CZ9099A3 - Způsob zvýšení obsahu sacharózy u rostlin - Google Patents
Způsob zvýšení obsahu sacharózy u rostlin Download PDFInfo
- Publication number
- CZ9099A3 CZ9099A3 CZ9990A CZ9099A CZ9099A3 CZ 9099 A3 CZ9099 A3 CZ 9099A3 CZ 9990 A CZ9990 A CZ 9990A CZ 9099 A CZ9099 A CZ 9099A CZ 9099 A3 CZ9099 A3 CZ 9099A3
- Authority
- CZ
- Czechia
- Prior art keywords
- pea
- seeds
- plant
- rug3
- pgm
- Prior art date
Links
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 title claims abstract description 59
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 title claims abstract description 59
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 47
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 title claims description 11
- 235000013681 dietary sucrose Nutrition 0.000 title 1
- 229960004793 sucrose Drugs 0.000 title 1
- 108091000115 phosphomannomutase Proteins 0.000 claims abstract description 103
- 102000009569 Phosphoglucomutase Human genes 0.000 claims abstract description 95
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 claims abstract description 93
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 claims abstract description 93
- 239000008107 starch Substances 0.000 claims abstract description 92
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 claims abstract description 87
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims abstract description 85
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 claims abstract description 58
- 241000219843 Pisum Species 0.000 claims abstract description 17
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 claims abstract description 5
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 claims abstract description 5
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 claims abstract description 5
- 238000003306 harvesting Methods 0.000 claims description 29
- 230000035772 mutation Effects 0.000 claims description 21
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 12
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 12
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 8
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 claims description 2
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 claims 1
- 240000004713 Pisum sativum Species 0.000 abstract description 114
- 235000010582 Pisum sativum Nutrition 0.000 abstract description 104
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 47
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 47
- 210000002706 plastid Anatomy 0.000 description 47
- 210000002257 embryonic structure Anatomy 0.000 description 41
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 33
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 29
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 28
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 26
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 24
- 241000282322 Panthera Species 0.000 description 23
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 23
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 21
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 20
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 18
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 18
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 16
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 16
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 16
- 108700023224 Glucose-1-phosphate adenylyltransferases Proteins 0.000 description 14
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 14
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 14
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 14
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 14
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 14
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 13
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 12
- 108010029485 Protein Isoforms Proteins 0.000 description 12
- 102000001708 Protein Isoforms Human genes 0.000 description 12
- 239000000287 crude extract Substances 0.000 description 12
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 12
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 12
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 11
- 239000000047 product Substances 0.000 description 11
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 10
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 10
- 238000011161 development Methods 0.000 description 10
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 10
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 9
- 241001162994 Rugosus Species 0.000 description 9
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N citric acid Chemical compound OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 9
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 9
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 9
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 9
- 101150049837 PGM gene Proteins 0.000 description 8
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 8
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 8
- 210000001161 mammalian embryo Anatomy 0.000 description 8
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 8
- 108700028369 Alleles Proteins 0.000 description 7
- XJLXINKUBYWONI-DQQFMEOOSA-N [[(2r,3r,4r,5r)-5-(6-aminopurin-9-yl)-3-hydroxy-4-phosphonooxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl] [(2s,3r,4s,5s)-5-(3-carbamoylpyridin-1-ium-1-yl)-3,4-dihydroxyoxolan-2-yl]methyl phosphate Chemical compound NC(=O)C1=CC=C[N+]([C@@H]2[C@H]([C@@H](O)[C@H](COP([O-])(=O)OP(O)(=O)OC[C@@H]3[C@H]([C@@H](OP(O)(O)=O)[C@@H](O3)N3C4=NC=NC(N)=C4N=C3)O)O2)O)=C1 XJLXINKUBYWONI-DQQFMEOOSA-N 0.000 description 7
- 230000034303 cell budding Effects 0.000 description 7
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 description 7
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 7
- 239000000463 material Substances 0.000 description 7
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 7
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 7
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 7
- 102100031126 6-phosphogluconolactonase Human genes 0.000 description 6
- 108010029731 6-phosphogluconolactonase Proteins 0.000 description 6
- 108010018962 Glucosephosphate Dehydrogenase Proteins 0.000 description 6
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 6
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 6
- HXXFSFRBOHSIMQ-UHFFFAOYSA-N [3,4,5-trihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-2-yl] dihydrogen phosphate Chemical compound OCC1OC(OP(O)(O)=O)C(O)C(O)C1O HXXFSFRBOHSIMQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 6
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 description 6
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 6
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 6
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 6
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 6
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 6
- 238000005204 segregation Methods 0.000 description 6
- 241000894007 species Species 0.000 description 6
- 108010021809 Alcohol dehydrogenase Proteins 0.000 description 5
- GXDLGHLJTHMDII-WISUUJSJSA-N Thr-Ser Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O GXDLGHLJTHMDII-WISUUJSJSA-N 0.000 description 5
- 230000009418 agronomic effect Effects 0.000 description 5
- 230000009194 climbing Effects 0.000 description 5
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 5
- 230000037039 plant physiology Effects 0.000 description 5
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 5
- 230000005070 ripening Effects 0.000 description 5
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 5
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 5
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 4
- WFPZSXYXPSUOPY-ROYWQJLOSA-N ADP alpha-D-glucoside Chemical compound C([C@H]1O[C@H]([C@@H]([C@@H]1O)O)N1C=2N=CN=C(C=2N=C1)N)OP(O)(=O)OP(O)(=O)O[C@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]1O WFPZSXYXPSUOPY-ROYWQJLOSA-N 0.000 description 4
- 229920000856 Amylose Polymers 0.000 description 4
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 4
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 description 4
- 108010044467 Isoenzymes Proteins 0.000 description 4
- 241000192130 Leuconostoc mesenteroides Species 0.000 description 4
- CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L Magnesium sulfate Chemical compound [Mg+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 4
- RZEQTVHJZCIUBT-WDSKDSINSA-N Ser-Arg Chemical compound OC[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCNC(N)=N RZEQTVHJZCIUBT-WDSKDSINSA-N 0.000 description 4
- UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M Sodium bicarbonate Chemical compound [Na+].OC([O-])=O UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- IOWJRKAVLALBQB-IWGUZYHVSA-N Thr-Asp Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC(O)=O IOWJRKAVLALBQB-IWGUZYHVSA-N 0.000 description 4
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 4
- 235000009508 confectionery Nutrition 0.000 description 4
- 239000013256 coordination polymer Substances 0.000 description 4
- 210000000172 cytosol Anatomy 0.000 description 4
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 4
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 4
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 4
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 4
- 238000013508 migration Methods 0.000 description 4
- 230000005012 migration Effects 0.000 description 4
- 229930027945 nicotinamide-adenine dinucleotide Natural products 0.000 description 4
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 4
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 4
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 4
- FQENQNTWSFEDLI-UHFFFAOYSA-J sodium diphosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O FQENQNTWSFEDLI-UHFFFAOYSA-J 0.000 description 4
- 229940048086 sodium pyrophosphate Drugs 0.000 description 4
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 4
- 235000019818 tetrasodium diphosphate Nutrition 0.000 description 4
- 239000001577 tetrasodium phosphonato phosphate Substances 0.000 description 4
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 4
- 230000017260 vegetative to reproductive phase transition of meristem Effects 0.000 description 4
- IYLGZMTXKJYONK-ACLXAEORSA-N (12s,15r)-15-hydroxy-11,16-dioxo-15,20-dihydrosenecionan-12-yl acetate Chemical compound O1C(=O)[C@](CC)(O)C[C@@H](C)[C@](C)(OC(C)=O)C(=O)OCC2=CCN3[C@H]2[C@H]1CC3 IYLGZMTXKJYONK-ACLXAEORSA-N 0.000 description 3
- 241000589158 Agrobacterium Species 0.000 description 3
- PSZNHSNIGMJYOZ-WDSKDSINSA-N Asp-Arg Chemical compound OC(=O)C[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCN=C(N)N PSZNHSNIGMJYOZ-WDSKDSINSA-N 0.000 description 3
- DWBZEJHQQIURML-IMJSIDKUSA-N Asp-Ser Chemical compound OC(=O)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O DWBZEJHQQIURML-IMJSIDKUSA-N 0.000 description 3
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 3
- WMFOQBRAJBCJND-UHFFFAOYSA-M Lithium hydroxide Chemical compound [Li+].[OH-] WMFOQBRAJBCJND-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- FSVCELGFZIQNCK-UHFFFAOYSA-N N,N-bis(2-hydroxyethyl)glycine Chemical compound OCCN(CCO)CC(O)=O FSVCELGFZIQNCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 3
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 3
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 3
- 102000048175 UTP-glucose-1-phosphate uridylyltransferases Human genes 0.000 description 3
- 239000007998 bicine buffer Substances 0.000 description 3
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 3
- 239000007979 citrate buffer Substances 0.000 description 3
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 3
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 3
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 3
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 3
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 3
- 230000009027 insemination Effects 0.000 description 3
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 3
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 3
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 3
- 238000003976 plant breeding Methods 0.000 description 3
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 3
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 3
- 238000011160 research Methods 0.000 description 3
- IYLGZMTXKJYONK-UHFFFAOYSA-N ruwenine Natural products O1C(=O)C(CC)(O)CC(C)C(C)(OC(C)=O)C(=O)OCC2=CCN3C2C1CC3 IYLGZMTXKJYONK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 3
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 3
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 3
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- OSJPPGNTCRNQQC-UWTATZPHSA-N 3-phospho-D-glyceric acid Chemical compound OC(=O)[C@H](O)COP(O)(O)=O OSJPPGNTCRNQQC-UWTATZPHSA-N 0.000 description 2
- OSJPPGNTCRNQQC-UHFFFAOYSA-N 3-phosphoglyceric acid Chemical compound OC(=O)C(O)COP(O)(O)=O OSJPPGNTCRNQQC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 2
- ZCYVEMRRCGMTRW-UHFFFAOYSA-N 7553-56-2 Chemical compound [I] ZCYVEMRRCGMTRW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000589155 Agrobacterium tumefaciens Species 0.000 description 2
- 102000007698 Alcohol dehydrogenase Human genes 0.000 description 2
- 229920000945 Amylopectin Polymers 0.000 description 2
- JQHASVQBAKRJKD-GUBZILKMSA-N Arg-Ser-Met Chemical compound CSCC[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)N JQHASVQBAKRJKD-GUBZILKMSA-N 0.000 description 2
- NTQDELBZOMWXRS-IWGUZYHVSA-N Asp-Thr Chemical compound C[C@@H](O)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O NTQDELBZOMWXRS-IWGUZYHVSA-N 0.000 description 2
- 240000002791 Brassica napus Species 0.000 description 2
- 235000004977 Brassica sinapistrum Nutrition 0.000 description 2
- 241000272470 Circus Species 0.000 description 2
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 2
- 241001573881 Corolla Species 0.000 description 2
- NBSCHQHZLSJFNQ-GASJEMHNSA-N D-Glucose 6-phosphate Chemical compound OC1O[C@H](COP(O)(O)=O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]1O NBSCHQHZLSJFNQ-GASJEMHNSA-N 0.000 description 2
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- PLUBXMRUUVWRLT-UHFFFAOYSA-N Ethyl methanesulfonate Chemical compound CCOS(C)(=O)=O PLUBXMRUUVWRLT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N Ethylene glycol Chemical compound OCCO LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- VFRROHXSMXFLSN-UHFFFAOYSA-N Glc6P Natural products OP(=O)(O)OCC(O)C(O)C(O)C(O)C=O VFRROHXSMXFLSN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102100031181 Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Human genes 0.000 description 2
- KRBMQYPTDYSENE-BQBZGAKWSA-N His-Ser Chemical compound OC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CNC=N1 KRBMQYPTDYSENE-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 2
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 2
- 206010021033 Hypomenorrhoea Diseases 0.000 description 2
- DRCKHKZYDLJYFQ-YWIQKCBGSA-N Ile-Thr Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O DRCKHKZYDLJYFQ-YWIQKCBGSA-N 0.000 description 2
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 2
- ZRKWMRDKSOPRRS-UHFFFAOYSA-N N-Methyl-N-nitrosourea Chemical compound O=NN(C)C(N)=O ZRKWMRDKSOPRRS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 2
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 2
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000004698 Polyethylene Substances 0.000 description 2
- 101710167959 Putative UTP-glucose-1-phosphate uridylyltransferase Proteins 0.000 description 2
- VBKBDLMWICBSCY-IMJSIDKUSA-N Ser-Asp Chemical compound OC[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC(O)=O VBKBDLMWICBSCY-IMJSIDKUSA-N 0.000 description 2
- YZMPDHTZJJCGEI-BQBZGAKWSA-N Ser-His Chemical compound OC[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CNC=N1 YZMPDHTZJJCGEI-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 2
- XZKQVQKUZMAADP-IMJSIDKUSA-N Ser-Ser Chemical compound OC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O XZKQVQKUZMAADP-IMJSIDKUSA-N 0.000 description 2
- LDEBVRIURYMKQS-WISUUJSJSA-N Ser-Thr Chemical compound C[C@@H](O)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CO LDEBVRIURYMKQS-WISUUJSJSA-N 0.000 description 2
- 235000009337 Spinacia oleracea Nutrition 0.000 description 2
- 244000300264 Spinacia oleracea Species 0.000 description 2
- HSCJRCZFDFQWRP-JZMIEXBBSA-N UDP-alpha-D-glucose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1OP(O)(=O)OP(O)(=O)OC[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](N2C(NC(=O)C=C2)=O)O1 HSCJRCZFDFQWRP-JZMIEXBBSA-N 0.000 description 2
- LTTQCQRTSHJPPL-ZKWXMUAHSA-N Val-Ser-Asp Chemical compound CC(C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(=O)O)C(=O)O)N LTTQCQRTSHJPPL-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 2
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 2
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 2
- HXXFSFRBOHSIMQ-VFUOTHLCSA-N alpha-D-glucose 1-phosphate Chemical compound OC[C@H]1O[C@H](OP(O)(O)=O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O HXXFSFRBOHSIMQ-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 2
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 2
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 2
- BZAQMGZYZWMMRU-UHFFFAOYSA-N benzo[a]phenoxazin-9-ylidene(dimethyl)azanium Chemical compound C1=CC=C2C(N=C3C=CC(C=C3O3)=[N+](C)C)=C3C=CC2=C1 BZAQMGZYZWMMRU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 2
- 238000009835 boiling Methods 0.000 description 2
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 2
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 210000003763 chloroplast Anatomy 0.000 description 2
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 2
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 2
- XPPKVPWEQAFLFU-UHFFFAOYSA-J diphosphate(4-) Chemical group [O-]P([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O XPPKVPWEQAFLFU-UHFFFAOYSA-J 0.000 description 2
- 235000011180 diphosphates Nutrition 0.000 description 2
- 239000011536 extraction buffer Substances 0.000 description 2
- 230000035784 germination Effects 0.000 description 2
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 2
- 229950010772 glucose-1-phosphate Drugs 0.000 description 2
- 102000010705 glucose-6-phosphate dehydrogenase activity proteins Human genes 0.000 description 2
- 108040005050 glucose-6-phosphate dehydrogenase activity proteins Proteins 0.000 description 2
- 108020004445 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Proteins 0.000 description 2
- YMAWOPBAYDPSLA-UHFFFAOYSA-N glycylglycine Chemical compound [NH3+]CC(=O)NCC([O-])=O YMAWOPBAYDPSLA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000000227 grinding Methods 0.000 description 2
- 108010018006 histidylserine Proteins 0.000 description 2
- 229910052740 iodine Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000011630 iodine Substances 0.000 description 2
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 229910052943 magnesium sulfate Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000019341 magnesium sulphate Nutrition 0.000 description 2
- 238000013507 mapping Methods 0.000 description 2
- 241001515942 marmosets Species 0.000 description 2
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 2
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 2
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 2
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 2
- -1 polyethylene Polymers 0.000 description 2
- 229920000573 polyethylene Polymers 0.000 description 2
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 2
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 2
- SCVFZCLFOSHCOH-UHFFFAOYSA-M potassium acetate Chemical compound [K+].CC([O-])=O SCVFZCLFOSHCOH-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 2
- 229940048084 pyrophosphate Drugs 0.000 description 2
- 238000007894 restriction fragment length polymorphism technique Methods 0.000 description 2
- 230000008117 seed development Effects 0.000 description 2
- 108010048818 seryl-histidine Proteins 0.000 description 2
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 2
- 235000017557 sodium bicarbonate Nutrition 0.000 description 2
- 229910000030 sodium bicarbonate Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 description 2
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000009331 sowing Methods 0.000 description 2
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 2
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 2
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 2
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 2
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 2
- 238000011426 transformation method Methods 0.000 description 2
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 2
- RIUWBIIVUYSTCN-UHFFFAOYSA-N trilithium borate Chemical compound [Li+].[Li+].[Li+].[O-]B([O-])[O-] RIUWBIIVUYSTCN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 2
- QZNNVYOVQUKYSC-JEDNCBNOSA-N (2s)-2-amino-3-(1h-imidazol-5-yl)propanoic acid;hydron;chloride Chemical compound Cl.OC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 QZNNVYOVQUKYSC-JEDNCBNOSA-N 0.000 description 1
- RVLOMLVNNBWRSR-KNIFDHDWSA-N (2s)-2-aminopropanoic acid;(2s)-2,6-diaminohexanoic acid Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O.NCCCC[C@H](N)C(O)=O RVLOMLVNNBWRSR-KNIFDHDWSA-N 0.000 description 1
- HNSDLXPSAYFUHK-UHFFFAOYSA-N 1,4-bis(2-ethylhexyl) sulfosuccinate Chemical compound CCCCC(CC)COC(=O)CC(S(O)(=O)=O)C(=O)OCC(CC)CCCC HNSDLXPSAYFUHK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZCWPHDXKEDBCER-UHFFFAOYSA-N 2,5-diphenyl-2h-tetrazol-2-ium;bromide Chemical group [Br-].C1=CC=CC=C1C1=[NH+]N(C=2C=CC=CC=2)N=N1 ZCWPHDXKEDBCER-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- AZKSAVLVSZKNRD-UHFFFAOYSA-M 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide Chemical compound [Br-].S1C(C)=C(C)N=C1[N+]1=NC(C=2C=CC=CC=2)=NN1C1=CC=CC=C1 AZKSAVLVSZKNRD-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- GJMPSRSMBJLKKB-UHFFFAOYSA-N 3-methylphenylacetic acid Chemical compound CC1=CC=CC(CC(O)=O)=C1 GJMPSRSMBJLKKB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101710166809 ADP-glucose phosphorylase Proteins 0.000 description 1
- HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N Acrylamide Chemical compound NC(=O)C=C HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WXERCAHAIKMTKX-ZLUOBGJFSA-N Ala-Asp-Asp Chemical compound [H]N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O WXERCAHAIKMTKX-ZLUOBGJFSA-N 0.000 description 1
- CXISPYVYMQWFLE-VKHMYHEASA-N Ala-Gly Chemical compound C[C@H]([NH3+])C(=O)NCC([O-])=O CXISPYVYMQWFLE-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- OKIKVSXTXVVFDV-MMWGEVLESA-N Ala-Ile-Pro Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N1CCC[C@@H]1C(=O)O)NC(=O)[C@H](C)N OKIKVSXTXVVFDV-MMWGEVLESA-N 0.000 description 1
- SDZRIBWEVVRDQI-CIUDSAMLSA-N Ala-Lys-Asp Chemical compound [H]N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O SDZRIBWEVVRDQI-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- MAEQBGQTDWDSJQ-LSJOCFKGSA-N Ala-Met-His Chemical compound C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CC1=CN=CN1)C(=O)O)N MAEQBGQTDWDSJQ-LSJOCFKGSA-N 0.000 description 1
- BUQICHWNXBIBOG-LMVFSUKVSA-N Ala-Thr Chemical compound C[C@@H](O)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](C)N BUQICHWNXBIBOG-LMVFSUKVSA-N 0.000 description 1
- 239000004382 Amylase Substances 0.000 description 1
- 102000013142 Amylases Human genes 0.000 description 1
- 108010065511 Amylases Proteins 0.000 description 1
- 108020005544 Antisense RNA Proteins 0.000 description 1
- 101150022237 Appl gene Proteins 0.000 description 1
- JSLGXODUIAFWCF-WDSKDSINSA-N Arg-Asn Chemical compound NC(N)=NCCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O JSLGXODUIAFWCF-WDSKDSINSA-N 0.000 description 1
- COXMUHNBYCVVRG-DCAQKATOSA-N Arg-Leu-Ser Chemical compound [H]N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O COXMUHNBYCVVRG-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- ISVACHFCVRKIDG-SRVKXCTJSA-N Arg-Val-Arg Chemical compound NC(N)=NCCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(O)=O ISVACHFCVRKIDG-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- KLKHFFMNGWULBN-VKHMYHEASA-N Asn-Gly Chemical compound NC(=O)C[C@H](N)C(=O)NCC(O)=O KLKHFFMNGWULBN-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- QJMCHPGWFZZRID-BQBZGAKWSA-N Asn-Lys Chemical compound NCCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O QJMCHPGWFZZRID-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 1
- OMSMPWHEGLNQOD-UWVGGRQHSA-N Asn-Phe Chemical compound NC(=O)C[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 OMSMPWHEGLNQOD-UWVGGRQHSA-N 0.000 description 1
- VBKIFHUVGLOJKT-FKZODXBYSA-N Asn-Thr Chemical compound C[C@@H]([C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)N)N)O VBKIFHUVGLOJKT-FKZODXBYSA-N 0.000 description 1
