DD201149A1 - Verfahren zur gewinnung pektinolytischer enzyme - Google Patents

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Gewinnung oektinolytischer Enzyme unter Verwendung von Schimmelpilzen. Das Enzympraeparat ist zur Steigerung der Fruchtsaftausbeute, zur Fruchtsaftklaerung sowie zur Mazeration von Obst und Gemuese geeignet. Ziel der Erfindung ist die Steigerung der Enzymbildung. Die daraus abgeleitete Aufgabe besteht im Auffinden einer geeigneten Verfahrensweise. Erfindungsgemaess wird in einer 1. Kulturstufe diffuses Myzel von einem Schimmelpilz, vorzugsweise Aspergillus niger, in Submerskultur angezuechtet und dieses dann in einem oder mehreren Behaeltnissen aus sterilisierbarem Textil- oder Drahtgewebe bestimmter Durchaessigkeit von der Kulturloesung abgetrennt, wodurch es zwangsweise zu einer fuer die Enzymbildung vorteilhaften Verdichtung des Myzels kommt. Ein oder mehrere der myzelhaltigen Behaeltnisse werden zum Zwecke der Enzymproduktion in einer 2. Kulturstufe unter Verwendung von Kulturmedien ueblicher Zusammensetzung 5 bis 7 Tage bei vorgegebenen Bedingungen kultiviert. Durch Ablassen des enzymhaltigen und durch Zugabe von frischem Kulturmedium kann das Myzel fuer mehrere Fermentationen genutzt werden.

Description

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Erfinder: Christine Wardsack

Dr. Andreas Leuchtenberger Prof. Dr. Heinz RuttIoff

Verfahren zur Gewinnung pektinol/ytischer Enzyme Anwendungsgebiet der Erfindung

Die Erfin'dung betrifft ein Verfahren zur Gewinnung pektinoIytischer Enzyme unter Verwendung von Schimmelpilzen. Die nach diesem Verfahren hergestellte Enzymlösung wird in der obst- und gemüseverarbeitenden Industrie eingesetzt und dient vorrangig zur Mazeration von Obst und Gemüse. Sie ist desweiteren zur Fruchtsaftklärung und zur Steigerung der Fruchtsaftausbeute verwendbar.

Charakteristik der bekannten technischen Lösungen

Verschiedene Schimmelpilze, insbesondere der Gattung Aspergillus niger, sind bekannt dafür, daß sie sowohl emers als auch submers pektinoIytische Enzmy bilden. Beim Submersverfahren wird die Kulturlösung im Schüttelkolben oder im Fermentor mit Sporen oder vegetativem Myzel beimpft und durch Schütteln oder durch Belüftung und Rührung wird das Wachstum der Schimmelkultur angeregt. Während der mehrtätigen !Cultivation entwickelt sich eine diffuse Myzelmasse, die pektinoIytische Enzyme ausscheidet. Die Enzymausbeute ist bei einer solchen Myzelstruktur erfahrungsgemä£ relativ gering. Es gibt daher eine Anzahl von Verfahren,

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die sich mit der Aktivitätssteigerung durch Zugabe spezieller Währmedienkomponenten oder durch Variierung der Kulturführung befassen.

Eine im Vergleich zu den zuvor mit diffuser Myzelmasse angeführten Verfahren wesentlich intensivere Bildung pektinolytischer Enzyme kann erreicht werden, wenn die .fermentation mit schwamm- bzw. pelletartigen Myzelstrukturen durchgeführt wird. A.A. Martakov und 0.P₀ Dianova (Izv. Akad. Nauk Kaz₀ SSR, Ser· Biol. 5 (6) 54-99 (196?)) erreichen diese Myzelform dadurch, daß durch kreisende Bewegung eines JXulturgefäßes ein Myzelring an der Gefäßwand entsteht bzw. sich durch Standkultur auf der Medienoberfläche eine Myzelschicht entwickelt,'die nachfolgend mittels Schütteleinrichtung submers kultiviert wird ο JiJiη Nachteil dieser Verfahrenweise ist, daß die Fermentationsgefäße zur Erhaltung der kompakten Myzelstruktur in kreisender Weise bewegt werden müssen, was im technischen Maßstab mit beträchtlichen Schwierigkeiten verbunden ist. nJine für diesen Maßstab praktikable Verfahrensvariante beschreibt ein Patent von F. Baum, A. Leuchtenberger, H. Rut loff, L·. Schiweck und Gh. lardsack (DWP 145 027; Verfahren und Vorrichtung zur Herstellung von pektinolytischen Enzymen )o Wach emerser Anzucht einer Myzeldecke von Aspergillus niger wird diese unter Verwendung eines geeigneten Nährbodens mit Hilfe einer siebartigen Vorrichtung untergetaucht und 5 bis 7 Tage belüftete Die Myzeldecke wächst zu einer schwammartigen Myzelstruktur heran, die erhöhte JSn zy mm engen produziert. Nachteil dieses Verfahrens ist eine durch den Gefäßdurchmesser beschränkte Myzeldeckengröße, die für eine gute Enzymentwicklung nur eine relativ schlechte Fermentorraumauslastung zuläßt.

