CZ75597A3 - Biologically active, metal containing ribonucleotide polypeptide, process of its preparation and pharmaceutical composition containing thereof - Google Patents

Description

Bioaktivní, kov obsahující ribonukleoti dový polypeptid, způsob jeho výroby a farmaceutický prostředek, který ho obsahuje

Oblast techniky

Vynález se týká kov obsahujících ribonuk1eotidových polypeptidů (RNP) a způsobu jejich přípravy, jejich použití a léčiv obsahujících ribonuk1eoti dové polypeptidy případně protilátky proti ribonukleotidovým polypeptidům a/nebo jejich molekulárně biologickým ekvivalentním strukturám a/nebo částem a/nebo derivátům.

Dosavadní stav techniky

Tkáňová homeostáza těla, jeho orgánů a tkání závisí na regulačním mechanismu angiogenese (laterálním a směrovém růstu kapilár krevního řečiště). Ovlivňuje jak nápravu tkání a hojení ran, tvoření nových tkání v embryogenesi a v reprodukčních cyklech jakož také narůstání, zmenšování a ničení tumorů, transplantátů a tkání zásobovaných žilami a tkání prostých žil.

Dosud nebyly nalezeny nemitogenní mediátory umožňující ovlivňovat tkáňovou homeostázu, tedy navození růstu tkání a jeho regulaci.

Proto je úkolem vynálezu poskytnout nemitogenní mediátor tkáňové hotneostázy, kterým je možno ovlivňovat vynikajícím způsobem nápravu tkání, hojení ran, angiogenesi a neovaskularizaci. Dále je úkolem vynálezu poskytnout způsob výroby nemitogenních mediátorů a léčiva, které tento nemitogenní mediátor obsahuje.

Podstata vynálezu

Bioaktivní, kov obsahující ribonuk1eotidový polypeptid, spočívá podle vynálezu v tom, že obsahuje následující dílčí sekvenci nukleotidů v části R Ν Λ;

AAAGAGAAAGCUGCUCCGAAGNCAG a následující sekvenci aminokyselin nebo jejich dílčí sekvencí nebo derivát v peptidovém podíle

NH2-TKLEDHLEGIINIFHQYSVRLG

HYDTLIKRELKQLITKELPNTLKN

TKDQGTIDKIFQNLDANQDEQVSF

KEFVVLVTDVLITAHDNIHKE-COOH

S překvapením se totiž zjistilo, že existují nemitogenní buněčné mediátory na bázi kyseliny nukleinové s definovanou sekvencí, které mohou způsobovat specificky tvoření cév in vivo a in vitro a představují biologicky specifické, přirozeně působící nemitogenní mediátory angiogenese případně směrového růstu vlásečnic .

Podle vynálezu poprvé prokázaná nová třída buněčných morfogenů pro endothelové buňky existuje ve formě kovov obsahujících ribonukleotídových polypeptidů (RNP). Kovem může být s výhodou vápník, měď nebo zinek.

Kromě jiných obsahují v části RNA následující sekvenci nukleotidů nebo jejich části nebo jejich deriváty:

AAAGAGAAAGCUGCUCCGAAGNCAG

V proteinové části obsahují kromě jiného následující sekve.nc proteinů:

NH2-TKLEDHLEGIINIFHQYSVRLG

HYDTLIKRELKQLITKELPNTLKN

TKDQGTIDKIFQNLDANQDEQVSF

KEFVVLVTDVLITAHDNIHKE-COOH

Podle vynálezu je třeba sekvencím rozumět tak, že mezi ně spadají také RNP, u kterých v části RNP a/nebo v proteinové části došlo k záměně nukleotidů a/nebo aminokyselin oproti shora uvedeným sekvencím, případně že se vyskytují pouze části uvedených sekvencí.

Vynález se týká také DNA, kódovaných pro shora uvedené aminokyseliny, přičemž DNA zahrnuje;

(a) následující DNA nebo jednu z nich lišící se alespoň jedním párem bází reverzní trans 1atovaná 1-91

TKLEDHLEGIIN IFHQYSVR 20

ACC2iAGCTGGAGGACCACCTGGAGGGCATCATCAACATCTTCCACCAGTACTCTGTGCGG lghydtlikrelkqlitkel 40

CTGGGCCACTATGACACCCTGATCAAGCGGGAGCTGAAGCAGCTGATCACCAAGGAGCTG

PNTLKNTKDQGTIDKIFQNL 60 cccaacaccctgaagaacaccaaggaccagggcaccattgacaagatcttccagaacctg danqdeqvsfkefvvlvtdv 80 gatgccaaccaggatgagcaggtgtccttcaaggagtttgtggtgctggtgacagatgtg

LITAHDNIHKE 91

CTGATCACAGCCCATGACAACATCCACAAGGAG nebo

b) jednu DNA z (a) hydridizující DNA, nebo

c) jednu DNA z (a) nebo (b) příbuzná pres degenerovaný genetický kód .

Nukleotidy obsažené v části RNA se překládají do DNA;

RNA/DNA

AAAGAGAAAGCNGCNCCGAAGNCAG

CTGNCTTCGGNGCNGCTTTCTCTTT

RMP podle vynálezu se dále vyznačují následujícími vlastnostmi :

a) biologickými účinky in vitro a in vivo:

buněčně selektivním morfogenním působením in vitro na izolované primární nebo klonované endothelové buňky krevních vlásečnic v kultuře k nemitogennímu navození změny buněčného fenotypu z konfluentního stavu, k nemitogenní změně a zvýšení pohyblivosti buněk a k nemitogenní změně suprabuněčné organizace buněk v čase a prostoru na trojrozměrné organoidy, kapilárám podobné struktury v kultuře;

specifickým chemotropickým účinkem na krevní cévy in vivo; navozením směrového růstu (chemotropismu) krevních cév in vivo;

ve stadiu vytváření výhonků in vivo mají hroty rostoucích vlásečnic zvýšenou permeabi 1 i tu ;

navozováním novaskular izace tkání směrovým vrůstáním krevních cév;

nezjistitelným LD50 vzhledem k tomu, že nejsou lethální účinky;

chybějící mobilizací dospělých nebo mladých leukocytů (žádné leukocytové reakce nebo reakce posouvající doleva) in vivo; chybějícím přímým účinkem na hladké svalstvo in vitro; chybějícím spasmogenním působením na hladké svalstvo in vitro;

chybějícím spasmogenním působením na příčně pruhované svalstvo in vitro;

chybějícími endotoxinu podobnými účinky in vivo a in vitro; chybějícím chemickým lákáním (chemotaxí) leukocytů in vitro; chybějícím kladným nebo záporným chemokinetickým působením na leukocyty in vitro;

chybějícím účinkem na leukocyty simulujícím fagocytosu in vitro;

cybějícími patrnými šokovými nebo jinými systematicky odbourávajícími účinky okamžitého nebo protrabovaného typu v celkovém organismu in vivo;

chybějícím 1yse-působením na erythrocyty, thrombocyty, leukocyty, endothelové buňky a fibroblasty in vitro; chybějícím přímým zvyšováním permeability vlásečnic při kožním testu in vivo;

chybějícím přímým působením na leukocty, fibroblasty a endothelové buňky in vitro;

Zn/Cu/Ca-RNP mohou vyvíjet regulované a selektivní nukleázové účinky a mohou být modulovány a řízeny přes obsahy kovových iontů zinku, mědi a vápníku jako molekulární výhybka v jejich vzájemné bioaktivitě.

b) fyzikálně-chemickými a chemicko-strukturá]ηími vlastnostmi:

typickými vlastnostmi kyseliny ribonukleové (RNA) v komplexu RNP s polypeptidem (proteinem a ionty mědí, zinku vápníku), typickými vlastnostmi proteinu a proteinovými reakcemi polypeptidové části (reakcemi folinu a biuretu) v komplexu RNP s RNA a s ionty mědi, zinku vápníku, teplotou tání: přibližně 200 ’C {za rozkladu s vyloučením vzduchu a kyslíku), při hydrolyse například CuRNP v 5N HC1, 150 *C, 1 h se uvolňuje iont mědi a může být oddělen jako žlutý Černající oxid měďný, mohou vznikat, jako buněčné mediátory, elektroforickým pohybem při hodnotě pH 7,40 v akrylamidových matricích: anodicky nebo jako široké rozdělení v celé dráze (anomálním hydrodynamickým chováním), jsou rozpustné ve vodném prostředí včetně 20% ethanolu při hodnotě pH alespoň 4,0 až 10, konstantním teplotním součinitelem rozpustnosti v amoniumsulfátových roztocích o teplotě -10 *C až + 50 *C, kromě jiného obsahují aminokyseliny v polypeptidovém podíle