- KWBQPGIYEZKDEG-FSPLSTOPSA-N Asn-Val Chemical compound CC(C)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O KWBQPGIYEZKDEG-FSPLSTOPSA-N 0.000 description 1
- ZAESWDKAMDVHLL-RCOVLWMOSA-N Asn-Val-Gly Chemical compound [H]N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)NCC(O)=O ZAESWDKAMDVHLL-RCOVLWMOSA-N 0.000 description 1
- FRYULLIZUDQONW-IMJSIDKUSA-N Asp-Asp Chemical compound OC(=O)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O FRYULLIZUDQONW-IMJSIDKUSA-N 0.000 description 1
- SNDBKTFJWVEVPO-WHFBIAKZSA-N Asp-Gly-Ser Chemical compound [H]N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O SNDBKTFJWVEVPO-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- HSPSXROIMXIJQW-BQBZGAKWSA-N Asp-His Chemical compound OC(=O)C[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CNC=N1 HSPSXROIMXIJQW-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 1
- UMHUHHJMEXNSIV-CIUDSAMLSA-N Asp-Leu-Ser Chemical compound OC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O UMHUHHJMEXNSIV-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- QJHOOKBAHRJPPX-QWRGUYRKSA-N Asp-Phe-Gly Chemical compound OC(=O)C[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(=O)NCC(O)=O)CC1=CC=CC=C1 QJHOOKBAHRJPPX-QWRGUYRKSA-N 0.000 description 1
- USNJAPJZSGTTPX-XVSYOHENSA-N Asp-Phe-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O USNJAPJZSGTTPX-XVSYOHENSA-N 0.000 description 1
- QOJJMJKTMKNFEF-ZKWXMUAHSA-N Asp-Val-Ser Chemical compound OC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O QOJJMJKTMKNFEF-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 1
- 101100205030 Caenorhabditis elegans hars-1 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100398835 Caenorhabditis elegans leo-1 gene Proteins 0.000 description 1
- GSXOAOHZAIYLCY-UHFFFAOYSA-N D-F6P Natural products OCC(=O)C(O)C(O)C(O)COP(O)(O)=O GSXOAOHZAIYLCY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N D-Glucitol Natural products OC[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N 0.000 description 1
- 108010090461 DFG peptide Proteins 0.000 description 1
- 238000012270 DNA recombination Methods 0.000 description 1
- 101710096830 DNA-3-methyladenine glycosylase Proteins 0.000 description 1
- 102100039128 DNA-3-methyladenine glycosylase Human genes 0.000 description 1
- 244000000626 Daucus carota Species 0.000 description 1
- 235000002767 Daucus carota Nutrition 0.000 description 1
- 101710088194 Dehydrogenase Proteins 0.000 description 1
- YZCKVEUIGOORGS-OUBTZVSYSA-N Deuterium Chemical compound [2H] YZCKVEUIGOORGS-OUBTZVSYSA-N 0.000 description 1
- 208000035240 Disease Resistance Diseases 0.000 description 1
- YXWOAJXNVLXPMU-ZXXMMSQZSA-N Fructose 2,6-diphosphate Chemical compound OP(=O)(O)O[C@]1(CO)O[C@H](COP(O)(O)=O)[C@@H](O)[C@@H]1O YXWOAJXNVLXPMU-ZXXMMSQZSA-N 0.000 description 1
- 102000001390 Fructose-Bisphosphate Aldolase Human genes 0.000 description 1
- 108010068561 Fructose-Bisphosphate Aldolase Proteins 0.000 description 1
- 241001200922 Gagata Species 0.000 description 1
- NUSWUSKZRCGFEX-FXQIFTODSA-N Glu-Glu-Cys Chemical compound OC(=O)CC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CS)C(O)=O NUSWUSKZRCGFEX-FXQIFTODSA-N 0.000 description 1
- HKTRDWYCAUTRRL-YUMQZZPRSA-N Glu-His Chemical compound OC(=O)CC[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CN=CN1 HKTRDWYCAUTRRL-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 1
- BBBXWRGITSUJPB-YUMQZZPRSA-N Glu-Lys Chemical compound NCCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O BBBXWRGITSUJPB-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 1
- BUEFQXUHTUZXHR-LURJTMIESA-N Gly-Gly-Pro zwitterion Chemical compound NCC(=O)NCC(=O)N1CCC[C@H]1C(O)=O BUEFQXUHTUZXHR-LURJTMIESA-N 0.000 description 1
- IKAIKUBBJHFNBZ-LURJTMIESA-N Gly-Lys Chemical compound NCCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)CN IKAIKUBBJHFNBZ-LURJTMIESA-N 0.000 description 1
- GMTXWRIDLGTVFC-IUCAKERBSA-N Gly-Lys-Glu Chemical compound [H]NCC(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O GMTXWRIDLGTVFC-IUCAKERBSA-N 0.000 description 1
- BCCRXDTUTZHDEU-VKHMYHEASA-N Gly-Ser Chemical compound NCC(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O BCCRXDTUTZHDEU-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- YOBGUCWZPXJHTN-BQBZGAKWSA-N Gly-Ser-Arg Chemical compound NCC(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCN=C(N)N YOBGUCWZPXJHTN-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 1
- 102000000587 Glycerolphosphate Dehydrogenase Human genes 0.000 description 1
- 108010041921 Glycerolphosphate Dehydrogenase Proteins 0.000 description 1
- VPZXBVLAVMBEQI-VKHMYHEASA-N Glycyl-alanine Chemical compound OC(=O)[C@H](C)NC(=O)CN VPZXBVLAVMBEQI-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- 108010008488 Glycylglycine Proteins 0.000 description 1
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 1
- 102000005548 Hexokinase Human genes 0.000 description 1
- 108700040460 Hexokinases Proteins 0.000 description 1
- JFFAPRNXXLRINI-NHCYSSNCSA-N His-Asp-Val Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CNC=N1)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O JFFAPRNXXLRINI-NHCYSSNCSA-N 0.000 description 1
- BZKDJRSZWLPJNI-SRVKXCTJSA-N His-His-Ser Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CNC=N1)C(=O)N[C@@H](CC1=CNC=N1)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O BZKDJRSZWLPJNI-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- VIJMRAIWYWRXSR-CIUDSAMLSA-N His-Ser-Ser Chemical compound OC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 VIJMRAIWYWRXSR-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- BCVIOZZGJNOEQS-XKNYDFJKSA-N Ile-Ile Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)[C@@H](C)CC BCVIOZZGJNOEQS-XKNYDFJKSA-N 0.000 description 1
- BBQABUDWDUKJMB-LZXPERKUSA-N Ile-Ile-Ile Chemical compound CC[C@H](C)[C@H]([NH3+])C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C([O-])=O BBQABUDWDUKJMB-LZXPERKUSA-N 0.000 description 1
- YKZAMJXNJUWFIK-JBDRJPRFSA-N Ile-Ser-Ala Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)O)N YKZAMJXNJUWFIK-JBDRJPRFSA-N 0.000 description 1
- 108010009595 Inorganic Pyrophosphatase Proteins 0.000 description 1
- 102100027050 Inorganic pyrophosphatase Human genes 0.000 description 1
- FADYJNXDPBKVCA-UHFFFAOYSA-N L-Phenylalanyl-L-lysin Natural products NCCCCC(C(O)=O)NC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 FADYJNXDPBKVCA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000880493 Leptailurus serval Species 0.000 description 1
- AZLASBBHHSLQDB-GUBZILKMSA-N Leu-Ile Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC(C)C AZLASBBHHSLQDB-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- HNDWYLYAYNBWMP-AJNGGQMLSA-N Leu-Ile-Lys Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)N HNDWYLYAYNBWMP-AJNGGQMLSA-N 0.000 description 1
- XZNJZXJZBMBGGS-NHCYSSNCSA-N Leu-Val-Asn Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O XZNJZXJZBMBGGS-NHCYSSNCSA-N 0.000 description 1
- 235000007688 Lycopersicon esculentum Nutrition 0.000 description 1
- 241000721701 Lynx Species 0.000 description 1
- NPBGTPKLVJEOBE-IUCAKERBSA-N Lys-Arg Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCNC(N)=N NPBGTPKLVJEOBE-IUCAKERBSA-N 0.000 description 1
- JGAMUXDWYSXYLM-SRVKXCTJSA-N Lys-Arg-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O JGAMUXDWYSXYLM-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- VMTYLUGCXIEDMV-QWRGUYRKSA-N Lys-Leu-Gly Chemical compound OC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H](N)CCCCN VMTYLUGCXIEDMV-QWRGUYRKSA-N 0.000 description 1
- QQPSCXKFDSORFT-IHRRRGAJSA-N Lys-Lys-Val Chemical compound CC(C)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@@H](N)CCCCN QQPSCXKFDSORFT-IHRRRGAJSA-N 0.000 description 1
- QTZXSYBVOSXBEJ-WDSKDSINSA-N Met-Asp Chemical compound CSCC[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC(O)=O QTZXSYBVOSXBEJ-WDSKDSINSA-N 0.000 description 1
- UZVWDRPUTHXQAM-FXQIFTODSA-N Met-Asp-Ala Chemical compound CSCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O UZVWDRPUTHXQAM-FXQIFTODSA-N 0.000 description 1
- WEDDFMCSUNNZJR-WDSKDSINSA-N Met-Ser Chemical compound CSCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O WEDDFMCSUNNZJR-WDSKDSINSA-N 0.000 description 1
- NSTPXGARCQOSAU-VIFPVBQESA-N N-formyl-L-phenylalanine Chemical compound O=CN[C@H](C(=O)O)CC1=CC=CC=C1 NSTPXGARCQOSAU-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- 108010079364 N-glycylalanine Proteins 0.000 description 1
- 101100109406 Neurospora crassa (strain ATCC 24698 / 74-OR23-1A / CBS 708.71 / DSM 1257 / FGSC 987) aga-1 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100281518 Neurospora crassa (strain ATCC 24698 / 74-OR23-1A / CBS 708.71 / DSM 1257 / FGSC 987) fox-2 gene Proteins 0.000 description 1
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 1
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 1
- 241000699693 Peromyscus Species 0.000 description 1
- 241000144285 Peromyscus polionotus Species 0.000 description 1
- 101710163504 Phaseolin Proteins 0.000 description 1
- JSGWNFKWZNPDAV-YDHLFZDLSA-N Phe-Val-Asp Chemical compound OC(=O)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 JSGWNFKWZNPDAV-YDHLFZDLSA-N 0.000 description 1
- 108010074307 Phosphoacetylglucosamine mutase Proteins 0.000 description 1
- 102100024440 Phosphoacetylglucosamine mutase Human genes 0.000 description 1
- 102000012435 Phosphofructokinase-1 Human genes 0.000 description 1
- 108010022684 Phosphofructokinase-1 Proteins 0.000 description 1
- 108091000080 Phosphotransferase Proteins 0.000 description 1
- FELJDCNGZFDUNR-WDSKDSINSA-N Pro-Ala Chemical compound OC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H]1CCCN1 FELJDCNGZFDUNR-WDSKDSINSA-N 0.000 description 1
- 102000001253 Protein Kinase Human genes 0.000 description 1
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 1
- 108700005079 Recessive Genes Proteins 0.000 description 1
- 102000052708 Recessive Genes Human genes 0.000 description 1
- 101150080176 SBE1 gene Proteins 0.000 description 1
- 108091081021 Sense strand Proteins 0.000 description 1
- WXUBSIDKNMFAGS-IHRRRGAJSA-N Ser-Arg-Tyr Chemical compound NC(N)=NCCC[C@H](NC(=O)[C@H](CO)N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 WXUBSIDKNMFAGS-IHRRRGAJSA-N 0.000 description 1
- BNFVPSRLHHPQKS-WHFBIAKZSA-N Ser-Asp-Gly Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)NCC(O)=O BNFVPSRLHHPQKS-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- SFZKGGOGCNQPJY-CIUDSAMLSA-N Ser-Asp-His Chemical compound C1=C(NC=N1)C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)O)NC(=O)[C@H](CO)N SFZKGGOGCNQPJY-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- MMAPOBOTRUVNKJ-ZLUOBGJFSA-N Ser-Asp-Ser Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CO)N)C(=O)O MMAPOBOTRUVNKJ-ZLUOBGJFSA-N 0.000 description 1
- SWSRFJZZMNLMLY-ZKWXMUAHSA-N Ser-Asp-Val Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O SWSRFJZZMNLMLY-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 1
- BXLYSRPHVMCOPS-ACZMJKKPSA-N Ser-Ile Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CO BXLYSRPHVMCOPS-ACZMJKKPSA-N 0.000 description 1
- FPCGZYMRFFIYIH-CIUDSAMLSA-N Ser-Lys-Ser Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O FPCGZYMRFFIYIH-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- JURQXQBJKUHGJS-UHFFFAOYSA-N Ser-Ser-Ser-Ser Chemical compound OCC(N)C(=O)NC(CO)C(=O)NC(CO)C(=O)NC(CO)C(O)=O JURQXQBJKUHGJS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- JGUWRQWULDWNCM-FXQIFTODSA-N Ser-Val-Ser Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O JGUWRQWULDWNCM-FXQIFTODSA-N 0.000 description 1
- 240000003768 Solanum lycopersicum Species 0.000 description 1
- NHUHCSRWZMLRLA-UHFFFAOYSA-N Sulfisoxazole Chemical compound CC1=NOC(NS(=O)(=O)C=2C=CC(N)=CC=2)=C1C NHUHCSRWZMLRLA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010006785 Taq Polymerase Proteins 0.000 description 1
- YKRQRPFODDJQTC-CSMHCCOUSA-N Thr-Lys Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCCN YKRQRPFODDJQTC-CSMHCCOUSA-N 0.000 description 1
- WYLAVUAWOUVUCA-XVSYOHENSA-N Thr-Phe-Asp Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O WYLAVUAWOUVUCA-XVSYOHENSA-N 0.000 description 1
- GVMXJJAJLIEASL-ZJDVBMNYSA-N Thr-Pro-Thr Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O GVMXJJAJLIEASL-ZJDVBMNYSA-N 0.000 description 1
- WPSKTVVMQCXPRO-BWBBJGPYSA-N Thr-Ser-Ser Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O WPSKTVVMQCXPRO-BWBBJGPYSA-N 0.000 description 1
- DSGIVWSDDRDJIO-ZXXMMSQZSA-N Thr-Thr Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O DSGIVWSDDRDJIO-ZXXMMSQZSA-N 0.000 description 1
- XGFYGMKZKFRGAI-RCWTZXSCSA-N Thr-Val-Arg Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCN=C(N)N XGFYGMKZKFRGAI-RCWTZXSCSA-N 0.000 description 1
- 108700019146 Transgenes Proteins 0.000 description 1
- GSEJCLTVZPLZKY-UHFFFAOYSA-N Triethanolamine Chemical compound OCCN(CCO)CCO GSEJCLTVZPLZKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000005924 Triose-Phosphate Isomerase Human genes 0.000 description 1
- 108700015934 Triose-phosphate isomerases Proteins 0.000 description 1
- SCCKSNREWHMKOJ-SRVKXCTJSA-N Tyr-Asn-Ser Chemical compound N[C@@H](Cc1ccc(O)cc1)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O SCCKSNREWHMKOJ-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- UUBKSZNKJUJQEJ-JRQIVUDYSA-N Tyr-Thr-Asp Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(=O)O)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC1=CC=C(C=C1)O)N)O UUBKSZNKJUJQEJ-JRQIVUDYSA-N 0.000 description 1
- KDKLLPMFFGYQJD-CYDGBPFRSA-N Val-Ile-Arg Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(=O)O)NC(=O)[C@H](C(C)C)N KDKLLPMFFGYQJD-CYDGBPFRSA-N 0.000 description 1
- LKUDRJSNRWVGMS-QSFUFRPTSA-N Val-Ile-Asp Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(=O)O)C(=O)O)NC(=O)[C@H](C(C)C)N LKUDRJSNRWVGMS-QSFUFRPTSA-N 0.000 description 1
- GVRKWABULJAONN-VQVTYTSYSA-N Val-Thr Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O GVRKWABULJAONN-VQVTYTSYSA-N 0.000 description 1
- DVLWZWNAQUBZBC-ZNSHCXBVSA-N Val-Thr-Pro Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)N1CCC[C@@H]1C(=O)O)NC(=O)[C@H](C(C)C)N)O DVLWZWNAQUBZBC-ZNSHCXBVSA-N 0.000 description 1
- GTACFKZDQFTVAI-STECZYCISA-N Val-Tyr-Ile Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)C(C)C)CC1=CC=C(O)C=C1 GTACFKZDQFTVAI-STECZYCISA-N 0.000 description 1
- LLJLBRRXKZTTRD-GUBZILKMSA-N Val-Val-Ser Chemical compound CC(C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)O)N LLJLBRRXKZTTRD-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- STTYIMSDIYISRG-UHFFFAOYSA-N Valyl-Serine Chemical compound CC(C)C(N)C(=O)NC(CO)C(O)=O STTYIMSDIYISRG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000589634 Xanthomonas Species 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 108010047495 alanylglycine Proteins 0.000 description 1
- GZCGUPFRVQAUEE-SLPGGIOYSA-N aldehydo-D-glucose Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)C=O GZCGUPFRVQAUEE-SLPGGIOYSA-N 0.000 description 1
- 230000029936 alkylation Effects 0.000 description 1
- 238000005804 alkylation reaction Methods 0.000 description 1
- 235000019418 amylase Nutrition 0.000 description 1
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 1
- 108010084758 arginyl-tyrosyl-aspartic acid Proteins 0.000 description 1
- 108010062796 arginyllysine Proteins 0.000 description 1
- 108010040443 aspartyl-aspartic acid Proteins 0.000 description 1
- 108010092854 aspartyllysine Proteins 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- BGWGXPAPYGQALX-ARQDHWQXSA-N beta-D-fructofuranose 6-phosphate Chemical compound OC[C@@]1(O)O[C@H](COP(O)(O)=O)[C@@H](O)[C@@H]1O BGWGXPAPYGQALX-ARQDHWQXSA-N 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 239000012490 blank solution Substances 0.000 description 1
- 235000010338 boric acid Nutrition 0.000 description 1
- KGBXLFKZBHKPEV-UHFFFAOYSA-N boric acid Chemical compound OB(O)O KGBXLFKZBHKPEV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960002645 boric acid Drugs 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 238000009924 canning Methods 0.000 description 1
- 238000006555 catalytic reaction Methods 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 239000013043 chemical agent Substances 0.000 description 1
- 239000002361 compost Substances 0.000 description 1
- 238000004590 computer program Methods 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 1
- 238000009402 cross-breeding Methods 0.000 description 1
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 1
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 230000006866 deterioration Effects 0.000 description 1
- 229910052805 deuterium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010432 diamond Substances 0.000 description 1
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 1
- 244000013123 dwarf bean Species 0.000 description 1
- 235000013399 edible fruits Nutrition 0.000 description 1
- 239000007772 electrode material Substances 0.000 description 1
- 230000002357 endometrial effect Effects 0.000 description 1
- 238000001952 enzyme assay Methods 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 description 1
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 1
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 1
- 239000000796 flavoring agent Substances 0.000 description 1
- 235000019634 flavors Nutrition 0.000 description 1
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 1
- 239000012737 fresh medium Substances 0.000 description 1
- 230000006870 function Effects 0.000 description 1
- 230000030279 gene silencing Effects 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- VPZXBVLAVMBEQI-UHFFFAOYSA-N glycyl-DL-alpha-alanine Natural products OC(=O)C(C)NC(=O)CN VPZXBVLAVMBEQI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010051307 glycyl-glycyl-proline Proteins 0.000 description 1
- 229940043257 glycylglycine Drugs 0.000 description 1
- 108010015792 glycyllysine Proteins 0.000 description 1
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010931 gold Substances 0.000 description 1
- 235000021331 green beans Nutrition 0.000 description 1
- 150000002402 hexoses Chemical class 0.000 description 1
- 230000008676 import Effects 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 1
- 230000002452 interceptive effect Effects 0.000 description 1
- 238000001155 isoelectric focusing Methods 0.000 description 1
- 235000021374 legumes Nutrition 0.000 description 1
- 230000035800 maturation Effects 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 1
- 238000000520 microinjection Methods 0.000 description 1
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 239000003471 mutagenic agent Substances 0.000 description 1
- 231100000707 mutagenic chemical Toxicity 0.000 description 1
- BOPGDPNILDQYTO-NNYOXOHSSA-N nicotinamide-adenine dinucleotide Chemical compound C1=CCC(C(=O)N)=CN1[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OC[C@@H]2[C@H]([C@@H](O)[C@@H](O2)N2C3=NC=NC(N)=C3N=C2)O)O1 BOPGDPNILDQYTO-NNYOXOHSSA-N 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 238000004806 packaging method and process Methods 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 1
- 230000035515 penetration Effects 0.000 description 1
- 108010073025 phenylalanylphenylalanine Proteins 0.000 description 1
- 102000020233 phosphotransferase Human genes 0.000 description 1
- 230000035479 physiological effects, processes and functions Effects 0.000 description 1
- 230000008121 plant development Effects 0.000 description 1
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 1
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 1
- 235000011056 potassium acetate Nutrition 0.000 description 1
- 229920001592 potato starch Polymers 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 230000003405 preventing effect Effects 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 108010031719 prolyl-serine Proteins 0.000 description 1
- 230000000644 propagated effect Effects 0.000 description 1
- 230000004952 protein activity Effects 0.000 description 1
- 108060006633 protein kinase Proteins 0.000 description 1
- 235000021251 pulses Nutrition 0.000 description 1
- 230000005855 radiation Effects 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000008844 regulatory mechanism Effects 0.000 description 1
- 239000012723 sample buffer Substances 0.000 description 1
- 239000012488 sample solution Substances 0.000 description 1
- 239000004576 sand Substances 0.000 description 1
- 239000013049 sediment Substances 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 125000003607 serino group Chemical group [H]N([H])[C@]([H])(C(=O)[*])C(O[H])([H])[H] 0.000 description 1
- 229910052709 silver Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000004332 silver Substances 0.000 description 1
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 1
- RMJPDRUNCDRUQC-MCDZGGTQSA-M sodium;[[[(2r,3s,4r,5r)-5-(6-aminopurin-9-yl)-3,4-dihydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-hydroxyphosphoryl] hydrogen phosphate Chemical compound [Na+].C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)([O-])=O)[C@@H](O)[C@H]1O RMJPDRUNCDRUQC-MCDZGGTQSA-M 0.000 description 1
- 238000007711 solidification Methods 0.000 description 1
- 230000008023 solidification Effects 0.000 description 1
- 239000000600 sorbitol Substances 0.000 description 1
- 238000002798 spectrophotometry method Methods 0.000 description 1
- 238000004611 spectroscopical analysis Methods 0.000 description 1
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 1
- 239000012192 staining solution Substances 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 230000001502 supplementing effect Effects 0.000 description 1
- 230000009897 systematic effect Effects 0.000 description 1
- 230000002123 temporal effect Effects 0.000 description 1
- 235000019587 texture Nutrition 0.000 description 1
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- HHLJUSLZGFYWKW-UHFFFAOYSA-N triethanolamine hydrochloride Chemical compound Cl.OCCN(CCO)CCO HHLJUSLZGFYWKW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940117957 triethanolamine hydrochloride Drugs 0.000 description 1
- HRXKRNGNAMMEHJ-UHFFFAOYSA-K trisodium citrate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O HRXKRNGNAMMEHJ-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 229940038773 trisodium citrate Drugs 0.000 description 1
- 229960004418 trolamine Drugs 0.000 description 1
- 210000004291 uterus Anatomy 0.000 description 1
- 108010073969 valyllysine Proteins 0.000 description 1
- 235000013311 vegetables Nutrition 0.000 description 1
- 230000000007 visual effect Effects 0.000 description 1
- 238000003260 vortexing Methods 0.000 description 1
- 230000003442 weekly effect Effects 0.000 description 1
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 1
- 108010027345 wheylin-1 peptide Proteins 0.000 description 1
- 239000002023 wood Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
- C12N15/8242—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits
- C12N15/8243—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits involving biosynthetic or metabolic pathways, i.e. metabolic engineering, e.g. nicotine, caffeine
- C12N15/8245—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits involving biosynthetic or metabolic pathways, i.e. metabolic engineering, e.g. nicotine, caffeine involving modified carbohydrate or sugar alcohol metabolism, e.g. starch biosynthesis
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/90—Isomerases (5.)
- C12N9/92—Glucose isomerase (5.3.1.5; 5.3.1.9; 5.3.1.18)
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Nutrition Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
- Fertilizers (AREA)
- Agricultural Chemicals And Associated Chemicals (AREA)
- Compounds Of Unknown Constitution (AREA)
- Distillation Of Fermentation Liquor, Processing Of Alcohols, Vinegar And Beer (AREA)
Description
Vynález se týká rostlin, zvláště pak hrachu (Pisum sativum L.), z nich získaných produktů a způsobů, které umožňují jejich genové manipulace zvláště ovlivňující obsah sacharózy a škrobu.
Dosavadní stav techniky
Hrách je důležitá zemědělská plodina, která produkuje produkty, které mohou konzumovat lidé a zvířata. Semena rostlin hrachu se sklízí buď v suché dozrálé formě nebo nezralá. Stádium zralosti závisí na účelu použití. Každá z těchto dvou kategorií zahrnuje řadu specializovaných použití. Suchá dozrálá semena se ve velkém rozsahu používají jako krmivo pro zvířata, přímo jako potravina pro lidi a jako ingredience různých připravovaných potravin. Hrách, který se sklízí v nedozrálé formě se .používá přímo jako čerstvá zelenina nebo se nakládá, dehydratuje nebo se zmrazuje. Hrách, který se sklízí strojem v nedozrálé formě za účelem rychlého zmrazení, se popisuje jako popínavý hrách.
Pro vývoj různých nových odrůd a kultivarů, aby se uspokojily lokální nebo národní požadavky a udržel se trh, se použily konvenční metody křížení. Tyto varianty zahrnují odrůdy odlišné barvy, struktury, obsahu cukru a škrobu a velikosti semen.
Hrách se také používá jako experimentální organizmus a řada známých odrůd je dobře charakterizována.
Charakterizované mutanty pokrývají celé spektrum vývoje rostlin, morfologie a fyziologie. Některé mutanty mohou mít člověkem požadovaný charakter zemědělské plodiny a z tohoto důvodu byly vybrány.