Ziel der Erfindung

Das Ziel der Erfindung besteht darin, durch eine spezielle Verfahrensweise zur Gewinnung pektinoIytischer Enzyme mit Aspergillus niger Enzymaktivitäten zu erzielen, die wesent

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lieh über den Ausbeuten mit diffusem Myzel liegen und geräte technische Probleme, die bei Verwendung von schwammartigen Myzelstrukturen entstehen, zu vermeiden.

Darlegung des "Wesens der Erfindung

Im Gegensatz zu bekannten Submersverfahren, die mit dif-v fusem Myzel arbeiten, besteht das Wesen des erfindungsgemäßen Verfahrens darin, daß angezüchtetes diffuses Myzel mechanisch verdichtet und dadurch überraschender Weise zu einer wesentlichen höheren Enzymproduktion veranlaßt wird. Gegenüber anderen Verfahren, die mit schwammartigen Myzelstrukturen arbeiten, zeichnet sich die gefundene Prinzip» lösung dadurch aus, daß sie mit relativ einfachen Mitteln im technischen Maßstab unter Verwendung von herkömmlichen Rührfermentoren oder auch Spezialfermentoren realisierbar ist und, daß durch Einsatz von Behältnissen aus einem für das Kulturmedium durchlässigen inerten Material, mit vorzugsweise poröser, poriger oder gewebter Struktur, insbesondere aus einem inerten Gewebe, die Myzeldichte reproduzierbar so einstellbar ist, daß der Schimmelpilz zu einer noch höheren Enzymsynthese veranlaßt wird.

Nach dem erfindungsgemäßen Verfahren wird zur Herstellung .von pektinolytischen Enzymen mittels Schimmelpilzen, insbesondere solchen der Gattung Aspergillus, vorzugsweise der Art Aspergillus niger, zunächst zu einem Nährmedium , üblicher Zusammensetzung aus Sporen unter Belüftung und Rührung bei 28 bis 32 ⁰C über 2 bis 3 Tage diffuses Myzel angezüchtet ("U Kulturstufe )_o Dieses diffuse Myzel wird anschließend unter Verwendung eines oder mehrerer Behältnisse aus einem für das Kulturmedium durchlässigen inertem Material, vorzugsweise aus Gewebe, von der Nährlösung abgetrennt, wodurch eine Verdichtung erfolgte Das in den Behältnissen befindliche verdichtete Myzel wird -dann in einer 2. Kulturstufe mit frischer Nährlösung gleicher oder anderer Zusammensetzung wie das Anzuchtmedium in an" sich bekannter Weise zum Zwecke der Enzymproduktion weiter kultiviert.

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Die Nährlösung beinhaltet Kohlenhydrat- und Stickstoffquellen sowie verschiedene Salze ο Es sind dies vorzugsweise 0,1 bis 0,5 % Pektin, 4 bis 7 % Glucose oder Saccharose, 0,5 bis 1 % M₄NO₃, 0,1 bis 0,75 % KH₂PO₄ sowie 0,03 % NaCl, MgSO₄, FeSO₄ und CaCO-. Pektin und Zucker können auch durch 4 % Zuckerrüben oder Rübenschnitzelextrakt unter Zusatz von 1 bis 5 % Glucose oder Saccharose ersetzt werden.

Die zum Abtrennen und Verdichten sowie zur spateren Kultivierung des Myzels erforderlichen Behältnisse müssen eine gewisse Durchlässigkeit besitzen und sterilisierbar sein; Zweckmäßig ist die Anwendung eines Textil- oder VpA-Gewebes.

Wesentlich ist, daß die Durchflußzeit durch das durchlässige Behältnis für 8 ml Fermentationslösung durch 1 cm Fläche des entsprechenden .Materials nicht weniger als 2 see. and nicht mehr als 16 see· beträgt.

