CZ451999A3 - Exprese fruktosa-1,6-bisfosfát-aIdoIasy v transgenických rostlinách - Google Patents

Abstract

Fruktosa-1,6-biofosfát aldolasa (FDA)je enzymreversibilně katalyzující reakci přeměňující triosafosfát na fiuktosa-1,6- bisfosfát. V listechje tento enzymlokalizován v choroplastech (syntéza škrobu) a cytosolu (biosyntéza škrobu). Transgenické rostliny byly vytvořenytak, že exprimmující fda gen E.coli v choroplastech aje u nich dosažen zvýšený výtěžek způsobený zvýšenou schopností syntézy škrobu v listech a zvláště sacharosy obecně. Listy z rostlin exprimujících fda transgen vykazují významně zvýšenou ” akumulaci škrobu v porovnání s kontrolními rostlinami Q) exprimujícími nulový vektor, zvláště na počátku fotoperiody, χ— ale mají nižší obsah sacharosy v listech. Transgenické rostliny IO mají také významně zvýšenou hmotu kořenů. Dále mají transgenické brambory exprimující fda zlepšenou 1 stejnoměrnostrozložení pevné hmoty.

Description

Oblast techniky

Vynález se týká exprese fruktosa-l,6-bisfosfát-aldolasy (FDA) v transgenických rostlinách pro zvýšení, nebo zlepšení růstu a vývinu těchto rostlin, jejich výtěžku, životaschopnosti, odolnosti ke stresu, alokace a ukládání uhlíku v různých zásobních formách a distribuce škrobu. Transgenické rostliny exprimující FDA mají zvýšenou asimilaci uhlíku, export a ukládání v asimilačních a zásobních orgánech, což vede ke zlepšení růstu, výtěžku a kvality plodin.

Dosavadní stav techniky

Současný pokrok v genetickém inženýrství poskytuje předpoklady a nástroje pro transformaci rostlin tak, aby obsahovaly cizí (často označované jako „heterologní“), nebo vylepšené endogenní geny. Tyto geny mohou způsobovat buď zlepšení funkce již existujících drah v rostlinných tkáních, nebo vložení nových drah modifikujících hladiny produktů, zvyšujících metabolickou účinnost, a/nebo vedou k úsporám energie buňky. V současnosti je možné produkovat rostliny s unikátními fyziologickými a biochemickými vlastnostmi a charakteristikami, které jsou zemědělsky významné. Výjimečné vlastnosti hrají důležitou roli v růstu a vývoji rostlin, potenciálu a stability výtěžku, kvality plodin a jejich složení zahrnující zvýšenou asimilaci uhlíku, účinné ukládání uhlíku a zvýšený export uhlíku a jeho rozdělování.

Fixace atmosferického uhlíku (fotosyntéza) rostlinami představuje hlavní zdroj energie umožňující procesy v živých organismech. Primárním místem fotosytetické aktivity, často označované jako „asimilační orgány“ jsou dospělé listy, v menším měřítku zelené stonky. Hlavním uhlíkatým produktem asimilace v listech je škrob, který představuje přechodnou zásobní formu cukrů v chloroplastech, a sacharosa, která představuje hlavní transportní formu uhlíku ve vyšších rostlinách. Jiné části rostlin označovanou jako „zásobní orgány“ (kořeny, plody, květy, semena, h1í7y a cibule) nejsou obvykle autotrofní a jsou závislé na importu sacharosy, nebo jiných hlavních transportovatelných cukrů pro svůj růst a vývoj. V zásobních orgánech jsou ukládány importované metabolity ve formě sacharosy a jiných oligosacharidů, škrobu a jiných polysacharidů, proteinů, a triglyceridů.

V listech je primárním produktem Calvinova cyklu (biochemická dráha vedoucí k asimilaci uhlíku) glyceraldehyd-3-fosfát (G3P) a dihydroxyaceton fosfát (DHAP), také označované jako triosa fosfáty (triosa-P). Kondenzace G3P a DHAP na fruktosa-l,6-bisfosfát (FBP) je reverzibilně • · · ·

• · · · ♦ · · • · · 9 · · · • · ··· ·· · • · · · ···* ·· · · · · ·· katalytzován enzymem fruktosa-l,6-bisfosfát aldolasa (FDA), jsou známy jeho různé isoenzymy. Kyselý isoenzym se vyskytuje v chloroplastech a tvoří asi 85% celkové aldolasové aktivity v listech. Bazický isoenzym je cytosolický. Oba isoenzymy jsou kódovány jaderným genomem a jsou kódovány různými geny (Lebherz et al., 1984).

V listech je FDA chloroplastů esenciálním enzymem Calvinova cyklu a jeho aktivita produkuje metabolity pro biosynthesu škrobu. Odstranění více než 40% plastidové aldolasové enzymatické aktivity pomocí antisens technologie snižuje akumulaci škrobu stejně jako hladiny rozpustných proteinů a chlorofylu, ale také snižuje růst rostlin a tvorbu kořenů (Sonnewald et al., 1994). Naproti tomu FDA cytosolu je součástí biosyntetické dráhy sacharosy, kde katalyzuje produkci FBP. Navíc je FDA cytosolu také klíčovým enzymem glykolysy a glukoneogenese, jak v asimilačních tak v zásobních orgánech rostlin.

Pro bramborářský průmysl je žádoucí a cenná produkce pevných a uniformních hlíz s vysokým obsahem škrobu. Současné odrůdy brambor, které jsou používány pro výrobu hranolků, například Russet Burbank a Shepody, trpí nestejnoměrným ukládáním pevné hmoty mezi dření hlízy (vnitřní jádro) a kůrou (vnější jádro). Hranolky, které jsou vyrobeny z dřeně mají vyšší obsah vody ve srovnání s hranolky vyrobenými z kůry; kůra obvykle vykazuje obsah pevné hmoty kolem 24% procent, zatímco dřeň obvykle vykazuje obsah pevné hmoty 17%. Z toho plyne, že v průběhu výroby hranolků musí být proužky dřeně běleny, sušeny a stejnoměrně smaženy delší dobu, aby byla odstraněn přebytek vody. Takové zpracování hranolků z dřeně vede k přesmažení hranolků z kůry s vyšším obsahem pevné látky. Doba bělení, sušení a smažení hranolek v technologickém zařízení musí být nastavena tak, aby vyhověla vodnatým hranolkům z dřeně a méně vodnatým hranolkům z kůry. Méně vodnatá brambora s rovnoměrnější distribucí škrobu mezi dření a kůrou by umožňovala stejnoměrnější prosmažení smaženého produktu, větší úplatném technologie šetřící náklady z důvodu zkráceným časům bělení, sušení a smažení.

Ačkoliv byly různé £ruktosa-l,6-bisfosfát aldolasy již dříve charakterizovány, bylo zjištěno, že over-exprese (zvýšená exprese) enzymu v transgenických rostlinách vede k výhodným výsledkům, jakým je zvýšená asimilace v těchto rostlinách, zvýšený export a ukládání uhlíku, zvýšená produkce olejů a/nebo proteinů v rostlině a vylepšená stejnoměrnost obsahu vody v hlíze.

Podstata vynálezu

Podstatou vynálezu je DNA konstrukt, který kóduje enzym fiuktosa-l,6-bisfosfát aldolasu (FDA) a který je vhodný pro zvýšení asimilace, exportu a ukládání uhlíku v rostlinách.

• 99 9 · · · « · · ·· · 9999 · · · · · · · · _· 9 9 9 · ······

3· 9 9 9 9 · 9 9·· •99 9 · · ·· ·· ··

Dále vynález poskytuje způsob pro přípravu geneticky upravených rostlin, které mají zvýšenou asimilaci a export uhlíku a vylepšenou stejnorodost pevné hmoty, a který zahrnuje okroky:

(a) Vložení do genomu rostliny rekombinantní dvouřetězcovou molekulu DNA obsahující (i) promotor, který je funkční v buňkách cílové tkáně rostliny, (ii) DNA sekvenci způsobující produkci RNA, která kóduje enzym fruktosa-1,6bisfosfát aldolasu, (iii) 3' nepřepisovanou DNA sekvenci, která je funkční v buňkách rostlin a způsobuje terminaci transkripce a přidání polyadenylového konce na 3' konec RNA sekvence;

(b) získání transformovaných rostlinných buněk; a (c ) regenerace geneticky transformovaných rostlin, které mají zvýšenou FDA aktivitu z transformovaných buněk.

Dalším aspektem vynálezu je, že poskytuje rekombinantní dvouřetězcovou molekulu DNA obsahující sekvenci, která zahrnuje (i) promotor, který je funkční v buňkách cílové tkáně rostliny, (ii) DNA sekvenci způsobující produkci RNA, která kóduje enzym fruktosa-1,6bisfosfát aldolasu, (iii) 3' nepřepisovanou DNA sekvenci, která je funkční v buňkách rostlin a způsobuje terminaci transkripce a přidání polyadenylového konce na 3' konec RNA sekvence;

Dalším aspektem vynálezu je, že DNA sekvence, která způsobuje produkci RNA sekvence která kóduje enzym fruktosa-l,6-bisfosfát aldolasu, je spojena s chloroplaste vým signálním peptidem, který zajišťuje transport enzymu do plastidu.

