spore suspension (1 × 10 spores / ml) of the strain * Aspergillus niger and shaken for 3 days at 30 ⁰ C and 220 rev / min «The cultivated mycelium a shake flask is from

ρ der Kulturflüssigkeit über 6,5 cm Textilgewebe abgetrennt, in diesem eingebunden und in eine Kulturflasche mit 50 ml frischem Kluturmedium überführte Auf einem Rotationsschüt— teltisch mit 220 U/min wird bei 30 ⁰C nach 3 Tagen im Kulturmedium eine feste Myzelstruktur ausgebildete Diese produziert nach 6 Tagen etwa 660 PG-E (Polygalakturonase-Einheiten) je ml Kulturlösung. Im Vergleich dazu werden mit diffusem Myzel nur ca. 10 PG-E/ml erzielteρ the culture liquid over 6.5 cm textile fabric separated, incorporated into this and transferred to a culture flask with 50 ml fresh Kluturmedium on a rotary shaking tabel at 220 U / min is produced at 30 ⁰ C after 3 days in the culture medium a solid mycelial structure formed this after 6 days, about 660 PG-E (polygalacturonase units) per ml of culture solution. In comparison, with diffuse mycelium only about 10 PG-E / ml scored

Example 2

600 ml Kluturmedium II (40 g Zuckerrübenextrakt; 10 g NHJMO. 5 g KH₂PO^, auf 1000 ml Leitungswasser, pH 4,5) in einem 3 1 Kulturkolben werden'mit Myzel aus 10 χ 200 ml Kultur-600 ml Kluturmedium II (40 g sugar beet extract;. 10 g NHJMO 5 g KH ₂ PO ^, to 1000 ml tap water, pH 4.5) in a 3 1 flask culture werden'mit mycelium from 10 χ 200 ml culture

P flaschen, das in ca. 20 cm Textilgewebe eingebunden ist, versetzt. Zur Kultivierung wird der Kolben auf einem Rotationsschüttertisch mit 220 U/min bei 30 °C gebrachte Nach 5 Tagen erzielt man ca. 240 PG-E/ml.P bottles, which is integrated in about 20 cm of textile fabric, offset. For cultivation, the flask is placed on a rotary table at 220 rpm at 30 ° C. After 5 days, about 240 PG-E / ml are obtained.

Example 3

In einem 30 1 Glasfermentor mit 15 1 Kulturmedium Il wirdIn a 30 1 glass fermentor with 15 1 culture medium Il is

2 die Myzelmenge aus 30 χ 200 ml Schüttelkolben, die in 50 cm textilem Gewebe verdichtet wurde, eingesetzt. Die Kultivation beginnt mit sehr geringer Belüftung (40 l/h Luft) und wird am 3« Tag auf 90 l/h erhöht. Nach 6 Tagen werden ca ο 90 PG-E/ml, erhalten*2 The amount of mycelium from 30 χ 200 ml shake flasks, which was compressed in 50 cm of textile fabric used. Cultivation starts with very low ventilation (40 l / h air) and is increased to 90 l / h on the 3rd day. After 6 days, approximately 90 PG-E / ml are obtained.

Claims

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invention claims

A method for obtaining pectinolytic enzymes by submerged cultivation of Aspergillus niger in two culture stages using conventional carbohydrate, nitrogen and saline culture media, characterized in that diffused in a first culture stage diffuse mycelium after 2 to 3 days with a for the culture medium permeable inert material, preferably porous, porous or woven, in the form of a tissue, separated from the culture medium, forcibly compacted to a predetermined extent and further cultured in a second culture step using a culture medium of the same or different composition for enzyme production.

Z ₀ Process according to item 1, characterized in that the mycelium grown from O ₁ Z to 0.5 g of 100 ml of culture medium is compacted to a media volume of 1.0 to 2.0 ml in a 1st culture stage.

3o method according to item 1 to 2, characterized in that compacted mycelium is used for several approaches of the second culture stage, wherein the enzyme-containing culture medium is poured off after 5 to 7 days and replaced by fresh »culture medium.

Method according to item 1, characterized in that diffuse mycelium of the first culture stage is separated and compacted in several portions.