• · „rugosus (vrásčité) loci r a rb loci
Mendel ve své klasické studii genetiky ukazuje, že fenotyp vrásčitého semene r (rugosus) mutantu je recesivní rys, který zapadá do nově formulovaných zákonů dědičnosti, r mutant se stává populárním nástrojem moderních i klasických genetiků a nyní je dobře charakterizován. Termíny rr, Rr a RR se používaly k popisu homozygotních recesivních, heterozygotních a homozygotních dominantních genotypů, přičemž genotyp rr jasně odpovídá za vrásčitost semen („rugosus znamená v latině vrásčitý). Přítomnost dominantní alely (R) odpovídá za hladkost semene. Věří se, že k původní mutaci došlo spontánně na začátku 17 století. Semena mutantu r ve srovnání s divokým typem obsahují menší množství škrobu (okolo 30% suché váhy, oproti přibližně 50 %) . Složení škrobu v hrachu se změnilo ve prospěch většího množství amylázy a menšího množství amylopektinu (přibližně 70 % suché váhy škrobu semen mutantů tvoří amylóza na rozdíl od 38 % škrobu u divokého typu) . Zjistilo se, že mutace v genu r redukuje aktivitu jedné z enzymových izoforem (SBE1). Gen se klonoval a sekvenoval a zjistilo se, že v mutantním genu se nachází inzerce podobná transpozonu o velikosti 0,8 kb.
Charakterizoval se druhý recesivní rugosus lokus, který se nazývá rb. Homozygotní recesivní mutanti v tomto lokusu mají fenotyp vrásčitých semen , který je podobný jako u rr rostlin, ačkoli se odlišují množstvím škrobu a jeho složením. Škrob představuje přibližně 36 % suché váhy semen, přičemž přibližně 23 % tvoří amylóza. Zjistilo se, že mutace rb vede k redukované aktivitě enzymu ADP glukózové pyrofosforylázy. Izolace enzymu a experimenty westernová přenosu vykazují nepřítomnost jedné ze čtyř polypeptidových podjednotek, které se nacházejí v enzymu divokého typu. Výsledkem redukce nebo potlačení aktivity enzymu ADP glukózové pyrofosforylázy (ADPG·· ·· ·· ···· ·· ·· ···· · · · ···· · ··· · · · · · ··· ··· • ····· · · • ··· ·· · · ·· · · ··
PPase) je zvýšené množství sacharózy v rostlinách, což se popisuje v publikaci US patent č. 5,498,831 (Burgess et al.).
Nové rugosus loci
Wang et al. provedl program mutageneze jak se popisuje v publikaci Plant Breeding 105, 311-320 (1990) „Rn Analysis of Seed Development in Pisum sativum. XIII The Chemical Induction of Storage Product Mutants. Program využívá chemické mutageneze za použití etylmetansulfonátu (EMS) nebo N-metyl-Nnitrozomočoviny (MNU). Hrách vykazuje náchylnost k mutacím pomocí chemických činidel a tyto určité mutageny pravděpodobně způsobují bodové mutace na základě alkylace. 22 000 kulatých semen divokého typu (RR) se ošetřilo shora uvedenými chemikáliemi a označily se jako mutagenizovaná semena (Ml) . Ze semen Ml vyrostly rostliny označené Ml°, které nesou semena M2. Ze semen M2 vyrostly rostliny M2 nesoucí semena označená M3. U semen označených M3 se analyzoval obsah akumulovaného produktu.
Semena izolovaná z generace M3 z vrásčitým fenotypem vykazují široké rozmezí obsahu škrobu. Hodnoty se pohybují od 0 do 60 % suché váhy dozrálých semen. Obsah amylózy ve škrobu těchto semen je v rozmezí 0 až 80 %. Obsah lipidů a proteinů semen M3 také kolísá více , než se pozorovalo u hrachu dříve. Obsah lipidů byl 1 až 8 % suché váhy a obsah proteinů kolísal od 24 až do 48 %. Později se vykazuje vyšší maximum, než u existujících druhů mezi 24 a 41 %. Závěr počátečních analýz semen M3 byl, že se indukovaly nové „rugosus mutanty a je pravděpodobné, že mutanty ovlivňují biosyntézu škrobu.
Nové linie mutantů se označily „SIM” číslem (SIM = semeno : indukovaný mutant). Testy předchozího alelizmu k r a rb lokům ukazují, že linie SIM nejsou alelické k žádnému z těchto loků a proto pravděpodobně byly mutanty ovlivňující jiné enzymy na dráze syntézy škrobu. Zjistilo se, že jiné linie jsou alelické s r nebo rb a proto tyto linie reprezentuji nové • · • »·· · · · · · ··· ··· • ····· · · ···· · · ·· ·· ·· ·· mutantní alely těchto loků (popisuje se v publikaci Wang and Hedley, Seed Science Research (1991) 1, 3-14, „Seed
Development in peas: knowing your three „r's(or four or five)). Detailnější analýza komplementace zahrnující celkové křížení dvou alel mezi 24 SIM liniemi a liniemi s genotypem rr a rbrb rozděluje mutanty do pěti skupin. Dvě z nich obsahovaly původní rugosus mutanty (popisuje se v publikaci Hedley and Wang, Aspects of Applied Biology 27 (1991) Production and protection of legumes, 205-209, „Adding value to the pea crop by genetically manipulating the stotage product composition of the seed). Dokončilo se rozdělení linií SIM do skupin a tři nové rugosus loci se označily genovými symboly rug3, rug4 a rug5 v souladu s Pisum Genetic Association (popisuje se v publikaci Wang and Hedley, 1993, Pisum Genetics 25, 64-70, „Seed Mutants in Pisum) . V tabulce č. 1 se uvádí pět komplementáčních skupin.
Tabulka č. 1
| Skupina | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 |
| Genový symbol | R | rb | Rug3 | rug4 | rug5 |
| Linie SIM | 53 | 14 | 1 | 11 | 51 |
| 54 | 15 | 32 | 91 | 52 | |
| 55 | 16 | 41 | 201 | 81 | |
| 56 | 101 | 42 | |||
| 57 | 102 | 43 | |||
| 58 | 103 | ||||
| 59 | 103W | ||||
| 61 | |||||
| 71 |
rug 3
Předchozí analýza obsahu zásobního produktu linií SIM ukazuje, že ty linie, které patří do skupiny rug3, vykazují ve • · ·· • · · • · · • · · · · · • · · · srovnání s kulatými semeny divokého typu dramaticky redukovaný obsah škrobu. Obsah škrobu u mutantů této skupiny se pohybuje ve srovnání s přibližně 55 % u kulatých semenech v rozmezí 1 a 20 % suché váhy zralých semen (popisuje se v publikaci Wang and Hedley, Seed Science Research (1991) 1, 3-14, „Seed Development in peas: knowing your three „r's(or four or five)). Navíc tyto linie vykazují úplnou absenci amylózy ve škrobu, který je přítomen. U hrachu takový fenotyp nebyl nikdy před tím pozorován.
Linie SIM patřící ke komplementační skupině rug3 se označily genovými symboly, jak ukazuje tabulka č. 2 (popisuje se v publikaci Wang and Hedley, 1993, Pisum Genetics 25, 6470, „Seed Mutants in Pí sum).
Tabulka č. 2
| Číslo SIM | Genový symbol |
| 1 | Rug3a |
| 32 | Rug3° |
| 41 | Rug3c |
| 42 | Rug3d |
| 43 | Rug3a |
Hrách s genotypem rug3rug3 (který se zde pro jednoduchost uvádí jako hrách rug3) je zajímavý pro vědce a je vhodný pro běžné použití vzhledem k nízkému obsahu škrobů neobvyklé podstaty a také proto, že obsahuje vysoký obsah proteinů a lipidů. Popisuje se například v publikaci Hedley and Wang, Agro-Food Industry Hi-Tech (January/February 1993) 14-17,
Farmers Weekly, 19 Apríl 1991, 54-57.
Vynález je založen na neočekávaném objevu, že hrách označený rug3 produkuje semena, která na konci období zrání vykazují ve srovnání s běžnými odrůdami popínavého hrachu vyšší množství sacharózy a tak jsou vhodnější ke konzumaci.
r *····· 4 4·· o · ··· · · · · · ··· ··· • ···*· · · ·· · · ·· ·· 4 4 44 44
Semena popínavého hrachu by měla být sladká a měla by vykazovat přijatelnou strukturu. Zjistilo se, že hrách označený rug3 produkuje semena, která udržují během dostatečně dlouhého období přijatelný vysoký obsah sacharózy a vhodně nízký obsah škrobu ve srovnání se známými odrůdami hrachu. Semena hrachu rug3 se mohou sklízet ve stádiu zralosti, které se u konvenčních odrůd hrachu považuje za příliš časné pro mrazení, a je vhodné pouze pro konzervování. Tato doba vhodná pro sklizeň, obecně nazývaná jako období sklizně, se proto prodlouží.
Zjistilo se, že mutace rug3 se spojuje s podstatnou redukcí aktivity enzymu plastidiální fosfoglukomatózy (PGM(p)). Zjistilo se, že aktivita PGM(p) se redukovala na 10 % aktivity běžných linií hrachu nebo méně a v extrémním případě aktivita PGM(p) úplně chybí.
Význam nepřítomnosti aktivity PGM(p) je ten, že se v plastidu nemůže objevit inter-konverze glukoza-1fosforečnanu a glukoza-6-fosforečnanu. Uvedená reakce je důležitá při syntéze škrobu protože glukoza-l-fosforečnan slouží jako substrát při syntéze škrobu. Uvažuje se, že glukoza-l-fosforečnan se v hrachu nemůže transportovat do plastidů (Hilland Smith, Planta 185, 91, 1991; Borchert et al., Plant Physiology 101, 303-312, 1993) a že produkce glukoza-l-fosforečnanu v plastidech je závislá na aktivitě PGM(p). Syntéza škrobu nemůže probíhat bez přidání glukoza-lfosforečnanu. Je známo, že metabolizmus cukru a škrobu souvisí s rostlinou a změnou množství enzymu, který se účastní syntézy škrobu, se může změnit množství cukru obsaženého v rostlině.
Z nezralých embryí hrachu se klonovala sekvence cDNA kódující enzym fosfoglukomutázu (PGM) a zjistilo se, že vykazuje nezanedbatelné oblasti homologie genu se známými sekvencemi cDNA PGM, které se klonovaly z ostatních druhů. Dále, genetická segregační analýza ukázala, že mapy mutace rug3 jsou velmi blízké genu PGM(p), což poskytuje důkaz, že ·· ·· ·· ···· ·· ·· ···· · · · ···· η ·'·····'·· • · ··· · · · · · »·· ··· • ····· · · ···· ·· ·· ·· ·· ·· mutace ovlivňuje gen PGM(p) . Potlačením nebo redukcí exprese PGM v rostlinách hrachu nebo v jiných rostlinách se může zvýšit obsah sacharózy.
Podstata vynálezu
Vynález popisuje semena hrachu, která mají obsah sacharózy vyšší než 6 hmotnostních % celkové hmotnosti semene, která se sklidila, když měření tenderometru přesáhlo 120 tenderometrických jednotek.
Upřednostňuje se, aby obsah sacharózy v semenech hrachu v souladu s vynálezem byl vyšší než Ί hmotnostních procent celkové hmotnosti semene.
Hrách fenotypu rug3 produkuje semena, které mají obsah sacharózy podstatně vyšší než je obsah sacharózy libovolného běžného popínavého hrachu rostoucího za stejných podmínek při daném stádiu zralosti.
Stádium zralosti vhodné pro sklizeň se může odhadnout různými způsoby:
1) S ohledem na stádium vývoje lusku. Pěstitel hrachu může na základě citu stanovit relativně přesně stádium zralosti semen a tak usnadnit sklizeň.
2) S ohledem na počet dnů po kvetu, na počasí, zvláště na teplotu. Stádium plného květu se odhaduje na základě posouzení zralosti každého květu na prvních čtyřech okvětních stoncích. Po té, co se dosáhne plného květu datum sklizně se může předpovědět na základě počtu dní, kdy byly průměrné teploty, od květu do sklizně s ohledem na odrůdu a datum vysetí.
3) S ohledem na měření získaná přístrojem, který se nazývá tenderometr a měří měkkost semen způsobem definovaným jako průmyslový standard, který stanovuje instituce Camden and Corley Wood Food and Drink Research Assocition v Anglii. V případě semen vhodných pro zpracování hodnoty měření • · • ·
tenderometrem v rozsahu 95 až 120 tendometrických jednotek vyhovují přijatelnému průmyslovému standardu. V případě semen vhodných pro zmrazení se s výhodou hodnoty tenderometrické měření pohybují v dolní části uvedeného rozmezí.
V důsledku chybějícího škrobu odrůdy rug3 nemohou vykazovat hodnoty tenderometrického měření přesně stejné jako vykazují běžné odrůdy, přičemž z předchozích studií vyplývá, že se získají stejné hodnoty měření, což naznačuje, že tenderometr neměří přímo škrob.
Množství sacharózy a škrobu semen se může stanovit použitím známých analytických metod, které zahrnují iontovou chromatografii a spektrofotometrické metody.
Dále vynález popisuje semena hrachu, kde poměr obsahu sacharózy a obsahu škrobu v semenech vzniklých při popínání je větší než 2.
Upřednostňuje se, aby poměr sacharózy a škrobu v semenech hrachu podle vynálezu ve stádiu popínání byl větší než 5, více se upřednostňuje, aby byl větší než 10.
Zralá suchá semena hrachu rug3 také vykazují ve srovnání se semeny běžných linií hrachu vyšší poměr obsahu sacharózy a obsahu škrobu. Tento poměr je běžně větší než 0,6, s výhodou je větší než 1, zvláště výhodné je, je-li větší než 2.
Poměr obsahu sacharózy a obsahu škrobu v semenech poskytuje použitelnou indikaci zhoršení chuti semen určených pro konzumaci lidí během dozrávání a tedy jeho vhodnost pro sklizeň během prodlouženého období. Poměr obsahu sacharózy a obsahu škrobu v semenech hrachu podle vynálezu zůstává během dozrávání z fáze popínání do zralé suché formy vyšší než 0,6.
Za účelem maximalizace výtěžku semen ve fázi popínání je nutné dosáhnout tak dlouhého období sklizně, jak jen je to možné. U běžných rostlin popínavého hrachu semena vykazují hodnoty tenderometrického měření v kritickém rozmezí 95 až 120 • · • · tenderometrických jednotek. Semena jsou dostatečně sladká a musí se zpracovat ve velmi krátkém časovém období, což znamená půl dne za podmínek horkého počasí a 2 dny za podmínek chladného počasí. Po tomto období semena jsou nepřijatelně tvrdá a obsah sacharózy klesá do rozmezí, kdy semena nejsou dostatečně sladká. Toto velmi krátké období sklizně představuje vážné praktické problémy se semeny ve fázi popínání v komerčním měřítku. V praxi to znamená, že dojde ke ztrátě podstatné části sklizně, což je způsobeno neschopností rostlin se popínat ve správném čase. Produkce a sklizeň popínavého hrachu se diskutuje v publikaci Arthey D. 1985. Vining peas; precessing and marketing. V Hebblethwaite P D, Heath M C, Dawkins T C K, eds. The pea crop. London: Butterworths, 433-440. Doba sklizně plodiny se shoduje s obdobím před počátkem rychlé syntézy škrobu. Po sklizni se plodina uskladněná při teplotě okolí musí rychle zpracovat.
V obecném případě to trvá tři hodiny, než se objeví zápach. Zjistilo se, že mutantní hrách rug3 vykazuje podstatně delší období sklizně a to v rozmezí jednoho dne za horkého počasí a 5 až 6 dní za chladného počasí.
Vynález popisuje rostlinu hrachu, která ve srovnání s běžnými odrůdami hrachu vykazuje prodloužené období sklizně.
Dále se zde popisuje způsob prodloužení období sklizně rostlin hrachu zahrnující kultivaci rostlin ze semene podle vynálezu.
Vynález dále popisuje polynukleotidy, které obsahují sekvenci plastidiální PGM hrachu (SEQ ID NO: 3), která je zobrazena na obrázku č. 1 nebo její funkční ekvivalent.
V typickém případě polynukleotid neobsahuje další DNA a RNA, se kterou je přirozeně spojen.
Je vhodné, aby funkčně ekvivalentní nukleotidové sekvence zahrnovaly sekvence vykazující alespoň 60 % nukleotidové homologie, upřednostňuje se alespoň 80 %, více se upřednostňuje alespoň 90 % homologie s nukleotidovou sekvencí • · • · · · • · · · ·· · ···· ··· ·· · · · · · uvedenou na obrázku č. 1. Takové ekvivalentní sekvence jsou schopny hybridizovat za standardních laboratorních podmínek (popisuje se například v publikaci Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Edition) s doplňkem sekvence uvedené na obrázku č. 1.
Navíc funkčně ekvivalentní sekvence zahrnují ty, které jsou antisense ekvivalenty sekvence nukleotidů uvedených na obrázku č. 1. Takové antisense ekvivalenty jsou proto schopny hybridizovat se sekvencí uvedenou na obrázku č. 1 a jsou přednostně schopny interferovat s expresí sense sekvence na úrovni DNA a/nebo mRNA.
Nukleotidová sekvence podle vynálezu je obsažena ve vektoru. Vhodným vektorem je expresivní vektor, který se adaptoval, aby vyvolal transkripci sekvence ve vhodných hostitelských buňkách. Selekce vhodných vektorů a způsobů jejich přípravy je v oboru dobře známa a popisují se například v publikaci Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Edition.
Způsoby transformace zavedení nukleotidové sekvence podle vynálezu do buněk hostitele jsou dobře známy v oboru a zahrnují metody jako mikroinjekce, vysokorychlostní balistickou penetraci a transformaci zprostředkovanou bakterií agrobakterium.
V běžném případě může být nukleotidová sekvence podle vynálezu zavedena do rostliny takovým způsobem, který způsobuje redukci nebo potlačení exprese PGM prostřednictvím sense nebo antisense suprese. Způsoby dosažení sense nebo antisense suprese jsou v oboru dobře známy. V běžném případě zaváděná nukleotidová sekvence je operabilně spojena s promotorem, který umožňuje transkripci nukleotidové sekvence. Vhodné promotory jsou známy v oboru a mohou být například indukovatelné, konstitutivní nebo tkáňově specifické.
• · · ·· · · · · · • · · ·· · «··· • ··· · · · · · ······ • · · · · · · · ···· ·· ·· ·· ·» »·
Zavedení sekvence podle vynálezu v antisense orientaci vzhledem k promotoru vede k redukci síly exprese. Sense suprese, kde přítomnost další sense sekvence inhibuje expresi nativního genu, je u rostlin dobře popsána (například v publikaci Matzke and Matzke, 1995 Plant Physicol, 107, 679685) . Uvažuje se, že antisense způsoby pracují prostřednictvím produkce antisense mRNA, která hybridizuje se sense mRNA a brání její translaci na funkční polypeptid. Přesný mechanizmus sense suprese není jasný, ale také vyžaduje homologii mezi zavedenou sekvencí a cílovým genem. V případě sense i antisense suprese není podstatná ani celá délka nukleotidové sekvence ani „nativní sekvence. Fragmenty nukleotidové sekvence o různých velikostech se mohou uplatňovat při změně množství PGM. Tyto fragmenty odborník může stanovit za použití srovnatelně jednoduché studie a chyby.
Produkují se rostliny, zvláště rostliny hrachu, které vykazují redukovanou aktivitu PGM(p) nebo v podstatě nevykazují žádnou PGM(p) aktivitu.
Vynález také popisuje způsob, který mění jednu nebo více charakteristik rostliny nebo její části, zvláště pak rostliny hrachu. Uvedený způsob může změnit rostlinu tak, že se redukuje její PGM(p) aktivita. Je vhodné, aby se rozšířilo období sklizně nebo se zvýšil obsah sacharózy.
Rostlina, do které se zavede sekvence, je přednostně komerčně signifikantní rostlinou, ve které PGM plní určitou roli a která podléhá metodám transformace rostlin. Příklady zahrnují například mrkev a rajče.
Vzhledem k určitým praktickým problémům spojeným s krátkým obdobím sklizně je výhodné na rostliny hrachu aplikovat metody, které umožní prodloužit krátkého období sklizně. Uvedené metody se mohou vhodně aplikovat na libovolné jiné rostliny, kde je nutné také prodloužit období sklizně, například u zelených fazolí.
jme semena.
ovoce mohou produkovat
43, které
Vynález také zahrnuje kořeny, produkty rostlin podle vynálezu.
Rostliny hrachu podle vynálezu se produkcí rostlin s genotypem rug3rug3.
Mutantní SIM linie hrachu 1, 32, 41, 42 a vznikají v rámci programu mutageneze Wanga et al. popsaného shora v textu, vykazují uvedenou charakteristiku. Avšak tyto linie hrachu nevykazují obecně přijatelné agronomické pro komerční použití. Mezi tyto patří například rezistence k onemocnění, struktura, výška rostliny atd. Za účelem komerčního použití se mohou produkovat nové linie nebo odrůdy, které mají přijatelný agronomický charakter a zahrnují mutaci rug3.
charakteristiky charakteristiky velikost semen,
Tyto rostliny mohou vznikat běžným šlechtěním rostlin , například křížením vhodných SIM linií rostlin s celou řadou komerčně přijatelných odrůd, jako jsou například Novella, Bikini atd. Vhodné metody šlechtění jsou dobře známy v oboru.
Program mutageneze následuje po postupu Wanga et al. (jak se popisuje v publikaci Plant Breeding 105, 311-320 (1990)) Počátečním materiálem je vhodná běžná odrůda rostliny hrachu (spíše než hrách s kulatými zrny, který použil Wang et al) a vzniká rug3 mutant běžné odrůdy. Požadované mutanty se mohou stanovit na základě testů množství škrobu v semenech nebo v jiných částech rostlin.
Jiný přístup volí použití metod rekombinace DNA za vzniku transformovaných rostlin, ve kterých exprese genu PGM(p) je tlumena nebo deaktivována alespoň ve vyvíjejících se semenech hrachu. V oboru jsou dobře známy vhodné metody, které se například popisují v publikaci Davies et al., Plant Cell Reports 12, 180-183 (1993). Tento přístup se také diskutuje v publikaci D. R. Davies and Ρ. M. Mullineau v Chapter 10 (Tissue Culture and Transforamtion) v Peas: Genetics, Molecular Biology and Biotechnology, eds. R. Casey and D. R.
·· ·· ·« ΦΦΦΦ » · · · · φ φ φ φ · φ
ΦΦΦ φφ φ ΦΦΦΦ φ φφφφφ φ φφ ΦΦΦ ΦΦΦ φ φφφφφ φ φ
Ιφφφ ΦΦ Φ· ΦΦ Φ φ φ φ
Davies, vyšlo v nakladatelství CAB International, v roce 1993 a v US patentu č. 5498831.
Vhodné metody, které se mohou použít pro zeslabení nebo k deaktivaci exprese genu PGM specificky ve vyvíjejících se semenech hrachu, zahrnují:
1) Tkáňově specifické a dočasné zeslabení exprese genu PGM ve vyvíjejícím se hrachu prostřednictvím metod antisense nebo sense suprese. Toho se může dosáhnout transformací divokého typu hrachu Rug3Rug3 transgenní konstrukcí obsahující promotor specifický pro semena hrachu (který napodobuje co nejblíže expresivní profil semen nativního genu PGM) ve fúzi s částmi kódující oblasti genu PGM hrachu v sense a antisense konfiguraci. Tento způsob zobrazuje obrázek č. 2. Různé sub-fragmenty cDNA PGM hrachu se mohou fúzovat downstream specifického promotoru v obou sense i antisense orientacích. Používaný promotor je ten, který nejlépe napodobuje aktivitu a patern exprese nativního PGM ve vyvíjejícím se hrachu. Takové promotory se mohou získat ze členů genové leghaemoglobinu, rodiny vicillinu, genové rodiny genové rodiny fazeolinu, genu USP (neidentifikovaný protein semen) nebo z jiných vhodných genů. Vhodná 3'terminační/polyadenylační oblast (např. polyadenylační sekvence nopalinové syntetázy) je také fúzována downstream sekvencí PGM. Tyto konstrukce se zabudují do oblasti T-DNA vhodného binárního vektoru z bakterie Agrobacterium, jako je například Binl9, pGPTV nebo vhodný derivát RS76. Jestliže v oblasti T-DNA není už přítomen selekční markerový gen BAR, kódující rezistenci na fofinotricin nebo jeho vhodná alternativa, pak se také začlení do uvedené oblasti. Konstrukce se transformují do definovaných linií hrachu za použití standardních postupů transformace hrachu, které se například vyvinuly v instituci John Innes Centre, Norwich. U transformantů se testuje přítomnost jednoduchých T-DNA inzercí s nízkým ·· · · • 9 ··
I 9 9 9 » · · ·
9 99 9
9
99 počtem kopií a analyzuje se exprese nativního genu PGM na úrovni mRNA a množství exprimovaného proteinu. Ty transformanty, které vykazují podstatně redukované množství PGM RNA a proteinu PGM nebo proteinovou aktivitu specifickou pro vyvíjející se hrách, se podrobí další analýze, jako kandidát požadovaného výsledku.