Podle vynálezu je dosahováno zlepšených průměrů asimilace, ukládání a exportu uhlíku ve tkáních různých rostlin. Dále je dosahováno zlepšených průměrných hodnot pro akumulaci uhlíku v různých zásobních orgánech (větší kořeny, hlízy, atd.) a následně zvýšené výtěžky a produktivita plodin. Zvýšená dostupnost uhlíku pro tyto zásobní orgány také zlepší složení a účinné využití uhlíku v těchto zásobních orgánech (produkce oleje, proteinu, škrobu, a/nebo sacharosy, a/nebo stejnorodost rozložení pevné hmoty).

Cílem vynálezu je dosažení rozličných výhod včetně:

Zvýšená exprese FDA v chloroplastech by měla zvýšit tok uhlíku přes Calvinův cyklus a zvýšit asimilaci atmosferického uhlíku během první fáze fotoperiody. To by mělo vést ke zvýšení • · • ···· 9 9 9 99 9 9 9

9 · 9 9 9 9 9 9 9

9 9 9 9 9 9 9 9

9 9 9 9 9 9 9 9 9 9

4· · 9999 9999

9 * 99 99 99 99 účinnosti fotosyntézy a ke zvýšení produkce škrobu chloroplasty (zásobní formy uhlíku v listech jsou degradovány v obdobích nízké, nebo chybějící fotosyntézy). Obě tyto skutečnosti by měly vést ke zvýšené produkci sacharosy v listech a s tím spojeného exportu uhlíku během dané fotoperiody. Tato zvýšená kapacita je žádoucí rys v plodinách a vede k vyššímu vzrůstu rostlin, skladovatelnosti, výtěžku, životnosti a toleranci ke stresu.

Zvýšená exprese FDA v cytosolu fotosytetisujících buněk by měla vést ke zvýšené produkci sacharosy a jejímu exportu ven z listů. Tato zvýšená kapacita je žádoucí rys v plodinách a vede k vyššímu vzrůstu rostlin, skladovatelnosti, výtěžku, životnosti a toleranci ke stresu.

Exprese FDA v zásobních orgánech může vykazovat několik žádoucích rysů, například zvýšený pool aminokyselin a/nebo mastných kyselin způsobený zvýšeným tokem uhlíku glykolysou (a tedy zvýšenou hladinou pyruvátu) v semenech, nebo jiných zásobních orgánech a zvýšená hladina škrobu jako důsledek zvýšené produkce glukosa-6-fosfátu v semenech, kořenech, stoncích a hlízách, kde je škrob hlavní nestruktumí formou cukrů (obrácená glykolysa). Tento zesílený vývoj zásobních orgánů je žádoucím rysem plodin a vede k vyššímu vzrůstu rostlin, skladovatelnosti, výtěžku, životnosti a toleranci ke stresu.

Vynález je zvláště výhodný pro využití při komerční produkci potravin vyráběných z brambor. Brambory používané pro výrobu smažených hranolků dalších výrobků trpí nestejnoměrnou distribucí pevné hmoty mezi dřeň hlízy (vnitřní jádro) a jádro (vnější jádro). Hranolky vyrobené z drěně takové hlízy mají nižší obsah pevné hmoty a vyšší obsah vody ve srovnání z hranolky z dřeně stejné hlízy. Zařízení pro výrobu smažených hranolků musí tedy nastavit technologické parametry tak, aby hranolky z dřeně byly dostatečně prosmaženy, zatímco hranolky z dřeně nebyly přesmaženy. Výsledek takového nastavení je vysoce variabilní a může vést k produktu s nízkou kvalitou. Transgenické brambory exprimující fda poskytují pro proces výroby smažených hranolků, nebo smažených bramborových lupínků surovinu, která vykazuje vyšší rovnoměrnost obsahu pevné hmoty a přijatelné agronomické vlastnosti. Při výrobě smažených hranolků vyžadují hranolky z dřeně s vyšší stejnoměrností rozložení pevné hmoty v hlíze kratší čas pro bělení, kratší čas sušení vzhledem k specifickému obsahu pevné hmoty a kratší čas pro smažení před zmražením a dodáním maloobchodním zákazníkům i velkoodběratelům.

Co se týká brambor vynález tedy poskytuje 1) vyšší kvalitu, stejnoměrněji smažený konečný produkt, kde hranolky ze všech částí hlízy jsou po úpravě téměř stejné, 2) větší výkon technologických zařízení pro přípravu hranolků, plynoucí z kratšího technologického času; a 3) úsporu nákladů plynoucí z menších nároků na energii plynoucích z kratších potřebných časů pro bělení, sušení, a smažení. Syrové výrobky z hlíz vykazujících stejnoměrnější rozložení pevné hmoty • 4 4 44 4 4 · 4 · • • 444 4444 _4 4 · 4 4 444444 j· 4 4444 4444

4 4 4 44 *4 44 ·4 rovněž tvoří bramborové lupínky, které vykazují menší sedlovité zakřivení a menší tendenci tvořit středovou bublinu, která je při výrobě bramborových lupínků nežádoucí. Dalším výsledkem by měl být také nižší obsah tuku; což je v souladu s požadavky spotřebitelů a důsledkem je nižší spotřeba oleje (a cena) při technologii. Zvýšení stejnorodosti rozložení pevné hmoty se projeví také zvýšením celkového obsahu pevné hmoty v hlíze. Při výrobu hranolků i bramborových lupínků vede tento vyšší obsah pevné hmoty k vyšší výkonosti technologických zařízen, plynoucí z kratšího technologického času úspoře nákladů plynoucí z menších nároků na energii z důvodu kratších potřebných časů pro bělení, sušení, a smažení.

Vynález je zaměřen na způsob produkce rostlinných buněk a rostlin, které vykazují zvýšený, nebo zlepšený růst a vývoj, výtěžek, kvalitu, stejnoměrnost ukládání škrobu, životnost, a/nebo toleranci ke stresu. Způsob využívá DNA sekvenci kódující fda (fruktosa-l,6-bisfosfát aldolasu) gen integrovaný v buněčném genomu rostliny, jako výsledek genetického inženýrství a způsobuje expresi enzymu FDA v takto připravených transgenických rostlinách. Rostliny s vysokou expresí enzymu FDA vykazují zvýšený průtok uhlíku přes Calvinův cyklus a zvýšenou asimilaci atmosferického uhlíku během ranné fotoperiody vedoucí ke zvýšené účinnosti fotosyntézy a zvýšené produkci škrobu. Takové rostliny vykazují vyšší hladiny produkce sacharosy v listech a schopnost dosáhnout vyššího čistého exportu uhlíku během určité fotoperiody. Toto zvýšení kapacity asimilace vede ke zvýšenému růstu rostlin, který poté vede k vytvoření větší biomasy a/nebo zvětšení velikosti zásobních orgánů a nakonec poskytující vyšší výtěžky transgenických rostlin. Tato větší biomasa, nebo zvýšená velikost zásobních orgánů může být dokázána různými způsoby, nebo na různých částech rostliny v závislosti na konkrétním druhu rostliny, nebo růstových podmínkách rostliny se zvýšenou expresí FDA enzymu. Zvětšená velikost, která je důsledkem nadprodukce FDA, může být pozorována na semenech, plodech, stoncích, listech hlízách, cibulích, nebo jiných částech rostliny v závislosti na druhu rostliny a jeho dominantních zásobních orgánech v určité fázi růstu a podmínkách prostředí způsobených různými růstovými podmínkami, například sucho, teplota, nebo další stresy. Transgenické rostliny se zvýšenou expresí FDA mohou proto mít zvýšenou asimilaci, export a ukládání uhlíku v asimilačních a zásobních orgánech rostlin, což vede ke zlepšením jejich růstu, výtěžku, stejnorodosti a kvalitě.

Rostliny se zvýšenou expresí FDA mohou také vykazovat žádoucí rysy, například zvýšenou produkci škrobu, oleje a/nebo bílkovin v závislosti na druhu rostliny se zvýšenou expresí FDA.

Zvýšená produkce FDA v určité rostlině tedy může mít vliv, nebo měnit směr toku uhlíku a tak zaměřovat využívání a ukládání metabolitů k produkci škrobu, nebo produkci bílkovin, nebo k produkci oleje, protože FDA je důležitou složkou dráhy glykolysy a glukoneogenese.

• ·· · • · ··· ·

Mechanismus, kterým exprese exogenní FDA modifikuje metabolismus uhlíku, má pravděpodobně příčinu ve vztazích asimilace a ukládání. Tkáň listů je zdrojem sacharosy a je-li důsledkem zvýšené exprese FDA zvýšená produkce sacharosy a její zvýšený transport do zásobních orgánů, vede to ke zvýšenému ukládání uhlíku (cukry, škrob, olej, bílkoviny, atd.), nebo dusíku (proteiny, atd.) na danou hmotnost zásobních orgánů.

