DD142973B1

DD142973B1 - ENZYME ELECTRODE FOR ATP DETERMINATION

Info

Publication number: DD142973B1
Application number: DD21246579A
Authority: DD
Inventors: Frieder Scheller; Dorothea Pfeiffer; Ingrid Seyer; Klaus Riedel; Oda Scheller; Martina Siepe
Original assignee: Frieder Scheller; Dorothea Pfeiffer; Ingrid Seyer; Klaus Riedel; Oda Scheller; Martina Siepe
Priority date: 1979-04-25
Filing date: 1979-04-25
Publication date: 1982-06-30
Also published as: DD142973A1

Description

Enzyme electrode for ATP determination Field of application of the invention

Die Erfindung betrifft eine Enzymelektrode zur Bestimmung der Konzentration von ATP, Die Enzymelektrode ist besonders für den Einsatz im klinischen Labor, in der Arzneimittelforschung sowie der Mikrobiologie geeignet, wo auf der Basis der ATP-Messung die enzymatisch^ Aktivität von Kinasen sowie die Konzentration derer Substrate (z.B# Glyzerol, Kreatinin), die Aktivität von ATP-asen sowie deren Hemmstoffen (herzwirksame Medikamente) und die Keimzahl in physiologischen und Fermentationslösungen bestimmt werden kann·The invention relates to an enzyme electrode for determining the concentration of ATP, The enzyme electrode is particularly suitable for use in clinical laboratory, in drug research and microbiology, where based on the ATP measurement, the enzymatic activity of kinases ^ ^ and the concentration of these substrates (eg # glycerol, creatinine), the activity of ATP-asen as well as their inhibitors (cardioactive drugs) and the number of bacteria in physiological and fermentation solutions can be determined ·

Characteristic of the known technical solutions

Eine bekannte Methode zur ATP-Bestimmung beruht auf der ATP-abhängigen Lumineszenz von Luciferin in Gegenwart von Luciferase.· Der Nachteil dieser Methodik liegt in dem großen apparativen Aufwand (Flurometer) sowie dem hohen Preis von Luciferin und Luciferase.A known method for determining ATP is based on the ATP-dependent luminescence of luciferin in the presence of luciferase. The disadvantage of this method is the large expenditure on equipment (flurometer) and the high price of luciferin and luciferase.

Eine andere Methode koppelt die Reaktionen von Hexokinase und Glukose-6-Phosphatdehydrogenase, wobei das in derAnother method couples the reactions of hexokinase and glucose-6-phosphate dehydrogenase, whereas in the

ersten Reaktion entstehende G-6-P unter Bildung von WADPH oxidiert wird. Die Messung der ATP-Konzentration erfolgt über die spektralphotometrisch gemessene NADPH-Menge. Der Nachteil dieser Methode liegt in der Notwendigkeit eines Spektralphotometers sowie des Verbrauchs von KADP. in jeder Messung (Handbook of Enzymatic Methods of Analysis, G. Guilbault, M. Dekker Inc., New York 1976).first reaction G-6-P is oxidized to form WADPH. The ATP concentration is measured by the NADPH amount measured spectrophotometrically. The disadvantage of this method is the need for a spectrophotometer and the consumption of KADP. in each measurement (Handbook of Enzymatic Methods of Analysis, G. Guilbault, M. Dekker Inc., New York 1976).

Object of the invention

Das Ziel der Erfindung ist es, durch die Kombination billiger Enzyme die ATP-Konzentration mittels Enzymelektrode ohne Kofaktorverbrauch in physiologischen und mikrobiologischen Lösungen zu bestimmen»The aim of the invention is to determine the ATP concentration by means of enzyme electrode without cofactor consumption in physiological and microbiological solutions by the combination of inexpensive enzymes.

Explanation of the invention of the invention

Die Aufgabe der Erfindung besteht darin, durch Kombination der Enzyme Glukoseoxidase (GOD) und Hexokinase (HK) ein Signal zu erhalten, das von der ATP-Konzentration abhängt. Die Aufgabe wird mit einer Enzymelektrode dadurch gelöst, daß die beiden Enzyme gemeinsam in einer Schicht vor einer üblichen Sauerstoffelektrode angeordnet sind und der Meßlösung eine definierte Menge Glukose zugesetzt ist. Ід Abwesenheit von ATP tritt durch die Glukoseoxidation ein Op-Verbrauch auf, der der zugesetzten Glukosemenge proportional ist (Prinzip der Glukoseelektrode (F. Scheller et al., Z.med.Lab.Diagn. 18, 312(1977)). Bei Zugabe von ATP zu dieser Lösung wird ein Teil der Glukose durch die HK vor der Elektrode zu G-6-P umgesetzt, so daß eine Verkleinerung des Signals für Glukose auftritt, die von der ATP-Menge abhängt.The object of the invention is to obtain by the combination of the enzymes glucose oxidase (GOD) and hexokinase (HK) a signal which depends on the ATP concentration. The object is achieved with an enzyme electrode in that the two enzymes are arranged together in a layer in front of a conventional oxygen electrode and the measuring solution is added a defined amount of glucose. The absence of ATP by glucose oxidation results in an Op consumption which is proportional to the amount of glucose added (principle of the glucose electrode (F. Scheller et al., Z. Med. Lab. Diag 18, 312 (1977)) From ATP to this solution, part of the glucose is converted by the HC in front of the electrode to G-6-P, so that a reduction of the signal for glucose occurs, which depends on the amount of ATP.