Tkáňově a dočasně specifická částečná komplementace materiálu rug3. V tomto případě celá délka cDNA klonu PGM (z hrachu, špenátu nebo z jiných vhodných zdrojů) se bude fúzovat s promotorem, který specifikuje expresi v rozsahu relevantních tkání (listy, stonky atd.), ale ne v tkáních, které se týkají vyvíjejícího se semena hrachu (zobrazuje obrázek č. 3) . Vznikají rostliny, jejichž semena sí ponechávají fenotyp rug3, ale jiné rostlinné tkáně jsou divokého typu. To znamená, že jiné tkáně, jako stonky, listy atd. jsou normálně sladké a tak nejsou více náchylné k ukořistění než běžné rostliny. Kódující oblast genu PGM z hrachu, špenátu nebo z jiného vhodného zdroje bude fúzovat downstream sekvence promotoru, což zabrání vzniku aktivity ve vyvíjejících se semenech hrachu. Aktivita v jiných částech rostlin se co nejvíce přibližují aktivitě divokého typu. Vhodná polyadenylační/terminační sekvence může fúzovat downstream sekvence kódující PGM. Konstrukce genu se může vestavět do T-DNA vhodného transformačního vektoru bakterie Agrobacterium, jak se popisuje shora v textu. Transgenní konstrukce se může začlenit do rug3 materiálu nebo do materiálu odvozeného z rug3 za použití standardních metod, jak se popisuje shora v textu, které jsou optimalizovány pro použití dohromady s materiálem rug3. Identifikovaly se transformanti s jednoduchou inzercí T-DNA s nízkým počtem kopií. Exprese transgenů PGM se testuje na úrovni RNA. Dále se testuje přítomnost/absence proteinu PGM nebo aktivita. Ty linie, kde v semenech PGM ·· ·» «··· ·· • · · • · · ♦ ··· • · • · • ·
··· · • · · • · · • · · • · · · ·· ·· ·· není přítomen, ale je přítomen v jiných částech rostlin, se používají pro další analýzu.
Série zkoumání A proběhla na mutantním hrachu rug3, který je výsledkem programu mutageneze Wanga et al., popsaného shora v textu.
Přehled obrázků na výkrese
Obrázek č. 1 zobrazuje nukleotidovou sekvenci a dedukovanou aminokyselinovou sekvenci cDNA klonu PGM(p) hrachu (SEQ ID NO: 3 a 4).
Obrázek č. 2 schématicky ilustruje genové konstrukce vhodné pro ztlumení PGM(p) aktivity specifické pro semena.
Obrázek č. 3 schématicky ilustruje konstrukce vhodné pro částečnou komplementaci rug3.
Obrázek č. 4 je série grafů vykazující změny a) váhy čerstvých semen, b) váhy suchých semen, c) obsahu sacharózy v semenech s časem (počet dní po kvetu) v linii rug3a rug3a (čtverečky) a v linii divokého typu (kolečka).
Obrázek č. 5 je série grafů, které ukazují změny a) váhy čerstvých semen, b) váhy suchých semen, c) obsahu sacharózy v semenech s časem (počet dní po kvetu) v linii rug3brug3b (čtverečky) a v linii divokého typu (kolečka).
Obrázek č. 6 zobrazuje schéma syntézy škrobu v embryích hrachu indikující aktivity způsobené mutacemi rugosus loci (r, rb a rug3).
Obrázek č. 7 zobrazuje způsob, kterým se testuje plastidiální aktivita PGM. Zobrazené hodnoty ukazují aktuální výsledky jednoho páru experimentů. Výpočty plastidiálních aktivit PGM proběhly , jak se popisuje. ADPGP=ADP glukózapyrofosforyláza. PGM=fosfoglukomutáza. PFP=na fosforečnanu závislá fruktóza-6-fosfát-l-fosfotransferáza.
Obrázek č. 8 ilustruje gelovou elektroforézu škrobu:
• · · · · · • · · · · · • · · · · ···· · · ·· · ·
A) Zymogram zobrazující aktivitu PGM z (p) izolovaných plastidů z přibližně 300 mg embryí divokého typu, (m) extrakt z listů mutantních rostlin rug3brug3b, (wt) extrakt z listů rostliny divokého typu. Pruhy, které doběhly dále (méně anodální) ve stopě (p) jsou relativně silnější neá horné pruhy, což indikuje, že spodní pruhy korespondují s aktivitou plastidiální PGM. Slabý pruh přítomný ve stopě (m) , který leží níže (méně anodální) než hlavní pruh (označený šipkou), se objevil pouze v tomto experimentu a může být artífaktem. Velká šipka ukazuje směr migrace (směrem k anodě).
B) Zymogram srovnávající extrakty z (wt) listů divokého typu a (m) z mutantních listů rugd^rugS1’. Elektroforéza tohoto gelu trvala delší dobu, než vykazuje odstavec A) a jasně ukazuje absenci méně anodálního, plastidiálního pruhu PGM u mutantu ve stopě (m).
C) Reakce, které se podílí na obarvení zymogramů PGM aktivity. MTT= 2, 5-difenyltetrazoliumbromid (tiazoylová modř).
Obrázek č. 9 je graf relativního množství cukru versus hodnoty stanovené tenderometrickým měřením, které ilustrují změny obsahu cukru v hrachu během zrání. Kosočtverce reprezentují linie rug3 a čtverce reprezentují linie ze stejného křížení podobného agronomického provedení, které nedědí charakter rug3. Tečkované čáry spojují vzorky odebrané ze stejné linie v různém stádiu zralosti.
Rostlinný materiál
Provedlo se porovnání rostlin genotypu rug3rug3 a divokého typu, tedy rostlin s kulatými semeny. Experimenty zahrnující taková porovnání využívaly blízce izogenní linie hrachu, které se značně liší pouze v ohledu lokusu rug3. Tyto blízké • · » ·
I · • · · · · izolinie se získaly re-selekcí linií, které jsou po šest generací heterozygotní v lokusu rug3. Na základě této metody každá linie s vrásčitými semeny (rug3rug3) má svoji vlastní odpovídající linii s kulatými semeny (Rug3Rug3 nebo ++) .
Podmínky růstu
Semena každé linie rug3rvg3 společně se semeny, která jsou blízce izogenní s každou linií mimo alel v lokusu rug3, se pěstovala ve skleníku. Ve sklenících se udržoval cyklus den/noc, teploty 15/10 °C s minimálním obdobím světla 16 hodin. Za účelem produkce kontinuální zásoby čerstvých listů a embryonálního materiálu se provedlo několik setí. Rostliny se pěstovaly venku za účelem množení a růstových experimentů. Rostliny BC1 a rostliny F1 a F2 vznikly na základě křížení, které se popisuje shora v textu, a pěstovaly se ve skleníku.
Za účelem porovnání rostlin rug3rug3 s jejich blízko izogenními rodiči během vývoje byly rostliny náhodně vybrány a kultivovaly se v místnosti se řízeným prostředím (Weiss Technik, Reiskirchen, Germany) na kompostu John Innes č. 1 s 30 % obsahem písku. Na rostliny se přes den svítilo 16 hodin v intenzitě přibližně 300 μΕ na úrovni rostlin (lampa HQI; Wotan Powerstars, Osram, Wembley, UK) a teplota během periody světla se udržovala na 15 °C a během periody tmy na 10 °C. Relativní vlhkost byla 75 %.
Experimenty s řízeným prostředím.
Velmi pozorně se zaznamenávala produkce květů rostlin kultivovaných v místnostech se řízeným prostředím. Vývojové stádium odpovídající jednomu dni po antezi se považuje za čas, kdy se otevírají vnější korunní plátky kvetu a svírají zhruba pravý úhel s vnitřními korunními plátky. V tomto stádiu se květy odstřihly a zaznamenala se data. Květy ze stejného stonku se odstranily. Když se na rostlině začaly tvořit tři lusky, odstranil se konec rostliny, aby se zabránilo dalšímu • · · · růstu směrem do výše. Boční výhonky se také odstranily ihned po té, co se objevily. Dále vyvíjet se nechaly pouze uvedené tři lusky a tak se redukovala kompetice lusků vzhledem k nutrientům.
Ve všech studiích vývoje se z lusků odebíraly vzorky v deseti časových bodech mezi 15 a 45 dny po antezi. Po odstranění rostlin se lusky a semena udržovaly na ledu a zpracovaly se v určitých experimentech. Ve všech případech se testovala tři semena uložená co nejvíce ve středu lusku.
Analýza růstu
Po sklizni lusků se ve specifický časový okamžik zvážily z každého lusku tři semena. Preparát embrya se získal sekcí z osemení a po přenosu kapalného endosperma se čerstvé embryo a osemení odděleně zvážilo. Dále se zvážilo embryo a osemení po vysušení zmrazením.
Měření obsahu sacharózy v semenech
Během vývoje se sklízela celá semena a zaznamenávala se váha čerstvých semen. Hmotnosti semen z rostlin rug3rug3 a divokého typu se pohybovaly v rozmezí přibližně 20 mg až 600 mg. Semena se vysušila mrazením a extrahoval se z nich cukr vařením v 5 ml 80 % etanolu (objem/objem) a pak se rozmělnila na pastu. Po usazení pevných částic centrifugací při 2 000 ot. po dobu 10 minut se odstranil supernatant a jeho zbytek se odpařil. K peletu se přidal další 80 % etanol a postup se zopakoval ještě dvakrát. Supernatanty z každé fáze se slily a odpařily se do sucha, přičemž konečný pelet obsahoval rozpuštěné cukry. Extrakty se analyzovaly iontovou chromatografii za následujících podmínek:
Chromatograf Dionex 4000i (BIO LC)
Kolona
Guard; CarboPac PA1 50 mm x 4
Teplota v koloně
Objem nanesení
Mobilní fáze
Detektor
Detektor nastavení
Aplikované potenciály ·· ·· • ·· · · · · · • ·· · · · · · ··· · ·· ··· ··· • · · · · · · • · ·· · · ·· mm i,d. (10 um).
Main; CarboPac PA1 250 mm x 4 mm i,d. (10 um).
25°C ul
150 mM NaOH izokrativký (kontinuální odstraňování plynů He) při průtoku 1 ml/min.
Pulzní amperometrický (PAD) s pracovní zlatou elektrodou, materiálem referenční elektrody je stříbro
Rozmezí; 3 KnA
El: + 0,05 V (480 ms E2: + 0,60 V (120 ms E3: - 0,60 V (60 ms)
Testování enzymatických aktivit v surových extraktech embryí hrachu.
Příprava surových extraktů
Za účelem měření celkové enzymatické aktivity se extrahovala 2 embrya (200 až 300 mg v čerstvé formě) do 5 až 10-ti objemů pufru chlazeného ledem. Pufr obsahuje 50 mM Mops (pH7,2), 10 % (objem/objem) etandiol, 2 mM DTT. Embrya se rozmělnila tloučkem v misce a pak ve skleněném homogenizéru. Homogenáty se centrifugovaly při 10 000 g, při teplotě 4 °C po • · · ·· · ···· ····· · · · ··· ··· • ····· · · ···· «· ·4 ·· ·· ·· dobu 10 minut. Výsledné supernatanty, zde uváděné jako surové extrakty, se umístily na led a ihned se provedly testy.
Spektrofotometrické testy
Všechny spektrofotometrické testy se provedly v plastových kyvetách na jedno použití o objemu 1 ml při teplotě 25 °C a k monitorování se použil spektrofotometr Phillips PU 8800. Každá reakční směs je uvedená dále v textu. V závorkách se uvádí odkazy, na základě kterých se modifikovaly. Všechny spřažené enzymy v reakci se získaly od firmy Boehringer Mannheim.
ADPglukózapyrofosforyláza (EC 2.7.7.27; Hill and Smith, Planta 185, 91, 1991}
Test proběhl v pufru 80 mM Hepes pufru (pH 7,9). Pufr obsahuje 1,5 mM pyrofosforečnan sodný, 5 mM MgCl2, 0,8 mM NAD, 2 mM ADPglukózu, 5 jednotek glukóza-6-fosfátdehydrogenáza (spojená s NAD, pochází z Leuconostoc mesenteroides), 2 jednotky fosfoglukomutázy a 10 až 50 ul surového extraktu. Všechny komponenty reakční směsi mimo fosforečnan sodný se kombinovaly v kyvetách na jedno použití o objemu 1 ml a reakce se monitorovaly spektrofotometricky při vlnové délce 340 nm. Když se dosáhlo základní reakční rychlosti, přidal se do reakční směsi fosforečnan sodný, kyvety se vrátily do spektrofotometru a stanovila se reakční rychlost.
UDPglukózapyrofosforyláza (EC 2.7.7.9,- Smith et al., Plant Physiology 89, 1279-1284, 1989)
Test proběhl v 80 mM pufru Bicine (pH 8,6). Pufr obsahuje
1,5 mM pyrofosforečnan sodný, 1 mM MgClž, 0,8 mM NAD, 0,8 mM
UDPglukózu, 10 jednotek glukóza-6-fosfátdehydrogenázy (spojená s NAD, pochází z Leuconostoc mesenteroides), 4 jednotky • · • · · ·· · · · · · • ··· · · « · « ··· ··· • · · · · · · · ···· ·· ·· ·· ·· ·· fosfoglukomutázy a 10 až 50 ul dvakrát ředěného surového extraktu. Bazální a testovaná reakční rychlost se stanovila jako v případě ADPglukózapyrofosforylázy s výjimkou, že reakce se inicioval UDPglukózou.
Fosfoglukomutáza (EC 2.7.5.5; Foster and Smith, Planta 190, 17-24, 1993)
Test proběhl v 50 mM pufru Bicine (pH 8,5). Pufr obsahuje 1 mM MgCl2, 0,8 mM NAD, 6 mM glukóza-l-fosforečnan, 2 jednotky glukóza-6-fosfátdehydrogenázy (spojená s NAD, pochází z Leuconostoc mesenteroides), 4 jednotky fosfoglukomutázy a 10 až 50 ul surového extraktu. Bazální a testovaná reakční rychlost se stanovila jako v případě ADPglukózapyrofosforylázy s tou výjimkou, že reakce se iniciovala glukóza-1fosforečnanem.
Radiometrický test ADPglukózy při syntéze rozpustného škrobu
Modifikovaný test z publikace Smith et al., Plant Physiology 89, 1279-1284 (1989) obsahoval 200 μΐ 100 mM pufru
Bicine (pH 8,5), 5 mM EDTA, 25 mM acetát draselný, 10 mM DTT, mM ADPglukózu, amylopektin (5 mg/ml), 0,23 Kbq ADP[U14C]glukózy a 20 μΐ surového extraktu. Reakce se iniciovala surovým extraktem a inkubovala se při teplotě 25 °C přesně po dobu 10 minut. Po uplynutí této doby se reakce zastavila povařením po dobu 1 minuty. Glukózový polymér se vysrážel přidáním 3 ml 75 % metanolu, 1 % (objem/objem) KC1. Do měření se zahrnuly slepé roztoky, které se ihned po přidání surového extraktu inkubovaly při teplotě 100 °C. Kapalnou scintilační spektrometrií za použití scintilačního roztoku Optiphase HiSafe II (LKB Scintillation Products, Loughborough, England) v scintilačním počítači LKB 1219 Rackbeta se stanovila radioaktivita inkorporovaná v glukózovém polyméru.
• · · · · · • · * ·· · · · · · ··· ·· · ♦ · · · • ····· · · · ··· ··· • ····· · 9 ·«·· ·· ·· ·· ·· ··
Testy enzymatických aktivit amyloplascú
Izolace amyloplastů
Izolace amyloplastů se provedla upraveným způsobem podle Hill and Smith, Planta 185, 91 (1951), Smith et al., Planta
180, 517-523 (1990) a Denyer and Smith, Planta 173, 172-182 (1988) .
Připravilo se extrakční médium (médium A) podle publikace Hill and Smith, Planta 185, 91 (1951) . Médium obsahovalo 500 mM sorbitolu, 20 mM Hepes (pH 7,4), 10 mM KCL, 1 mM MgCl2, 1 mM EDTA, 5 mM DTT, 10 % (obj em/obj em) etandiol, 1 % (hmotnost/objem) BSA. Shromáždilo se přibližně 5 g embryí, jejichž individuální hmotnosti se pohybovaly kolem 200 mg, buď z mutantních rostlin rug3 nebo z jejich ekvivalentní isolinie divokého typu se v médiu A nařezalo žiletkou. 3x až 4x se extrakt nahradil čerstvým médiem. Známý celkový objem extraktu je 15 až 20 ml. Extrakt se filtroval přes dvě vrstvy Miracloth (Chicopee Mills, New Jersey, USA) do zkumavek Corex (Corning glass works) o objemu 30 ml chlazených ledem a 1 ml extraktu se odebral pro testování enzymatické aktivity. Zbývající filtrát se centrifugoval v centrifuze při nízké rychlosti 30g. Výsledný supernatant se použil pro testování. Pelet se resuspendoval v 10 ml média A a centrifugoval se za stejných podmínek, jak už bylo uvedeno. Pelet obsahující promyté amyloplasty se resuspendoval v 0,5 ml média A. Úplné lyže intaktních amyloplastů v každé frakci se dosáhlo mícháním na vortexu po dobu 30 vteřin, pak následovalo protažení hypodermickou jehlou. Extrakty za všech frakcí se centrifugovaly při 10 OOOg po dobu 10 minut a tak se odstranily pevné části.
Enzymatické testy amyloplastových přípravků
Po izolaci amyloplastů, jak se popisuje shora v textu, se ve všech frakcích testovala fosfoglukomutázová aktivita a • · • · amyloplastů a cytosolu. Markér aktivity v normálním případě kompartmenty rostlinné buňky, markerovými enzymy byly a glyceraldehyd-3EC 1.2.1.12) a v případě cytosolu závislou fruktóza-6-fosfát-l9.7.1.90) a alkoholdehydrogenázu markér enzymatické aktivity enzymatických aktivit byly asociované se specifickými V případě amyloplastů ADPglukózapyrofosforyláza fosfátdehydrogenáza (GAPDH; jde o na pyrofosfátu fosfotransferázu (PFP; EC (ADH; EC 1.1.1.1).
Aktivita ADPglukózapyrofosforylázy se testovala jako v surových embryonálních extraktech s tou výjimkou, že surový extrakt se v testované směsi nahradil vhodnou frakcí vzniklé při přípravě amyloplastů.
Modifikovaný test GAPDH aktivity pochází z publikace Wu and Racker , The Journal of Biological Chemistry 234, 10291035 (1958) a v lml obsahoval: 80 mM Mops (pH 7,4), 9 mM MgC12, 3 mM ATP, 0,25 mM NADPH, 5 mM 3-fosfoglycerovou kyselinu (3-PGA), 2,5 jednotek 3-fosfoglycerátkinázy a 10 až 50 μΐ vhodné frakce vzniklé během přípravy amyloplastů. Reakce se iniciovala 3-PGA a monitorovala se spektrofotometricky při vlnové délce 340 nm.
PFP se testoval modifikovaným způsobem pocházejícím z publikace Smith, Planta 166, 264-270 (1985). Test obsahoval v 1 ml: 70 mM Mops (pH 7,5), 1,5 mM MgC12, 10 mM fruktóza-6fosfát, 1,5 mM pyrofosforečnan sodný, 0,015 mM fruktóza-2,6bifosforečnan, 0,18 mM NADH, 10 jednotek triosefosfátizomerázy, 0,1 jednotek aldolázy, 1 jednotka glycerol-3-fosfátdehydrogenázy a 50 μΐ vhodné frakce vzniklé při přípravě amyloplastů. Reakce se iniciovala pyrofosforečnanem sodným a monitorovala se spektrofotometricky při vlnové délce 340 nm.
Test aktivity ADH obsahoval v 1 ml: 75 mM glycylglycin (pH
9,0), 100 mM etanol, 0,8 mM NAD a 10 až 50 μΐ vhodné frakce vzniklé při přípravě amyloplastů. Reakce se iniciovala • φ • φ ΦΦΦΦ » φ · · φ φ φ φ
ΦΦΦ φφ φ ΦΦΦΦ • ΦΦΦ ΦΦΦ φ φ φφφ ΦΦΦ φ φφφφφ φ φ
ΦΦΦΦ φφ φφ φφ φφ φφ etanolem a monitorovala se spektrofotometricky pří vlnové délce 340 nm.
Test fosfoglukomutázové aktivity se provedl, jako u surových embryonálních extraktů, s tou výjimkou, že surový extrakt v testované směsi se nahradil vhodnou frakcí, která vznikla při přípravě amyloplastů.
Podíly fosfoglukomutázové aktivity přisuzovatelné cytosolu a plastidům se vypočítala za použití následující rovnic:
P + C = T (1) kde P znamená plastidiální PGM aktivitu, C je PGM aktivita cytosolu a T je celkové PGM aktivita v embryonálním extraktu;
(Mc% x C) + (Mp% x P) = Pa kde Mc znamená markér aktivity cytosolu, Mp znamená markér aktivity plastidů a Pa je PGM aktivita testovaná v plastidových frakcích, které vznikly, jak se popisuje shora v textu, to je McC + MpP = 100Pa (2).
Jestliže za písmena Mc, Mp a Pa do rovnice dosadíme hodnoty získaná z testů a vyřešíme rovnice (1) a (2) dostaneme hodnoty P a C.
Škrobová gelová elektroforéza
Pufry pro gelovou elektroforézu škrobu se připravily podle popisu v publikaci Selander et al., Biochemical polymorphism and systematics in the genus Peromyscus. I. Variation in the old-field mouše (Peromyscus polionotus). University of Texas Publications 7103, 49-90, (1971). Elektrodovým pufrem byl borát litia pH 8,1 (0,03 M hydroxid litný, 0,19 M kyseliny ortoboritá). Gelový pufr zahrnuje 1 díl elektrodového pufru a dílů tris-citrátového pufru, pH 8,4 (0,05 M Tris, 0,008 M kyseliny citrónové). Extrakční pufr obsahuje 0,05 Tris-HCl, pH 8, 2 mM DTT.
Škrobové gely se připravily suspendováním 11,25 g bramborového škrobu (hydrolyzovaného pro účely elektroforézy; firma Sigma-Aldrich, Dorset, England) ve 150 ml gelového pufru. Suspenze se zahřála v nádobě s postraním ramenem o objemu 250 ml za stálého míchání dokud se směs nezačala vařit a stala se transparentní. V tomto okamžiku se nádoba neprodyšně uzavřela gumovou zátkou. Z gelu se aplikací vakua trubicí k bočnímu ramenu nádoby odstranily plyny. Gel se pak bezprostředně nalil do formy a překryl se a utěsnil se. Po ztuhnutí při teplotě místnosti se gel přes noc chladil při teplotě 4 °C.
Vzorky pro elektroforézu se připravily rozmělněním listů a embryí z rostlin divokého typu a rug3rug3 v minimálním množství extrakčního pufru tak, že vznikla koncentrovaná suspenze. Do extraktu se pak vložil proužek filtračního papíru (Whatman No. 182) a nechal se nasát asi po dobu 10 minut při teplotě 4 °C. Když byl knot zcela impregnován, vložil se do štěrbiny v gelu připravené ve vzdálenosti 2 cm od katodového okraje gelu.
Elektroforéza na Škrobovém gelu proběhla při napětí 300 V a teplotě 4 °C. Povrch gelu byl překryt polyetylénovou folií a v některých experimentech byl navíc chlazen, jak se popisuje v publikací Przybylska et al., Genetica Polonica 30, 120-138 (1989) tak, že na polyetylenovou blánu se umístil led. Po přibližně 30 minutách se vypnul proud a z gelu se odstranil knot z filtračního papíru. Elektroforéza pak pokračovala po dalších 6 hodin. Po uplynutí této doby se gel vyňal z elektroforetického přístroje a položil se na rovný povrch. Připravily se horizontální proužky gelu za použití kytarové struny o průměru 0,008''. Tento postup byla nezbytný, protože se musel odstranit horní povrch škrobového gelu, který tvořil • · • · kůži, která nevykazovala vlastnosti matrice, jako uprostřed gelu. Vnitřní pruhy gelu se položily na misku a jejich povrch se přelil barvícím roztokem.