RNP: alanin (A), kyselinu asparagovou (D), glutanmovou (Ε), glycin (G), isoleucin (1), lysin (K), leucin (L) , prolin (P), arginin (R), serin (S), theonin (T), valin (V), tyrosin (Y), na 5-koncí nukleotidové sekvence jsou v části RNA RNP blokovány fosfátovým zbytkem, v komplexu RNP obsahují alespoň jeden iont mědi, v části RNA RNP obsahují modifikované báze, z nichž může být alespoň jedna reprezentována isoguanosinem, typickým absorpčním spektrem {v UV-oblasti, ve viditelné oblasti a v blízké IR-oblasti) kyseliny nukleinové (E2 to n m t E28O n m ) 1 molekulovou hmotností nativní RNP (primární struktura): pribl ižně 40 000 Daltonů (nejmenší společný násobek složek RNP), chybějící proteinovou quaterní strukturou v proteinové části RNP ve formě fyzikálně vázaných peptidových podjednotek, nativní protein sestává pouze z jedné peptidové jednotky (nejmenší společný násobek složek RNP), jsou rozpustné v anion i umsu 1 f átovéro roztoku při nasycení 90% (3,6 mol/1), hydrodynamicky se chovají anomálně, takže hydrodynamický ekvivalent molekulové hmotnosti se jeví přibližně 20-násobně menší než skutečná molekulová hmotnost složek ve formě nejmenšího společného násobku složek, pokud jsou stanovitelné gelovými chromatografickými, elektroforetickými a membránovými způsoby, pronikají proto membránami s jmenovitou mezí zbytku > 1000 Daltonů, absorbují vratně ve struktuře a bilogické aktivitě na anexech a katexech, kalciumfosfátový gel a hydroxylapatit a mohou být podrobovány nativně objemové dělicí chromatografií.

Bioaktivní RNP podle vynálezu jsou buněčnými mediátory hojení zánětů a ran s topobiochemickým a biologickým působením.

Jejich biologickou úlohou je navození a regulace nemítogenního směrového růstu cév. To může vést k novaskularizaci tkání. Vznikají in vitro u kultur leukocytů nebo in vivo u shluků leukocytů v zánětlivém místě vedle mnoha jiných hormonů a mediátorů.

Bíoaktivní RNP-morfogeny, připravené podle vynálezu, představují cenné tělu vlastní účinné látky. Lze jich použít například k ovlivňování vaskulárního stavu tkání (například tkání srdečního svalu, kosterních svalových tkání, plic, k hojení ran, v reprodukčních cyklech, v embryogenesi a u transplantací). Další možností použití je příprava brzdicích látek nežádoucí angiogenese a neovaskular izace tkání při patologických jevech u tuberkulosy, cukrovky, tumorů, reprodukčních cyklů a u transaplantací tkání. Jakožto mediátory působící jako parakrin mohou přenášet genetické informace od buňky k buňce (shutteln”). Dají se použít tím také v genové biotechnice k přenášení genetické informace s optimalizovaným podílem kyseliny nukleinové (horizontální přenos) a s enzymatickými účinky (aktivita nukleázy) k ovlivňování obsahu kyseliny nukleinové a buněčných funkcí (například k diferenciaci)

Bíoaktivní RNP-morfogeny podle vynálezu se mohou podávat jednotlivě nebo v podobě směsi, ve formě obvyklých léčiv lokálně savcům, například lidem, v množství > 1 fmol v koncentraci > 10 pmol/1. Prahová dávka účinnosti obnáší > 50 fmol, s výhodou 2,4 fmol. Tato léčiva se hodí ke specifickému ovlivňování angiomorfogenese a vaskulárního stavu tkáně těla savce. Tato léčiva mohou obsahovat ke splnění stejných úkolů také alespoň jeden anítiRNP-immunoglobulin a/nebo molekulárně biologické ekvivalentní struktury.

Způsob výroby a získávání bioaktivních RNP-morfogenň buněk reti kulo-endothe1 iá1 ηího systému leukocytů a zánětlivé tkáně, spočívá podle vynálezu v tom, že se buňky, například leukocyty nebo zánětlivá tkáň homogenizují nebo se leukocyty kultivují a vzniklé RNP-morfogeny se získají z homogenátů nebo ze supernatantního kultivačního roztoku,

V zásadě je též možné zpracovávat buňky , například leukocyty na med iátorech přímo bez kultury.

Buňky (leukocyty) lze v zásadě pěstovat v každém mediu, které je obsahuje.

Ke kultuře buněk, jako jsou leukocyty, se přidávají do kultivačního media při plánovaném pěstování přes 1 hodinu většinou séra, například telecí nebo koňské sérum, jelikož součásti séra jsou příznivé pro životní funkce buněk. Má-li však být roztok kultury, obsahující sérum, zpracován na proteiny (mediátory), které se kulturou vyrábějí, představuje získávání většinou jen v malých koncentracích získávaných produkovaných proteinů velké potíže pro velký počet cizích proteinů pocházejících ze séra. Kromě toho se při tom nedá bezpečně zjistit, zda je určitý medíátor humolárního nebo buněčného původu a od kterého druhu pochází, tedy zda jde o mediátor druhů, jejichž buňky byly pěstovány, nebo druhů, z nichž pochází použité (většinou heterogenní) sérum.

Podle vynálezu výhodně používané medium k pěstování buněk obsahuje obvyklé látkové skupiny, jako jsou soli, cukr, aminokyseliny, nukleosidy a nukleosidové báze, vitaminy, v i tam i no idy , koenzymy a/nebo steroidy ve vodném roztoku. Vyznačuje se tím, že že obsahuje jednu nebo směs několika přídavných látek, které se obzvlášt osvědčily jako užitečné pro životnost a růst leukocytů a pro jejich schopnost k výrobě mediátorů. K těmto látkám patří nenycené mastné kyseliny, flavonoidy, ubichinony, vitamin C a mevalolakton.

Medium k pěstování buněk se používá při dlouhodobém pěstování leukocytové kultury s výhodou bez přísady séra. Místo toho obsahuje alespoň jeden definovaný protein, který je v obzvlášť vhodné formě proveden jako vysoce čistý molekulárně jednotný sérový albumin.

V dalších vhodných formách provedení může podle vynálezu výhodně používané plně syntetizované séru prosté médium k pěstování buněk obsahovat ještě další pro kulturu leukocytů příznivé sloučeniny z látkových tříd polyhydřoxysloučenin a cukců, aminokyselin, nukleosidů, anióňtových sloučenin a/nebo vitaminů, jejichž použití není ve známých kultivačních mediích obvyklé. Součásti media, používaného podle vynálezu, jsou svými obsahovými poměry nastaveny tak, že koncentrace složek v mediu je do značné míry přizpůsobena přirozeným koncentračním rozsahům plasmy (Ciba-Geigy AG (vydavatel) (1969) ve Documenta Geigy, Wissenschaftliche Tabellen, 7. vydání Geigy S.A., Basilej),

S výhodou je medium k pěstování buněk prosté tensidů, solí těžkých kovů a barviv, které buňky poškozují a výrobu žádaných buněčných produktů mohou rušit.

Obzvlášť výhodné je pro pěstování buněk/leukocytů způsobem podle vynálezu kultivační médium o složení podlé následující tabulky I .

K přípravě media se používá vody kvality ATM-1 (ASTM D1193-70 Standard Spécification for Reagent Watér 1970-ročenka norem ASTM, Easton Maryland, ASTM 1970). Kr.omě toho je voda zbavena možných Zňečištěnin endotoxiny ultrafiltrací ňa membránách prostých tensidů s vylučovací mezí 10000 Ďaltonů. Hotové medium se filtračně sterilizuje na membránách prostých tensidů š velikostí pórů í 0,2 μιη.