Exprese genů, které existují ve formě dvouřetězcové DNA zahrnuje transkripci mediátorové RNA (mRNA) z jednoho řetězce DNA za pomoci enzymu RNA polymerasy a následnou úpravou primárního transkriptu mRNA uvnitř jádra. Tyto úpravy zahrnují 3' nepřekládaný region tvořený polyadenylovými nukleotidy na 3' konci RNA. Transkripce DNA do RNA je regulována oblastí DNA obvykle označovanou jako promotor. Promotorová oblast obsahuje sekvenci bází, která je signálem pro RNA polymerasu k vazbě na DNA a k iniciaci transkripce mRNA na jednom z řetězců DNA jako templátu pro syntézu odpovídajícího komplementárního řetězce RNA. Tato RNA je poté použita jako templát pro produkci proteinů kódovaných bio syntetickým mechanismem buňky.

Počet promotorů, které jsou aktivní v buňkách rostlin byly popsány v literatuře. Jsou mezi nimi také promotory pro nopalin synthasu (NOS) a oktopin synthasu (OCS), (které jsou přítomny na tumor indukujícím plazmidu bakterie Agrobacterium tunefaciens), promotory caulimovirů, například je virus mozaiky květáku (CaMV) 19S a 35S a viru mozaiky krtičníku (FMV) 35Spromotory, světlem indukovaný promotor malé podjednotky ribulosa-l,5-bisfosfát karboxylasy (ssRUBISCO), velmi hojného rostlinného polypeptidu, promotory genu pro protein vážící chlorofily a a b, a tak dále. Všechny tyto promotory byly použity pro vytvoření různých typů DNA konstruktů, které byly exprimovány v rostlinách; viz. například PCT publikace WO 84/02913.

Ve vynálezu mohou být využity promotory o nichž je známo, nebo bylo zjištěno, že způsobují transkripci DNA v rostlinách. Takové promotory mohou být získány z různých zdrojů jako jsou rostliny a rostlinné viry, například mimo jiné zesílený CaMV35S promotor a promotory izolované z rostlinných genů, například ssRUBISCO geny. Jak je popsáno níže, je výhodné, aby konkrétní zvolený promotor byl schopný způsobovat dostatečnou expresi produkující účinné množství enzymu fruktosa-l,6-bisfosfát aldolasy, který způsobuje žádané zvýšeni asimilace, exportu a ukládání uhlíku. Exprese dvouřetězcových DNA molekul podle vynálezu může být zajištěno konstitutivním promotorem exprimujícím DNA molekuly ve většině tkání rostliny. Případně může být výhodnější působit expresi fda genu jen v určitých rostlinných tkáních, například v Uštu, stonku, kořeni, hlíze, semeni, plodu, atd. Zvolený promotor bude mýt specifitu pro zvolenou tkáň a vývojové stádium. Odborníkům v oboru je zřejmé, že množství enzymu fruktosa99 9999

9 · · 9 9 9 9 9 9

9 · · · · · · · —9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 /· · 9 9 9 9 9 9 9 9

9 9 9 9 9 9 9 9 9 9

1,6-bisfosfát aldolasy potřebné k dosažení žádaného zvýšení asimilace, exportu a ukládání uhlíku se může v závislosti na typu rostliny lišit. Funkce promotoru by proto měla být optimalizována zvolením promotoru s žádanou schopností exprese v dané tkáni a přibližné síly promotoru a zvolením transformantu, který vykazuje žádanou fruktosa-l,6-bisfosfát aldolasovou aktivitu, nebo žádanou změnu metabolismu cukrů v cílové tkáni. Tento postup výběru ze souboru transformantů je rutině používán při expresi heterologních strukturálních genů v rostlinách kvůli rozdílům mezi transformanty obsahující stejný heterologní gen, pro rozdíly způsobené místem inserce tohoto genu v rámci genomu rostliny (obvykle označovaný „position effect“). Kromě promotorů, o nichž je známo, že způsobují transkripci (konstitutivně, nebo tkáňově specificky) DNA v rostlinných buňkách, mohou být další promotory použitelné pro vynález identifikovány screeningem rostlinných cDNA knihoven genů, které jsou selektivně, nebo s výhodou exprimovány v cílových tkáních a poté izolovány z promotorových oblastí obvyklými postupy. Zvláště může být výhodné použití promotoru specifického (nebo se zvýhodněnou expresí) pro buňky cévních svazků v C4 rostlinách, například kukuřice, čirok a cukrová třtina, jelikož nadprodukce FDA tak vede k vyšším výnosům, ale ne promotoru s vlastnostmi vedoucími k zvýšené expresi v mezofilních buňkách.

Pro účely exprese fda genu v asimilačních tkáních, jako jsou listy nebo stonky, je výhodné, aby promotory využívané ve dvouřetězcových molekulách podle vynálezu měli relativně vysokou expresi v těchto specifických tkáních. Pro tento účel je možno zvolit velký počet promotorů, které jsou specifické pro listy a se zvýšenou expresí v listech. Příklady takových genů známých z literatury jsou chloroplastová glutamin syntetasa GS2 z hrachu (Edwards et. al., 1990), chloroplastová fruktosa-l,6-bisfosfatasa (FBPase) z pšenice (Lloyd et al., 1991), jaderná fotosyntetická ST-LS1 z rajčat (Stokhaus et al., 1989), a genů pro fenylalanin amoniak lyasu (PAL) a chalcon syntasu (CHS) z Arabidopsis thaliana (Leyva et al., 1995). Dalšími geny o nichž je známo, že jsou aktivní ve foto synteticky aktivních tkáních jsou ribulosa-l,5-bisfosfát karboxylasa (RUBISCO), isolovaná z modřínu východního (Larix laricina) (Campbell et al., 1994); cab gen kódující chlorofil a/b vazný protein PSU, izolovaný z borovice (cabó; Yamamoto et al., 1994), pšenice (Cab-1; Fejes et al., 1990), špenátu (CAB-1; Luebberstedt., 1994), a rýže (cablR: Luan et al., 1992); pyruvát fosfát dikinasa (PPDK) z kukuřice (Matsuoka et al., 1993); gen Lhcbl tabáku (Cerdan et al., 1997); gen SUC2 pro sacharosa-FT symporter Arabidopsis thaliana (Truemit et al., 1995); a proteiny thylakoidní membrány, isolované ze špenátu (psaD, psaF, psaE, PC, FNR, atpC, atpD, cab, rbcS; Oelmueller et al., 1992). Jiné chlorofyly a/b vazné proteiny byly studovány a popsány v literatuře, jako je LhcB a PsbP z bílé hořtice (Sinapsis alba; Kretsch et al., 1995).

• · ··· ·

Homologní proteiny k těm, které byly popsány mohou být také izolovány v cílových nebo příbuzných plodinách pomocí standardních postupů molekulární biologie.

Pro účely exprese fda v zásobních tkáních rostlin například v hlízách brambor; plodech rajčat; nebo semenech rostlin, pšenice, rýže nebo ječmene je výhodné, aby promotory využívané ve dvouřetězcových molekulách podle vynálezu měly relativně vysokou expresi v těchto specifických tkáních. Je známo velký počet genů ze specifickou nebo zvýšenou expresí v hlízách včetně patatinového promotoru I třídy (Bevan et al., 1986; Jefferson et al., 1990); ADPGPP geny bramborových hlíz, malá i velká podjednotka (Muller et al., 1990); syntasa sacharosy (Salanoubat a Belliard, 1987, 1989); hlavní proteiny hlízy včetně 22 kDa proteinové komplexy a proteinasové inhibitory (Hannapel, 1990); gen syntasy škrobu vázané na zrna (GBSS) (Rohde et al., 1990); a jiné patainy I a II třídy (Rocha-Sosa et al., 1989; Mignery et al., 1988). Také jiné promotory mohou být použity pro expresi genu fruktosa-l,6-bisfosfát aldolasy ve specifických tkáních jako jsou semena, nebo plody. Promotory pro β-konglycinin (Tiemey, 1987), nebo jiné pro semena specifické promotory jako je napinový a fazeolinový promotor mohou být použity pro over-expresi fda specificky v semenech. Zeiny jsou skupinou zásobních proteinů, které nacházíme v endospermu. Byly izolovány a klonovány zeinové geny (Pedersen et al., 1982) a promotory těchto genů, včetně 15 kDa, 16 kDa, 19 kDa, 22 kDa, 27 kDa a gama genů a tyto promotory mohou být také použity pro expresi fda genu v semenech kukuřice a dalších rostlin. Další promotory, o kterých je známo, že jsou funkční v kukuřici, pšenici, nebo rýži zahrnují promotory následujících genů: wxy, Brittle, Shrunken 2, větvící enzymy I a II, syntasu škrobu, odvětvovací enzymy, oleosiny, gluteliny, a syntasa škrobu. Zvláště výhodnými promotory pro expresi fda genu v endospermu kukuřice, stejně jako rýže je promotor pro glutelinový gen z rýže a ještě výhodnější je Osgt-1 promotor (Zheng et al., 1993); genu (zmGBS) kukuřičné syntasy škrobu vázané na granule (waxy); promotor (osAGP) genu malé podjednotky kukuřičné ADPGPP; a zeinové promotory, zvláště promotor (zm27) genu pro kukuřičný 27 kDa zein (viz., obecně, Russel et al., 1997). Příklady promotorů vhodných pro expresi fda genu v pšenici zahrnují promotory pro geny podjednotek ADPglukosa pyrofosforylasy (ADPGPP), na granule vázanou a jiné syntasy škrobu, pro větvící a enzymy zbavující větvení, pro proteiny hojné v embryogenesi, pro gliadiny a pro gluteiny. Příklady takových promotorů rýže zahrnují promotory pro geny podjednotek ADPGPP, na granule vázanou a jiné syntasy škrobu, pro větvící enzymy a enzymy zbavující větvení, pro syntasu sacharosy a pro gluteiny. Zvláště výhodnými promotory jsou promotor pro glutein rýže Osgt-1. Příklady takových promotorů ječmene zahrnují promotory genů pro podjednotek ADPGPP, na granule vázanou a jiné syntasy škrobu, pro větvící enzymy a enzymy zbavující • · · · ©· ···· • · · · · · · · · · • · · · · · · · · • · » · · ·©···· ο · · ···· · · · · '· · · · · · ·· ·· · · větvení, pro syntasy sacharosy, pro hordeiny, pro embryonální globuliny a pro aleuron-specifické proteiny.

