DE2264764C3 - Process for the production of yeast mutants with high citric acid production capacity - Google Patents
Process for the production of yeast mutants with high citric acid production capacityInfo
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Description
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Hefemutanten mit hohem Citronensäurebildungsvermögen. The invention relates to a process for the production of yeast mutants with a high ability to produce citric acid.
Citronensäure findet in der Lebensmittelindustrie, Pharmazie, Kosmetik und anderen Industriezweigen in großen Mengen Verwendung. Ihre industrielle Gewinnung durch mikrobielle Fermentation beschränkte sich bisher auf die Verwendung von Schimmelpilzen und kohlenhydrathaltigen Rohstoffen. In den letzten Jahren wurden in Veröffentlichungen und Patentschriften in zunehmendem Maße auch die Möglichkeit des Einsatzes einzelliger Mikroorganismen, wie Hefen oder Bakterien, sowie die Verwendung von Kohlenwasserstoffen als Rohmaterial zur Herstellung von Citronensäure beschrieben. Für eine Herstellung im industriellen Maßstab sind jedoch diese Verfahren in der Praxis den herkömmlichen Verfahren mit Aspergillus und Kohlenhydraten als Substrat noch unterlegen. Dafür sind hauptsächlich die folgenden Gründe zu nennen:Citric acid is found in the food industry, pharmaceuticals, cosmetics and other industries in large amounts of use. Their industrial production through microbial fermentation was limited so far on the use of mold and raw materials containing carbohydrates. In recent years In publications and patents, the possibility of use was also increasingly found unicellular microorganisms such as yeast or bacteria, as well as the use of hydrocarbons described as a raw material for the production of citric acid. For an industrial production In practice, however, these methods are the standard for conventional methods with Aspergillus and carbohydrates still inferior as a substrate. The main reasons for this are:
1. Bei nahezu allen beschriebenen Verfahren sind die Citronensäure-Konzentrationen in der Fermentationssuspension noch verhältnismäßig niedrig und dadurch wird die Aufarbeitung mitunter unrationell. 1. In almost all of the processes described, the citric acid concentrations are in the fermentation suspension still relatively low and this makes work-up sometimes inefficient.
2. Neben Citronensäure wird Iso-Citronensäure z.T. in beträchtlichen Mengen gebildet, die unter großtechnischen Bedingungen nur mit größten Schwierigkeiten von der Citronensäure zu trennen ist.2. In addition to citric acid, iso-citric acid is sometimes formed in considerable quantities, which are below to separate from the citric acid on a large scale only with great difficulty is.
Man hat auch schon gefunden, daß man die Citronensäureausbeute durch Zusatz eines Aconitase-Hemmstoffes bzw. Citronensäureantimetaboliten oder deren Vorstufen in das Fermentationsmedium verbessern kann. Der Einsatz von Aconitase-Hemmstoffen bei der Fermentation ist in großtechnischem Maßstab aus preislichen Gründen jedoch nicht vorteilhaft. Auch besteht bei der Zugabe des Aconitase-Hemmstoffes in das Fermentationsmedium die Gefahr, daß die Substanz in das Endprodukt gelangen kann und dort für den Menschen toxisch ist.It has also already been found that the citric acid yield can be increased by adding an aconitase inhibitor or citric acid antimetabolites or their precursors in the fermentation medium can. The use of aconitase inhibitors in fermentation is off on an industrial scale price reasons, however, not advantageous. Also with the addition of the aconitase inhibitor there is the fermentation medium the risk that the substance can get into the end product and there for the Is toxic to humans.
Es war deshalb das Ziel der Erfindung, die durch die Antimetaboliten bewirkte Aconitase-Hemmung durch Mutation genetisch festzulegen, so daß sich der Zusatz eines Aconitase-Hemmstoffes zum Fermentationsmedium erübrigt.It was therefore the aim of the invention that by the Antimetabolite-induced aconitase inhibition by genetic mutation so that the addition an aconitase inhibitor is unnecessary for the fermentation medium.
Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung von Hefe mit hohem Citronensäure-Bildungsvermögen, bei dem man Citronensäure bildende Hefen mit Mutation auslösenden Mitteln behandelt, die behandelten Hefen in ein Glucose-Mineral-Medium überimpft, anschließend mehrtägig bei 28° C inkubiert und aus dem Nährmedium die angereicherten Hefemutanten mit hohem Citronensäure-Bildungsvermögen nach Ausplattieren auf Vollmediumplatten nach dem üblichen Verfahren isoliert, dadurch gekennzeichnet, daß man im Verlauf der mehrtägigen Inkubation bei 28° C steigende Konzentrationen an Citronensäureantimetaboliten oder deren Vorstufen bis zu einer Endkonzentration von 5 χ 10"2 Mol/l zusetzt.The invention relates to a process for the production of yeast with high citric acid production capacity, in which citric acid-producing yeasts are treated with mutation-inducing agents, the treated yeasts are inoculated into a glucose-mineral medium, then incubated for several days at 28 ° C. and removed from the Nutrient medium, the enriched yeast mutants with high citric acid production capacity are isolated after plating on complete medium plates according to the usual method, characterized in that in the course of the multi-day incubation at 28 ° C increasing concentrations of citric acid antimetabolites or their precursors up to a final concentration of 5 χ 10 " 2 Mol / l added.
Überraschenderweise wurde festgestellt, daß Hefestamme mit geringerem Citronensäure-Bildungsvermögen schon bei einer geringeren Konzentration an Aconitase-Hemmstoff, z. B. Monofluoracetat, im Wachstum gehemmt werden, als solche mit höherer Citronensäureproduktion. Der erfindungsgemäße Zu-Surprisingly, it was found that yeast strains with lower citric acid production capacity even at a lower concentration Aconitase inhibitor, e.g. B. monofluoroacetate, im Growth will be inhibited than those with higher citric acid production. The inventive addition
Hi satz eines Citronensäureantimetaboliten, wie z. B. Fluoressigsäure, während der sich an die Mutationsauslösung anschließenden mehrtägigen Inkubation, stellt somit einen äußerst wirksamen Anreicherungsschritt dar, der solchen Mutanten, die vermehrt CitronensäureHi rate of a citric acid antimetabolite, such as. B. Fluoroacetic acid, during the incubation of several days following the mutation thus an extremely effective enrichment step for those mutants that increase citric acid
;s bilden, einen Selektionsvorteil gegenüber schwächeren
Produzenten bietet. Diese Beobachtung wurde als Prinzip für das erfindungsgemäße Verfahren ausgenutzt.
Hefemutanten, die Citronensäure gegenüber dem Wildtyp vermehrt ausscheiden, konnten bisher nur
durch Austesten einer Vielzahl von nach Mutationsauslösung isolierter Kolonien in Fermentationsversuchen
aufgefunden werden.
Erfindungsgemäß ist es nun gelungen, diese äußerst; s form, offers a selection advantage over weaker producers. This observation was used as a principle for the method according to the invention.
Yeast mutants which excrete more citric acid than the wild type could only be found by testing a large number of colonies isolated after mutation in fermentation experiments.
According to the invention it has now been possible to achieve this extremely
}s aufwendige und mit unsicheren Erfolgschancen bekannte Verfahrensweise auf ein Minimum an Arbeitsaufwand zu reduzieren. } s time- consuming procedure, known with uncertain chances of success, to reduce to a minimum of work.