Tabulka ϊ

Číslo	Složka	rool/1
1	KCI	5,0 tn
2	KH2P0q	0,2 m
3	NaCl	120,0 m
4	Na2HP0«	0,8 m
5	Na2S0q	0,2 m
6	kyselina L-askorbová	0,2 m
7	choli nch1or i d	50,0 μ
8	2-desoxy-D-ribosa	5,0 μ
9	D-galaktosa	0,5 m
10	D-glukosa	5,0 m
11	D-glukurono-gama-galakton	0,1 m
12	Glycerin	50,0 μ
13	mycí ' inos i t	0,5 m
14	Na-acetát	0,2 m
15	Na-citrát	50,0 μ
16	Na-pyruvát	0,1 ro
17	D-r i bosa	20,0 μ
18	kyselina jantarová	0,1 m
19	Xylit	10,0 μ
20	D-xylosa	20,0 μ
21	CaCl2	2,0 m
22	MgCl2	1,0 m
23	NaHCO3	10,0 tn
24	lidský sérový albumin	7,7 μ
25	penicill. in	1,0 μ
26	streptomycin	1,0 μ
27	L - g 1 u t a m i n	1,0 Dl
28	L-alan i n	0,2 m
29	L-asparag i n	0,1 m
30	kyselina L-asparagová	0,1 m

Složka mol/1

kyselina L-glutamová	OJ	m
g 1 y c i n	0,2	m
L-prolin	0,1	m
L - s e r i n	0,1	m
L-arginin	0,1	Hl
kyselina 4-aminobenzoová	2,0	μ
L-cyste in	0,2	ID
L-hystidin	0,1	m
L-hydroxypro1 i n	10,0	μ
L-isoleucin	0,2	ID
L-leucin	0,2	tn
L-lysin-HCl	0,2	m
L-methionin	0,1	m
L-ornithin	50,0	μ
L-f enylalan i n	0,1	m
sarkosin	50,0	μ
taur i n	0,1	m
L-threonin	0,2	m
L-t.r y ptof an	50,0 μ	l
L-tyros in	0,1	m
- v a 1 i n	0,2	m
redukovaný glutathion	3,0	μ
karnos i n	5,0	μ
aieval o 1 akton	5,0	μ
aden i n	50,0	μ
adenos i n	50,0	μ
cyt i d i n	50,0	μ
guan i n	5,0	μ
guanosin	20,0	μ
hypoxanthin	5,0	μ
5-methy1cytosi n	5,0	μ
thymidi n	20,0	μ

Složka mol/1 thymin 5,0 μ uráčil 5,0 μ uridin 20,0μ xanthin 5,0 μ biotin 1,0 μ

D-Ca-pantothenát 5,0 μ ergokalcifero1 0,5 μ

D,L-karnitbin 50,0 μ kyselina folová 5,0 μ kyselina D,L-α-Ιiponová 2,0 μ menadion 0,2 μ amid kyseliny nikotinové 20,0 μ pyridoxal-HCl 5,0 μ pyridoxin-HCl 2,0 μ riboflavin 1,0μ rutin 5,0 μ thiamin-HCl 5,0 μ

D,L-α-tokoferylacetát 1,0 μ vitamin-A-acetát 1,0 μ vitamin Ki 0,2μ v i tamin Bi 2 0,5 μ vitaminU 1,0μ cholesterin 1,0μ koenzym-Qi o 0,1 μ kyselina li notová 1,0 μ kyselínalinolenová 5,0μ kyselina olejová 5,0 μ etbanol 1,0 m pH 7,10 konkanavalin 50,0 n

Podle druhu požadovaných produktů se pěstují buď smíšené po pulace buněk a leukocytů nebo jednotlivé druhy buněk a-leukocytů. Výroba a pěstování buněk, případně leukocytů musí probíhat za sterilních podmínek. K dosažení uspokojivého výtěžku mediátorů probíhá pěstování po dostatečně dlouhou dobu. K tomu se osvědčila doba přibližně 10 až 50 hodin. Při kratších dobách je výtěžek mediátoru příliš malý, takže se postup stává nehospodárným. Při době pěstování delší než přibližně 50 hodin, je na druhé straně medium vyčerpáno a buňky začínají odumírat, takže zvyšování výtěžku nelze očekávat.

Pěstování kultury buněk případně leukocytů probíhá při teplotě 30 až 42 ’C, s výhodou přibližně 37 ‘C. Při nižších teplotách je pěstování neuspokojivé, zatímco při teplotách nad 42 *C se buňky, případně leukocyty poškozují.

Pěstování kultury buněk se provádí při koncentraci přibližně 10⁶ až 5 x 10« buněk/ml, s výhodou 10⁷ až 10® buněk/ml. Při nižších koncentracích buněk je výtěžek na objemovou jednotku kultivačního roztoku příliš malý. V důsledku velkého kultivačního objemu je postup nehospodárný. Při koncentraci buněk nad 5 x 10® buněk /ml dochází velmi rychle k ochuzení media o živiny.

Pěstování kultury buněk se může provádět v ovzduší. S výhodou se nad kulturou udržuje zvýšený parciální tlak oxidu uhličitého, který může dosahovat přibližně až 10 objemových % , obzvláště přibližně 2 objemová Z. Velký význam má zajišťování kyslíku v kultuře. Lze to provést například přiváděním vzduchu. Aby se zabránilo znečištění kultury, je přiváděný vzduch s výhodou sterilizován a tepelně zbaven nečistot, tedy endotoxinů a jiných organických součástí. Roztok se může v průběhu pěstování míchat nebo protřepávat, Jako buněčný slimulát.or slouží s výhodou lektin, výhodně z Canavalia ensiformis (Con A).

Ke konci pěstování se buňky, případně leukocyty z kultivačního roztoku odstředí, kultura se pak zpracuje na vzniké mediátory. Aby se zabránilo poškození buněk a tím znečištění kultivačního roztoku buněčnými částmi, odstředí se kultura při poměrně malém zrychlení, tedy přibližně 300 až 400 x g. Po oddělení větší části buněk od zbytku se účelně supernatant znovu odstředí při větším zrychlení k odstrnění zbylých vznášejících se částic. Oddělené buňky přípdně leukocyty mohou být znovu kultivovány, uloženy kryotechnicky a nebo jinak použity.

Kromě pěstování leukocytů mohou být biologicky aktivní morfogeny RNP podle vynálezu získávány také ze zánětlivých tkání. Tam vznikají hromaděním leukocytů v důsledku zánětlivého procesu způsobeného poškozením tkáně. Zánětlivou tkáň lze získat obvyklým způsobem a použít ji k přípravě RNP. K tomu se zánětlivá tkáň homogenizuje v pufrovém roztoku a rozpustné součásti (exudát) se od nerozpustných strukturních součástí zbývající tkáně oddělí.

S výhodou se používá zanícené infarktované tkáně srdečního svalu, která se tvoří spojením levé přední vyčnívající větve levé koronární arterie pomocí transfemorální katetrové techniky během 24 hodin. Zanícená část srdečního svalu, obsahující leukocyty, se při teplotě 0 až 4 *C od ne infarktové, zdravé tkáně oddělí.

K izolování a získání bioaktivních RNP podle vynálezu je potřeba zpracovat velmi značný objem kultivačního roztoku. Na počátku čisticího procesu je proto z praktických důvodů nutno provést co nejúčinnější zmenšení zpracovávaného objemu. Kulurní roztok obsahuje vedle malého množství vyrobených látek, mezi nimi hlavně proteinů, směs součástí media, S výhodou se proto v první operaci čištění oddělí vzniklé proteiny od součástí media a současně od velkého objemu vodného roztoku. To se dá ovlivnit selektivním vysolením proteinů z kulurního roztoku, kterého se dá do15 sáhnout například přidáním sulfátu nebo fosfátu. Pak se vysráží proteiny podle popsaného příkladu vysolení přísadou síranu amonného do kultivačního roztoku.

Nasycením kultivačního roztoku síranem amonným se vysráží větší část vzniklých proteinů s případně obsaženým serumalbuminem. Po oddělení sraženiny látek například odstředěním, je možno ji rozdělit na její jednotlivé složky dále popsaným postupem a získat obsažené bioaktivní RNP. Získaný supernatant obsahuje vedle rozpustných součástí media také část látek rozpustných v nasyceném roztoku síranu amonného, mezi nimiž se nachází také část hioaktivních RNP. Zbytek se zkoncentruje a obsažené látky se z něj získají následujícím postupem. Když se kultivační roztok obsahující proteiny smíchá se síranem amonným až do nasycení, vysráží se větší část doprovodných proteinů. Tím se získá směs proteinů sestávající z určitého počtu různých proteinů a jejichž oddělení na jednotlivé díly je v důsledku toho obtížné. Podle výhodného provedení vynálezu se směs proteinů, obsažená v kultivačním roztoku, proto odděluje již ve vysrážecím stupni na několik frakcí. Toto rozdělení na několik proteinových frakcí je možné, jelikož jednotlivé proteiny vypadávají při různých koncentracích síranu amonného. S výhodou se proto kultivační roztok při způsobu podle vynálezu směšuje postupně se síranem amonným až do určitých stupňů nasycení, přičemž v každé frakci vypadne část proteinů, jejíž rozpouštěcí produkt leží pod příslušným stupněm nasycení. Vhodnou volbou mezí nasycení jednotlivých frakcí se dá docílit při způsobu podle vynálezu hrubého rozdělení do skupin proteinů už při vysrážení.