Obarvení za účelem zjištění PGM aktivity se dosáhlo modifikovaným způsobem, jehož původní forma se popisuje v publikaci Thorpe et al., Proceduře for the detection isozymes of Rapeseed by starch gel electrophoresis. Department of crop science technical bulletin Agriculture Canada. (1987) . Barvivo obsahuje 50 ml 0,1 M Tris-histidinového pufru (pH 8,0; 0,1 M Tris titrovaný histidin-HCl do dosažení optimálního pH), 100 mg MgC12, 120 mg glukóza-l-fosforečnanu, 10 mg NADP, 20 mg thyazoylové modře (MTT) a stopové množství 8dimetylamino-2,3-benzofenoxazinu (modř Meldola) a 50 jednotek glukóza-6-fosfátdehydrogenázy (z Leuconostoc mesenteroides).
Škrobový gel se barvil ponořený v barvivu po dobu 60 minut při teplotě 37 °C ve tmě. Po tomto čase byly fialové pruhy znázorňující enzymatickou aktivitu dobře viditelné.
Analýza cukrů ve vyvíjejících se semenech
Za účelem analýzy obsahu cukru vyvíjejících se semen rug3rug3 a divokého typu se rostliny pěstovaly za řízených podmínek, jak se popisuje shora v textu. V těchto experimentech se použily semena rug3arug3a a jejich odpovídající izolinie divokého typu. Semena hrachu se sklízela tak, aby vzniklo 10 až 11 časových bodů v rozmezí mezi 15 a 45 dny po antezi. V každém uvedeném časovém bodě se sklidily dva lusky a z každého lusku se analyzovaly tři semena. V každém časovém bodě se zaznamenávaly hmotnosti čerstvých a suchých semen.
Obrázky č. 4 a 5 zobrazují data, která jsou reprezentována jako průměry každého časového bodu se standardními chybami pro dva zkoumané blízce izogenní páry. U mutantu rug3arug3a a u blízké izolinie divokého typu se podstatně neliší absolutní množství sacharózy v semenech do hodnoty 30 DAF. Po uplynutí • · · · · * • ··· · · · · · ··· ··« • · · · · · · ···· Μ ·· ·· ·· ·· tohoto časového úseku se objevují podstatné rozdíly v okamžiku, kdy mutantní semena akumulují sacharózu do hodnoty 45 DAF, zatímco semena divokého typu vykazují snížení obsahu sacharózy z hodnoty 30 DAF. Při 45 DAF hodnota u mutantních semen se snižuje na hodnotu, která se podstatně neliší od hodnoty u divokého typu. Podstatný rozdíl v obsahu sacharózy u mutantních semen rug3arug3a a odpovídajících blízce izogenních semen divokého typu se objevuje až po přibližně 35 DAF. Mutantní semena pokračují v akumulaci sacharózy až do 45 DAF, kdy se pozoroval pokles uvedené hodnoty. Zatímco u semen divokého typu se pokles objevil mezi 35 DAF a 40 DAF. Po dosažení 40 DAF se pozoroval neočekávaný vzrůst hodnoty obsahu sacharózy u semen divokého typu. Růstová křivka linie divokého typu byla neobvyklá okolo časového bodu 40 DAF, což může odrážet růstové problémy, které se objevily u těchto rostlin. Chyby spojené s hodnotami měření provedených na semenech uvedené linie v tomto experimentu jsou větší než ty spojované s jinými liniemi a pravděpodobně za ně také odpovídají růstové problémy.
Společný rys paternu akumulace sacharózy obou mutantních linií je rychlý pokles obsahu sacharózy na konci vývoje tak, že rozdíly v obsahu sacharózy mezi mutantními semeny a semeny divokého typu jsou méně podstatné. Křivky hmotností suchých a čerstvých semen zobrazené na obrázcích 4 a 5 (a a b) slouží k demonstraci skutečnosti, že semena všech zde zkoumaných linií nezačaly sesychat dříve než ve stádiu 45 DAF a je proto možné, že hodnoty obsahu sacharózy po tomto časovém úseku budou opět růst. Tato skutečnost opět povede k rozdílům obsahu sacharózy zralých semen divokého typu a rug3arug3a . Tyto hodnoty jsou 7 % u hmotnosti suchých mutantních semen a 3 % u semen divokého typu. Procentuální hodnoty rozdílů konečných hmotností suchých semen se nemohou vypočítat. Je však možné říct, že reflektují na zvýšené absolutní množství sacharózy v semenech rug3arug3a .
• · · ·· ··
Měření enzymatických specifických aktivit ve vyvíjejících se embryích
Mutanti hrachu r a rb ovlivňují enzymy při biosyntéze škrobu, jak je zobrazeno na obrázku č. 6. Výsledkem je následná redukce obsahu škrobu, což vede ke zvrásnění zralých semen. Přímá analogie těchto mutantů bude nejpravděpodobněji rug3 mutace, která také působí na aktivitu enzymů při syntéze škrobu. To však neznamená, že enzym nebo enzymy musí být ovlivněny přímo. Mutace může vést ke změnám regulačních mechanizmů syntézy škrobu. Dalším důkazem, že rug3 ovlivňuje enzymy biosyntézy škrobu, je existence mutantů jiných rostlin, které neobsahují škrob. V těchto případech je známo, že mutace ovlivňují aktivitu buď ADPglukózafosforylázy nebo plastidiální fosfoglukomutázy.
V extraktech mutantních embryí rug3 a jejich blízce izogenních ekvivalentů divokého typu se testovaly aktivity enzymů účastnících se při biosyntéze škrobu. Analyzovala se embrya z rostlin rug3rug3f které reprezentují extrémy alelických sérií, co se týče obsahu škrobu v dozrálých semenech. To jsou ta, která nesou alely rug3a a rugd*. Pro účely těchto měřené se sklízela embrya, jejichž hmotnost v čerstvém stavu odpovídala 200 až 300 mg. Tato hmotnost odpovídá stádiu vývoje, kdy se očekává, že se škrob syntetizuje vysokou rychlostí, a kdy enzymy účastnící se na syntéze škrobu jsou nejvíce aktivní (popisuje se v publikaci Smith et al., Plant Physiology 107, 673-678, 1989). Mezi nejdříve vybrané enzymy patří: UDPglukózapyrofosforyláza, fosfoglukomutáza (PGM; celková aktivita), fosfoglukomutáza (plastidiální izoforma; PGM(p), ADPglukózepyrofosforyláza a syntetáza škrobu. Uvedené enzymy se vybraly za účelem testování z následujících důvodů. Za prvé, jde o hlavní enzymy, které se účastní syntézy škrobu. Za druhé, katalytické reakce (pokud je známo) nemohou probíhat jinými cestami. Je • · známo, že aktivita některých z nich je ovlivněna u mutantů hrachu i v jiných rostlinách. Tyto enzymy se testují zavedenými metodami. Velkým opomenutím v těchto experimentech je měření translokátoru glukóza-6-fssforečnanu (G-6-P), který je odpovědný za přechod G-6-P z cytosolu do amyloplastů. Měření uvedené aktivity nelze přímou cestou a zvažovalo se, že bude provedeno později, jestli se potvrdí, že je to nutné. Navíc, vzhledem k tomu, že mutace zug3 odpovídají za absenci škrobu v listech a že substrát vhodný pro syntézu škrobu je schopný pravděpodobně vstupovat do chloroplastů listů odlišnými způsoby, protože chloroplasty nevykazují přítomnost G-6-P translokátoru, je nepravděpodobné , aby mutace primárně ovlivňovala uvedenou molekulu. Vzhledem k tomu, že mutace rug3 silně ovlivňuje syntézu škrobu, hlavním cílem zkoumání enzymatických specifických aktivit je identifikace aktivit, které se silně redukovaly a proto nohou odpovídat za fenotyp rostlin rug3rug3, který neobsahuje skoro žádný škrob.
Výsledky testů shora uvedených enzymů jsou zobrazeny v tabulce č. 3, která následuje dále v textu. Výsledky testů provedených s embryi divokého typu, které jsou blízce izogenní s každým z mutantních embryí rug3 jsou srovnatelné s výsledky uvedenými kdekoli jinde (například v publikacích Smith et al., Plant Physiology 89, 1279-1284, 1989; Foster and Smith, Planta 190, 17-24, 1993) . V případě syntetázy škrobu se provadlo pouze jedno měření, což je způsobeno podstatou měření a náklady radiometrického testu. Získaná počáteční data jasně naznačují přítomnost aktivity uvedeného enzymu v extraktech z mutantních embryí rug3 a proto nebylo nutné test opakovat. Rozdíly zjevné aktivity syntetázy škrobu u embryí divokého typu a u mutantních embryí může být způsoben tím, že embrya jsou v odlišných stádiích vývoje navzdory tomu, že vykazují podobné hmotnosti, jak se diskutuje dále v textu. V jiném případě mohou reflektovat na reálné odlišnosti, které jsou pravděpodobně způsobeny zesílením produkce enzymu v embryích rug3, což je výsledkem změn během syntézy.
·· ····
Tabulka č. 3
Výsledky testů enzymatických aktivit v surových extraktech a v plastidových přípravcích získaných z 200 až 300 mg embryí. Jednotky enzymatické aktivity jsou pmol'1 min-1 g'1 hmotnosti v čerstvém stavu. Výjimku tvoří aktivita plastidiální PGM, která se vypočítala jako procento celkové aktivity PGM. Obrázky jsou průměry pěti testů oddělených extraktů + standardní chyba. Označení ND znamená, že se nestanovila žádná aktivita.
• · · · · · ···· • · · · · · ···· • ··· · · · · · ··· ··· • ·
| c to Q> c to a> | •M c O to >3 c to | Genotyp embryí • • |
| 3, 55 ± 0, 13 | tn > to VO 1+ o >» tn ΟΊ | G O 13 Q 13 13 |
| VO to 1+ t—* oo to | VO -X Cn H- o co co | O O I_u ?r o < 13 |
| ss o | t-* h-> σ cJP 1+ o co | Plastidiální PGM |
| J—1 1-‘ Cn 1+ O X ω | o > σ VO 1+ o X o -J | > σ 13 vQ l·—1 ť O' N (D 13 13 |
| o oo σι | o *x ID | Syntetáza škrobu |
Tabulka č.
·· ···*
V extraktech z embryí rug3rug3 pouze jeden z testovaných enzymů byl silně redukován. Byla to plastidiální izoforma fosfoglukomutázy. Plastidiální izoformě uvedeného enzymu z embryí rug3rug3 nepřísluší žádná aktivita dokonce ani v případě, že se prokázala podstatná celková PGM aktivita. Způsob, kterým se odhadovala aktivita plastidiální izoformy uvedeného enzymu, zahrnuje izolaci plastidů a měření množství markerových enzymů v případě plastidů (ADPglukózapyrofosforyláza) a cytosolické frakce (PFP nebo ADH), jak se popisuje shora v textu. Uvedené enzymy spolu s PGM se testovaly ve všech frakcích získaných při izolaci, to znamená frakce plastidů, celkový extrakt a zbytek po odstraněné neporušených plastidů. Přítomnost plastidového markéru ve frakci plastidů spojená s absencí cytosolického markéru indikuje, že se získaly čisté plastidy. Získání plastidiálního markerového enzymu a aktuální množství kontaminujícího cytosolického markéru se může použít pro odhad výtěžku a čistoty plastidů. Testy PGM se provedly pouze u extraktů, kde se podstatná část plastidiálního markerového enzymu získala ve frakci plastidů a proto výtěžek plastidů byl vysoký. Výsledkem používání mechanických sil během postupu extrakce je poškození velkého počtu plastidů, ale z frakce plastidů se může běžně získat 10 % plastidiální markerové aktivity. Tato hodnota odpovídá hodnotě uvedené v publikaci Foster and Smith, Planta 190, 17-24 (1993), kde se odhaduje, že část PGM aktivity, která náleží plastidům embryí hrachu, je přibližně 20 %. Graf zobrazený na obrázku č. 7 ukazuje způsob, kterým se odhadla aktivita PGM(p) a skutečný zisk a výsledky testů jednoho páru experimentů, které se uskutečnily současně. Úplnější výsledky rozsáhlejších testů jsou uvedeny v tabulce č. 4.
Tabulka č. 4 ·· · · · ·
9 ·*·· ·« 9 • · · 9 9 9 9 9 9 • ·*· 9 · · · · 999 • 9 9 9 9 9 9
Enzymatické specifické aktivity měřené v^*· fVakcíčh,*· ktere vznikly při přípravě plastidů. Jednotky enzymatické aktivity jsou μπιοί“1 min“1 g“1 hmotnosti v čerstvém stavu nebo procenta ± standardní chyby pro dvě nazávislé izolace. * označuje procenta aktivity, kterou vykazují plastidy v případě cytosolických a plastidiálních markerových enzymů. t označuje aktivity fosfoglukomutázy v plastidech, která se vypočítala způsobem popsaným shora v textu.
»444 • 4 • · · 4 4 4 • 4 4 4 4 • 44444 4
| 3 p rt P 3 rt | Divoký typ | fosfoglukomutáza | 3 c rt Ρ 3 rt | Divoký typ | | Na pyrofosforečnanu závislá fruktóza-6-fosfát-l-fosfotransferáza j | 3 ρ rt P 3 rt | •er H- < O zr rt | 1. ADP glukózapyrofosforyláza j | ,Ťyp rostliny I 4 » ___I |
| ~4 ·>» (p ω tO 1+ o cn | ct cn to cn 1+ tú <1 | A A A 1+ O O to | o •s 1-1 A 1+ O co tú A | o cn -o co 1+ o o tú to | o I-4 co A 1+ O o A 03 | P Q řv CD rt H A zr < O H· < rt pi' P> | |||
| -j ω tú tú 1+ o > -4 | σ> ω -j (P 1+ tú > ΟΛ | o to co 00 1+ o o A co | O tú OO 1+ o co cp co | o A co A 1+ O o ω co | O -s t—1 <1 o H“ o «* o <P 00 | P < > rt zr ρ ω rt 0 H· P < CD HP rt P P P rt P | |||
| 0, 007±0, 001 | o X O Cp ω 1+ o > o I-1 -J | o o o tú 1+ o o o l·-* | o o o o Ό 1+ o | A o o CP <P 1+ o o o CP | CP o ·«» o A tú 1+ o o o o | P- <5 > zr P rt A HP < 0) A rt rt A (D Cl CD 0 | |||
| to -j tú t+ O *» tú | <1 tú 1+ ω A > tú | 00 <o <1 1+ ω | A O O Cn CP !+ co to | co ω M i+ H1 <% | to ω Ή σι 1+ σ> 00 | P < ctp rt P Ρ ω zf P rt P A CD < P A P rt P >< rt P | |||
| O O to 1+ o X o M | O 00 4* H- O | o tú 1+ o A | o >s A tú H~ o o σ\ | t—1 μ-i ΓΟ 1+ l·-1 to | A ο 1+ A (Ρ | or < op P 1—1 P v * Cň α rt ρ. A << SX A CD a O | |||
| to -J ω 1+ o ·> o t-J | VD CO *n o 1+ A > ω & | co to > to 1+ co > co | a o o >· -J !+ co co | kO >£» í+ > -J | A Ο Ο > σ\ 1+ (Ρ χ C0 | OP A N 0 A P O CD | |||
| 1 o •N OO 1+ o ·> Cn t-* | Η» O ·* σ> 1+ A ο Η—4 | Η4 O o * o * | o * | I-—1 o o * | |_i ο ο * | A 0 áP CL P P A O p; P < ZT W H' rt rt CL a A P <J CL t-J- p. Ρ P r 3 O t< |
· • 4
4 ·«· » 4
II»
Tabulka č.
·· ···· ·· ·» • · · · · · < • 9 · · · · • ··· » · · « • · · · · « ··>· ·· ·· «· ·· ·· • · · · • · · · • ··· ··· • · ·· ··
Opakovaná měření plastiaiální PGM nevykazují žádnou aktivitu enzymu v embryích rugJ2rugJ5. Navíc za použití uvedené metody se nemohla detekovat žádná aktivita v embryích rostlin rug3arug3af navzdory akumulaci malého množství škrobu v semenech uvedeného mutantu. To pravděpodobně naznačuje, že test nebyl dostatečně citlivý při detekcí malého množství aktivity PGM(p), kterou mohou vykazovat embrya rug3arug3a.
Enzymatické aktivity všech testovaných enzymů, které se účastní biosyntézy škrobu s výjimkou PGM(p) vykazují malé odlišnosti mezi embryi divokého typu a rug3arug33. Omezený počet opakování určuje, že s výjimkou aktivity PGM(p) tyto diference nejsou podstatné s 95 % limity významnosti (v případě UDPGPP, t=3,0, P>0,05; v případě ADPGPP, T=l,47, P>0,2; v případě celkového PGM t=0,26, P>0,5). Je nutné také brát v úvahu, že mají-li semena rug3arug3a být skoro bez škrobu, musí se během syntézy škrobu v tkáních dramaticky redukovat určitá enzymatická aktivita a to se stalo pouze v případě PGM(p) . Mutanti v lokusu rb vykazují ve 200 až 300 mg embryí desetinásobný pokles aktivity ADPglukózapyrofosforylázy vzhledem k divokému typu a navzdory tomuto zjištění zralá semena rbrb obsahují 32% škrobu. Jak se uvedlo při zmínce jediného měření v případě syntetázy škrobu, za rozdíly ve zde měřených enzymatických aktivitách může odpovídat skutečnost, že růst embryí rug3arug3a a embryí divokého typu se od sebe liší. Navzdory přibližně stejné hmotnosti v čerstvém stavu zvýšené zadržování vody v mutantu znamená, že embrya divokého typu nebo mutantní embrya jsou v různé fázi vývoje. Dále se ukázalo, že embryo rug3rug3 pravděpodobně vykazuje nižší hmotnost ve vysušeném stavu při dané hmotnosti v čerstvém stavu než embryo divokého typu. Když se provedly tyto experimenty růstová data spojená s hmotností v čerstvém a suchém stavu nebyla dostupná v případě rostlin rug3rug3 a proto se pro odhad rovnosti stádií vývoje mezi rostlinami divokého typu a mutanty použily stejné hmotnosti v čerstvém stavu. Je možné, že existují reálné rozdíly” v áktivvtách některých důležitých enzymů, které se podílí na syntéze škrobu. Prostřednictvím regulace jejich aktivity se může řídit koncentrace substrátu u mutantních embryí. Jeden takový kandidát tohoto typu regulace je ADPglukózapyrofosforyláza, která ve zde uvedených experimentech soustavně vykazuje vyšší aktivity v extraktech z mutantních embryí ve srovnání s embryi divokého typu. Substrát tohoto enzymu (G-l-P) není prakticky přítomen u plastidů rug3rug3, které nevykazují aktivitu PGM(p) a to pravděpodobně vede k zesílení aktivity enzymu.
Tyto experimenty naznačují, že aktivita plastidiální PGM byla v embryích rug3.rug3 silně redukována. Nepřímý způsob, kterým se tento enzym testuje, to znamená, že zahrnuje také výpočet části aktivity, jenž náleží plastidům, navozuje potřebu důkazu z jiných linií, který podpoří počáteční zjištění.
Škrobová gelová elektroforéza
Škrobová gelová elektroforéza se použila k separaci izoforem fosfoglukomutázy (a řady jiných enzymů) z hrachu za účelem mapování genů (isozymu) (Weeden, The Journal of Heredity 75, 365-370, 1984 a 78, 153-159, 1987). Metoda separace enzymů na základě náboje a velikosti může vykázat elektroforetické odlišnosti stejného enzymu u odlišných linií rostlin. Došlo ke křížení mezi rostlinami hrachu, které vykazují u určitých enzymů odlišnosti této podstaty a u populace F2 se testoval se analyzovaly isozymové paterny, které korespondují buď s paternem jednoho z rodičů nebo s kombinací obou rodičovských paternů v případě heterozygota. Vizualizace enzymů na gelu se provedla způsobem spřažené reakce, která probíhá v gelu a výsledkem je obarvený produkt. Obrázek č. 8C ukazuje zahrnutou reakci. Extenzivní použití této metody u hrachu znamená, že informace je dostupná extrakty se pro To není s ohledem na migraci izoforem PGM v tomto gelu ‘przybylska et al., Genetica Polonica 30, 120-138 (1989).
Z praktických důvodů, aby se získaly s dostatečnou koncentrací enzymatické aktivity, přípravu vzorků pro elektroforézu použily listy, problém, protože je známo, že mutace rug3 ovlivňuje listy. U hrachu se zjistila přítomnost pouze dvou loků, které kódují izoformy fosfoglukomutázy (jeden cytosolický a jeden plastidiální) (Weeder and Marx, The Journal of Heredity 75, 365-370, 1984; Weeden et al., The Journal of Heredity 75, 411412, 1984; a Przybylska et al, Genetica Polonica 30, 120-138 (1989)). Způsoby škrobové gelové elektroforézy přinášejí několik praktických problémů. Protože elektroforetický přístroj nebyl dostupný, nejdříve byl způsob za účelem mapování genů nahrazen izoelektrickou fokuzací za použití akrylamidových gelů. Přístroj navržený pro elektroforézu nukleových kyselin v agarózových gelech se modifikoval pro tyto účely. Vznikly také problémy s barvením gelů. Z počátku na gelech obarvených způsobem popsaným v publikaci Thorpe et al., Proceduře for the detection isozymes of Rapeseed by starch gel electrophoresis. Department of crop science technical bulletin Agriculture Canada. (1987) nebylo vidět žádné pruhy naznačující enzymatickou aktivitu. Proto se použila metoda podle N.F. Weeden. V publikaci Przybylska et al., Genetica Polonica 30, 120-133 (1989) se popisuje, že migrace do vzdálenosti 10 cm je nezbytná, aby se separovaly izoformy PGM hrachu v 6 % gelu. To se také vzalo na vědomí během pozdějších experimentů.
Obrázek č. 8 ukazuje výsledky zymogramu, kde se nanesly extrakty z listů rug3°rug3b a z relevantní izolinie divokého typu. Výsledek potvrdil absenci jedné izoformy PGM v extraktu rug3rug3. Výsledky uvedené v publikaci Przybylska et al., Genetica Polonica 30, 120-138 (1989) popisují použití stejného systému pufrů, jako se používají v uvedených experimentech • · • φ φ·· ·· · φ · · · φ φφφ φφφ φ · φφφ φφφ φ φφφφφ φ φ φφφφ φφ φφ φφ φφ φφ (borát litný/triscitrát) . Udává se, že více anodální izoforma PGM v hrachu je plastidiální forma, to znamená, že tato forma bude za těchto podmínek migrovat dále směrem k anodě. Zymogram na obrázku č. 8 ukazuje, že v extraktu rug3rug3 není přítomna anodální forma. Za účelem demonstrace, že anodální pruh souvisí s PGM aktivitou v plastidech, se provedl pokus.
Způsob, který se použil pro měření specifických aktivit u plastidů, se použil ve větším měřítku, aby se z plastidů z embryí divokého typu izolovalo podstatně větší množství extraktu, který se pak nanesl na škrobový gel. Zymogram zobrazený na obrázku č. 8 A je výsledkem uvedeného experimentu. Je možné vidět, že anodální pruh ve stejné stopě kam se nanesl vzorek izolovaných plastidů vzhledem ke katodálnímu zesílil. Rozmazán byl však více anodální pruh ve srovnání s plastidiálním pruhem PGM. To mohl způsobit škrob v extraktu plastidů, který interferuje s matricí gelu, nebo pravděpodobně komponenty izolačního média amyloplastů, které ovlivňují migraci.