GOD Glukose + Oo Glukonsäure + HpO₂ GOD Glucose + Oo Gluconic Acid + HpO ₂

HK Glukose + ATP G-6-P + ADPHK glucose + ATP G-6-P + ADP

Die erfindungsgemäße Enzymelektrode arbeitet also ohne die Verwendung eines Kofaktors. Sie erlaubt sowohl die kontinuierliche als auch die punktweise Bestimmung der ATP-Konzentration mit einfachen Geräten (pO₂-Me-ter) und ersetztThe enzyme electrode according to the invention thus operates without the use of a cofactor. It allows the continuous as well as the pointwise determination of the ATP concentration with simple devices (pO ₂ -Me-ter) and replaced

teure Enzyme durch GOD*expensive enzymes by GOD *

Zur Bestimmung von Substraten von Kinasen ist es zweckmäßig, daß die Enzymschicht zur Glukoseoxidase und Hexokinase zusätzlich mit Glyzerol- oder Keratininkinase versehen ist·For the determination of substrates of kinases, it is expedient that the enzyme layer for glucose oxidase and hexokinase is additionally provided with glycerol or keratin kinase.

embodiments

Die Erfindung 'soll nachstehend an 3 Ausführungsbeispielen erläutert v/erden.The invention will be explained below with reference to three exemplary embodiments.

Л ·—^is PjL elЛ · - ^ is PjL el

2000 U GOD und 300 U HK werden in 0,3 ml Lösung von 5 mg2000 U GOD and 300 U HK are dissolved in 0.3 ml solution of 5 mg

Acrylamid aufgelöst und auf einer Fläche von 8 cm zwischen 2 Glasplatten ausgestrichen und phot©polymerisiert· Ein 3x3 mm großes Filmstück wird auf der Polyäthylenfolie der Clark-Elektrode unmittelbar vor der Indikatorelektrode (Pt) plaziert, über di-e Enzymschicht wird ein Dialyseschlauch mit einem O-Ring über den Elektrodenmantel gespannt. Die so präparierte Enzymelektrode taucht in die gerührte Meßlösung von 0,1 M Phosphatpuffer, pH 6 mit 10 mM MgCIg und ist an ein pOg-Meter mit Schreiber angeschlossen.Acrylamide dissolved and spread over an area of 8 cm between 2 glass plates and polymerized phot · a 3x3 mm piece of film is placed on the polyethylene film of the Clark electrode immediately in front of the indicator electrode (Pt), via the enzyme layer is a dialysis with a O-ring stretched over the electrode sheath. The enzyme electrode thus prepared is immersed in the stirred measuring solution of 0.1 M phosphate buffer, pH 6 with 10 mM MgClg and is connected to a pOg meter with recorder.

Nachdem sich der Grundstrom eingestellt hat_}wird eine Menge an Glukose zugegeben, sodaß die Konzentration in der Meßlösung 0,5 mM beträgt. ITach 2 Minuten ist der stationäre Stromwert erreicht und es erfolgt 8-mal die Zugabe von jeweils 0,25 mM ATP (Aufnahme der Eichkurve)· Dabei tritt jeweils eine Verkleinerung des Glukosesignals ein, wobei nach dem steilen Abfall unmittelbar nach ATP-Zugabe der Übergang zu einem konstanten Gebiet erfolgt. Der Meßwert ergibt sich als Schnittpunkt der linearen Extrapolation beider Gebiete· Zur Messung der АТР-азе-Aktivität wird eine Lösung, die 0,5 mM Glukose und 2mM ATP enthält in die Meßzelle eingefüllt. Nachdem der Strom einen konstanten Wert besitzt, wird die ATP-ase-Probe zugegeben. Durch die Enzymreaktion erfolgt ein Anstieg der Strom-Zeit-Kurve, da die ATP-Konzentration verkleinert wird. Aus der Eichkurve kann damit die ATP-ase-Aktivi· tat errechnet werden.After the background current has been _established} an amount of glucose is added so that the concentration is 0.5 mM in the test sample. ITach 2 minutes, the steady state current value is reached and it is 8 times the addition of 0.25 mM ATP (recording the calibration curve) · It occurs in each case a reduction of the glucose signal, wherein after the steep drop immediately after ATP addition of the transition to a constant area. The measurement results as the intersection of the linear extrapolation of both regions. To measure the ATR activity, a solution containing 0.5 mM glucose and 2 mM ATP is introduced into the measuring cell. After the current has a constant value, the ATP ase sample is added. The enzyme reaction increases the current-time curve by decreasing the ATP concentration. From the calibration curve, the ATPase activity can be calculated.