Například se kultivační roztok směšuje napřed až do 3 5% nasycení síranem amonným. Obsažená sraženina proteinu se oddělí.

Pak se zvýší stupeň nasycení zbylého roztoku na 45%. Vytvoří se opět sraženina proteinů, která se oddělí. Nakonec se zbylý roztok nastaví ria supen nasycení 90%. Při tom vzniklá sraženina proteinů se rovněž oddělí. Zbylý roztok se například zkoncentruje 'odvodňovat: í dialysou nebo ultrafiltrací. ;

Vysrážehí solí proteinů a rovněž následné čištění se provádí s výhodou při teplotě přibližně 0 až 10 *C, obzvláště přibližneě 0 až 4 ’C. Roztoky použité k čištění mají hodnotu pH 5 až 9 obzvláště 6 až 8. K dosažení konstantní hodnoty pH roztoku se přidává před vyšrážením soli silný pufr, například 0,1 mol/1 fosfátového pufru. K udržení redoxpotenciálu proteinů se do roztoků přidává s výhodou cystein v množství 0,001 mol/1. Sterilní podmínky nejsou při čištění proteinů nutné.

Proteiny, získané při vysrážení solí, mohou být po rozpuštění v mediu proteiny nepoškozujícím přímo .zaváděny dó dále.popsaného čištění a oddělování. Zbytek posledního stupně vysrá/žení se zkoncentruje například odvodňovací dialysou nébo ultrafiltřací. Přitom se všechny součásti s molekulovou hmotností větší než přibližně 300 až 500 Dalto.nů, tedy také proteiny a peptidy této frakce kvantitativně uchovají jako retentát.

Frakce proteinů, získané v předchozím popsaném stupni, obsahují biologicky aktivní RNP podle vynálezu ve směsi s četnými cizími proteiny (jinými secernovanými proteiny, případně seřumalbúminem a případně CON). Gizí proteiny se ve směsích . vyskytují v daleko převažující míře. Řadou čisticích operací musejí být biologicky aktivní RNP obohaceny a odděleny od cizích proteinů do té míry, že už nenarušují jejich molekulární biologickou specifitu. Biologicky aktivní RNP jsou samy o sobě třídou látek, která se rozdělí ila jednotlivé, specificky působící individuální látky.

Čisticí postupy bílkovin (proteinů) a jiných přírodních lá..tek„sestávají obecně ze sekvence kombinovaných oddělovacích postupů, které využívají k oddělování rozdílů velikostí molekul, napětí, tvaru, strukturní stability a stavu povrchu nolekul mezi hledanou účinnou látkou a doprovodnými cizími látkami. Podle toho lze vypracovat četné kombinace oddělovacích postupů k vyčištění proteinu. Pro manipulační vlastnosti, technickou proveditelnost, možnost automatizace a hospodárnost čisticího postupu má proto význam nejenom samotný druh použitých oddělovacích operací, ale obzvláště jejich optimalizované uspořádání a jejich účelná kombinace v následnosti Čisticích operací v rámci strukturní stability a jiných strukturních parametrů hledané účinné látky. To také znamená, že samotné použití stejných nebo podobných oddělovacích principů (například filtrace molekulárním sítem, dialysa, iontoměničová adsorpce), avšak v různé kombinaci, mohou být pro manipulační schopnost a hospodárnost čisticího procesu rozhodující. V určitých případech má rozhodující význam pro kvalitu hledané účinné látky jakož i man ipulovate1nost a hospodárnost postupu jejího čištění použití nebo vynechání jedné jediné techniky (například hydroxylapaptitové chromatografie, zonální precipitaČní chromatografie) v určitém místě čisticí sekvence, nebo v omezené dílčí sekvenci. Tyto obecné souvislosti a základní principy čištění přírodních látek vyplývají zřetelně například z všeobecně známé skutečnosti, že v ekonomicky rozumném a v technicky proveditelném postupu Čištění přírodních látek není účelná operace čištění sloupcovou chromatografií nebo 1yofi 1 izačním postupem, pokud celkový objem a výchozí koncentrace doprovodných součástí cizích látek extraktu účinné látky není jinými postupy snížena na alespoň 1/500 až 1/1000 jinými operacemi.

Pro čištění jednotlivých proteinových frakcí se nabízí řada čisticích operací jednotlivě v biochemii o sobě známých. Příklady takových čisticích operací jsou: preparativní a analytická filtrace molekulárním sítem, anexová a katexová chromatografie, případně adsorpce prováděná v jedné nádobě, chromatografie na hydroxylapatitu, zonální precipitaČní chromatografie a oběhová nebo kaskádová filtrace molekulárním sítem.

Už jednorázovým provedením jmenovaných čisticích postupů může být odděleno patrné množství doprovodných proteinů od biologicky aktivní RNP. Přes svou rozdílnou molekulovou hmotnost ulpívají však často na sobě velmi silně látky obsažené ve frakcích. Oddělují se například při filtraci molekulovým sítem vlivem existence neideálních rovnovah u proteinových polyelektrolytů často neúplně vzhledem k jejich molekulové hmotnosti. Doporučuje se proto provést za sebou nejméně dvě jmenované oddělovací operace. S výhodou se podrobují frakce proteinů, obsahující biologicky aktivní RNP, nejméně třem po sobě následujícím čisticím operacím.

Vynález se týká všech zmíněných dílčích operací. Přitom je věcí stavu znalostí odborníka, že některé následky oddělovacích operací jsou méně účelné než jiné kombinace. Například je si odborník vědom, že se dosáhne horšího celkového výsledku z hlediska oddělovacího účinku při provádění preparát, ivní filtraci molekulovým sítem po analytické filtraci molekulovým sítem než při opačném řazení operací.

Filtrace molekulovým sítem způsobuje oddělování proteinů podle jejich molekulových hmotností. Jelikož má převažující část doprovodných proteinů jinou molekulovou hmotnost než biologicky aktivní RNP, je jejich oddělení tímto způsobem možné. K oddělování látek podle jejich molekulové hmotnosti se používá hydrofilního, ve vodě bobtnajícího molekulového síta. Příklady vhodných molekulových sít jsou epichlorhydrinem zesítěnč dextrany (Sephadex), arylamidem zesítěné agarosy (Ultrogely) a prostorově zesílené akrylamidy (Biogely), jejichž vylučovací meze jsou větší než separační meze používané k oddělování.

Pokud se použije většího počtu oddělovacích stupňů, provede se s výhodou filtrace molekulovým sítem jako první z nich. Podle poměru délky k průměru použitého sloupce a podle průměru částic gelové matrice, které ovlivňují teoretický počet pater ve sloupci, se filtrace molekulovým sítem označuje jako preparativní a analytická'’. Jako preparativní se označuje, provádí-li se chromatografie na sloupcích, jejichž poměr délky k průměru je až 10:1 a náplň činí až 1/3 obsahu sloupce, případně při plném využití celkového separačního objemu typického pro matrice. Analatický” znamená poměr délky k průměru nad 10:1, s výhodou přibližně 50:1 a náplň až maximálně 3 X obsahu sloupce, i při verzích HPLC.

Při preparativní chromatografií molekulovým sítem se používá gelových matric s co možno velkou velikostí částic, k docílení rychlého průtoku a často poněkud vískosních proteinových roztoků při pokud možno malých tlacích. Při analytické chromatografií molekulovým sítem se volí co možno nejmenší velikost částic gelové matrice k docílení maximálního teoretického počtu pater při tlaku použitelném z technického a bezpečnostního hlediska k docílení průtočné rychlosti mobilní fáze 2 až 4 cm³/h. Tyto parametry závisí na struktuře gelové matrice a jsou u různých gelů různé.