Výsledky experimentů na škrobovém gelu spolu s měřením enzymatických aktivit potvrzuje, že u rostlin rug3rug3 je aktivita enzymu plastidiální fosfoglukomutázy redukována na množství, které není detekovatelné uvedenými způsoby. Při použití listů z rostlin rug3arug3a jako počátečního materiálu pro škrobovou elektroforézu, nebyla po obarvení patrná žádná aktivita plastidiální izoformy PGM. V tkáni musí být přítomno malé množství aktivity PGM(p), které odpovídá za syntézu malého množství škrobu u embryí rug3arug3a. Je však pravděpodobné, že tato zbytková aktivita byla velmi slabá, protože embrya divokého typu na konci svého vývoje akumulovala přibližně 20 % škrobu. Aktivita PGM(p) u těchto embryí může být malá, a zde používané způsoby nejsou dostatečně citlivé, aby se mohla detekovat. Je nutné také poznamenat, že aktivita PGM je pravděpodobně menší ve tkáni listů než u embryí, které rychle syntetizují škrob.
• · • · · · • · · · · · · ···· • · · ·· · · · · · • · · · · · · · · · · · · ·« • · · · · · · · • · · · ·· · · ·· ·· · ·
Šlechtitelský program
Mutantní SIM linie rug3 používané při shora popisovaných experimentech jsou vhodná pro experimentální práci, nejsou však vhodná pro komerční použití. Na základě šlechtitelského programu proto vznikly rostliny hrachu s mutací rug3, které mají agronomicky přijatelný charakter. Detaily jsou následuj ící:
1. První křížení proběhlo v roce 1993 mezi pěti SIM liniemi rug3rug3 a mezi dvěmi normálními odrůdami (Rug3Rug3 nebo ++); Harrier registrované šlechtitelské odrůdy Unilever a běžné odrůdy Novella.
2. Křížení proběhlo jako z poloviny dialelické (to znamená, že každá ze SIM linií s každou z uvedených dvou odrůd, aniž se bral zřetel, která z odrůd se použila jako samičí a samčí).
3. Ze zkřížených rostlin se sklidila semena (Fl) a rostliny Fl se pěstovaly ve skleníku bez přístupu hmyzu. Rostliny se nechaly samooplodnit a během roku 1993 se sebraly semena F2.
4. Semena se rozdělila na vrásčitá (rug3rug3—, —rr nebo rug3rug3rr) (přičemž — indikuje buď dominantu divokého typu nebo heterozygota) nebo kulatá (obsahující alespoň jednu dominantní kopii Rug3 a R). Zvrásněná semena se zasela na pole na jaře 1994, jako podpora sloužily dráty a provedl se standardní výběr rostlin F2 podle původu.
5. Během srpna 1994 se odebralo z každé uvedené rostliny pět semen F3. Uvedené rostliny mají přijatelný agronomický charakter, jak se uvádí shora v textu.
6. U semen F3 se určil obsah škrobu. To se provedlo rozmělněním malého množství prášku z dělohy každého semene a přidal se roztok jódu. Tímto způsobem se vyřadily linie rrRug3Rug3 obsahující škrob a vrásčitá • · · · • · * * · ·*»·» * semena. Testy se však neprovedly přečísne·· a aosi© pravděpodobně k chybám při rozdělení do kategorií. Putativní linie ruq3ruq3 se rozdělily do čtyř velmi přibližných skupin (podle obsahu škrobu <1, <5, <10 a 10 + % škrobu) podle porovnání intenzity barvy se SIM standardy.
7. Zbývajících 765 semen F3, všechny byly pravděpodobně genotypu rug3rug3 a potenciálně agronomicky přijatelné, se vyselo do skleníku bez přístupu hmyzu v říjnu 1994.
8. Když dozrály, z každé rostliny F3 se odebraly čtyři semena F4 a zasely se do velkého květníku do skleníku.
9. Když dozrály (květen 1995) z každého květináče se sklidil maximální počet semen (až 100 semen) a zasely se na pole na záhon o velikosti jednoho metru čtvereční jako semena F5.
10. Standardní způsob stanovení zralosti pomocí tenderometru není možno aplikovat v měřítku malého pole. Data se proto získala na základě zkušeností pěstitele, který pohledem a pohmatem stanovil plnost lusku. Za účelem analýzy cukru se odebralo malé množství vzorků. Vzorky se zamrazily při teplotě -18 °C a obsah cukru se analyzoval modifikovaným způsobem stanovení hexakináza/glukóza-6-fosfátdehydrogenázy hexózy. Detaily jsou uvedeny dále v textu.
11. Na základě těchto testů a agronomického zhodnocení se pro další vývoj vybralo 45 linií. Tyto linie splňovaly podmínky rozmezí zvýšené úrovně sladkosti. Suchá semena těchto linií se sklízela v srpnu 1995.
12. Padesát semen každé vybrané linie se pěstovalo na Novém Zélandu.
13. V březnu 1996 se pomnožená semena (F7, ale směs linií odvozených od F4) vrátila zpět do Anglie. Přidal se k nim zbytek semen F6 ze záhonů z roku 1995 a vysely • · · · • · · · · · • · ·· ·· se na dva záhony o velikosti 6,75 metrů '•čtwrečrríčfi·.· Jeden záhon se sklízel v červenci 1996 za účelem mrazení. Ostatní semena se nechala seschnout a pak se sklidila. Tato semena se použila pro pokusy ve větším měřítku.
U jednotlivých linií se při sklizni ve fázi popínání a po seschnutí testoval obsah cukru a škrobu (za použití metod uvedených dále v textu). V některých případech se sklizeň ve fázi popínání provedla ve dvou stádiích zralosti. Analýza obsahu škrobu u suchých semen dala nej širší rozmezí hodnot a jasně odděluje linie s a bez homozygot rug3.
Obrázek č. 9 jasně ukazuje, že v odrůdách hrachu ++ nebo Rug3Rug3 se množství cukru snižuje se vzrůstajícími hodnotami naměřenými tenderometrem, zatímco u linií rug3 pokles obsahu cukru je daleko pomalejší a udržuje se vysoká hladina cukru dokonce i u vysokých hodnot tenderometrického měření.
Tyto výsledky se mohou také demonstrovat změnami v poměru obsahu sacharózy a obsahu škrobu po dozrání. Výsledky jsou uvedeny dále v textu v tabulce č. 5.
Je zřejmé, že u odrůd hrachu ++ nebo Rug3Rug3 poměr obsahu sacharózy a obsahu škrobu se se stádiem zralosti snižuje daleko rychleji, než je tomu u linií příbuzných rug3. Uvedený poměr je v případě odrůdy hrachu -H- při sklizni ve stádiu popínání v typickém případu nižší než je tomu u mutantních linií získaných podle vynálezu. Tyto rozdíly se stávají daleko významnější u semen sklizených v suchém stádiu zralosti. V případě sklizně v suchém stádiu poměr obsahu sacharózy a škrobu u linií rug3 zůstává ve všech případech vyšší než 0,6, zatímco u kontrolních odrůd nejvyšší zaznamenaný poměr je pouze 0,26.
Uvedené výsledky naznačují, že linie rug3 ve srovnání s běžnými odrůdami pravděpodobně vykazují zvýšenou sladkost v případě daného obsahu cukru u všech stádiích zralosti při • φ
sklizni ve fázi popínání a zvláště pak ve fázi zralosti seschlých semen. Čímž se prodlouží perioda, během které je hrách schopný popínání, což přináší důležité komerční výhody.
Analýza obsahu škrobu v semenech při sklizni ve stádiu seschlých semen je vhodný způsob identifikace těch linií, které vykazují charakter rug3, což umožní vznik rostlin produkující hrách, který vykazuje vysoký obsah sacharózy v období popínání.
lo >υ
Tabulka
| • • • · · | • · · · • » ·· | Β · • · • · | • • · • · | |||||||||||||
| Ν | ||||||||||||||||
| Ό | ||||||||||||||||
| Μ | 2 | |||||||||||||||
| Μ Φ | Λ | γ- | ||||||||||||||
| >Φ Λ | 0 | ST | sr | Lb | r-H | sr | sr | c~H | ||||||||
| β ο | .· | Μ | ΟΜ | CM | σ | kO | o | o | CM | CM | ||||||
| Ο (0 | λ; | *» | X. | x. | *. | «X | X | χ | ||||||||
| σ φ | >1 | >φ | ο | ο | t— | O | CM | CM | O | CM | ||||||
| ιο | ||||||||||||||||
| σι | Ν | |||||||||||||||
| σ | Ό | |||||||||||||||
| τ—1 | Μ | |||||||||||||||
| Φ | ||||||||||||||||
| Ή | Λ | Ub | ||||||||||||||
| -Ρ | υ | CO | C0 | CM | r- | r-~ | I> | a | ||||||||
| 2 | <ΰ | X. | X» | X. | X | X | ||||||||||
| Ρ | θ\° Φ | >1 | Lb | Lb | LO | CM | lb | Lb | sr | ιΌ | ||||||
| υ | ||||||||||||||||
| Φ | ||||||||||||||||
| 0) | 2 | |||||||||||||||
| φ | Λ | |||||||||||||||
| Ο | Lb | |||||||||||||||
| φ | Μ | Lb | Lb | sr | ||||||||||||
| Ν | Λί | «Μ | X | LO | sr | co | CO | * | ||||||||
| '(0 | >Φ | CM | CM | X. | *» | X. | X | o | ** | |||||||
| tu | ο\ο | CM | CM | sr | sr | CM | CM | CM | CM | |||||||
| • · >1 | ||||||||||||||||
| Ν | ||||||||||||||||
| '0 | ||||||||||||||||
| 2 | ||||||||||||||||
| Μ Φ | Ό | i— | ||||||||||||||
| >φ λ | Ο | 1-ί | sr | σ | rH | Lb | i— | t- | Γ' | |||||||
| β 0 | 2 | a | Lb | lb | o | CM | o | O | χ | |||||||
| Ο Φ | Χ | κ. | X. | X. | X | «X | X | X | LO | |||||||
| a φ | >ω | ΐ—1 | o | Lb | σ | r- | σ | rH | 00 | |||||||
| Ν | ||||||||||||||||
| Ό | ||||||||||||||||
| ΙΟ | 2 | |||||||||||||||
| σ | Φ | |||||||||||||||
| σ | & | |||||||||||||||
| τ—1 | υ φ φ | |||||||||||||||
| Ή | τ—1 | oo | r- | oo | CO | a | LO | CM | ||||||||
| α | Μ. | X» | *» | x | X | X | X | X | ||||||||
| '<ΰ £ | tíP | LO | a | LO | kD | Lb | k£> | sr | Γ- | |||||||
| Ή | ||||||||||||||||
| a | 2 | |||||||||||||||
| ο | Ρ | |||||||||||||||
| a | Ο | |||||||||||||||
| Μ | ||||||||||||||||
| φ | ,Χ | CM | ||||||||||||||
| Ν | >Φ | σ | l— | CM | Γ | CO | r- | co | ||||||||
| OJ | X» | x. | X | X | X | X | X | |||||||||
| pLI | ο\° | ΓΩ | ιο | r—1 | o | o | o | sr | ο | |||||||
| lb | a | a | a | a | ||||||||||||
| a | a | a | a | a | a | |||||||||||
| >1 | 3 | 3 | 3 | 3 | 3 | |||||||||||
| -Ρ | ím | L | 2 | |||||||||||||
| 0 | a | a | a | a | a | |||||||||||
| Ρ | a | a | Ói | ó | a | |||||||||||
| φ | Μ | M | 3 | 3 | 3 | 3 | p | 3 | ||||||||
| a | 2 | L | L | L | 4 | ÍH | 4 | |||||||||
| (—ι | O | o | t—1 | sr | i-i | |||||||||||
| os | 00 | r—l | CM | r—l | sr | r* | O | |||||||||
| Η | τ—Η | t—1 | r-1 | i—l | t—1 | i—1 | σ | t—1 | ||||||||
| X | X | X | X | X | X | |||||||||||
| Ή | φ | M | L | L | 2 | 2 | ||||||||||
| 2 | ι—Η | Φ | Φ | Φ | Φ | Φ | ||||||||||
| Φ | ι—1 | ι—1 | H | Ή | •H | •rl Γ—1 | •H | 1—i | ||||||||
| >Μ | φ | sr | L | r—1 | L | rd | L | rH | M TJ1 | 2 | sr | |||||
| Ή | > | β | n | β | β | 2 | β | Μ β | 2 | f± f-4 | ||||||
| >Μ | 0 | •Η | Φ | •H | Φ | Ή | Φ | •H | ctí Ή | Φ | •H | |||||
| Λ4 | £ | φ | ffi | Φ | K | φ | K | Φ | φ | ffi | w | |||||
| ω | a | ω | ω | a | ||||||||||||
| Γ0 | Cb | o | sr | ιο | LO | a | Lb | |||||||||
| Ό | Γ | r- | σ | σ | σ | σ | r—l | x—! | ||||||||
| Ό | ο | o | o | o | o | o | τ—1 | r-H | ||||||||
| τ—1 | Γ—i | rH | í—1 | —1 | i—1 | ΐ—1 | τ—1 |
·· ·· • · «· · · 9·
| ο | <Ό | ||
| LO | CM | ||
| κ. | X. | ||
| CM | ο | ||
| 00 | Γ- | ||
| κ | κ | ||
| cd | |||
| L0 | κ | ||
| χ | 00 | ||
| ΟΙ | ί— | ||
| CO | |||
| ϊ—1 | (Μ | ||
| *k | Γ- | ||
| co | S. | ||
| γ—1 | 1— | ||
| η | ΙΓ> | ||
| V | κ | ||
| Γ- | L0 | ||
| CM | |||
| *» | |||
| ο | 00 | ||
| <n | |||
| ό | |||
| 3 | |||
| Η | |||
| to | |||
| σι | |||
| 3 | Η | ||
| Η | Η | ||
| cd | σ-, | ||
| 1-1 | Ο | ||
| τ-4 | »—1 | ||
| X | X | ||
| Μ | |||
| 0) | Q) | ||
| Ή | ϊ—I | Ή | ί—1 |
| Μ | Μ | ||
| Μ | β | β | |
| <0 | Ή | Γθ | Ή |
| m | W | ω | |
| CD | σι | ||
| r-j | <—} | ||
| rH | τΗ | ||
| γΗ | τ—1 |
Analýza obsahu cukru u hrachu
1) Úvod
Kvalita zmrazeného hrášku se definuje měkkostí a sladkostí. Obě tyto vlastnosti jsou silně ovlivněný stádiem zralosti. Tenderometr se běžně používá při stanovení zralosti hrachu a tedy jeho vhodnosti pro sklizeň. Obsah pevných částic nerozpustných v alkoholu (AIS) (měřený buď přímo nebo infračervenou reflektancí (NIR) se používá k odhadu měkkosti v laboratorním měřítku.
Zde popsaný způsob je přímá přesná metoda měření skutečného obsahu cukru v hrachu. V praxi je užitečné měřit obsah sacharózy v případě, že je dominantním cukrem a je primárně odpovědná za sladkost hrachu.
2) Přístrojové vybavení a činidla
2.a) Přístrojové vybavení
Váhy
Kinematica Microtron nebo podobný homogenizátor
Topná deska
Volumetrické nádoby (250 ml)
Spektrofotometr (UV/viditelné, použitá vlnová délka 340 nm) Jednocentimetrové UV kyvety na jedno použití (naplní se maximálně 3 ml)
Automatické pipety
Mikrocentrifuga a zkumavky do mikrocentrifugy
2.b) Reagenční činidla
Katalogové číslo
Trietanolaminhydrochlorid Boehringer 127 426 (C6H15NO3 . HCl)
Hydroxid sodný (NaOH), 5M a 2M
Síran hořečnatý (MgSO4 . 7H?O) • · · · · · • ····· · *
Boehringer 128 (738.......
Sigma A-2383
Boehringer
Boehringer 104 914
NADP-Na2
Hydrogenuhličat sodný (CHO2Na)
ATP-Na2H2
Hexakináza/glukóza-6fosforečnan DH
Kyselina citrónová (C4H807 )
Fruktozidáza
Příprava roztoků
2.b.l) 2M a 5M hydroxid sodný
8,0 g hydroxidu sodného se rozpustí ve vodě a doplní se na objem 100 ml, přičemž vzniká 2 M roztok. 20,0 g hydroxidu sodného se rozpustí ve vodě a doplní se na objem 100 ml, vznikne 5M roztok. Před doplněním na konečný objem je nutno roztok ochladit.
2.b.2) Citrátový pufr (0,32 M; pH 4,6):
Rozpustíme 6,9 g kyseliny citrónové a 9,1 g trisodiumcitrátu přibližně ve 150 ml vody. Hodnota pH se upraví na 4,6 pomocí 2 M hydroxidu sodného (2.b.l) a objem se doplní vodou na 200 ml.
2.b.3) Fruktozidáza:
mg fruktozidázy se rozpustí ve 2 ml citrátového pufru (2.b.2). Tento roztok je v lednici stabilní alespoň po dobu jednoho týdne.
2.b.4) Trietanolaminový pufr (0,75 M, pH 7,6):
14, 0 g trieatanolaminchloridu a 0,25 g síranu horečnatého se rozpustí v v přibližně 80 ml vody. Hodnota pH se upraví na
7,6 pomocí 5M hydroxidu sodného (2.b.l) a roztok se doplní • · · ·
• · · • · · · vodou na objem 100 ml alespoň po dobu 4 týdnů.
Tento pufr je v lednici stabilní
2.b.5) NADP:
mg NADP se rozpustí v 6 ml vody. Tento roztok je v lednici stabilní alespoň po dobu 4 týdnů.
2.b.6) ATP:
300 mg ATP a 300 mg hydrogenuhličitanu sodného se rozpustí v 6 ml vody. Tento roztok je v lednici stabilní alespoň po dobu čtyř týdnů.
2.b.7) hexokináza/glukóza-6-fosfátdehydrogenáza (HK/G6PDH):
Používá se neředěná suspenze získaná od firmy Boehringer (katalogové číslo 127 825).
Standardy
Není nutné použít standardy, protože koncentrace se vypočítá z absorpčních koeficientů (jak se popisuje v sekci 6) .
5) Metody
5.a) Extrakce
Zapne se varná plotna. 25 g čerstvého nebo mrazeného hrášku a umístí se do velké nádoby homogenizéru. Přidá se 150 ml vody a homogenizuje se po dobu 60 vteřin při 3/4 rychlosti (Kinematica Microtron). Homogenát se přelije do kádinky o objemu 250 ml, nádoba homogenizéru se několikrát vypláchne a promývací roztok po promytí se přidá k homogenátu. Za účelem deaktivace všech enzymů, extrakce cukrů a koagulace proteinů se homogenát povaří. Homogenát se ochladí ve dřezu z vodou a přelije se do nádoby o objemu 250 ml. Nádoba se vypláchne a ·· ··· roztok po vypláchnutí se přidá do odměrné nádoby. Nádoba se doplní na požadovaný objem.
V odměrné nádobě se nechá sediment usadit po dobu 30 minut a odebere se část supernatantu. Supernatantem se naplní centrifugační zkumavka(y) a proběhne centrifugace při 10 000 rpm po dobu 5 minut. Za účelem stanovení obsahu sacharózy je třeba další ředění. Odeberou se 2 ml nebo 5 ml centrifugovaného supernatantu a doplní se na objem 10 ml nebo 25 ml vodou.
5.b) Stanovení obsahu sacharózy
Zapne se spektrofotometr a nastaví se vlnová délka na 340 nm a zapnou se obě lampy deuteriová a s viditelným světlem.
Roztoky popsané v tabulce č. 6 se pipetou nanesou do UV kyvet na jedno použití a měří se OD proti vodě.
Roztok vzorku nesmí obsahovat v kyvetě více jak 150 ug sacahrózy. Jestliže obsahuje větší množství sacaharózy je nutné ho naředit.
·· ··· · ·· o
φ η-1 řr o
<
o tr l_l.
Φ tO [O >
JO to tfc» cn
HΦ
P <
N
O tr
Φ
ΪΤ σ
φ<
σ *<
rt cn rt tu tr
Hb
H'
Hb e
ΓΙΟ <
·<
o tr
CL ><
N<
cn
Φ rt
Φ >T tu
H*
Φ
O tr tu
N<
tr o
Φ
Φ řr
O
Φ φ<
ir<
H' fU σ
cn
O ir σ
tu ít
O
Φ ft
Φ
N
Φ cn rifu <
>
to
CL
O σ
<
Φ cn
Φ<
cn
Hcn
Φ ft
Φ
O tr fU'
CL
O σ
φ<
tr ít o
tt rt ir φ
tu tr o
φ
Ό
O řr cr ÍU o< tr ct
O. LJ. < Φ tr o
cl o
rt *<
φ<
ir<
φ ít
H' cn
O ft tr o
ít cn rifu tt rt tJ
H' cn
Φ φ<
ir<
φ ft
H' tu σ
cn
O r
σ tu ít o
H' (Ji
P
O
CL
O σ
c
1—1 o tu
N<
cn
H· b
ft rifu
P fu ?r cn
Φ
| w | ω | > | 2 | < | i-3 | cn | P | < | o | o |
| ft | 3 | i-3 | > | <· | ir | 3 | tr | N | H- | σ |
| H' | rt | σ | r. >— | H- | H' | ft | o | rt | cn | |
| o | cn | P | Φ | cn | tr | ir | ir | cu | ||
| P' | s | rt | P· | rt | φ | cu. | tr | |||
| rt | to | rt | o | tr | rt | |||||
| σ | cn | to | N | 0 | tr | |||||
| w | Φ | ω | • | P | cu | P· | < | rt | ||
| > | σ | ft | CL | !<' | <3 | |||||
| • | ir> | tt | CU. | Φ | ||||||
| to | P | 40 | tr | Φ | N | P | rt | |||
| • | O | 0 | fu | ft | ||||||
| σ | tr | Hi | — | |||||||
| • | CO | to | Φ | ir | 3 | |||||
| -o | • | rt | to | I—1 | ||||||
| 3 | σ | —' | ||||||||
| H- | P | σ | to | |||||||
| tt | r< | • | ||||||||
| ft | H· | Cú | tr | |||||||
| ď | —- | • | ||||||||
| fU' | rt | to | ||||||||
| O | Φ | ---- | ||||||||
| tr | P | |||||||||
| Η* | ||||||||||
| o | cn Φ | o | o | L- | H-1 | o rt- Φ< | o | 1 | o | Ol |
| -» | -· | -* | -* | > | t-1 | |||||
| 02 | N 3 φ< | 1—1 O | Η-1 O | c | O O | o to | to o | Φ P | ||
| ir< | cn | < N O | ||||||||
| í a | tno | |||||||||
| tr | cn | ir φ P | ||||||||
| cn 0 | rt H- | |||||||||
| ir | ||||||||||
| σ | l·-1 | “Ί3 t-1 | ||||||||
| φ tt | cn | |||||||||
| o | 3 | |||||||||
| φ | H- | |||||||||
| ft | ||||||||||
| II | ft | |||||||||
| rt | ||||||||||
| > | ||||||||||
| p | ||||||||||
| o | o | o | p- | ir< | 1 | o | 1 | > | ||
| ·> | to | ·* | -» | -* | H- | b | ||||
| o | Φ | ř— | o | o. | p·1 | cu | ||||
| to | tu | o | o | o | fu | o | P4 | |||
| tr | r | |||||||||
| o | • · | N | ||||||||
| φ | CU | |||||||||
| cn | P | |||||||||
| Φ | I—1 | |||||||||
| ít | ||||||||||
| o | tr | |||||||||
| CL | 0' | |||||||||
| cn | N | |||||||||
| rt | >< | |||||||||
| fU | ||||||||||
| h | ||||||||||
| rt | 3 | |||||||||
| ft | 1—1 | |||||||||
| LJ. | ||||||||||
| Φ | ||||||||||
| P | ||||||||||
| ir< | ||||||||||
| o | H· CL £ | o | o | c | P1 | o | o | o | > | |
| ** | -* | -» | -» | ·> | ·» | b | ||||
| o | f—1 | p* | X' | o | o | t—1 | to | fu | ||
| to | H' | o | o | c | o | to | o | o | I—1 | |
| 3 | N | |||||||||
| OJ | ||||||||||
| cn | ||||||||||
| CU | ||||||||||
| O | ||||||||||
| tr | ||||||||||
| cu | ||||||||||
| ir | ||||||||||
| 0' | ||||||||||
| N | ||||||||||
| ? | ||||||||||
| l·-1 | ||||||||||
Tabulka č. 6: Objemu roztoků v každém testu • · · · • ··· · · · · · ··· ··· • ····· · · ···· ·· ·· ·· ·· ··
6) Výsledky
Sacharóza
2,44 X 342,3 x absorbance (A2 - Al) = 1,326 x absorbance g/1
6,3 x 0,1 x 1 000 kde hodnoty: 2,44 = celkový objem
342,30 = molekulová hmotnost sacharózy
6,3 = koeficient absorbance NADPH při vlnové délce 340 nm
0,1 = objem vzorku g hrášku se homogenizuje ve 250 ml, 2 ml homogenátu se připraví do objemu 10 ml a to v ředění 10 x 5 = 50 x nebo ekvivalent extraktu 25 g hrášku v 1 250 ml.