Obsah pevné hmoty tkáně kořenu může být zvýšen expresí fda genu umístěného za specifickým promotorem pro kořen. Příklady takových promotorů je promotor pro gen kyselé chitinasy (Samac et al., 1990). Exprese v tkáni kořenů může být také spojena z využitím kořenově specifických subdomén CaMV35S promotoru, který byl identifikován (Benfey et al., 1989).

RNA tvořená z DNA konstruktu podle vynálezu může také obsahovat 5' nepřekládanou vedoucí sekvenci (leader sequence). Tato sekvence může být odvozena od promotoru zvoleného, aby exprimoval gen a může být specificky modifikována, aby byla zvýšena translace RNA. Tato 5' nepřekládaná oblast může být také získána z virových RNA, z vhodných eukariotických genů, nebo ze syntetické genové sekvence. Vynález není omezen na konstrukty uvedené v následujících příkladech, kde nepřekládaná oblast je odvozena z 5' nepřekládané sekvence, která doprovází promotorovou sekvenci.

V jednoděložných rostlinách je do genového konstruktu výhodné vložit intron, který napomáhá nebo zvyšuje expresi kódující sekvence. Příklady vhodných intronů zahrnují HSP70 intron a aktinový intron rýže a jsou odborníkům známé. Dalším vhodným intronem je intron katalasy z Ricinus communis (Suzuki et al., 1994).

Polyadenylační signál

3' Nepřekládaná oblast chimérických rostlinných genů obsahují polyadenylační signál, který je funkční v rostlinách způsobuje přidání polyadenylových nukleotidů na 3' konec RNA. Příklady vhodných 3'-oblastí jsou (1) 3' přepisované, nepřekládané oblasti obsahující polyadenylační signál tumor indukujících (Ti) plazmidových genů Agrobacteria, například nopalin syntasový (NOS) gen, a (2) rostlinné geny, například gen zásobního proteinu sóji a gen malé podjednotky ribulosa-1,5bisfosfát karboxylasy (ssRUBISCO).

Řízená exprese fiuktosa-l,6-bisfosfát aldolasové aktivity v plastidech

V jednom provedení vynálezu může být fda gen fúzován s chloroplastovým signálním peptidem, aby byl vzniklý protein směrován do plastidu. Zde je termín chloroplast a plastid používán tak, že zahrnuje různé formy plastidů včetně amyloplastů. Mnoho v plastidech lokalizovaných proteinů je exprimováno z jaderných genů jako prekursory a jsou poté směrovány do plastidů pomoct chloroplastovým signálním peptidem (CTP), který je během importu odstraněn. Příklady takových chloroplastových proteinů zahrnují malou podjednotku ribulosa-l,5-bisfosfát ·· ····

·· ·· • · · · · · • · · · · · • · · · · * · • · · · · · ·

99 99 karboxylasy (ssRUBISCO, SSU), 5-enolpyruvátšikimát-3-fosfát syntasu (EPSPS), ferredoxin, ferredoxin oxidoreduktasa, protein I a II světlosběmého komplexu a thioredoxin F. Bylo ukázáno, že neplastidové proteiny mohou být cíleny do chloroplastů pomocí fuze s CTP, že CTP sekvence je schopna nasměrovat protein do plastidu. Odborníkům v oboru je zřejmé, že mohou být vytvořeny různé další chimérické konstrukty využívající funkci konkrétního plastidového signálního peptidu pro import enzymu fruktosa-l,6-difosfát aldolasy do plastidů rostlin. Gen fda může být nasměrován do plastidů také transformací genu do genomu chloroplastu (Danieli et al., 1998).

Fruktosa-l,6-bisfosfát aldolasy

Termín „Fruktosa-l,6-bisfosfát aldolasa“ tak jak je používán zde znamená enzym (E.C.4.1.2.13), který katalyzuje reversibilní štěpení fiuktosa-l,6-bisfosfátu na glyceraldehyd-3fosfát (G3P) dihydroxyacetonfosfát (DHAP). Aldolasové enzymy jsou rozděleny do dvou tříd označovaných třída I a třída II (Witke a Gotz, 1993). Byly sekvenovány různé fda geny kódující enzym mezi nimi cytosolický enzym z kukuřice (GenBank Accession S07789; S10638), cytosolický enzym z rýže (GenBank Accesion JQ0543), cytosolický enzym ze špenátu (GenBank Accesion S31091; S22093), z Arabidopsis thaliana (GenBank Accesion S11985), z chloroplastů špenátu (GenBank Accesion S31090; A21815;S22092), z kvasnic (S. cerevisiae) (GenBank Accesion S07855; S37882; S12945; S39178; S44523; X75781), z Rhodobacter sphaeroides (GenBank Accession B40767; D41080), z B. subtilis (GenBank Accession S55426; D32354; E32354; D41835), z hrachu (GenBank Accession S29048; S34411), chloroplastů hrachu (GenBank Accession S29047; S34410), z kukuřice (GenBank Accession S05019), z Chlamydomonas reinhadtii (GenBank Accession S48639; S58485; S58486; S34367), z Corynebacterium glutamicum (GenBank Accession S09283; X17313), z Campylobacter jejími (GenBank Accession S52413), z Haemophilus influenzae (kmen Rd KW20) (GenBank Accession C64074), z Streptococcus pneumonia (GenBank Accessin AJ005697), z rýže (GenBank Accession X53130), a z anaerobně regulovaného genu kukuřice (GenBank Accession X12872).

Enzymy třídy I mohou být izolovány z vyšších eukaryot, jako jsou zvířata a rostliny a některá prokaryota včetně Peptococcus aerogenes, (Lebherz a Rutter, 1973), Lactobacillus casei (London a Kline, 1973), Escherichia coli (Stribling a Perham, 1973), Mycobacterium smegmatis (Bai et al., 1975), a většiny zástupců rodu staphylococcus (Gotz et al., 1979). Gen pro FDA enzym může být získán známými metodami a to z několika organismů, například králík (Lai et al., 1974), člověk (Besond et al., 1983), krysa (Tsutsumi et al., 1984), Trypanosoma brucei (Clayton, 1985), a Arabidopsis thaliana (Chopra et al., 1990). Tyto enzymy třídy I jsou vždy tetramemí proteiny s ·* ···♦ ,ι:ι.

• · · • · « e · w · • · · · ·· ·· »» t celkovou molekulovou hmotností asi 160 kDa a vyznačují se tvorbou iminu mezi substrátem a lysinovým zbytkem v aktivním centru (Alfounder et al., 1989).

V živočiších jsou exprimovány tři isoenzymy třídy I klasifikované jako A, B a C, jsou exprimovány v cytosolu svalů, jater respektive mozkové tkáni a liší se od rostlinných aldolas ve své expresi a kompartmentaci (Joh et al., 1986). V listech vyšších rostlin se nachází FDA enzym třídy I a byly zde dokumentovány dva isoenzymy této třídy. Jeden je obsažen v chloroplastech a druhý v cytosolu (Lebherz et al., 1984). Kyselý rostlinný isoenzym je obsažen v chloroplastech a představuje asi 85% celkové aldolasové aktivity v listech. Bazický rostlinný isoenzym je cytosolický a oba enzymy jsou kódovány jaderným genomem avšak rozdílnými geny (Lebherz et al., 1984).