Erfindungsgemäß wird die in einer 1. Kulturstufe gebildete Myzeltrockenmasse von 0,2 bis 0,5 S> bezogen auf 100 ml Medium, auf ein Medienvolumen von 1 'bis 2 ral verdichtet. Die Enzyrabildung in der 2. Kulturstufe erfolgt über 3 bis 7 Tage bei 28 bis 32 ⁰C unter Rühren und Belüften. Erforderlichenfalls ist ein mehrmaliger Austausch (3 bis 5 aal) der pektinolytisch aktiven Fermentationslösung gegen frisches Nährmedium nach 3 bis 7 Tagen durchführbar. Die zum Aufnehmen, Verdichten und späteren Kultivieren des Myzels erforderliche Anzahl und Größe der Behältnisse kann nach der Fermentationsgröße variiert werden,» Die Erfindung ist in den folgenden Aüsführungsbeispielen näher erläuterte

Ausführungsbeispiele., Beispiel 1

In 200 ml Kulturflaschen werden 50 ml Kulturmedium (50 g · Glucose; 1 g Pektin; 7,5 S NH₄NO₃; 5 g KH₂PO₄; 0,3 g FeSO₄ O; 0,3 g MgSO₄ ο 7H₂O; 0,3 g CaCO₃; 0,3 g NaNO₃ auf

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1000 ml Aqua desto,pH 4,5) mit 0,5 ml einer Sporensuspension (1 χ 10 Sporen/ml) des Stammes*Aspergillus niger beimpft und 3 Tage lang bei 30 ⁰C und 220 U/min geschüttelt« Das angezüchtete Myzel aus einem Schüttelkolben wird von

ρ der Kulturflüssigkeit über 6,5 cm Textilgewebe abgetrennt, in diesem eingebunden und in eine Kulturflasche mit 50 ml frischem Kluturmedium überführte Auf einem Rotationsschüt— teltisch mit 220 U/min wird bei 30 ⁰C nach 3 Tagen im Kulturmedium eine feste Myzelstruktur ausgebildete Diese produziert nach 6 Tagen etwa 660 PG-E (Polygalakturonase-Einheiten) je ml Kulturlösung. Im Vergleich dazu werden mit diffusem Myzel nur ca. 10 PG-E/ml erzielte

Beispiel 2

600 ml Kluturmedium II (40 g Zuckerrübenextrakt; 10 g NHJMO. 5 g KH₂PO^, auf 1000 ml Leitungswasser, pH 4,5) in einem 3 1 Kulturkolben werden'mit Myzel aus 10 χ 200 ml Kultur-

P flaschen, das in ca. 20 cm Textilgewebe eingebunden ist, versetzt. Zur Kultivierung wird der Kolben auf einem Rotationsschüttertisch mit 220 U/min bei 30 °C gebrachte Nach 5 Tagen erzielt man ca. 240 PG-E/ml.

Beispiel 3

In einem 30 1 Glasfermentor mit 15 1 Kulturmedium Il wird

2 die Myzelmenge aus 30 χ 200 ml Schüttelkolben, die in 50 cm textilem Gewebe verdichtet wurde, eingesetzt. Die Kultivation beginnt mit sehr geringer Belüftung (40 l/h Luft) und wird am 3« Tag auf 90 l/h erhöht. Nach 6 Tagen werden ca ο 90 PG-E/ml, erhalten*

Claims (1)

1. 235310 5 ,

   Erfindungsansprüche

   1. Verfahren zur Gewinnung pektinolytischer Enzyme durch submerse Kultivierung von Aspergillus niger in zwei Kulturstufen unter Verwendung von gebräuchlichen kohlenhydrate , stickstoff- und salzhaltigen Kulturmedien, dadurch gekennzeichnet, daß in.einer ersten Kulturstufe angezüchtetes diffuses Myzel nach 2 bis 3 Tagen mit einem für das Kulturmedium durchlässigen inertem Material, mit vorzugsweise poröser, poriger oder gewebter Struktur in .Form eines Gewebes, vom Kulturmedium abgetrennt, in einem vorgegebenen Maße zwangsweise verdichtet und in einer zweiten Kulturstufe unter Verwendung eines Kulturmediums gleicher oder anderer Zusammensetzung zur Enzymproduktion weiter kultiviert wird.

   Z₀ Verfahren nach Punkt 1, dadurch gekennzeichnet, daß in einer 1. Kulturstufe angezüchtetes Myzel von O₁Z bis 0,5 g üe 100 ml Kulturmedium auf ein Medienvolumen von 1,0 bis 2,0 ml verdichtet wird·

   3ο Verfahren nach Punkt 1 bis 2, dadurch gekennzeichnet, daß verdichtetes Myzel für mehrere Ansätze der zweiten Kulturstufe verwendet wird, wobei das enzymhaltige Kulturmedium nach 5 bis 7 Tagen abgegossen und durch frisch» Kulturmedium ersetzt wird.

   Verfahren nach Punkt 1 dadurch gekennzeichnet, daß diffuses Myzel der ersten Kulturstufe in mehreren Portionen abgetrennt und verdichtet wird.