Erfindungsgemäß wird so verfahren, daß nach der Mutationsauslösung mit den üblichen bekannten mutagenen Agentien, wie z.B. Nitrit, t-Methyl-3-nitro-l-nitroso-guanidin, UV- oder Röntgenstrahlen, die behandelte Zellsuspension in eine Glucose-Mineralmedium geimpft wird und man im Verlauf der anschließenden, mehrtägigen Inkubation bei 28°C mit steigendenAccording to the invention, the procedure is that after the mutation has been triggered with the usual known mutagenic Agents such as nitrite, t-methyl-3-nitro-l-nitroso-guanidine, UV or X-rays transfer the treated cell suspension into a glucose mineral medium is inoculated and one in the course of the subsequent, multi-day incubation at 28 ° C with increasing
4s Konzentrationen an Aconitase-Hemmstoffen bzw. Citronensäureantimetaboliten oder deren Vorstufe, wie halogenierte Mono-, Di- und Tricarbonsäuren, deren Salze oder Amide, insbesondere Monofluoracetat, bis zu einer Endkonzentration von 5 χ 10" 2 Mol/l versetzt.4s concentrations of aconitase inhibitors or citric acid antimetabolites or their precursors, such as halogenated mono-, di- and tricarboxylic acids, their salts or amides, in particular monofluoroacetate, up to a final concentration of 5-10 " 2 mol / l.
M> Während dieser Zeit tritt eine starke Anreicherung von Mutanten mit hoher Citronensäureausscheidung ein, die anschließend nach Ausplattieren auf Vollmedium-Platten nach dem üblichen Verfahren isoliert werden können. Diese Anreicherungstechnik bietet eineM> During this time there is a strong accumulation of mutants with a high level of citric acid excretion, which are then plated out on complete medium plates can be isolated by the usual method. This enrichment technique offers a
>5 erhebliche Ersparnis an Zeit und Arbeitsaufwand und erhöht die Chance der Entdeckung geeigneter Mutanten beträchtlich, da als Alternative nur die Untersuchung einer Vielzahl von abgeimpften Kolonien in Fermentationsversuchen in Frage käme, wobei die> 5 considerable savings in time and effort and increases the chance of discovering suitable mutants considerably, since the only alternative is the investigation a large number of inoculated colonies in fermentation experiments would come into question, the
(χ) erwünschten Mutanten nur einen äußerst geringen Prozentsatz der insgesamt vorhandenen Zellen nach Mutationsauslösung darstellen.(χ) desired mutants only an extremely small number Represent the percentage of the total cells present after the mutation has been triggered.
Mittels dieser Technik gelang es, Mutanten der Hefe Candida oleophila zu isolieren, die sich gegenüber demUsing this technique, it was possible to isolate mutants of the yeast Candida oleophila, which differed against the
''s Ursprungsstamm durch eine stark erhöhte Citronensäureausscheidung
in Kohlenhydratmedien auszeichneten.
Bei Einsatz dieser Mutanten in n-Paraffingärmedien stellte sich überraschenderweise heraus, daß hier nicht'' s original strain was characterized by a greatly increased excretion of citric acid in carbohydrate media.
When these mutants were used in n-paraffin fermentation media, it was surprisingly found that not here
nur die Ausbeute an Citronensäure erhöht war, sondern auch der Prozentsatz an gleichzeitig gebildeter Iso-Citronensäure von ca. 40% der Gesamtsäure beim Ursprungsstamm auf 0,5 bis 5% je nach Mutantenstamm zurückgegangen war.only the yield of citric acid was increased, but also the percentage of iso-citric acid formed at the same time of approx. 40% of the total acid Original strain had decreased to 0.5 to 5% depending on the mutant strain.