Aido lasy třídy II jsou obyčejně dimemí s molekulovou hmotností asi 80 kDa ajejich aktivita závisí na divalentních iontech kovů. Enzymy třídy II mohou být isolovány z prokaryot jako jsou purpurové sinice a bakterie a eukaryotických zelených řas a hub (Baldwin et al., 1978). Gen pro FDA enzym třídy II může být získán známými metodami a což bylo již také provedeno u několika organismů včetně Saccharomyces cerevisiae (Jack a Harris, 1971), Bacillus stearothermophilus (Jack, 1973) a Escherichia coli (Baldwin et al., 1978).

Předpokládá se, že vysoce homologní fruktosa-l,6-bisfosfát aldolasy třídy II s podobnou katalytickou aktivitou se nalézají také v dalších druzích mikroorganismů, například Saccharomyces (Saccharomyces cerevisiae); Bacillus (Bacillus subtilis); Rhodobacter (Rhodobacter sphaeroides); Plazmodium (Plazmodium faciparium, Plazmodium berghei); Trypanosoma (Trypanosoma brucei); Chlamydomonas (Chlamydomonas reinhardtii); Candida (Candida albicans); Corynebacterium (Corynebacterium glutamicum); Campylobacter (Campylobacter jejuni); a Haemophilus (Haemophilus influenza).

Takové sekvence mohou být snadno izolovány methodami dobře známými odborníkům například pomocí hybridizace nukleových kyselin. Podmínky, za kterých dojde k hybridizaci indikují stupeň podobnosti nebo identity obou nukleových kyselin. Sekvence nukleových kyselin mohou být nalezeny na základě jejich schopnosti hybridizovat se známými sekvencemi fda. Méně přísné podmínky mohou být použity pro nálezem sekvencí s nižší homologií nebo identitou. Jsou to například podmínky zahrnující asi 0,15 M až 0,9 M chlorid sodný a teplotu od 20°C do 55°C. Přísnější podmínky mohou být použity pro nalezení sekvencí nukleových kyselin s vyšším stupněm identity se známými sekvencemi. Typicky používané podmínky jsou asi 0,02 M až 0,15 M chlorid sodný, asi 0,5% až 5% kasein, asi 0,02% SDS, nebo si 0,1% N-laurylsarkosin, asi 0,001 M až asi 0,03 M citrát sodný a teploty hybridizace mezi asi 50°C až 70°C. S výhodou mohou být použity ·· • ř3 ·· ···· ·· ♦· « » Λ » · a « · · * • · · · · · • « · · · .· ·· ·« přísnější hybridizační podmínky zahrnující 0,02 M chlorid sodný, asi 0,5% kasein, asi 0,02% SDS, asi 0,001 M citrát sodný při teplotě asi 50°C. Odborníci v oboru jasně vidí, že existuje velký počet různých variací možných podmínek, za kterých může být hybridizace za účelem isolace fda sekvencí podobných známým publikovaným fda sekvencím prováděna, a že vynález není omezen pouze na ty, které jsou zde explicitně uvedeny. S výhodou je pro izolaci sekvencí fda použit přístup vedoucí k nalezení sekvencí s více než 60% podobností s publikovanou fda sekvencí E. coli, a ještě výhodněji s větší než asi 70% identitou, nejlépes více než asi 80% identitou.

V závislosti na růstových podmínkách produkují Euglena gracilis, Chlamydomonas mundara, a Chlamydomonas rheinhardi aldolasy třídy I, nebo II (Cremona, 1968; Russell a Gibbs, 1967; Guerrini et al., 1971).

Isolace genu pro FDA třídy II z E. coli je popsáno v následujících příkladech. Jeho DNA sekvence je uvedena jako SEQ ID č.: 1 a zobrazena na obr. 1. Aminokyselinová sekvence SEQ ID č.: je ukázána na obr.l. Tento gen může být izolován a použit k inserci do rostlinného expresního vektoru vhodného pro zvolenou metodu transformace. FDA enzym E. coli má zdánlivé pH optimum v oblasti pH 7-9 a uchovává si aktivitu v oblasti nižších pH 5-7 (Baldwin et al., 1978; Alfounder et al., 1989).

Pro účely vynálezu mohou být tedy izolovány a použity rozličné geny kódující fruktosa-1,6bisfosfát aldolasu.

Syntetické genové konstrukty

Enzymy uvažované ve vynálezu zahrnují jakoukoli sekvenci aminokyselin, například protein, polypeptid, nebo peptidový fragment, který vykazuje schopnost katalyzovat reakci zahrnutou v syntéze nebo degradaci škrobu, nebo sacharosy. Tato sekvence může být získána z heterologního zdroje, například řasa, bakterie, houba, a prvok, nebo endogenní rostlinná sekvence, kterou je míněna jakákoli sekvence, která může být přirozeně nalezena v rostlinné buňce, včetně nativních (indigenních) rostlinných sekvencí stejně jako sekvencí z rostlinných virů, nebo rostlinných patogenních bakterií.

Odborníku v oboru je zřejmé, že genové sekvence enzymů metabolizujících sacharidy mohou být také modifikovány pomocí standardních technik, jako je místně cílená mutagenese, nebo PCR, případně může být modifikace sekvence spojena s přípravou syntetické nukleové kyseliny a tato sekvence je také rovněž uvažována, jako součást vynálezu. Například poslední „kolísavé párování bází“ (wobble) pozice v kodonech mohou být zaměněny tak, že sekvence nukleových kyselin kóduje stejnou aminokyselinovou sekvenci, nebo případně mohou být kodony změněny tak, že •9 99 99 99 dojde k substituci konservativních aminokyselin. V každém případě si peptidy, nebo proteiny zachovávají žádoucí enzymatickou aktivitu a jsou tedy součástí vynálezu.

Sekvence nukleové kyseliny pro enzym metabolizující sacharidy může být DNA, nebo RNA sekvence odvozená od genomické DNA, cDNA, mRNA, nebo může být syntetická celá, nebo její část. Sekvence strukturních genů mohou být klonovány například izolací genomické DNA z vhodného zdroje, její amplifikací a klonováním žádané sekvence pomocí polymerasové řetězové reakce (PCR). Případně mohou být genové sekvence syntetizovány, buď zcela, nebo zčásti. Zvláště tam, kde je to žádoucí, je připravena sekvence preferovaná vybravými rostlinnými hostiteli. Celý, nebo část žádaného strukturního genu může být syntetizována za použití kodonů výhodných zvoleným rostlinným hostitelem. Kodony, které jsou pro rostlinu výhodné mohou být určeny například podle kodonů nejčastěji používaných v proteinech exprimovaných v určitém hostitelském rostlinném druhu. Další modifikace genových sekvencí mohou vést k mutantům majícím mírně pozměněnou aktivitu.

Je-li to žádoucí může být genová sekvence fda genu změněna bez změny proteinové sekvence tak, že je možno zvýšit expresi, a tak ještě více pozitivně ovlivnit obsah sacharidů v transformovaných rostlinách. Výhodným způsobem pro provedení změn v sekvenci genu je uveden v PCT publikaci WO 90/10076. Gen syntetizovaný metodami tam uvedenými mohou být vloženy do rostlin, jak je popsáno níže a výsledkem jsou vyšší hladiny exprese FDA enzymu. To může být zvláště výhodné v jednoděložných rostlinách, například kukuřice, rýže, pšenice, cukrová řepa a ječmen.

Kombinace s jinými transgeny

Účinek v fda v transgenických rostlinách může být zvýšen kombinací s jinými geny, které pozitivně ovlivňují asimilaci sacharidů, nebo jejich obsah, jako jsou geny kódující sacharosa fosforylasu jak je to popsáno v PCT Publikaci WO 96/24679, nebo ADPGPP geny jako je glgC gen E.coli a jeho mutant glgCló. PCT publikace WO 91/19806 uvádí, jak je možno vložit naposledy zmíněný gen do mnoha druhů rostlin za účelem zvýšení podílu škrobu, nebo pevné hmoty. Další gen, který může být kombinován s fda pro zvýšení asimilace, exportu, nebo ukládání uhlíku je gen kódující sacharosafosfát syntasu (SPS). PCT publikace WO 92/16631 uvádí jeden takový gen a jeho použití v transgenických rostlinách.

Transformace/regenerace rostlin

Při vývoji konstruktů nukleových kyselin podle vynálezu mohou být různé komponenty konstruktu, nebo jeho fragmentů vloženy do vhodného klonovacího vektoru, například plazmidu, který je schopný replikace v bakteriálním hostiteli, například E.coli. V literatuře bylo popsáno mnoho existujících vektorů, mnoho z nich je komerčně dostupných. Po každém klonování může být žádaný insert izolován a podroben další manipulaci, jako je štěpení restriktasami, vložení nového fragmentu, nebo nukleotidů, ligace, delece, mutace, vyštěpení, atd., aby byly patřičně upraveny komponenty žádané sekvence. Jakmile je konstrukt dokončen může být přenesen do vhodného vektoru pro další manipulaci tak, aby mohla být transformována hostitelská buňka.