V případě, že se provádí více preparativních filtrací molekulovým sítem následně za sebou, může být separační mez volena odstupňovaně. Na to může navazovat analytická filtrace molekulovým sítem s příslušně odstupňovanými separačními mezemi. Vylučovací mez použitého gelu musí být v každém případě větší než přibližně 10 000 Dal tonů k umožnění objemového rozdělení RNP mezi stacionerní fázi gelových částic a mobilní vodnou pufrovou fázi.

Pojem vylučovací mez označuje hydrodynamický parametr rozpuštěné částice, který odpovídá velikosti póru gelové matrice.

Částice s větším hydrodynamickým parametrem už nemohou proniknout do gelové matrice (součinitel objemového rozdělení K d - 0). Pojmem separační mez se označuje hydrodynamický parametr účelně stanovený k oddělení rozpuštěných částic, ležící mezi součinitelem objemového rozdělení Ko -0 a Ko = 1.

K filtraci molekulárním sítem se na molekulární síto nanášejí látky rozpuštěné v kapalině, která látky nepoškozuje. Specielnějším příkladem vhodného rozpouštědla je roztok 0,003 mol/1 natriumkalíumfosfátu s obsahem 0,3 mol/1 chloridu sodného a 0,001 mol/1 cysteinu a s hodnotou pH 7,4. Po filtraci se frakce obsahující RNP koncentrují dále popsaným způsobem a podrobují se případně další čisticí operaci.

Jako anexy k čištění látek se hodí například epich1orhydri nem zesítěné dextranové (Sephadex) nebo celulózové matrice, na něž jsou napojeny funkční skupiny s anexovou schopností. Po použití je možno je regenerovat a znovu použít. S výhodou se používá slabého anexu předběžně nabobtnalého a vyváženého v pufrovém roztoku ve formě Cl', jako je DEAE Sephadex-A 50 a zpracování se provádí při hodnotě pH 8 až 10. Specielním příkladem takového pufrového roztoku je 0,01 mol/1 kyseliny tris-chlorovodíkové, která obsahuje 0,04 mol/1 chloridu sodného a 0,001 mol/1 cysteinu a má hodnotu pH 8,0.

Při použití anexu se látková frakce přidává do takového množství anexu, které postačí k úplné adsorpci RNP a pozitivně adsorbujících doprovodných proteinů. Obvykle k tomu stačí dva objemy nabobtnalého anexu na jeden objem koncentrované proteinové frakce. Reakce může být uspořádána buď jako chromatografie nebo jako snadněji ovladatelný postup v jedné nádobě. Při postupu v jedné nádobě se přebývající kapalina s negativně adsorbovanými proteiny oddělí od anexu nabitého pozitivně adsorbovanými RNP a jinými látkami, například filtrací (v chromatografickém sloup- 21 cí), deka n tací nebo odstře (i Čním (při postupu v jedné nádobě).

Nabitý anex se zbavuje ulpělých, negativně adsorbovaných sloučenin promytím vodou nebo solným roztokem s ekvivalentní maximální iontovou silou odpovídající až 0,04 mol/1 chloridu sodného, s výhodou při teplotě maximálně 15 *C. Speciálním příkladem solného roztoku, vhodného k promývání, je zmíněný roztok pufru Tris-HCj s hodnotou pH 8,0.

Anex, zbavený negativně adsorbovaných sloučenin, nabitý RNP a jinými látkami, se eluuje vodným solným roztokem nepoškozujícím proteiny, který má iontovou sílu větší než odpovídající 0,04 mol/1 chloridu sodného a hodnotu pH 4,0 až 10,0. S výhodou se používá solného roztoku s velkou iontovou silou a s hodnotou pH 5,0 až 7,0. Speciálním příkladem takového solného roztoku je roztok 2,0 mol/1 chloridu sodného pufrovaný kyselinaou piperazinchlorovodíkovou s hodnotou pH 6,5, který obsahuje 0,001 mol/1 cysteinu .

Je-li anexová reakce uspořádána jako cbromatografický postup, může eluování RNP a jiných látek probíhat také s lineárním gradientem koncentrace chloridu sodného.

Jako katexy se hodí k čištění proteinových frakcí například epich1orhydrinem zesítěný Dextran-(Sephadex} nebo celulozóvé matrice, na něž jsou napojeny funkční skupiny s katexovou schopností. Po použití je možno je regenerovat a znovu použít. S výhodou se používá slabě kyselého katexu ve formě Na⁺, jako je CM-Sephadex C-50 a zpracování se provádí při hodnotě pil 4 až 6. Ke snadnějšímu nastavení rovnováhy nabití se mohou frakce látek před zpracováním katexem rozředit solným roztokem nepoškozujícím proteiny, který má ekvivalentní maximální iontovou sílu 0,04 mol/1 chloridu sodného. Může současně sloužit k nastavení hodnoty pH.

Speciálním příkladem takového solného roztoku je 0,001 mol/1 káli umf o sfát-acetátový pufrový roztok ε obsahem 0,04 mol/1 chloridu sodného a s hodnotou pH 4 až 6. Tato katexová reakce může být, uspořádána jako chromatograficky postup stejně jako snáze ovladatelný postup v jedné nádobě.

Katex se přidává do frakce látek v množství postačujícím k adsorbování proteinové frakce. Obvykle k tomu stačí dva objemové díly nabobtnalého iontoměniče na jeden díl proteinové frakce. Nato se oddělí přebytečná kapalina od katexu nabitého látkami například dekantací nebo odstředěním. Nabitý katex se zbaví ulpělých neadsorbovaných sloučenin promytím vodou nebo solným roztokem s maximální ekvivalentní iontovou silou 0,04 mol/1 chloridu sodného, s výhodou s hodnotou pH přibližně 4 až 6 při teplotě maximálně 15 'C. Speciálním příkladem takového solného roztoku, vhodného k promývání, je zmíněný kaliumfosfát-acetátový pufrový roztoku s hodnotou pH 5,0.

Katex zbavený adsorbovaných sloučenin, nabitý látkami, se nyní eluuje vodným solným roztokem nepoškozujícím proteiny a nukleinové kyseliny. S výhodou se k tomu používá solného roztoku s vysokoii iontovou silou a s hodnotou pH přibližně 4 až 10. Speciálními příklady takových solných roztoků jsou vodný roztok 0,5 mol/1 fosforečnanu draselného s hodnotou pH 6,5 až 7,5 nebo roztok 2 až 5 mol/1 chloridu sodného se stejnou hodnotou pH.

Pro chromatografi i na hydroxy1apati tu se před nanesením na hydroxylapat.it odstraňují pokud možno soli z předchozích operací, například síran amonný a především fosfáty, s výhodou dialysou nebo u 11rafi 1trací na membráně s vylučovací mezí 500 Daltonů. Nezávisle na zvýšení viskozity cizími přísadami je však k tomu, aby se chromatografíe na hydroxylapat i tu zdařila, rozhodující koncentrace fosfátů v proteinovém roztoku. Eluování látek probíhá vlivem koncentračního gradientu fosforečnanu draselného, který je s výhodou lineární. Frakce obsahující RNP se shromáždí a zkoncentru jí se dále popsaným způsobem.

Použití hydroxylapat.itu má pro získávání strukturu chránící“ ho kov obsahujícího RNP v čistém stavu rozhodující význam. Z technických a z ekonomických důvodů je to však spojeno se značnými obtížemi, mají-li se chromatografoval větší objemy látek na hydroxy 1 apaptitových sloupcích. Jednak má hydroxylapatit totiž při větších objemech látek sklon k ucpávání a stává se tak nepoužitelným. Jednak je hydroxy1 apatit drahý, což je v rozporu s použitím ve větším měřítku. Z toho důvodu se při způsobu podle vynálezu s výhodou oddělí z látkových frakcí, ve kterých jsou biologicky aktivní RNP obsaženy ve stopách, před chromatografií na hydroxy3apapti tu větší díl doprovodných cizích proteinů vhodnými operacemi a tím se rozhodujícím způsobem zmenší objem proteinů, který musí být vnesen na hydroxylapat it.

Při zonální precipitační chromatografií (J. Porath, Nátuře, sv. 196, str. 47 až 48, 1962} se oddělují proteinová znečištění bioaktivních RNP vysolovací frakcionací proteinů pomocí gradientu koncentrace soli.