Beispiel 1 a) Gewinnung geeigneter Mutantenexample 1 a) Obtaining suitable mutants
Candida oleophila ATCC Nr. 20 177, eine übliche, ι ο Citronensäure bildende Hefe, wurde von einem Schrägagarröhrchen in 25 ml Glucose-Mineral-Medium (1% Glucose. 0,05% KH2PO4, 0,02% MgSO4 · 7 H2O, 0,025% MnSO4 · 4 H2O, 0,2% NH4Cl, 0,05% Hefeextrakt, 0,1% NaHCO3) geimpft und 48 Stunden bei 28° C geschüttelt. Mit dieser Vorkultur wurde eine zweite Glucose-Mineral-Kultur so beimpft, daß die Anfangs-ZellkonzentratioD ca. 1 χ lOVinl betrug. Nach 15stündiger Inkubation unter Schütteln bei 28° C waren die Zellen in der logarithmischen Wachstumsphase und hatten eine Konzentration von ca. 8 χ I OVmI erreicht 5 ml der wachsenden Kultur wurden mit 0,05 ml l-Nitrose-3-nitro-l-methyl-guanidin-Lösung (50 mg/ml) versetzt und weitere 2 Stunden geschüttelt. In dieser Zeit wurden 99,9% der Hefezellen abgetötet. Die Reaktion wurde durch Abzentrifugieren und Waschen der Zellen mit 0,9%iger NaCl-Lösung abgestoppt. Anschließend wurden die Zellen in Vollmedium (5% Glucose, 0,5% Pepton, 0,3% Hefeextrakt, 03% Malzextrakt) suspendiert und bei 28°C geschütteltCandida oleophila ATCC No. 20 177, a common yeast which produces citric acid, was removed from an agar slant in 25 ml of glucose-mineral medium (1% glucose. 0.05% KH 2 PO 4 , 0.02% MgSO 4 . 7 H 2 O, 0.025% MnSO 4 · 4 H 2 O, 0.2% NH 4 Cl, 0.05% yeast extract, 0.1% NaHCO 3 ) and shaken for 48 hours at 28 ° C. A second glucose-mineral culture was inoculated with this preculture in such a way that the initial cell concentration was approx. After incubation for 15 hours with shaking at 28 ° C., the cells were in the logarithmic growth phase and had reached a concentration of about 8 μl of OVmI. 5 ml of the growing culture were mixed with 0.05 ml of 1-nitrose-3-nitro-1-methyl guanidine solution (50 mg / ml) and shaken for a further 2 hours. During this time, 99.9% of the yeast cells were killed. The reaction was stopped by centrifuging off and washing the cells with 0.9% NaCl solution. The cells were then suspended in complete medium (5% glucose, 0.5% peptone, 0.3% yeast extract, 03% malt extract) and shaken at 28.degree
Während der folgenden 5tägigen Bebrütung wurden die Zellen täglich in frisches Vollmedium mit steigenden Mengen an Mono-Fluoracetat bis zu einer Endkonzentration von 5 χ 10~2 Mol/l übertragen. Die Zellsuspen- sicn wurde anschließend in geeigneter Verdünnung auf Vollmedium-Platten ausgespatelt. Die überlebenden Zellen wuchsen innerhalb 2 Tagen zu Kolonien heran und wurden nun durch Stempelübertragung auf Glucose-Mineral-Agar-Platten mit unterschiedlichen Konzentrationen an Fluoracetat abgeimptt. Nach 2tägiger Inkubation wurden die Platten mit einer Zellsuspension des Ursprungsstammes (ca. 107 Zellen/ml in Glucose-Mineral-Lösung) besprüht und weitere 2 Tage inkubiert.During the next 5-day incubation, the cells were transferred daily to fresh complete medium with increasing amounts of mono-fluoroacetate to a final concentration of 5 χ 10 -2 mol / l. The cell suspensions were then spatially diluted onto complete medium plates with a spatula. The surviving cells grew into colonies within 2 days and were then seeded with different concentrations of fluoroacetate by transferring stamps to glucose-mineral-agar plates. After incubation for 2 days, the plates were sprayed with a cell suspension of the original strain (approx. 10 7 cells / ml in glucose-mineral solution) and incubated for a further 2 days.
Auf den Platten mit einer Fluoracetat-Konzentration von 10~2 Mol/l kamen die Wildtyp-Zellen nicht mehr zum Wachstum; vorher gewachsene, stark citronensäureausscheidende Mutanten konnten jedoch an einem sie umgebenen Hof von Satellitenkolonien des Ursprungs-Stammes erkannt und an der entsprechenden Stelle von der Vollmediumplatte abgeimpft und isoliert werden.On the plates with a fluoroacetate concentration of 10 -2 mol / l of the wild-type cells did not come to the growth; However, previously grown, strongly citric acid-secreting mutants could be recognized in a surrounding courtyard of satellite colonies of the original strain, and they could be inoculated and isolated at the appropriate point from the complete medium plate.