Rekombinantní DNA molekuly podle vynálezu typicky zahrnují selekční znaky tak, že transformované buňky mohou být snadno identifikovány a odděleny z netransformovaných buněk. Příklady takových znaků zahrnují mimo jiné gen pro neomycin fosfotranferasu (nptll) (Potrykus et al., 1985), který zprostředkovává rezistanci ke kanamycinu. Buňky exprimující nptll gen mohou být selektovány pomocí vhodného antibiotika, jako je kanamycin, nebo G418. Jiné obvykle používané selekční znaky jsou bar gen, který zprostředkuje bialaphos resistenci·, nitrilasový gen, který zprostředkuje rezistenci k bromoxynylu (Stalker et al., 1988); mutantní gen acetolaktát syntasy (ALS), který zprostředkuje rezistenci k imidazolinonu, nebo sulfonylmočovině (European Patent Aplication 154, 204, 1985); gen DHFR pro rezistenci k methotrexátu (Thillet et al., 1988).

Rostliny, které mohou být upraveny tak, aby vykazovaly zvýšenou asimilaci uhlíku, zvýšený export a ukládání uhlíku metodami podle vynálezu zahrnují mimo jiné rostliny rodu Acacia, vojtěška, kopr, jabloň, meruňka, artičok, Eruca sativa, asparagus, avokado, banán, ječmen, fazole, řepa, ostružina, borůvka, brokolice, růžičková kapusta, zeli, řepka, meloun, mrkev, kasava, květák, celer, třešeň, koriandr, citrusy, clementine, káva, kukuřice, bavlna, okurka, Douglasova jedle, lilek, čekanka, locika lesní, eukalypt, fenykl, fíkovník, tykev, vinná réva, grepfruit, Cucumis melo, jicama, kivi, hlávkový salát, pórek, citrón, lípa, ananas, mango, meloun, houby, ořech, oves, řepka, okra, cibule, pomeranč, okrasné rostliny, papaja, petržel, hrášek, broskev, arašíd, hruška, pepř, tomel, borovice, platan, švestka, granátové jablko, topol, rajče, dýně, kdoule, cikorka, ředkvička, malina, rýže, žito, čirok, borovice jižní, sója, špenát, dýně, jahodník, cukrovka, cukrová třtina, batáty, L. styraciflua, mandarinka, čaj, tabák, rajče, triticale, trávník, réva, vodní meloun, pšenice, rostliny rodu Dioscorea, a cukiny.

Dvouřetězcové molekuly DNA podle vynálezu obsahující fda gen mohou být vloženy do genomu rostliny, kteroukoli vhodnou metodou. S výhodou vektory pro transformaci rostlin zahrnují ty, které jsou odvozeny od Ti plazmidu Agrobacterium tumefaciens stejně jako ty, které

jsou uvedeny v například Herrera-Estrella et al. (1983), Bevan (1984), Klee et al. (1985) a EPO publikace 120,516. Navíc k transformačním vektorům pro rostliny odvozených od Ti, nebo kořenyindukujícímu (Ri) plazmidu Agrobacteria, mohou být použity pro vložení DNA konstruktů podle vynálezu také alternativní metody. Tyto metody mohou zahrnovat například použití liposomů, elektroporace, chemické látky, které mohou zvýšit příjem volné DNA, doprava volné DNA pomocí bombardování mikroprojektily a transformace pomocí virů, nebo pylu. DNA může být také vložena do genomu chloroplastu (Danieli et al. 1998).

Plazmidový expresní vektor vhodný pro vložení fda genu do jednoděložných rostlin pomocí bombardování mikroprojektily má tyto součásti: promotor, který je specifický, nebo má zvýšenou expresi v škrobových zásobních tkáních jednoděložných rostlin, hlavně endospermu, například promotor pro zeinové geny z endospermu kukuřice (Pedersen et al., 1982); intron, který má sestřihové místo usnadňující expresi genu, například Hsp70 intron (PCT Publikace WO93/19189); a 3' polyadenylačm sekvence, například 3' sekvence nopalin syntasy (NOS 3'; Fraley et al., 1983). Tato expresní kazeta může být vložena do replikonu s velkým počtem kopií vhodným pro přípravu velkých množství DNA.

Zvláště vhodný na Agrobacteriu založený vektor pro transformaci rostlin použitelný pro transformaci dvouděložných rostlin je plazmidový vektor pMON530 (Rogers et al., 1987). Plazmid pMON530 je derivát pMON505 připraveného přenesením 2,3 kb StuI-HindlII fragmentu pMON316 (Rogers et al., 1987) do pMON526. Plazmid pMON526 je jednoduchý derivát pMON505, ve kterém je odstraněna Smál oblast odstraněna štěpením Xmal, úpravou Klenovovou polymerasou a ligací. Plazmid pMON530 uchovává všechny vlastnosti pMON505 a CaMV35SNOS expresní kazeta a nyní obsahuje jedinečné restrikční místo pro Smál mezi promotorem a polyadenylační signál.

Binární vektor pMON505 je derivát pMON200 (Rogers et al., 1987), ve kterém byl homologní region k Ti plazmidu, LIH, nahrazen 3,8 kb HindlII/Smal segment mini RK2 plazmidu, pTJS75 (Schmidhauser a Helinski, 1985). Tento segment obsahuje RK2 počátek replikace, oriV a počátek přenosu oriT pro konjugaci při Agrobacterium zahrnující tri-parental konjugačnún postupu (Horsch a Klee, 1986). Plazmid pMON505 zachovává všechny důležité znaky pMON200 včetně syntetického multispojovníku pro inserci žádaného DNA fragmentu, chimérického NOS/NPTIT/NOS genu pro resistenci ke kanamycinu v rostlinných buňkách, resistenci k spektinomycinu/streptomycinu pro selekci v E.coli a A.tumefaciens, intaktní gen pro nopalin syntasy pro snadnou selekci transformantů, a pBR322 počátek replikace pro snadnou přípravu velkých množství vektoru v E.coli. plazmid pMON505 obsahuje jednoduchý T-DNA okraj • ··©· ·· ···· » · ·· © ©· © ··· • « ©·© ·«© • · ©·· ····· • · ···· ··· ···· ·· ·· ·· odvozený od pravého konce pTiT37 T-DNA nopalinového typu. Southern bol analýza ukázala, že plazmid pMON505 a jakákoli DNA, kterou nese jsou integrovány do rostlinného genomu. Jeden konec integrované DNA je lokalizována mezi pravý okraj sekvence a genu pro nopalin syntasu a druhý konec je mezi okrajem sekvence a pBR322 sekvencí.

Jiný zvláště vhodný Ti plazmidový kazetový vektor je pMON17227. Tento vektor je popsán v PCT publikaci WO 92/04449 a obsahuje gen kódující enzym zprostředkující glyfosatovou rezistenci (označený CP4), který je výborným selekčním genem signálního znaku pro mnoho rostlin včetně brambory a rajčete. Tento gen je fúzován s Arabidopsis EPSPS chloroplastovým signálním peptidem (CTP2) a je exprimován z FMV promotoru, jak je popsáno.

Pokud je získán adekvátní počet buněk (nebo chloroplastů) obsahujících fda gen, nebo cDNA, buňky (chloroplasty) jsou regenerovány v úplné rostlině. Volba metodologie pro regeneraci není podstatná, jsou dostupné vhodné postupy pro rostliny Leguminosae (vojtěška, sója, jetel, atd.), Umbelliferae (mrkev, celer, pastifták), Cruciferae (zelí, křen, řepka, atd.), Cucurbitaceae (melouny a okurka), Gramineae (pšenice, ječmen, rýže, kukuřice, atd.), Solanaceae (brambor, tabák, rajče, paprika), různé kvetoucí plodiny, například slunečnice, a stromy nesoucí ořechy, například mandloň, kešú, vlašský ořech, a lískový ořech. Viz, Ammirato et al., (1984); Shimamoto et al., (1989); Fromm (1990); Vasil et al., (1990); Vasil et al., (1992); Hayashimoto (1990); a Datta et al. (1990).

Následující definice mají sloužit odborníkům v oboru pro porozumnění detailnímu popisu vynálezu.

Termín „promotor“, nebo „promotorova oblast“ označuje sekvenci nukleové kyseliny, kterou obvykle nalézáme před (5') kódující sekvencí, která řídí expresi kódující sekvence pomocí kontroly produkce mediátorové RNA (mRNA) tím, že poskytuje specifické místo pro RNA polymerasu, nebo další faktory nezbytné pro zahájení transkripce ve správném místě. Jak je zde zamýšleno promotor, nebo promotorova oblast zahrnuje variace promotorů odvozených na základě ligace k různým regulačním sekvencím, náhodné nebo cílené mutagenese, a přidání nebo duplikace sekvencí zesilujících přepis (transkripci). Promotorová oblast uvedená zde a její biologický funkční ekvivalent jsou odpovědné za zajištění kontrolované transkripce kódujících sekvencí, jsou-li vloženy do hostitelského organismu jako součást rekombinantního vektoru, což je demonstrováno jeho schopností produkovat mRNA.