Základním principem oddělování proteinů pomocí zonální precipitační. chromatografie jsou odlišné, strukturu určující reversi vη í rozpouštěcí vlastnosti proteinů a RNP. Patří k nejcitlivějším molekulárním oddělovacím parametrům a často se jich používá jako kritéria pro důkaz molekulární jednotnosti proteinu. Při tom se mohou měnit teploty a hodnota pH, rozměry sloupce, druh soli, tvar gradientu a nabití sloupce v poměrně širokých mezích. Při zonální precipitační chromatografií může teplota obnášet přibližně 0 až 40 ’C. Výhodnou je teplota přibližně 0 až 10 'C, obzvláště přibližně 4 až 6 C. Hodnota pH může být v rozmezí 6 až 8, obzvláště přibližně 7. Poměr délky k průměru použitého sloupce má být větší než přibližně 10:1, s výhodou 30 až 100:1, obzvláště přibližně 50:1. Jako soli přicházejí v úvahu všechny solí nepoškozující proteiny a nukleinové kyseliny. Příklady takových solí jsou fosforečnan sodnodraselný, síran amonný a síran sodný. S výhodou se používá síranu amonného.

Gradient koncentrace solí může mít jakýkoli tvar, pokud jsou vysolovací body proteinů přiměřeně odděleny v průběžném směru. Výhodné jsou lineární gradienty koncentrace, obzvláště stoupající gradient koncentrace s 25 až 100X nasycením síranu amonného. Nabití sloupce obnáší nejvýše 5X s výhodou IX.

Oběhovou nebo kaskádovou filtraci molekulovým sítem lze provádět za shora popsaných podmínek pro molekulovou filtraci. Použít lze stejných molekulových sít a stejných podmínek sloupce. Výhodný je Sephadex G 50 při poměru délky k průměru nejméně přibližně 50:1 a s nabitím nejvýše 3 X obsahu sloupce. Jako rozpouštědla k eluování se s výhodou používá rozpouštědla použitého při analytické filtraci molekulovým sítem.

Při oběhové filtraci molekulovým sítem se přivádí eluát při stanovených separaěních mezích v oběhu opět do stejného sloupce. Tímto způsobem se diferenčně prodlužuje dráha molekul. Při jiném provedení, při kaskádové filtraci molekulovým sítem, se eluát při stanovených separaěních mezích přivádí na sloupec se stejnými nebo podobně definovanými parametry.

Mezi popsanými čisticími operacemi mohou být získané roztoky látek obsahující biologicky aktivní RNP čištěny a koncentrovány k následným oddělováním pro t.e i ηύ/RNP od nežádoucích solí. Tato koncentrace (oddělování velké části vodného solného roztoku od látek) může probíhat různým způsobem. Například mohou být koncentrovány biologicky aktivní RNP a doprovodné látky ultrafiltrací nebo odvodňovaní dialysou na membráně s vylučovací mezí 500 Dalt o η ů nebo lyofilizací. K tomu se dá použít i filtrace na molekulovém sítu volbou odpovídající obvyklým způsobem modifikované mobilní fáze. Při filtraci molekulovým sítem se do roztoku látek přidává s výhodou přibližně 0,4 mol/1 síranu amonného. Oproti vyšším koncentracím má síran amonný v této koncentraci silný vysolovací účinek oproti proteinům. Těmito opatřeními se podle toho proteiny během filtrace molekulovým sítem v roztoku udržují. Síran amonný dále zabraňuje růstu bakterií a brzdí určité enzymy. Tím to přispívá ke stabilizaci biologicky aktivních RNP, především provádí-li se chromatografie při vyšších teplotách (přibližně nad 20 ’C) a za nést, erilních podmínek.

Teplota a podmínky hodnoty pH nejsou při provádění čisticích operací obzvlášť rozhodující. Je-li dbáno nativní konformace látek, doporučuje se dodržovat teplotu v rozmezí přibližně 0 až 8 'C, s výhodou přibližně 0 až 4 ’C. Dále musejí být oddělovací a čisticí operace prováděny za podmínek v podstatě fyziologické hodnoty pH a solí. Významnou předností způsobu podle vynálezu je, že dodržování těchto podmínek je poprvé snadno možné. Aby se zabránio oxidaci, je roztok látek s výhodou dále směšován s přibližně 0,001 mol/1 cysteinu.

Biologicky aktivní RNP se dají uchovávat v pufrovaném fyziologickém solném roztoku, například v roztoku 0,0015 mo]/l fosforečnanu sod nud rase 1 ného obsahujícího 0,15 mol/1 (0,9 %) chloridu sodného a 0,001 mol/1 cysteinu a vykazujícího hodnotu pH 7,4, po obvyklé filtrační sterilizaci (s velikostí pórů 0,2 μπι) nativní a biologicky aktivní i při teplotě místnosti (po dobu nejméně 200 hodin) nebo ve zmraženém stavu na -25 ’C (po dobu nejméně 5 let). Tuto stálost biologicky aktivních RNP je možno považovat kromě jiného za jedno z kriterií jejich vysoce čistého stavu.

Biologicky aktivní RNP lze vyrábět také za použití chemicky nebo biologicky syntetizovaných dílčích sekvencí nebo částí a mohou se z nich vyrábět homologové sekvence. Výhodné je, jestliže se použije chemicky nebo biologicky syntetizovaných oligonukleoti dových nebo protismyslných nukleotidových sekvencí in vivo nebo in vitro, které kódují dílčí sekvence s nejméně G bázemi v reakci PCR nebo jestliže se nasadí prosti smyslná technika biologických procesů.

Vynález blíže objasňují, nijak však neomezují, následující příklady praktického provedení. V příkladech je podrobně popsáno získávání morfogenů RNP z leukocytů vepřové krve. Vynález není na tuto formu provedení omezen. Použít je možno také buněk retikuloendothe1 iálního systému, případně zánětlivé tkáně ran nebo kapaliny (exsudátu) jiných savců.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

Vysvětlena je výroba biologicky aktivních RNP z kultivačního roztoku smíšené populace leukocytů a oddělení monocyto-CuRNP od ostatních součástí kultivačního roztoku. Pokud není uvedeno jinak, jsou veškeré pracovní operace prováděny při teplotách 0 až 8 ’C za přítomnosti 0,001 mol/1 cysteinu. Odstřeďování probíhá jak popsáno buď jednostupňově nebo dvojstupňové (jako průtočné od střeďováni).

Izoluje se 50 kg (přibližně 10¹) leukocytů jako směsná buněčná populace fyziologického složení z 10 000 litrů vepřové krve a kultivuje se za sterilních podmínek ve 20 dávkách po 2,5 kg (přibližně 10¹² buněk). Jako kultivační roztok se použije například medium uvedené v tabulce I. Na jednu kulturu připadne 50 1 kultivačního media Pěstuje se ve skleněných nádobách. Hustota buněk obnáší zpočátku 10 ⁰ bunek/ml. Kultura se udržuje při teplotě 37 *C. po dobu 40 hodin v atmosféře objemově 1% oxidu uhličitého. Během této doby se suspense buněk pomalu promíchává (za počtu otáček 60/min) a nechá se prohub lávat sterilními vodou promytými malými (menšími než 1 mm) bublinami vzduchu (přibližně 5 1/h vzduchu) prostého pyrogenň přiváděnými křemennou trubicí, dekontaminovanou při teplotě přibližně 500 C. Přídavně k parciálnímu tlaku vzduchu se měří a udržuje na konstantní výši hodnota pH (7,1) a hladina D-glúkosy. Obsahem polyvalentního lektinu (CON) v kultivačním mediu se buňky během pěstování stimulují. Obvyklými hematologickými metodami techniky pěstování buněk se průběžně sleduje počet, diferenciál a morfologická životnost buněk (testem vylučování barviva). Funkční životnost buněk se měří jejich pohyblivostí a sti mu 1 ovate1 ností chemickými a chemotaktickými proteiny. Mitosy se určují sčítáním chromosomů. Na konci biotechnického pěstování je morfologická životnost buněk > 85%. Celková ztráta buněk (hlavně granulocytů) během pěstování je maximálně 20 X, což je u primárních buněčných kultur normální.

Kultivace se ukončí oddělením buněk od zbylého roztoku 10minutovým odstředěním při 500 x g a při teplotě 10 * C. Buňky se promyjí dvakrát solným roztokem, který obsahuje 0,15 mol/1 chloridu sodného a 0,0015 fosforečnanu sodnodrase1 něho a vykazuje hod notu pil 7,1, Lze jich dále použít.