Tak 1,326 x absorbance x 50 = obsah sacharózy v jednom gramu hrášku (v čerstvé formě).
Glukóza
2,44 x 180,16 x absorbance (A2 - Al) = 0,698 x absorbance g/1
6,3 x 0,1 x 1 000 kde hodnoty : 2,44 = celkový objem
180,16 = molekulová hmotnost glukózy
6,3 = koeficient absorbance NADPH při vlnové délce 340 nm
0,1 = objem vzorku x 50 = mg na g hrášku (v čerstvé formě).
Tak 0,698 x absorbance x 50 = mg glukózy v jednom gramu hrášku (v čerstvé formě).
• · • · • · · • ·
Poznámka: koncentrace glukózy je nízká a většinou ‘není*třeba ji měřit. Avšak, jestliže chceme být přesní, obsah sacharózy se rovná obsahu sacharózy a glukózy a jestliže chceme stanovit pravdivou hodnotu obsahu sacharózy, musíme stanovit oba obsahy a odečíst obsah glukózy od sacharózy.
7) Závěr g hrášku se homogenizuje ve 150 ml vody po dobu 60 vteřin. Homogenizát se povaří Doplní se na objem 250 ml
Homogenizát se centrifuguje a supernatant se pětkrát naředí.
Do kyvet se přidá vzorkový pufr a fruktozidáza, vše se smísí a inkubuje se po dobu 15 minut.
Do kyvet se přidá pufr, voda, NADP a ATP, vše se smísí a po 3 minutách se stanoví absorbance = Al.
Přidá se HK/G6PDH, vše se smísí a po ukončení reakce se stanoví absorbance (10 až 15 minut) = A2.
Vypočítá se % sacharózy a glukózy.
Klonování cDNA genu PGM(p) hrachu a genová segregační analýza.
A. Materiál a metody.
1. Příprava knihovny cDNA
Z nezralých embryí hrachu se izolovala RNA (Pisum sativum, odrůda Novella), hmotnost embryí byla 200 mg. Izolace se provedla za použití kitu Quicjprep mRNA (Pharmacia).
Za použití klónovacího kitu Superscript II (GIBCO-BRL) se syntetizoval první a druhý řetězec cDNA, přičemž pro první řetězec cDNA jako primer sloužil oligo(dT). Konce cDNA byly tupé konce ligované do adaptéru EcoRI a přebytečné adaptéry se odstranily na kolonách Sephacryl-300 (Pharmacia). Inzerty se ligovaly do vektoru Lambda ZAP II a pakovaly se za použití balících extraktů Gigapack III (Stratagene). Část knihovny se ·· nanesla na plotny, 24 000 pfu s průměrnou velikostí
1,5 Kbp. Největší inzert amplifikovatelný PCR má Provedl se obtisk ploten na filtry (Hybond N +) hybridizací se fixovaly UV zářením.
inzertu 3 Kbp. a před
2. Amplifikace genového fragmentu PGM
Na základě oblastí konzervativní aminokyselinové sekvence ve známých genech PGM bakterie E.coli, kvasinek, králíka, krysy a člověka se syntetizovaly degenerované primery (5ACIGCIWSICAYAAYCC (SEQ ID No. 1) a 5'- CKRTCICCRTCICCRTCRAAIGC (SEQ ID No: 2) . PCR amplífikace cDNA (Novella) probíhá za standardních podmínek (25 ul reakční směsi obsahuje 0,2 mM dNTP, 0,3 ůM každého oligonukleotidového primeru, 10 mM Tris pH 8,3, 50 mM Kel, 1,5 mM MgC12 a 0,5 jednotek Taq DNA polymerázy, Advanced Biotechnologies) a ke spojení vláken dochází při teplotě 44 °C (Phillip et al, Theor Appl Gene 88: 845-851, 1994) a vzniká fragment o očekávané velikosti (500 bp) . Tento fragment se klonoval za použití vektorového kitu pT7BlueT (Novagen) a konce se sekvenovaly. Sekvenační data potvrdila podstatnou homologii se známými sekvencemi PGM.
3. Testování knihovny
Produkt PCR (shora v textu) se značil 32P (Feinberg & Vogelstein, Anal Biochem 132:6-13,1983) a hybridizoval se s filtry, na kterých je otisk plotny s knihovnou, při teplotě 65 °C přes noc. Filtry se promyly za přísných podmínek (0,1 x SSC při teplotě 65 °C) a exponovaly se na X-film při teplotě 70 °C. Izolovaly se pozitivní plaky a za účelem zjištění velikosti inzertu se provedla PCR amplifikace.
4. Genová segregační analýza
Zkonstruovaly se segregační populace prostřednictvím křížení běžného popínavého kultivaru Rug3 (Harrier) se rug3
Sim linií 43 a genarací F2 (populace A) a F4 (populace B).
• 4
9 4 44 4 4 4 4 4 • 4·4 « 4 4 44 444 444 • 44444 · · • •44 44 44 44 44 44
Fenotyp rostlin se určil prostřednictvím kombinace vizuálního porovnání jejich semen (Rug3 - zvrásněny, rugd-superzvrásněný) a barvení tkáně listů jódem. Ze segregačních populací se izolovala DNA (Dellaporta et al., Plant Mol Biol Rep. 1: 19-21, 1983), štěpila se enzymem EcoRI a provedla se elektroforéza na 1 % agarózovém gelu, pak se provedl kapilární přenos (Sambrook et al., 1989). Inzert z klonu knihovny s nej delší cDNA se značil 32P a použil se jako sonda.
1. Klonování cDNA genu plastidiální fosfoglukomutázy hrachu
Provedlo se srovnání sekvence DNA mezi dříve popsanými geny PGM z druhů, které se popisují dále v textu. Našly se dvě vysoce konzervativní oblasti a použily se pro navržení degenerovaných oligonukleotidových PCR primerů. Amplifikace cDNA hrachu dala vznik generaci DNA fragmentů očekávané velikosti. Zkonstruovala se knihovna cDNA a uvedený produkt PCR se použil jako sonda. Identifikovalo se celkem 38 pozitivních plaků. Velikost největšího inzertu je 2,2 kb, což odpovídá očekávané kódující kapacitě, která se odvodila z jiných klonovaných genů PGM, a také s velikostí mRNA transkriptu na northernovou metodou. Stanovila se sekvence DNA uvedeného klonu (Obrázek č. 1) . Aminokyselinová sekvence největšího otevřeného čtecího rámce bez putativní transitní peptidové domény se porovnala se sekvencí jiných klonovaných genů PGM za použití standarního počítačového programu DNAStar (DNAStar lne, Madison, USA) . Výsledky jsou uvedeny v tabulce č. 7. Výsledky ukazují, že v genu existují podstatné oblasti homologie. Největší homologie se zjistila se sekvencí z rostliny kosmatec křišťálový (Mesembryantlemumcrystallunuin), pak se sekvencí bakterie Agrobacterium tumefaciens a s geny kvasinek a nakonec s geny bakterií Escherichia coli a Xanthomonas. Zde popsaná cDNA hrachu měla na N-konci přesah přibližně 65 aminokyselin, což naznačuje, že plní úlohu tranzitního peptidu pro import do plastidů. Důkaz, který • φ podporuje uvedenou teorii o úloze peptidu, vychází z obsahu serinových zbytků, což se zjistilo u řady tranzitních peptidů.
vysokého takových
ΦΦ ··
AA A···
A A · • A A A A A A
Tabulka
| Hrách | Kosmatec křišťálový | Agrobacterium tumefaciens | Člověk | Králík | Krysa | Kvasinky | E. coli | Xanthamonas | |||
| Procento podobnosti | i— | 00 | in | kO | Γ | CO | σ | ||||
| σ | 16, 0 | O kD 1—! | 17,0 | o co t— | 17,0 | 17, 0 | o sr rH | o co lO | σ | ||
| CO | 17,0 | O r- | 20,0 | o co 4- | 17,0 | 17,0 | 16, 0 | 12,0 | CO | ||
| r- | O kO | o v co | 50, 0 | 51,0 | 51,0 | o *—i LÍ0 | 36, 8 | 35, 7 | r-~ | ||
| ko | 56, 0 | 57,0 | 55, 0 | 96, 0 | 91,0 | 20, 8 | 35, 1 | 34,5 | kD | ||
| lO | 56, 0 | O u0 | 55, 0 | 90, 0 | 00 00 | 21, 5 | 35, 9 | 35, 0 | LO | ||
| 56, 0 1 | 57, 0 | 55, 0 | 3, 1 | CM l— | 20,8 | 35,2 | co oo | ||||
| oo | 57,0 | 55, 0 | 17,5 | 17,9 | 17,5 | 22, 7 | 33, 2 | 33,2 | co | ||
| CM | 61,0 | 19, 8 | cn γ-η | CTs *» ,— | 19, 5 | 24,5 | 36,1 | i—1 kO 00 | CM | ||
| 1—1 | C\i LO t—! | co co i—1 | 18,2 | 19, 0 | 18,0 | 23, 9 | 35, 4 | co co | r—1 | ||
| O. Ό diverge nce | i—1 | CM | co | lO | co | r- | CO | σι |
• A AA
9 99 9 ·
·· · · ···· 9 9 « 9 · · * ·«· ·· 9 9 9 9 9 ·»· · · · · · ··· ··»
9 9 9 9 9 9 9
99·9 99 · 9 ·· ·· ··
2. Genová segregační analýza
U populace segregující rug3 „super-zvrásněný fenotyp se testovalo spojení mezi genem pPGM a fenotypem rug3. Tabulka č.
ukazuje výsledky dvou takových populací.
Tabulka č. 8
| Genotyp | ||||
| RFLP alely v | lokusu pPGM | |||
| Fenotyp | Populace A | Populace B | ||
| RugRug/ Rugrug | rugrug | RugRug/ Rugrug | rugrug | |
| Divoký typ | 77 | 0 | 33 | 0 |
| Rug3 „super- zvrásněný | 0 | 21 | 0 | 9 |
U populace A se segregace rostlin divokého typu a rug3 „superzvrásnšného typu podstatně neliší od poměru segregace 3:1, jak se očekávalo u recesivních genů, které se nedědí klasickým způsobem podle Mendela. Všechny případy rug3 rostlin byly homozygotní v případě RFLP alel odvozených z rug3 rodičovské rostliny. Podobné pozorování se zjistilo v populaci B.
Tyto data ukazují, že rug3 mutace mapují velmi blízko pGM genu.
•9 9·»·
9« «9 • · ♦ · · · • 99 9 · ·99 9 9 · • »99
9**9 9« 99
99 e 9 · ·
9 9 9
999 999
9
99
SEKVENČNÍ PROTOKOL (1) Údaje k SEQ ID NO: 1:
| i) | CHARAKTERISTIKA SEKVENCE: | |
| (A) | DÉLKA: 17 párů baží | |
| (B) | TYP: nukleová kyselina | |
| (C) | DRUH ŘETĚZCE: jednořetězcová | |
| (D) | TOPOLOGIE: lineární | |
| ií ) | DRUH | MOLEKULY: jiná nukleová kysel |
(iii) HYPOTETICKÁ: ne (iv) POZITIVNÍ: ne (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 1:
ACNGCNWSNC AYAAYCC 17
| Údaj e | k SEQ | ID NO: 2: |
| (i) | CHARAKTERISTIKA SEKVENCE: | |
| (A) | DÉLKA: 23 párů baží | |
| (B) | TYP: nukleová kyselina | |
| (C) | DRUH ŘETĚZCE: jednořetězcová | |
| (D) | TOPOLOGIE: lineární | |
| (ii) | DRUH | MOLEKULY: jiná nukleová kyselina |
| (iii) | HYPOTETICKÁ: ne | |
| (iv) | POZITIVNÍ: ne | |
| (Xi) | Popis | sekvence: SEQ ID NO: 2: |
CKRTCNCCRT CNCCRTCRAA NGC 23 (1) Údaje k SEQ ID NO: 3:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 2182 párů bázi
44
4 4 φ
4 4
444 4 • 4
4444 44
• ·· 4
4 4 4
444 444 ·
44
4444
| (B) | TYP: nukleová kyselina | |
| (C) | DRUH ŘETĚZCE: jednořet | |
| (D) | TOPOLOGIE: lineární | |
| (ii) | DRUH | MOLEKULY: cDNA |
| (íii) | HYPOTETICKÁ: ne | |
| (iv) | POZITIVNÍ: ne | |
| (ix) | ZNAK: | |
| (A) | NÁZEV/KLÍČ: CDS | |
| (B) | POZICE: 77..1957 | |
| íxi) | Popis | sekvence: SEQ ID NO: 3 |
• 4 • 4
CAAACACATA GTTAAACAAA 60
AAACACTCTC TCTTGACTCT TCGAAGAAAA
AGTTGTCACT
| GTTACAGACT CGATCA 109 | ATG GCT TTC | TGT TAC | AC-A Arg | CTC GAC AAC TTC | ATC Ile | ||||||
| Met 1 | Ala | Phe | Cys | Tyr 5 | Leu | Asp | Asn | Phe 10 | |||
| ATC TCT GCG TTT AAA | CCC | AAA | CAC | TCA | AAT | GTC | CCA | CTT | TCA | ATT | CAT |
| 157 | |||||||||||
| ;Ile Ser Ala Phe Lys | Pro | Lys | His | Ser | Asn | Val | Pro | Leu | Ser | Ile | Hrs |
| 1 15 | 20 | 25 | |||||||||
| CAT TCA TCA TCC AAT | TTT | CCT | TCT | TTC | AAA | GTT | CAA | AAC | TTT | CCT | TTC |
| 205 | |||||||||||
| His Ser Ser Ser Asn | Phe | Pro | Ser | Phe | Lvs | Val | Gin | Asn | Phe | Pro | Phe |
| 30 | 35 | 40 | |||||||||
| AGG GTT CGC TAT AAT | TCA | GCT | ATT | AGA | GCC | ACT | TCA | TCT | TCC | TCT | TCT |
| 253 | |||||||||||
| Arg Val Arg Tyr Asn | Ser | Ala | Ile | Arg | Ala | Thr | Ser | Ser | Seir | Ser | Ser |
| 45 | 50 | 55 | |||||||||
| ACT CCC ACA ACC ATT | GCA | GAA | CCT | AAT | GAC | ATT | AAG | ATT | AAC | TCT | ATT |
| 301 | |||||||||||
| Thr Pro Thr Thr Ile | Ala | Glu | Pro | Asn | Asp | Ile | Lys | Ile | Asn | Ser | Ile |
| 60 | 65 | 70 | 75 | ||||||||
| CCT ACT AAA CCT ATT | GAA | GGA | CAA | AAA | ACT | GGT | ACC | AGT | GGT | CTA | AGA |
| 349 | |||||||||||
| Pro Thr Lys Pro Ile | Glu | Gly | Gin | Lys | Thr | Gly | Thr | Ser | Gly | Leu | Arg |
| 80 | 85 ' | 90 | |||||||||
| AAA AAG GTG AAA GTG | TTT | AAG | CAA | GAA | AAT | TAC | CTT | GCA | AAT | TGG | ATT |
| 397 | |||||||||||
| Lys Lys Val Lys Val | Phe | Lys | Gin | Glu | Asn | Tyr | Leu | Ala | Asn | Trp | Ile |
| 95 | 100 | 105 |
·· ····
| • · • • 4 4 4 4 | • 444 4 • • · | • · • · • · · • 4 | • • · •__ • 4 | |||||||||||
| CAG GCA | CTG | TTT | AAT | TCG | TTG | CCG | CCG | GAG | GAT | TAC | AAG | AAT | GGA | TTG |
| 445 | ||||||||||||||
| Gin Ala | Leu 110 | Phe | Asn | Ser | Leu | Pro 115 | Pro | Glu | Asp | Tyr | Lys 120 | Asn | Gly | Leu |
| TTG GTT | TTG | GGA | GGC | GAT | GGT | CGA | TAC | TTC | AAT | AAA | GAA | GCT | GCA | CAG |
| 493 | ||||||||||||||
| Lea Val 125 | Leu | Gly | Gly | Asp | Gly 130 | Arg | Tvr | Phe | Asn | Lys 135 | Glu | Ala | Ala | Gin |
| ΑΤΑ ATA | ATC | AAG | ATT | GCT | i | GGA | AAT | GGT | GTT | GGA | AAA | ATT | CTG | GTT |
| 541 | ||||||||||||||
| Ile Ile 14 0 | Ile | Lys | Ile | Ala 145 | Ala | Gly | Asn | Gly | Val 150 | Gly | Lys | Ile | Leu | Val 155 |
| GGG AAG | GAA | GGG | ATA | TTG | TCA | ACG | CCA | GCC | GTT | TCT | GCT | GTG | ATA | AGG |
| 589 | ||||||||||||||
| Gly Lys | Glu | Gly | Ile 160 | Leu | Ser | Thr | Pro | Ala 165 | Val | Ser | Ala | Val | Ile 170 | Arg |
| AAG AGA | GAG | GCA | AAT | GGT | ULAJ | TTT | X rr>r-< A i <· | ATG | AGT | GCG | AGC | CAT | AA.C | CCT |
| 637 | ||||||||||||||
| Lys Arg | Glu | Ala 175 | Asn | Gly | Gly | Phe | Ile 1 Q ň j. u O | Met: | Ser | Ala | Ser | His 135 | Asn | Pro |
| GGT GGA 685 | CCT GAA TAT GAT | rT/'“’ Trp | GGT ATT AAG | TTT AAT TAC | AGT Ser | AGC Ser | GGA Gly | |||||||
| Pro 190 | Glu | Tyr | Asp | Phe | Asn | Tyr 200 | ||||||||
| Gly Gly | Gly 195 | Ile | Lys | |||||||||||
| CAA CCT | GCA | CCA | GAA | TCC | ATC | ACC | GAC | AAG | ATT | TAC | GGA | AAC | ACC | CTA |
| 733 | ||||||||||||||
| Gin Pro 205 | Ala | Pro | Glu | Ser | Ile 210 | Thr | Asp | Lys | Ile | Tyr 215 | Gly | Asn | Thr | Leu |
| TCG ATT | TCT | GAG | ATA | AAG | ATT | GCT | GAT | ATT | CCC | GAT | GTT | GAC | TTA | TCA |
| 731 | ||||||||||||||
| Ser ile 220 | Ser | Glu | Ile | Lys 2 25 | II s | Ala | Asp | Ile | Pro 230 | Asp | Val | Asp | Leu | Ser 235 |
| AAT GTT | GGA | GTT | ACG | AAA | TTC | GGA | AGC | TTC | AGT | GTG | GAA | GTA | ATA | 7» |
| 829 | ||||||||||||||
| Asn Val | Gly | Val | Thr 240 | Lys | Phe | Gly | Ser | Phe 245 | Ser | Val | Glu | Val | Ile 250 | Asp |
| CCA GTT | TCT | GAT | TAC | CTG | GAG | TTA | TTG | GAG | AGA | GTG | TTC | GAT | TTT | CáG |
| 1 877 | ||||||||||||||
| Pro Val | Ser | Asp 255 | Tyr | Leu | Glu | Leu | Leu 260 | Glu | Thr | Val | Phe | Aso 2 65 | Phe | Gin |
| CTA ATC | AAA | AGT | CTT | ATT | TCA | CGG | CCA | GAT | TTT | AGG | TTT | ACA | TTT | GAT |
| 925 | ||||||||||||||
| Leu Ile | Lys 270 | Ser | Leu | Ile | Ser | Arg 275 | Pro | Asp | Phe | Arg | Phe 280 | Thr | Phe | Asp |
• · · ·
| 1 | • · » · · • · • | • · • • • · · · | • · · • · • · • · | • · · • • • · | ||||||||||
| GCC ATG | CAT | GCA | GTT | GCC | GGT | GCT | TAT | GCA | ACA | < CCC | • » · · · ATT | • • · TTC | • · · • · GTT | *GAT |
| 973 | ||||||||||||||
| Ala Met | His | Ala | Val | Ala | Gly | Ala | Tyr | Ala | Thr | Pro | Ile | Phe | Val | Asp |
| 285 | 290 | 295 | ||||||||||||
| AAA CTT | GGT | GCT | AGT | CCG | GAT | TCA | ATT | TCA | AAT | GGA | ATA | CCT | TTG | GAA |
| 1021 | ||||||||||||||
| Lys Leu | Gly | Ala | Ser | Pro | Asp | Ser | Ile | Ser | Asn | Gly | ile | Pro | Leu | Glu |
| 300 | 305 | 310 | 315 | |||||||||||
| GAT TTT | GGA | CAT | GGT | CAT | CCT | GAT | CCT | AAT | CTA | ACA | TAC | C-GA | AAG | GAT |
| 1059 | ||||||||||||||
| Asp Pne | Gly | His | Gly | His | Pro | Asp | Pro | Asn | Leu | Thr | Tyr | Ala | Lvs | Asp |
| 320 | 325 | 3 30 | ||||||||||||
| CTT C-TC | AAT | ATT | ATG | TAT | GCT | GAA | AAC | GGA | CCT | GAT | TTT | /'“«/-•'Τ' i | GCC | GCT |
| 1117 | ||||||||||||||
| Leu Val | Asn | Ile | Met | Tyr | Ala | Glu | Asn | Gly | Pro | Asp | Phe | Gly | Ala | Ala |
| 335 | 340 | 3 45 | ||||||||||||
| AGT GAT | GGT | GAT | GGT | GAT | AGA | AAT | ATG | ATT | TTG | GGA | ACA | AGT | TTC | TTC |
| 1165 | ||||||||||||||
| Ser Asp | Gly | Asp | Gly | Asp | Arg | Asn | Met | Ile | Leu | Gly | Thr | Ser | pho | Phe |
| 7 ς q | 3 55 | 3 60 | ||||||||||||
| GTA ACT | CCT | TCA | GAC | TCT | GTA | GCC | GTT | ATT | GCA | GCC | AAT | GCA | AAA | G.AA |
| 1213 | ||||||||||||||
| Val Thr | Pro | Ser | Asp | Ser | val | Ala | Val | Ile | Ala | Ala | Asn | Ala | Lys | Glu |
| 365 | 370 | 375 | ||||||||||||
| GCG ATT | CCG | TAC | TTT | AAG | GAC | AGT | ATC | AAG | GGT | CTT | GCA | CGA | TCA | ATG |
| 1261 | ||||||||||||||
| Ala Ile | Pro | Tyr | Phe | Lys | Asp | Ser | Ile | Lys | Gly | Leu | Ala | Arg | Ser | Met |
| 380 | 385 | 390 | 395 | |||||||||||
| CCG ACA | AGC | GGT | GCT | CTA | GAT | AGA | GTT | GCT | GAA | AAG | TTG | AAC | CTC | CCT |
| 1309 Pro Thr | Ser | Gly | Al a | Leu | Asp | Arg | Val | Ala | Glu | Lys | Leu | Asn | Leu | Pro |
| 400 | 405 | 410 | ||||||||||||
| TTT TTT | GAG | GTT | CCC | ACT | GGT | TGG | AAA | TTC | TTT | GGT | .AAT | CTT | ATG | GAT |
| ' 1357 | ||||||||||||||
| Píle Phe | Glu | Val | Pro | Thr | Gly | Trp | Lys | Phe | Phe | Gly | Asn | Leu | Met | Asp |
| 415 | 4 2 0 | 4 2 5 | ||||||||||||
| GCT GC-A | AAT | CTG | TCG | ATT | TGC | crucr | GAA | GAG | AGT | TTT | GGA | ACA | GGT | TCT |
| 1405 | ||||||||||||||
| Ala Gly | Asn | Leu | Ser | Ile | Cys | Gly | Glu | Glu | Ser | Phe | Gi y | 'PhX’ | Gly | Ser |
| 430 | 435 | 440 | ||||||||||||
| GAC CAC | ATT | CGT | GAG | AAA | GAC | GGA | ATC | TGG | GCT | GTA | TT^ | GCT | TGG | CTT |
| 1453 | ||||||||||||||
| Asp His | Ile | Arg | Glu | Lys | Asp | Gly | Ile | Trp | Ala | Val | Leu | nic | Trp | Leu |
445 450 455 • · • · • ·
| TCG ATT 1501 Ser Ile 460 | ATT Ile | GCT Ala | CAC His | CGC AAC Arg Asn 465 | AAA Lys | GAC ACG AAA CCA GGG GAG AAA TTG | |||||
| Asp Thr | Lys 470 | Pro Gly | Glu | Lys | Leu 475 | ||||||
| GTC TCT | GTG | TCT | GAT | GTT GTG | AAG | GAG CAT | TGG | GCA ACC | TAT | GGT | AGA |
| 1549 | |||||||||||
| val Ser | Val | Ser | Asp | Val Val | Lys | Glu His | Trp | Ala Thr | Tyr | Gly | Arg |
| 480 | 485 | 490 | |||||||||