„Regenerace“ označuje proces růstu rostlin z rostlinné buňky (například rostlinného protoplastu nebo explantátu).

44 • · · · · * ·

4 4 4

4 4 4 • 4 4 4 „Transformace“ označuje proces vložení exogenní sekvence nukleové kyseliny (například vektoru, rekombinantní molekuly nukleové kyseliny) do buněk, nebo protoplastů, ve kterých se exogenní nukleová kyselina inkorporuje do chromosomu, nebo je schopna autonomní replikace.

„Transformovaná buňka“ je buňka jejíž DNA byla pozměněna vložením exogenní molekuly nukleové kyseliny do této buňky.

Termín „gen“ označuje chromosomální DNA, plazmidové DNA, cDNA, syntetické DNA, nebo jiné DNA, která kóduje peptid, polypeptid, protein, nebo RNA molekulu a oblasti sousedící s kódující sekvencí účastnící se regulace exprese.

„Identita“ označuje stupeň podobnosti mezi dvěma nukleovými kyselinami, nebo proteinovými sekvencemi. Srovnání dvou sekvencí je prováděno pomocí vhodného počítačového v

programu. Široce používaným a akceptovaným počítačovým programem pro srovnání sekvencí je CLUSTALW v 1.6 (Thompson et al., 1994). Počet stejných bází, nebo aminokyselin je dělen celkovým počtem bází, nebo aminokyselin a vynásobený 100, čímž se získájí procenta identity. Například má-li sekvence 580 párů bází má 145 shodných aminokyselin je zde 25% identita. Jsou-li dvě porovnávané sekvence různé ve své délce je počet shodných aminokyselin dělen délkou kratší ze dvou sekvencí. Například máme-li 100 shodných aminokyselin mezi 200 a 400 aminokyselinovými proteiny, mají tyto sekvence 50% shodu vzhledem ke kratší sekvenci. Je-li kratší sekvence kratší než 50 bází, nebo aminokyselin, je počet shodných dělen 50 a vynásoben 100 za získání procenta identity.

„C-koncová oblast“ označuje oblast peptidu, polypeptidu, nebo proteinového řetězce od jeho středu ke konci, který nese aminokyselinu mající volnou karboxylovou skupinu.

Fráze „DNA segment heterologní k promotorové oblasti“ označuje kódující DNA segment neexistuje v přírodě ve stejném genu s promotorem, ke kterému je připojen.

Termín „kódující DNA“ označuje chromozomální DNA, plazmidovou DNA, cDNA, nebo syntetickou DNA, která kóduje některý z enzymů diskutovaných zde.

Termín „genom“ je-li aplikován na bakterie označuje jak chromozom, tak plazmidy bakteriální hostitelské buňky. Kódující DNA podle vynálezu vložená do bakteriální hostitelské buňky může být tedy integrovaná do chromozomu, nebo lokalizovaná na plazmidu. Termín „genom“ je-li aplikován na rostliny zahrnuje nejen chromozomální DNA nacházející se uvnitř jádra, ale i DNA organel nacházející se uvnitř dílčích buněčných složek. DNA podle vynálezu vložená do rostlinných buněk může tedy být integrována do chomozomu, nebo se nacházet v organelách.

Termíny „mikrob“, nebo „mikroorganismus“ označují řasy, bakterie, houby a prvoky.

Termín „mutein“ označuje mutantní formu polypeptidu, nebo proteinu.

• · · · · · · · • · · · ···· • ♦ · · ······ • · · · · · « · · • » · · ·· · · · · „N-koncová oblast“ je označení pro oblast peptidu, polypeptidu, nebo proteinu od aminokyseliny nesoucí volnou aminoskupinu po střed řetězce.

„Overexprese“ je označení pro expresi polypeptidu, nebo proteinu kódovaného DNA vloženou do hostitelské buňky, nebo tento polypeptid, nebo protein není normálně v hostitelské buňce přítomna, nebo že tento polypeptid, nebo protein je přítomen v hostitelské buňce ve větším množství, než jak je exprimován normálně z endogenního genu kódujícího tento polypeptid, nebo protein.

Termín „plastid“ označuje třídu organel rostlinné buňky, která zahrnuje amyloplasty, chloroplasty, chromoplasty, elaioplasty, eoplasty, etioplasty, leukoplasty a protoplastidy. Tyto organely jsou samoreplikující se a obsahují kruhovou molekulu DNA, která je obvykle označována jako „genom chloroplastu“, a jejíž velikost se pohybuje od asi 120 kb do asi 217 kb, v závislosti na druhu rostliny, a která obvykle obsahuje oblasti invertované repetice.

Fráze Jednoduchý sacharidový substrát“ označuje monosacharid, nebo oligosacharid, ale ne polysacharid; jednoduché sacharidové substráty zahrnují glukosu, fruktosu, sacharosu, laktosu. Komplexnější sacharidové substráty obvykle používané v médiích, například kukuřičný syrup, škrob, melasa mohou být rozštěpeny na jednoduché sacharidové substráty.

Termín „pevná hmota“ označuje bezvodý podíl hlízy (například brambory), nebo plodu (například rajčete) tvořený převážně škrobem a jinými polysacharidy, jednoduchými sacharidy, nestruktumími sacharidy, aminokyselinami a dalšími organickými molekulami.

Následující příklady jsou uvedeny pro lepší objasnění provedení vynálezu a neměly by být interpretovány tak, že omezují rozsah vynálezu. Odborníci v oboru rozeznají množství modifikací a podobě, kterými může být zasaženo do způsobů a genů zde uvedených, aniž je opuštěn duch a rozsah vynálezu.

Přehled obrázků na výkresech

Obr. 1 ukazuje nukleotidovou sekvenci genu a odvozenou aminokyselinovou sekvenci fruktosa-l,6-bisfosfát aldolasy z E. coli (SEQ ID č.: 1).

Obr. 2 ukazuje plazmidovou mapu transformačního vektoru rostlin pMON17524.

Obr. 3 ukazuje plazmidovou mapu transformačního vektoru rostlin pMON17542.

Obr. 4 ukazuje změny v denních fluktuacích hladin sacharosy, glukosy a škrobu v tabákových listech exprimujících fda transgen (pMON17524) a kontroly (pMON17227). Světelná perioda od 7:00 do 19:00 hodin. Vzorkovány byly pouze zcela rozvinuté a nepřestárlé listy.

Obr. 5 ukazuje plazmidovou mapu transformačního vektoru rostlin pMON 13925.

Β Β Β ΒΒΒ • Β ΒΒΒ ΒΒΒΒΒ

Β Β ΒΒΒ ΒΒΒΒ • Β Β Β Β Β Β Β Β Β Β

ΒΒ ΒΒΒΒ ΒΒΒΒ ¹⁷ ΒΒΒΒ ΒΒ ΒΒ ΒΒ ΒΒ

Obr. 6 ukazuje plazmidovou mapu transformačního vektoru rostlin pMON17590.

Obr. 7 ukazuje plazmidovou mapu transformačního vektoru rostlin pMON13936.

Obr. 8 ukazuje plazmidovou mapu transformačního vektoru rostlin pMON17581.

Obr. 9 ukazuje řez bramborovou hlízou se zlepšenou stejnoměrností rozložení pevné hmoty linie Segal Russet Burbank (horní řádek) ve srovnám s nevylepšenou netransgenických Russer Burbank (spodní řádek).

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

Klonování cDNA a overexprese

Není-li uvedeno jinak, jsou základní DNA manipulace a genetické techniky, například PCR, agarosová elektroforéza, restrikčm štepení, ligace, transformace E.coli, selekce kolonií, a Western bloty prováděny v podstatě podle postupu popsaném v Sambrook et al., (1989), nebo Maniatis et al., (1982).

Sekvence fda genu E.coli (SEQ ID č.: 1) byla získána z Genbank (Accession number XI4682) a byly připraveny nukleotidové primery homologní k 5' a 3' koncům pro PCR amplifikaci. Chromozomální DNA E.coli byla izolována a fda gen byl ampliíikován pomocí PCR za použití 5' oligonukleotidu 5OGGGCCATGGCTAAGATTTTTGATTTCGTA3' (SEQ ID ě.:3) a 3'oligonukleotidu 5 'CCCCGAGCTCTTACAGAACGTCGATCGCGTTCAG3' (SEQ ID č.: 4). Podmínky PCR cyklů jsou následující: 94°C, 5 min (1 cyklus); přídavek polymerasy; 94°C, 1 minut, 60°C, 1 minut, 72°C, 2 minut 30 sekund (35 cyklů). 1,08 kb PCR produkt byl purifikován v gelu a ligován s E.coli expresním vektorem pMON5723 za vzniku vektorového konstruktu, který byl použit pro transformaci zmražených kompetentních buněk E.coli JM101. pMON5723 vektor obsahuje E.coli recA promotor a vedoucí sekvence genu T7 (G10L), které zajišťují vysokou expresi v E.coli (Wong et al., 1988). Po indukci transformovaných buněk je na SDS PAGE gelu patrný zřetelný pás odpovídající 40 kDa, který odpovídá velikosti podjednotky polypeptidového řetězce dimemí aldolasy II. Bylo ukázáno, že většina indukovaného proteinu je přítomno v rozpustné fázi. Segment gelu obsahující vysoce indukovaný protein byl izolován a protilátky se získaly od kozy, které byl injektován homogenizovaný segment gelu (emulgované Freudovým kompletním adjuvans).