Kultivační roztok se pak znovu odstřeďuje jednu hodinu při 10000 x g pří teplotě 4 ’C k odstranění vznášejících se částic. Získaný čistý kultivační roztok (celkově 1000 litrů s obsahem přibližně 1400 g proteinů a jiných makromolekul) se pak bezprostředně podrobuje vysolovací frakcionaci síranem amonným.

1. Operace čištění (vysolovací frakcionace)

Kultivační roztok se smísí s 0,5 mol/1 pufrového roztoku fosforečnanu sodnodraselncho až do konečné koncentrace 0,1 do koncentrace 0,001 roztok na koncentraci 35% nasyg síranu amonného na litr rozkontroluje hodnota pH roztoku mol/1. Dále se přidá pevný L-cystein až mol/1, Pak se nastaví kultivační cení síranem amonným přísadou 199 toku. Během přísady se průběžně a přidáním 2n amoniaku se udržuje na 6,7. Část proteinů se z roztoku vysráži. Proteinová sraženina se oddělí od zbytku obsahujícího rozpuštěné látky jednohodi no vým odstředěním při 10 000 x g. Získá se proteinová frakce 1 v podobě proteinového kalu obsahujícího síran amonný, který obsahuje přibližně 100 g proteinu.

Následně se nastaví kultivační roztok přísadou 60 g síranu amonného na 1 1 roztoku na koncentraci 45% nasycení síranem amonným. Během přísady se průběžně kontroluje hodnota pH roztoku a přidáním 2n amoniaku se udržuje na 6,7. Z roztoku se vysráži další část proteinů. Proteinová sraženina se oddělí od zbytku obsahujícího rozpuštěné látky jednohodi novým odstředěním při 10 000 x g. Získá se proteinová frakce 2 v podobě proteinového kalu obsahujícího síran amonný, který obsahuje přibližně 60 g proteinu. Proteinová frakce 2 může být. rovněž oddělena a dále popsaným způsobem zpracována k získání jejích obsahových látek.

Pak se přísadou 323 g síranu amonného na 1 1 roztoku nastaví kultivační roztok na koncentraci 90% nasycení síranem amonným. Během přísady se průběžně kontroluje hodnota ρH roztoku a přidáním 2n amoniaku se udržuje na 6,7. Z roztoku se vysráži další část. proteinů. Proteinová sraženina se oddělí od zbytku obsahujícího rozpuštěné látky jednohodi novým odstředěním při 10 000 x g. Získá se. proteinová frakce 3 v podobě proteinového kalu obsahujícího síran amonný, který obsahuje přibližně 1080 g proteinu. V této frakci se nachází také velký podíl sérového albuminu. Proteinová frakce 3 se rovněž zpracovává dále popsaným způsobem k získání jejích obsahových látek. Přebytek 4 surové frakce obsa29 huje 160 g proteinu a jiné makromolekuly. V tomto přebytku se nacházejí biologicky aktivní jednobuněčné RNP.

Přebytek 4 obsahující proteiny še zředí stejným objemem pufrového roztoku A (0,15 mol/1 chloridu sodného, 0,0015 mol/1 fosforečnanu sodnodřaselného, 0,001 mol/1 L-cysteinu, pH 7,4) na 45% stupeň nasycení síranem amonným a na koncentraci fosfátu 0,05 mol/1. Tento roztok se zkoncentruje přes membránu s mezí vyloučení 500 Daltonů. Látky obsažené v roztoku se získají jako retentátní roztok s obsahem 13 1 (asi 100-násobná koncentrace).

Retentátní roztok se odděleně dále Čistí.

Retentátní roztok se Čistí shora popsaným způsobem, přičemž se před preparativní filtraci molekulovým sítem předřadí anexová chromatografie. Kromě toho se použije při preparativní filtraci molekulovým sítem a při analytické oběhové filtraci molekulovým sítem místo Ultrogelu AcA epichlorhydinem zesítěná dextran molekulová sítová matrice (Sephadex-50) s velikostí částic 40 až 160, :případně 20 až 80 pm. .

Při preparativní filtraci molekulovým sítem se nastaví sepárační meze na 7000 až 3000 Daltonů. Při chromatografií na.hydroxylovém apatitu se eluují RNP še střední koncentrací fosfátu 0,001 mol/1 až 1,0 mol/1. Při zonální precipitační chromatografií se eluuje RNP v čelním rozdělení. Při analytické oběhové filtraci molekulovým sítem se eluát zavádí do oběhu při separační mezi 7000.

Získá se přibližně 8 mg RNP o čistotě > 95%.

Příklad 2

Kultivuje se 3,5 kg (přibližně 1O¹²) monocytů získaných z vepřové krve za podmínek popsaných v příkladu 1. Obsahem polyvalentního lektinu (CON) kultivačního media se buňky během kultivace stimulují.

RNP, vzniklé v kultivačním roztoku, se izolují způsobem popsaným v příkladu 1 a získají se ve vysoce Čistém stavu. Dosahuje se podobných výtěžků jako v příkladu 1.

Příklad 3

Popisuje se výroba biologicky aktivních RNP ze zánětlivé tkáně a oddělení v ní obsažené RNP od ostatních součástí tkáně. Použije se 500 g infarktové zánětlivé tkáně psího srdce. Tkán srdce se rozemele na masovém strojku při teplotě 0 až 4 'C a smísí s trojnásobným objemem své hmotnosti 0,05 mol/1 pufrového roztoku síranu sodnodrase1ného, obsahujícího 0,001 mol/1 cysteinu při pH 6,80. Získaná suspense se homogenizuje v homogenizátoru (Ultraturax). Pak se supernatant, který obsahuje rozpustné podíly zánětlivé tkáně, od nerozpustných součástí oddělí odstředěním při 10 000 x g. Pracuje se při teplotě 4 ’C. Pak se získaný roztok 3 hodiny odstřeďuje při 100 000 x g. Při tom získaný čirý roztok se oddělí od nahoře plovoucí vrstvy lipidu.

Získaný čirý roztok obsahující RNP se nyní podrobí frakcionovánému vysrážení podle příkladu 1. Získaný koncentrovaný roztok retentátu se zpracuje podle příkladu 1 na RNP. Získá se přibližně

0,03 mg morfogenu RNP.

Příklad 4

Podle příkladu 3 se vyrobí homogenizát s 500 g leukocytů a suspenduje se v tam uvedeném pufrovém roztoku. Zpracování na biologicky aktivní RNP, obsžené v leukocytech, probíhá podle příkladu 1, V leukocytech kultivovaných bez stimulace jsou obsažena pouze poměrně nepatrná množství (asi 11) monocytových RNP. Výtěžek je přibližně 1 pg RNP.

Prů my s1o vá využitelnost

Kov obsahující ribonuk1eotidové polypeptidy použitelné pro výrobu farmaceutických prostředků případně protilátek proti ribonukleotidovým polypeptidům a/nebo jejich molekulárně biologickým ekvivalentním strukturám a/nebo částem a/nebo derivátům.

Claims (27)

1. Bioaktivní, kov obsahující ri bonuk 1 eoti dový polypeptid obsahující následující dílčí sekvenci nukleotidů v části RNA:

A AAG AG A A AGCIJGCUCCG AAGNCAG a následující sekvenci aminokyselin nebo jejich dílčí sekvenci nebo derivát v peptidovém podíle

NH2-TKLEDHLEG1IN1FHQYSVRLG

HYDTLIKRELKQLITKELPNTLKN

TKDQGTIDKIFQNLDANQDEQVSF

KEFVVLVTDVL1 TAHDN IHKE-COOII

2. Ribonuk1eotidový peptid podle nároku 1 obsahující alespoň jeden kovový iont v komplexu RNP.

3. Ribonukleotidový peptid podle nároku 1 nebo 2 obsahující alespoň jednu modifikovanou bázi v části RNP, z nichž jedna je reprezentována isoquanosinem.

4. Ri horník 1 eot i dový peptid podle nároku 1 nebo 3, přičemž molekulová hmotnost nativního RNP je 40 000 Daltonů.

5. Způsob výroby biologicky aktivních RNP podle nároku 1 až 4, vyznačující se tím, že se buňky, biologické kapaliny, exsudáty, krev, leukocyty, zánětlivé tkáně, bybridomy, genbiologické rekombináty, leukocyty nebo zánětlivé tkáně a jejich části jednotlivě nebo společně homogenizují, lysují nebo se kultivují a získané biologicky aktivní RNP se získávají z homogenátů nebo z supernatantního kultivačního roztoku.