| AAT TTC | TTT | TCT | AGA | TAC GAT | TAC | GAG GAA | TGT | GAA TCC | GAA | GGC | GCA |
| 1597 | |||||||||||
| Asn Phe | Phe | Ser | Arg | Tyr Asp | Tyr | Glu Glu | Cys | Glu Ser | Glu | Gly | Ala |
| 495 | 500 | 505 | |||||||||
| AAT AAG | ATG | ATA | GAG | TAC CTA | CGA | GAG CTT | TTG | TCG AAG | AGC | AAG | CCT |
| 164 5 | |||||||||||
| Asn Lys | Mec | Ile | Glu | Tyr Leu | Arg | Glu Leu | Leu | Ser Lys | Ser | Lys | Pro |
| 510 | 515 | 52 0 | |||||||||
| GGT GAT | AAG | TAT | GGA | AGT TAC | GTC | CTC CAG | TTT | GCC GAT | GAT | TAT | ACA |
| 1693 | |||||||||||
| Glv Aso | Lys | Tyr | Gly | Ser Tyr | Val | Leu Gin | Phe | Ala Asp | Asp | Tyr | Thr |
| 525 | 530 | 535 | |||||||||
| TAC ACT | GAT | CCT | GTA | GAT GGA | AGT | GTA GTA | TCA . | AAA CAA | GGG | GTT | CC-G |
| 1741 | |||||||||||
| Tyr Thr | Asp | Pro | Val | Asp Gly | Ser | Val Val | Ser | Lys Gin | Gly | val | Arg |
| 540 | 545 | 550 | 5 5 5 | ||||||||
| i TTT GTT | TTC | ACC | GAT | GGT TCA | AGA | ATT ATT | TAC | CGT TTA | TCA | GGA | ACG |
| 1789 | |||||||||||
| Phe Val | Phe | Thr | ASO | Gly Ser | Arg | Ile Ile | Tyr | Arg Leu | Ser | Gly | Thr |
| 560 | 565 | 570 | |||||||||
| 1 GGT TCT | GCT | GGT | GCA | ACT GTT | AGA | GTG TAT | ATC | GAA CAG | TTT | GAA | CCA |
| 1837 | |||||||||||
| Gly Ser | Ala | Gly | Ala | Thr Val | Arg | Val Tyr | ile | Glu Gin | Phe | Glu | Pro |
| 575 | 580 | 585 | |||||||||
| GAT GTT | TCT | AAA | CAC | GAC GTC | GAT | GCT CAA | ATT | GCC TTG | AAA | CCA | TTA |
| 1885 | |||||||||||
| Asp Val | Ser | Lys | His | Asp Val | Asp | Ala Gin | Ile | Ala Leu | Lys | Pro | Leu |
| 590 | 595 | 600 | |||||||||
| AfcA GAT | TTA | GCA | TTA | TCT GTT | TCA | AAG CTC | AAA | GAC TTC | ACA | GGG | AGA |
| 1 1933 | |||||||||||
| Ile Aso | Leu | Ala | Leu | Ser Val | Ser | Lys Leu | Lys | Asp Phe | Thr | Gly | Arg |
| 60 5 | 610 | 615 | |||||||||
| GAG AAG | CCT | ACA | GTC | ATC ACT | TAA | TATAAGTTTG GTTTTTCATT ΓιΟΑΏΤΙ ΙΌ | |||||
| J 1987 | |||||||||||
| Glu Lys | Pro | Thr | val | Ile Thr | ♦ | ||||||
| 620 | 625 |
• · · · · ·
GTTATTTTTC CACTTTGGAG CTTAGCATCT TTTTTGTATA ATATGATATT TTGTATTTAC 2047
TTTCAAGAAA ATGAAGTATC ATTGTGTAAC AGAATAAATA ATGGTATTAA TAATAGCTAG | 2107
CTTCTATGCA GAGAAGTTGT TCTTTTCAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA | 2167
AAAAAAAAAA AAAAA 2182 (1) Údaje k SEQ ID NO: 4:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 627 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: protein (xi) Popis sekvence:
SEQ ID NO: 4:
| Mát | Ala | Phe | Cys | Tyr | Arg | Leu | |
| 1 | 5 | ||||||
| Pro | Lys | His | Ser 20 | Asn | Val | Pro | |
| Phe | Pro | Ser 35 | Phe | Lys | Val | Gin | |
| Ser | Ala 50 | Ile | Arg | Ala | Thr | Ser 55 | |
| * | Ala 65 | Glu | Pro | Asn | ASO | Ile 70 | Lys |
| Glu | Gly | Gin | Lys | Thr 65 | C-ly | Thr | |
| Phe | Lys | Gin | Glu 100 | Asn | Tyr | Leu |
| Asp | Asn | Phe 10 | Ile | Ile | Ser | Ala | Phe 15 | Lys |
| Leu | Ser 25 | Ile | His | His | Ser | Ser 30 | Ser | Asn |
| Asn 40 | Phe | Pro | Phe | Arg | Val 45 | Arg | Tyr | Asn |
| Ser | Ser | Ser | Ser | Thr 60 | Pro | Thr | Thr | Ile |
| Ile | Asn | Ser | Ile 75 | Pro | Thr | Lys | Pro | Ile 80 |
| Ser | Gly | Leu 90 | Arg | Lys | Lys | Val | Lys 95 | val |
| Ala | Asn 105 | Trp | Ile | Gin | Ala | Leu 110 | Phe | Asn |
• · · · · » · · · · ·· ··· ··· • · · · · • · ··· · ··
| Ser | Leu | Pro | Pro | Glu | Asp | Tyr | Lys | Asn Gly | Leu | Leu Val Leu | Gly | Gly |
| 115 | 120 | 125 | ||||||||||
| Isp | Gly | Arg | Tyr | Phe | Asn | Lys | Glu | Ala Ala | Gin | Ile Ile Ile | Lys | Ile |
| 130 | 135 | 140 | ||||||||||
| Ala | Ala | Gly | Asn | Gly | Val | Gly | Lys | Ile Leu | Val | Gly Lys Glu | Gly | Ile |
| 145 | 150 | 155 | 160 | |||||||||
| Leu | Ser | Thr | Pro | Ala | Val | Ser | Ala | Val Ile | Arg | Lys Arg Glu | Ala | Asn |
| 165 | 170 | 175 | ||||||||||
| Gly | Gly | Phe | Ile | Met | Ser | Ala | Ser | His Asn | Pro | Gly Gly Pro | Glu | Tyr |
| 180 | 185 | 190 | ||||||||||
| Asp | Trp | Gly | Ile | Lys | Phe | Asn | Tyr | Ser Ser | Gly | Gin Pro Ala | Pro | Glu |
| 195 | 200 | 205 | ||||||||||
| Ser | Ile | Thr | Asp | Lys | Ile | Tyr | Gly | Asn Thr | Leu | Ser Iie Ser | Glu | Ile |
| 210 | 215 | 220 | ||||||||||
| Lys | Ile | Ala | Asp | Ile | Pro | Asp | Val | Asp Leu | Ser | Asn Val Gly | Val | Thr |
| 225 | 230 | 235 | 240 | |||||||||
| Lys | Phe | Gly | Ser | Phe | Ser | Val | Glu | Val Ile | Asp | Pro Val Ser | Asp | Tyr |
| 245 | 250 | 255 | ||||||||||
| Leu | Glu | Leu | Leu | Glu | Thr | Val | Phe | Aso Phe | Gin | Leu Ile Lys | Ser | Leu |
| 260 | 2 65 | 270 | ||||||||||
| Ile | Ser | Arg | Pro | Asp | Phe | Arg | Phe | Thr Phe | Asp | Ala Met His | Ala | Val |
| 275 | 280 | 285 | ||||||||||
| Al a | Gly | Ala | Tyr | Ala | Thr | Pro | Ile | Phe Val | Asp | Lys Leu Gly | Ala | Ser |
| 290 | 295 | 300 | ||||||||||
| Pro | Asp | Ser | Ile | Ser | Asn | Gly | Ile | Pro Leu | Glu | Asp Phe Gly | His | Gly |
| 305 | 310 | 315 | 320 | |||||||||
| His | Pro | Asp | Pro | Asn | Leu | Thr | Tyr | Ala Lys | Asp | Leu Val Asn | Ile | Met |
| 325 | 330 | 335 | ||||||||||
| Tyr | Al a | Glu | Asn | Gly | Pro | Asp | Phe | Gly Ala | Ala | Ser Asp Gly | Asp | Gly |
| 340 | 345 | 350 | ||||||||||
| Asp | Arg | Asn | Met | Ile | Leu | Gly | Thr | Ser Phe | Phe | Val Thr Pro | Ser | Asp |
| 355 | 360 | 365 | ||||||||||
| Ser | Val | Ala | Val | Ile | Ala | Ala | Asn | Ala Lys | Glu | Ala Ile Pro | Tyr | Phe |
| 370 | 375 | 380 | ||||||||||
| Lys | Asp | Ser | Ile | Lys | Gly | Leu | Ala | Arg Ser | Met | Pro Thr Ser | Gly | Ala |
| 385 i | 390 | 395 | 400 | |||||||||
| Leu | Asp | Arg | Val | Ala | Glu | Lys | Leu | Asn Leu | Pro | Phe Phe Glu | Val | Pro |
| 405 | 410 | 415 |
• · • · • · · · • 9 ··· · · · 9 9 9 9
999 9 9 9 9 9 999 ··· • 99··· · ·
9999 99 99 99 99 99
| Thr | Gly | Trp | Lys 420 | Phe | Phe | Gly | Asn | Leu 425 | Met | Asp Ala | Gly | Asn 430 | Leu | Ser | |
| Ile | Cys | Gly | Glu | Glu | Ser | Phe | Gly | Thr | Gly | Ser | Asp | His | Ile | Arg | Glu |
| 435 | 440 | 445 | |||||||||||||
| Lys | Asp | Gly | Ile | Trp | Ala | Val | Leu | Al a | Trp | Leu | Ser | Ile | Ile | Ala | His |
| 450 | 455 | 460 | |||||||||||||
| Arg | Asn | Lys | Asp | Thr | Lys | Pro | Gly | Glu | Lys | Leu | Val | Ser | Val | Ser | Asp |
| 465 | 470 | 475 | 480 | ||||||||||||
| Val | Val | Lys | Glu | His | Trp | Ala | Thr | Tyr | Gly | Arg | Asn | Phe | Phe | Ser | Arg |
| 485 | 490 | 495 | |||||||||||||
| Tyr | Asp | Tyr | Glu | Glu | Cys | Glu | Ser | Glu | Gly | Ala | Asn | Lys | Met | Ile | Glu |
| 500 | 505 | 510 | |||||||||||||
| Tyr | Leu | Arg | Glu | Leu | Leu | Ser | Lys | Ser | Lys | Pro | Gly | Asp | Lys | Tyr | Gly |
| 515 | 520 | 5 25 | |||||||||||||
| Ser | Tyr | val | Leu | Gin | Phe | Ala | ASp | Asp | Tyr | Thr | Tyr | Thr | Asp | Pro | Val |
| 530 | 535 | 540 | |||||||||||||
| Asp | Gly | Ser | Val | Val | Ser | Lys | Gin | Gly | Val | Arg | Phe | Val | Phe | Thr | Asp |
| 545 | 550 | 555 | 5 60 | ||||||||||||
| Gly | Ser | Arg | Ile | Ile | Tyr | Arg | Leu | Ser | Gly | Thr | Gly | Ser | Ala | Gly | Ala |
| 565 | 570 | 575 | |||||||||||||
| Thr | val | Arg | val | Tyr | ile | Glu | Gin | Phe | Glu | Pro | Asp | Val | Ser | Lys | His |
| 580 | 585 | 590 | |||||||||||||
| Asp | Val | Asp 595 | Ala | Gin | Ile | Ala | Leu 600 | Lys | Pro | Leu | Ile | Asp 605 | Leu | Ala | Leu |
| Ser | val 610 | Ser | Lys | Leu | Lys | Asp 615 | Phe | Thr | Gly | Arg | Glu 620 | Lys | Pro | Thr | Val |
Ile Thr * 625
Claims (16)
1. Semena hrachu, vyznačující se tím, že mají obsah sacharózy větší než 6 % (hmotnostní) celkové hmotnosti semene, které se sklízelo, když tenderometrický záznam přesáhl hodnotu 120 tenderometrických jednotek.
2. Semena hrachu, vyznačující se tím, že poměr obsahu sacharózy a obsahu škrobu ve stádiu popínání je větší než 2.
3. Semena hrachu podle nároku 2, vyznačující se tím, že poměr obsahu sacharózy a obsahu škrobu je větší než 10.
4. Semena hrachu, vyznačující se tím, že obsah sacharózy a obsahu škrobu pří v sklizní v suché formě je větší než 0,6.
5. Semena hrachu podle libovolného z nároků 1 až 4, , vyznačující se tím, že poměr obsahu sacharózy a obsahu škrobu zůstává během zrání ze stádia popínání do stádia zralé suché formy nad hodnotou 0,6,
6. Rostlina hrachu, vyznačující se tim, žeje schopna produkovat semena podle libovolného z nároků 1 až 5.
7. Rostlina hrachu, vyznačující se tím, že ve srovnání s běžnými odrůdami hrachu má podstatně redukovanou plastidiální fosfoglukomutázovou (PGM(p)) aktivitu a prodloužené období sklizně.
• ·
8. Rostlina hrachu podle nároku 7, vyznačující se tím, žejív podstatě chybí plastidiální fosfoglukomutázová (PGM(p)) aktivita.
9. Způsob prodloužení období sklizně nebo zvýšení obsahu sacharózy u rostliny hrachu, vyznačující se tím, že zahrnuje růst rostliny ze semene podle libovolného z nároků 1 až 5.
10. Použití rug3 mutace ke zvýšení obsahu sacharózy alespoň v části rostliny, zvláště v semenech.
11. Použití rug3 mutace k prodloužení období sklizně rostliny.
12. Polynukleotidová sekvence kódující plastidiální fosfoglukomutázu hrachu nebo funkčně ekvivalentní nukleotidovou sekvenci, přičemž funkční ekvivalence vyžaduje, aby alespoň 60 %, s výhodou 80 %, preferuje se alespoň 90 % sekvence hybridizovala při standardních laboratorních hybridizačních podmínek se sekvencí uvedenou na obrázku č. 1 (SEQ ID NO: 3) nebo s její komplementární nukleotidovou sekvencí.
13. Vektor obsahující polynukleotidcvou sekvenci podle nároku
12.
14. Způsob měnící jednu nebo více charakteristik rostliny nebo její části, vyznačující se tím, že zahrnuje změnu rostliny nebo její části tak, aby se v rostlině redukovala plastidiální fosfoglukomutázová (PGM(p)) aktivita.
···· ·· · 9 9 9 9
9 9 9 9 9 · 9 9 9 9
9 9 99 9 · 9 · 9 · · · 999
9 9 9 9 9 9 · 9
15. Způsob podle nároku 14, vyznačující se tím, že změněná charakteristika zahrnuje jeden nebo více obsahů sacharózy a období sklizně.
16. Způsob podle nároku 14, vyznačující se tím, ž e se do rostliny nebo její části zavede účinná část sekvence podle nároku 12.
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US2141096P | 1996-07-09 | 1996-07-09 | |
| GBGB9615103.0A GB9615103D0 (en) | 1996-07-18 | 1996-07-18 | Plants |
| GBGB9702653.8A GB9702653D0 (en) | 1996-07-18 | 1997-02-10 | Plants |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CZ9099A3 true CZ9099A3 (cs) | 1999-06-16 |
Family
ID=27268395
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CZ9990A CZ9099A3 (cs) | 1996-07-09 | 1997-07-03 | Způsob zvýšení obsahu sacharózy u rostlin |
Country Status (11)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0912750B1 (cs) |
| AT (1) | ATE241015T1 (cs) |
| AU (1) | AU730997B2 (cs) |
| BR (1) | BR9710158A (cs) |
| CZ (1) | CZ9099A3 (cs) |
| DE (1) | DE69722207T2 (cs) |
| GB (1) | GB2326414B (cs) |
| NO (1) | NO990085L (cs) |
| NZ (1) | NZ333674A (cs) |
| PL (1) | PL331099A1 (cs) |
| WO (1) | WO1998001574A1 (cs) |
Families Citing this family (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1999029161A1 (en) * | 1997-12-08 | 1999-06-17 | Seminis Vegetable Seeds, Inc. | A starchless variety of pisum sativum having elevated levels of sucrose |
| US6127605A (en) * | 1997-12-08 | 2000-10-03 | Seminis Vegetable Seeds, Inc. | Starchless variety of pisum sativum having elevated levels of sucrose |
| AU2321499A (en) * | 1998-01-15 | 1999-08-02 | E.I. Du Pont De Nemours And Company | Plant phosphoglucomutase homologs |
| AU3702299A (en) * | 1998-04-08 | 1999-11-01 | Unilever Plc | Method for increasing vitamin c content of plants |
| AU6018399A (en) * | 1998-08-25 | 2000-03-14 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Plant glutamine: fructose-6-phosphate amidotransferase nucleic acids |
| EP1144663A1 (en) * | 1999-01-19 | 2001-10-17 | Unilever Plc | Method of increasing the water soluble antioxidant content in mechanically harvested peas |
| EP1268831A2 (de) * | 2000-03-31 | 2003-01-02 | Institut Für Pflanzengenetik Und Kulturpflanzenforschung | Verfahren zur herstellung von leguminosen mit erhöhtem proteingehalt bei verlängerter samenfüllungsdauer |
| US7323560B2 (en) | 2000-07-17 | 2008-01-29 | E.I. Du Pont De Nemours And Company | Plastidic phosphoglucomutase genes |
| US7250557B2 (en) | 2000-07-17 | 2007-07-31 | E. I. Du Pont De Nemours And Company | Plastidic phosphoglucomutase genes |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB9223454D0 (en) * | 1992-11-09 | 1992-12-23 | Ici Plc | Novel plants and processes for obtaining them |
| US5498831A (en) * | 1993-07-23 | 1996-03-12 | Dna Plant Technology Corporation | Pea ADP-glucose pyrophosphorylase subunit genes and their uses |
-
1997
- 1997-07-03 GB GB9817283A patent/GB2326414B/en not_active Expired - Fee Related
- 1997-07-03 PL PL97331099A patent/PL331099A1/xx unknown
- 1997-07-03 CZ CZ9990A patent/CZ9099A3/cs unknown
- 1997-07-03 AU AU36209/97A patent/AU730997B2/en not_active Ceased
- 1997-07-03 EP EP97932785A patent/EP0912750B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1997-07-03 NZ NZ333674A patent/NZ333674A/xx not_active IP Right Cessation
- 1997-07-03 BR BR9710158A patent/BR9710158A/pt not_active Application Discontinuation
- 1997-07-03 AT AT97932785T patent/ATE241015T1/de not_active IP Right Cessation
- 1997-07-03 DE DE69722207T patent/DE69722207T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1997-07-03 WO PCT/EP1997/003613 patent/WO1998001574A1/en active IP Right Grant
-
1999
- 1999-01-08 NO NO990085A patent/NO990085L/no unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| BR9710158A (pt) | 1999-08-10 |
| DE69722207T2 (de) | 2003-11-27 |
| GB2326414B (en) | 2000-12-13 |
| ATE241015T1 (de) | 2003-06-15 |
| GB2326414A (en) | 1998-12-23 |
| GB9817283D0 (en) | 1998-10-07 |
| NZ333674A (en) | 2000-09-29 |
| EP0912750A1 (en) | 1999-05-06 |
| AU730997B2 (en) | 2001-03-22 |
| PL331099A1 (en) | 1999-06-21 |
| NO990085D0 (no) | 1999-01-08 |
| NO990085L (no) | 1999-03-08 |
| AU3620997A (en) | 1998-02-02 |
| EP0912750B1 (en) | 2003-05-21 |
| DE69722207D1 (de) | 2003-06-26 |
| WO1998001574A1 (en) | 1998-01-15 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Xie et al. | Over‐expression of mutated Zm DA 1 or Zm DAR 1 gene improves maize kernel yield by enhancing starch synthesis | |
| Prioul et al. | Expression of ADP-glucose pyrophosphorylase in maize (Zea mays L.) grain and source leaf during grain filling | |
| Caspar et al. | Mutants of Arabidopsis with altered regulation of starch degradation | |
| Harrison et al. | Evidence that the rug3 locus of pea (Pisum sativum L.) encodes plastidial phosphoglucomutase confirms that the imported substrate for starch synthesis in pea amyloplasts is glucose‐6‐phosphate | |
| Wright et al. | The maize auxotrophic mutant orange pericarp is defective in duplicate genes for tryptophan synthase beta. | |
| WO1994009144A1 (en) | Novel plants and processes for obtaining them | |
| BR9810973B1 (pt) | método para produzir uma planta tolerante à seca. | |
| Kulwal et al. | QTL analysis and molecular breeding for seed dormancy and pre-harvest sprouting tolerance in bread wheat | |
| US6680429B1 (en) | Starchless variety of pisum sativum having elevated levels of sucrose | |
| CN109369789B (zh) | ZmDRR206蛋白质及其编码基因在调控植物抗病性与生长发育中的应用 | |
| AU2006223312A1 (en) | Slow-maturing, determinate peas | |
| Cook et al. | A rice mutant lacking a large subunit of ADP-glucose pyrophosphorylase has drastically reduced starch content in the culm but normal plant morphology and yield | |
| KR20180109859A (ko) | 두꺼워진 호분을 갖는 벼 낟알 | |
| CZ9099A3 (cs) | Způsob zvýšení obsahu sacharózy u rostlin | |
| EP2621943B1 (en) | Modulation of solanaceae fruit ripening | |
| US7439419B1 (en) | Solanum tuberosum β-solanine/β-chaconine rhamnosyl transferase sequences and uses thereof | |
| BRPI0617411A2 (pt) | molÉcula de Ácido nuclÉico, isolada de coffea spp e vetor | |
| KR20140135719A (ko) | 종자 활력의 조절 | |
| US20040177405A1 (en) | Method for increasing stress-resistance to a plant | |
| Funatsuki et al. | Deficiency of a cytosolic ascorbate peroxidase associated with chilling tolerance in soybean | |
| US6538180B1 (en) | Method for increasing sucrose content of plants | |
| Yao et al. | Analysis of the rice SHORT-ROOT5 gene revealed functional diversification of plant neutral/alkaline invertase family | |
| EP1001029A1 (en) | Method for increasing sucrose content of plants | |
| JP2022044024A (ja) | アミロース含有率が低減されたソバ属植物 | |
| Ribeiro et al. | Engineering 6-phosphogluconate dehydrogenase to improve heat tolerance in maize seed development |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PD00 | Pending as of 2000-06-30 in czech republic |