Der Zusatz von ATPase-Hemrnern, z.B. Ouabain, ruft eine Verkleinerung des Anstiegs hervor. Durch Variation der Inhibitor-The addition of ATPase inhibitors, e.g. Ouabain, calls for a reduction of the rise. By varying the inhibitor

konzentration wird die notwendige Konzentration zur 50%igen Hemmung der ATP-ase ermittelt. Diese Größe ist ein Maß der Herzwirksamkeit von Medikamentenconcentration, the necessary concentration for 50% inhibition of ATP is determined. This size is a measure of the cardiac efficacy of drugs

Eine photopolymerisierte Enzymschicht, die nur GOD enthält, wird wie in Beispiel 1 auf die Og-Elektrode aufgebracht, Anschliessend wird eine zweite Polyacrylamidschicht von 100/U Dicke, die 30 U HK und 20 U Glyzerokinase je cm enthält, über die GOD-Schicht gelegt und mit einem Dialyseschlauch auf der Stirnfläche des Elektrodenmantels fixiert. Diese Elektrode taucht in 5 ml temperierte Grundlösung, die 0,5 шМ Glukose, 1 mM ATP und 1 mM MgCl₂ in 0,1 M Phosphatpuffer pH 6 enthält. Nachdem sich der Strom stabilisiert hat werden 100/Ul der Glyzerol-haltigen Meßprobe zugegeben· In der Enzymreaktion wird ei.ne zur Ausgangskonzentration an Glyzerol proportionale ATP-Menge verbraucht, die aus der Änderung des Stromes über die Eichkurve bestimmt wird. Die Messung dauert 2 Minuten.A photopolymerized enzyme layer containing only GOD is applied to the OG electrode as in Example 1, then a second polyacrylamide layer of 100 / U thickness containing 30 U HK and 20 U glycerokinase per cm is placed over the GOD layer and fixed with a dialysis tube on the end face of the electrode sheath. This electrode is immersed in 5 ml tempered stock solution containing 0.5 μM glucose, 1 mM ATP and 1 mM MgCl ₂ in 0.1 M phosphate buffer pH 6. After the current has stabilized, 100 μl of the glycerol-containing test sample are added. The enzyme reaction consumes a quantity of ATP proportional to the starting concentration of glycerol, which is determined from the change in the current over the calibration curve. The measurement takes 2 minutes.

Über"den Elektrodenmantel wird ein Dialyseschlauch gespannt, auf dem eine Enzymschicht mit GOD und HK (wi« in Beispiel 1) mit einem zweiten Dialyseschlauch fixiert wird. Die Pt-Elektrode wird auf +-600 mV gegenüber der Bezugselektrode polarisiert, sodaß die HgOg-Oxidation erfaßt wird. Die Elektrode· ist an einen Analogdifferenzierer angeschlossen, der den maximalen Anstieg der Strom-Zeit-Kurve anzeigt« Der Grundstrom stellt sich in 2 ml einer Pufferlösung von pH mit 0,.5 mM Glukose, 1 mM MgGl₂ ein· Danach erfolgt die Zugabe von 50/Ul des Filtrates, der mit Trichloressigsäure behandelten Fermentationslösung. Die Geschwindigkeit des Stromabfalls ist der ATP-Konzentration proportional, sodaß die Keimzahl über die ermittelte ATP-Konzentration erhalten wird. Bei glukosehaltigen Meßproben wird vor der ATP-Messung mit einer nur GOD-enthaltenden Enzymelektrode.die Glukosekonzentration ermittelt und bei der Auswertung berücksichtigt·A dialysis tube is stretched over the electrode sheath, on which an enzyme layer with GOD and HK (as in Example 1) is fixed with a second dialysis tube, The Pt electrode is polarized to + -600 mV with respect to the reference electrode, so that the HgOg- The electrode is connected to an analogue differentiator which indicates the maximum increase in the current-time curve. The base current is established in 2 ml of a buffer solution of pH 0, 5 mM glucose, 1 mM MgGl ₂ . Thereafter, 50 / μl of the filtrate, the trichloroacetic acid-treated fermentation solution, is added The rate of fall in the current is proportional to the ATP concentration so that the bacterial count is maintained above the determined ATP concentration of a GOD-containing enzyme electrode only. The glucose concentration is determined and taken into account in the evaluation.

Claims

-S--S

invention claim

1. enzyme electrode for the determination of ATP in a measurement solution containing a defined amount of glucose by means of a О «- or ELOp-indicating electrode, characterized in that the electrode is provided with an enzyme layer, applied in the glucose oxidase and hexokinase homogeneously or in separate layers and by a dialysis tube are covered.

Enzyme electrode according to item 1, characterized in that the enzyme layer for glucose oxidase and hexokinase additionally contains glycerol or creatinine kinase.