G. Způsob podle nároku 5, vyznačující se tím, že se kultivují smíšené populace buněk a tkáňových součástí retíku1o-endothe1 iálního systému nebo antibuněk.

7. Ί. působ podle nároku 5, vyznačující se tím, že se kultivují leukocyty v plně syntetickém séra prostém buněčném kultivačním mediu.

8 . Způsob podle nároku 5 nebo 7, v y z n a č u j í c í s e t i m, že se během kultivace leukocyty stimulují m i togeny .

9. Způsob podle nároku 8, v y z na č u j i c í s e t í m, že se k povzbuzení leukocytů přidává polyvalentní mytogen nebo endotoxinový mii.ogen nebo se na povrchu buněk zrušuje imunitní reakce .

10. Způsob podle nároku 9, vyznačující že se leukocyty povzbuzují přísadou lektinu.

se tím,

11 . Způsob podle nároku 10, vyznačujíc že se používá lektinu z Canavalia ensiformis (CON)).

í se tím, (Concanavalinu A

12. Způsob podle nároku 5 až 11, vyznačující se t, í m, že se kultivace leukocytů provádí v buněčném kultivačním mediu o složení uvedeném v tabulce I, které obsahuje sérový albumin jako jediný protein.

13. Způsob podle nároku 5 až 12, v y z n a č u j i c i s e t í m, že se kultivace leukocytů provádí 40 hodin při teplotě 37 ’C a při koncentraci 10⁷ až 10⁸ buněk/ml kultivačního roztoku při 1% parciálním tlaku oxidu uhličitého za dostatečného přívodu vzduchu pro kultivaci.

14. Způsob podle nároku 5 až 13, vyznačující se t í m, že se z homogenátu, lysátů nebo kultivačních roztoků buněk po ukončení kultivace oddělováním buněk a součástí tání získávají látky obsažené v roztocích dialysou, ultrafiltrací, vysol ováním z roztoků látkového podílu rozpustného v nasyceném solném roztoku koncentrováním tohoto roztoku.

15. Způsob podle nároku 14, vyznačující se tím že se k vysolování používá síranu amonného.

16. Způsob podle nároku 15, vyznačující se tím, že se postupně zvyšuje koncent.race síranu amonného roztoku po, každé přísadě síranu amonného se vysrážené látky oddělují a tím se získá více surových frakcí s odstupňovanou rozpustností při různých koncent,racích síranu amonného.

17. Způsob podle nároku 16, vyznačující se tím, že se koncentrace síranu amonného postupně nastavuje na 35%, 45% a 90% nasycení.

18. Způsob podle nároku 15 až 17, vy z n a č u j í c í se t í m, že se roztok homogenátu nebo lysátu nebo supernátant vysulo v ac í ho srážení koncentruje po odstranění látkové sraženiny ultrafiltrací nebo dialysou.

19. Způsob podle nároku 15 až 18, v y z n a č u j í c í s e tím, že se surové frakce, získané stupňovitým vysolováním, a koncentrovaný supernatant vysolovacího vysrážení odděleně zpracovává j í na RNP.

20. Způsob podle nároku 5 až 19, vyznačující se f. í m, že se zpracování surových frakcí a získávání biologicky aktivních RNP provádí preparativní a analytickou filtrací na molekulovém sítu, anexovou a katexovou chromatografií, případně adsorpčním postupem v jedné nádobě, chromatografií na hydroxylapatitu, zonální precipítační chromatografií a/nebo oběhovou nebo kaskádovou filtrací molekulovým sítem v normálním nebo Η PtC pro35 vedení .

21 . Způsob podb’ nároku 20, v y z n a Č u j í c í s e tím, že se provádějí nejméně dvě po sobě následující čisticí operace. 22 . Způsob podle nároku 20, v y z n a č u j í c í s e tím, že se provádějí nejméně tři po sobě následující čisticí operace. 23 . Způsob podle nároku 5, v y z n a č u j í c í s e tím,

že se k získání monocytového RNP kultivuje smíšená populace len— kocytů, přičemž se kultura buněk stimuluje CON, kultivační roztok *

se po ukončení kultivace směšuje se síranem amonným až na 90% nasycení, vysrážené proteiny se od supernatantu obsahujícího síran amonný oddělují, supernatant se koncentruje, čistí se preparativní filtrací molekulovým sítem, anexovou a katexovou chromatografií, chromatografií na hydroxylapat i tu, zonální precipitační chromatografií a kaskádovou filtrací molekulovým sítem a po oddělení doprovodných cizích látek se v elnátu filtrace kaskádovým molekulovým sítem získává ve vysoce vyčištěné formě.

24. Způsob podle nároku 5, v y z n a č u j í c í se tím, že se k získání monocytového RNP kultivuje smíšená populace leukocytu nebo jen granulocyty, přičemž sc případně kultura buněk stimuluje CON, kultivační roztok se po ukončení kultivace směšuje se síranem amonným až na 35% nasycení, vysrážené proteiny se od supernatantu, obsahujícího síran amonný, oddělují, supernatant se koncentruje, čistí se preparativní filtrací molekulovým sítem, anexovou a katexovou chromatografií, chromatografií na hyóroxylapatitu, zonální precipitační chromatografií a kaskádovou filtrací molekulovým sítem a po oddělení doprovodných cizích látek se v e luátu filtrací kaskádovým molekulovým sítem získává leukocytový RNP ve vysoce vyčištěné formě.

25. Způsob podle nároku 5 a 14 až 24, v y z n a č u j i e í s e t í m, že se mísí.o kultivačního roztoku leukocytů používá rozpustného podílu homogenátu leukocytů, případně zánět,! ivé tkáně z přirozených nebo rekombinantních buněčných forem.

26. Způsob výroby biologicky aktivních RNP podle nároku 1 až 4, vyznačující se t, í m, že se k výrobě používá chemicky nebo molekulárněbiologicky syntetizovaných sekvencí nebo částí a homologových sekvencí z nich.

27. Způsob podle nároku 26, vyznačující se tím, že se používá chemicky nebo molekulárněbiologicky syntetizovaných oligonukleidových nebo protismyslových nnkleidovýcb sekvencí in vivo a in vitro, které kódují podle dílčích sekvencí uvedených v nároku 1, s nejméně 6 bázemi nebo s částmi jejich homologových sekvencí těchto struktur způsoby in vivo a in vitro, obzvláště reakcí po 1ymerázovou řetězcovou reakcí PCR a/mebo proti srnys1 ovou bioprocesní technikou k výrobě jednotlivě nebo společně.

28. Farmaceutický prostředek ke specifickému ovlivňování tvoření krevních cév - angiomorfogenese a vaskulárního stavu tkáně těla savců, vyznačující se tím, že obsahuje alespoň jeden RNP a/nebo alespoň jednu molekulárně biologickou ekvivalentní strukturu a/nebo část a/nebo jejich deriváty podle nároku 1 až 4 a nosič, pomocné a přídavné látky,

29. Farmaceutický prostředek ke specifickému ovlivňování a/ nebo k diagnostice případně k analytice angiomorfogenese a vaskulárnítio stavu tkáně těla savců, v y z ti a č u j í c í s e t í m , že obsahuje alespoň jeden anti-RNP-imunoglobulín a/nebo molekulárně biologickou ekvivalentní strukturu a/nebo část a/nebo jejich derivát podle nároku 1 až 4 a nosič, pomocné a přídavné látky.

3 O. Použití alespoň molekulárně biologických a/nebo jejich derivátů ke nostice případně analytice tkáně těla savců.

jednoho RNP podle nároku 1 až 4 a/nebo ekvivalentních struktur a/nebo částí specifickému ovlivňování a/nebo diagangiomorfogenese a vaskulárního stavu

Použití alespoň jednoho anti-RNP-imunog1obu1 i nu a/nebo molekulárně biologických ekvivalentních struktur a/nebo částí a/nebo jejich derivátů ke specifickému ovlivňování a/nebo k diagnostice případně k analytice angiomorfogenese a vaskulárního stavu tkáně těla savců.

32. Farmaceutický a pomocný prostředek k přenášení genetických informací v buňkách, vyznačující se tím , že obsahuje alespoň jeden RNP a/nebo část, a/nebo jejich derivát podle nároku ] až 4.

33. Farmaceutický a pomocný prostředek k selektivnímu měnění obsahu nukleinové kyseliny buněk, vyznačující se t í m , že obsahuje alespoň jeden RNP a/nebo část a/nebo jejích derivát podle nároku 1 až 4 .