Nach dem im Beispiel beschriebenen Verfahren wurde aus dem Hefestamm Candida oleophila ATCC 20 177 die Mutante AC 7, DSM 343 (deutsche Samm- 5.s lung für Mikroorganismen, Göttingen) erhalten.Following the procedure described in Example 177, the method 20 mutant AC 7, DSM 343 (German collec-. 5 Göttingen s development of microorganisms) was prepared from the yeast strain Candida oleophila ATCC obtained.
Außer der Hefe Candida oleophila können erfindungsgemäß alle Hefen, die fähig sind, Citronensäure zu produzieren, nach Beispiel \ in Hefemutanten mit hohem Citronensäurebildungsvermögen übergeführt f,0 werden. So lassen sich nach Beispiel 1 z. B. Mutanten der ursprünglichen Stämme der Candida lipolytica ATCC 8661,8662 und 9773 gewinnen.Except for the yeast Candida oleophila can according to the invention all the yeasts which are able to produce citric acid, f converted according to Example \ in yeast mutants with high Citronensäurebildungsvermögen, are 0th Thus, according to Example 1, for. B. Mutants of the original strains of Candida lipolytica ATCC 8661, 8662 and 9773 can be obtained.
Die folgenden Beispiele sollen den technischen Fortschritt zeigen, der bei Einsatz der.erfindungsgemäßen Hefemutanten im Vergleich zu dem Ursprungsstamm bei der Herstellung von Citronensäure erzielt 5 wird.The following examples are intended to show the technical progress achieved when using the yeast mutants according to the invention in comparison to the original strain in the production of citric acid 5 will.
Die nach dem im Beispiel 1 beschriebenen Verfahren isolierte Mutante AC 7 des Ursprungsstammes Candida oleophila ATCC Nr. 20 177 wurde von einem Schrägagarröhrchen mit Hefe-Malzextrakt-Pepton-Glucose-Agar in 50 ml eines flüssigen Mediums der gleichen Zusammensetzung geimpft und 24 Stunden bei 28°C geschüttelt Die gut gewachsene Kultursuspension wurde daraufhin in 500 ml des folgenden Mediums überführt: 0,05% KH2PO4, 0,02% MgSO4 · 7 H2O, 0,025% MnSO4 · 4 H2O, 0,25% NH4CI, 0,05% Com steep powder, 2% (Vol.) n-Dodecan, 1% CaCO3. Nach 48stündiger Kultivierung wurde mit dieser Vorkultur eine zweite Vorkultur mit 51 Gesamtvolumen beimpft und in einem Fermentergefäß unter Rühren und Luftzufuhr weitere 24 Stunden kultiviert Mit 2 1 der so erhaltenen Zellsuspension erfolgte die Animpfung von 301 des nachfolgend aufgeführten Fermentationsmediums:The mutant AC 7 of the original strain Candida oleophila ATCC No. 20 177, which was isolated by the method described in Example 1, was inoculated from an agar slant with yeast-malt extract-peptone-glucose agar in 50 ml of a liquid medium of the same composition and inoculated for 24 hours at 28 The well-grown culture suspension was then transferred to 500 ml of the following medium: 0.05% KH 2 PO 4 , 0.02% MgSO 4 · 7 H 2 O, 0.025% MnSO 4 · 4 H 2 O, 0, 25% NH 4 CI, 0.05% com steep powder, 2% (vol.) N-dodecane, 1% CaCO 3 . After 48 hours of cultivation, a second preculture with a total volume of 51 was inoculated with this preculture and cultivated in a fermenter vessel with stirring and supply of air for a further 24 hours.
0,050/o KH2PO4 0.050 / o KH 2 PO 4
0,02% MgSO4 · 7 H2O 0,025% MnSO4 · 4 H2O0.02% MgSO 4 · 7H 2 O 0.025% MnSO 4 · 4H 2 O
0,25% NH4CI0.25% NH 4 CI
0,05% pulverisiertes Maisquellwasser0.05% powdered corn steep water
8,0% CaCO3 8.0% CaCO 3
10,0% (Gew./ VoI.) n- Dodecan10.0% (w / v) n-dodecane
Die Fermentation wurde in einem 50-1-Fermentergefäß bei 28° C mit einer Rührerdrehzahl von 600 U/min und einem Luftdurchfluß von 0,7 l/l/min durchgeführt. Nach 24stündiger Kultivierung war eine maximale Zellzahl von ca. 8 χ 108ZmI erreicht.The fermentation was carried out in a 50 l fermenter vessel at 28 ° C. with a stirrer speed of 600 rpm and an air flow rate of 0.7 l / l / min. After 24 hours of cultivation, a maximum cell count of approx. 8 10 8 ZmI was reached.
Nach 4tägiger Gärung betrug die Citronensäurekonzentration im Fermentationsmedium 114/g/l. Es konnten 4,5 g/l Iso-Citronensäure nachgewiesen werden.After 4 days of fermentation, the citric acid concentration in the fermentation medium was 114 / g / l. 4.5 g / l iso-citric acid could be detected.
Die Citronensäure konnte nach Zusatz von Salzsäure zum Medium und Abfiltrieren der Hefezellen durch Ausfällung mit Calciumhydroxid und anschließende Filtration als Tricalciumcitrat aus dem Medium isoliert und nach Umsetzung mit Schwefelsäure aus dem eingeengten Filtrat kristallin gewonnen werden.After adding hydrochloric acid to the medium and filtering off the yeast cells, the citric acid was able to pass through Precipitation with calcium hydroxide and subsequent filtration as tricalcium citrate isolated from the medium and obtained in crystalline form from the concentrated filtrate after reaction with sulfuric acid.
Candida oleophila ATCC 20 177 wurde von einem Schrägagarröhrchen mit Hefe-Malzextrakt-Pepton-Glucose-Agar in ein flüssiges Medium der gleichen Zusammensetzung geimpft und 24 Stunden bei 28° C geschüttelt. Diese Zellsuspension wurde zur Animpfung einer Vorkultur mit 2% n-Dodecan, deren Zusammensetzung im Beispiel 1 beschrieben wurde, benutzt und nach 48stündiger Belüftung 10%ig in 100 ml des im Beispiel 1 aufgeführten Fermentationsmediums übertragen. Die Fermentation erfolgte im 1-l-Rundkolben unter Schütteln bei 28° C.Candida oleophila ATCC 20 177 was taken from an agar slant containing yeast-malt extract-peptone-glucose agar in a liquid medium of the same Inoculated composition and shaken at 28 ° C for 24 hours. This cell suspension was used for inoculation a preculture with 2% n-dodecane, the composition of which was described in Example 1, used and after aeration for 48 hours, 10% is transferred into 100 ml of the fermentation medium listed in Example 1. The fermentation took place in a 1 l round bottom flask Shake at 28 ° C.
Es wurden nach 4tägiger Fermentationsdauer folgende Konzentrationsverhältnisse erhalten: 72,5 g/l Citronensäure, 50,5 g/l Iso-Citronensäure.After 4 days of fermentation, the following concentration ratios were obtained: 72.5 g / l citric acid, 50.5 g / l iso-citric acid.
Claims (1)
Priority Applications (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE2264763A DE2264763C3 (en) | 1972-03-17 | 1972-03-17 | Process for the production of citric acid |
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Applications Claiming Priority (2)
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Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| DE2264764A1 DE2264764A1 (en) | 1975-03-20 |
| DE2264764B2 DE2264764B2 (en) | 1977-05-26 |
| DE2264764C3 true DE2264764C3 (en) | 1978-01-19 |
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