Sekvence fda genu byla následně klonována do jiného E.coli expresního vektoru pod kontrolou taq promotoru. Po indukci buněk JMI 01 pomocí IPTG, transformovaných tímto vektorem, je pozorován stejný 40 kDa overexprimovaný proteinový pás. Tento nový klon byl použit pro enzymové stanovém FDA aktivity. Buňky transformované tímto vektorovým konstruktem byly kultivovány v tekuté kultuře, indukovány pomocí IPTG a kultivovány další 3 hodiny. Následně byly 3 ml buněčné kultury stočeny, rozsuspendovány v 100 mM Trisu a ozvučeny. Buňky byly stočeny a v surovém supematantu buněčného extraktu byla stanovena FDA aktivita pomocí spřaženého enzymatického stanovení popsaného v Baldvin et al. (1978). Toto stanovení je rutině prováděno při 30°C.

Reakce byla prováděna v celkovém objemu 1 ml s nadbytkem enzymů triosafosfát isomerasy (TIM) a alfa-glycerolfosfát dehydrogenasy (GDH) v reakční směsi obsahující celkovou koncentrace 100 mM Tris pH 8,0; 4,75 mM fruktosa-l,6-bisfosfát; 0,15 mM NADH, 500 U/ml TIM; a 30 U/ml GDH.

Pokles absorbance při 340 nm po přídavku supematantu buněčného extraktu, byl zaznamenáván pomocí spektrofotometru HP vybaveného diodovým polem. Jedna mezinárodní jednotka (I.U.) aldolasové aktivity je způsobena oxidací 2 pmol NADH/minutu v tomto systému.

Buněčný extrakt buněk obsahujících vektor s fda sekvencí vykazoval podstatně zvýšenou aldolasovou aktivitu (13,1 U/mg proteinu) ve srovnání s buňkami transformovanými kontrolním vektorem (0,15 I.U./mg proteinu). Bylo ukázáno, že aktivita je inhibována EDTA, o které je známo, že specificky inhibuje aldolasy typu II.

Příklad 2

Transformace rostlin a exprese fda v tabáku

Zacílení FDA proteinu

Fruktosa-l,6-bisfosfát aldolasa E.coli byla zacílena po plastidů rostlin, aby bylo její pomocí dosaženo ovlivnění sacharidového metabolismu a biosyntézy škrobu v těchto rostlinných organelách. Aby bylo dosaženo importu aldolasy a E.coli do plastidů, byl zkonstruhován vektor, ve kterém byla aldolasa fúzována se signálním peptidem malé podjednotky (CTP1) Arabidopsis (Stark et al., 1992), nebo kukuřičné malé podjednotky CTP (Russell et al., 1993), za vzniku konstruktu, ve kterém je CTP-/JU fuzní gen umístěn mezi sekvencí 35S promotoru z viru mozaiky krtičníku (PFMV35S; Gowda et al., 1989) a 3'-nepřekládanou oblastí genu pro nopalinsyntasu (NOS 3'; Fraley et al., 1983). Vektorový konstrukt obsahující expresní kazetu [P-FMV/CTPl//tZa/NOS3'] byl následně použit pro transformaci tabákových protoplastů, které byly připraveny postupem

9 9 9 «9 9999

popsaným v Fromm et al., (1987), s následujícími modifikacemi. Suspense buněk tabákového kultivaru Xanthi linie D (Txd) byly pěstovány v 250 ml lahvých při 25°C a 138 obrátkách za minutu ve tmě. Pro zachování kultury bylo odebráno 9 ml dílčí kultury a přidáno 40 ml čerstvého Txd média obsahujícího MS soli, 3% sacharosa, 0,2 g/1 inositolu, 0,13 g/1 asparaginu, 80 μΐ zásobního roztoku 50 mg/ml PCPA, 5 μΐ roztoku 1 mg/ml kinetinu a lml lOOOx vitaminů (1,3 g/1 nikotinová kyselina, 0,25 g/1 thiaminu, 0,25 g/1 pyridoxinu HCL, a 0,25 g/1 pantothenatu vápenatého) každé 3 až 4 dny. Protoplasty byly izolovány z jeden den staré suspenze buněk, která byla připravena ze dva dny staré kultury. Šestnáct mililitrů buněk bylo přidáno k 40 ml čerstvého Txd media a ponecháno růst 24 hodin před štěpením a izolací chloroplastů. Fáze centrifugace enzymové směsi byla vypuštěna. Elektroporační pufr a medium pro izolaci chloroplastů bylo sterilizováno filtrací spíše než autoklavováním. Elektroporační pufr neobsahoval 4 mM CaCl₂. Buňky v suspenzi byly lyžovány enzymem 1 hodinu. Protoplasty byly spočteny na hemacytometru, spočteny byly jen protoplasty, které vypadaly jako intaktní a kruhové. Bio-rad Gene Pulser kyvety (katalogové číslo 165-2088) s 0,4 cm šířky a maximálního objemu 0,8 ml byly použity pro elektroporaci. Do kyvety bylo přidáno od 5 do 100 pg DNA obsahující žádaný gen a 5 pg DNA obsahující luciferasový gen jako vnitřní standard. Hustota chloroplastů při elektroporaci byla 2xl0⁶/ml a podmínky elektroporace byly nastaveny na kapacitanci 500 pF a 140 voltů pomocí Bio-rad Gene Pulser. Protoplasty byly po resuspendování v elektroporačním pufru v kyvetách umístěny na led na 10 minut po elektroporaci. Protoplasty byly přidány do 7 ml Txd média + 0,4 M manitolu a kondiciovaného média po elektroporaci. V této fázi nebyla již používána voda z kokosového ořechu. Protoplasty byly kultivovány 1 hodinových periodách den/noc při 26°C a poté stočeny a je v nich stanovena aktivita, nebo byly zmraženy 20-24 hodin po elektroporaci.

Western blot analýza extraktu protoplastů získaných po transformaci ukázala tvorbu nativní FDA v tabákových protoplastech. Exprese byla detekována objevením proteinu o molekulové hmotnosti 40 kDa, což je molekulová hmotnost aldolasové podjednotky a je to stejný proteinový pás, jaký lze pozorovat i při overexpresi aldolasy v E.coli.

Expresní kazeta [P-FMV/CPTl//í/«/NOS3'j byla následně klonována do Notl místa pMON17227 (popsaném v PCT Publikaci WO 92/04449) ve stejné orientaci jako selekční signální znak expresní kazety, za vzniku rostlinného transformačního vektoru pMON17524, jak je ukázáno na obrázku 2 (SEQ ID č.: 5).

Další konstrukt byl připraven a použit pro transformaci protoplastů, fiizí fda genu

Arabidopsis EPSPS signálního peptidu (CTP2), který byl popsán v U.S. patentu 5,463,175.

Signální peptid byl klonován (pomocí Sphl místa) do Sphl místa umístěného bezprostředně před N22

9 · 9 9 9 9 · 9 9

9 9 9 9 9 9

99 9· 99 konec fda genové sekvence v CTPl-/ító fúzním genu (popsaném výše). Tento nový CTP2-/t/a fúzní gen byl poté klonován do vektoru mezi FMV promotor a NOS3' sekvence. Poté co tento konstrukt obsahující CTP2/fda genovou sekvenci byl použit pro transformaci tabákových protoplastů, byla pozorována exprese proteinu odpovídajícího přibližně 40 kDa, který má molekulovou hmotnost podjednotky aldolasy a protein stejné hmotnosti byl pozorován i při overexpresi aldolasy v E.coli.

Notl kazeta [P-FMV/CTP2//tfa/NOS3'] z tohoto konstruktu byla poté klonována do Notl místa pMON17227 ve stejné orientaci jako selekční signální znak expresní kazety, za vzniku transformačního vektoru pro rostliny pMON17542, který je zobrazen na obrázku 3 (SEQ ID č.: 6).

Pro cytoplazmickou expresi FDA v tabákových protoplastech byl připraven další konstrukt, ve kterém je sekvence fda genu klonována (bez toho aniž by byla připojena k tranzitnímu peptidu) do páteře vektoru mezi FMV promotorovou a NOS3' sekvenci. Pomocí tohoto konstruktu pro transformaci tabákových protoplastů byla také prokázána exprese proteinu stejné velikosti migrujícího při přibližně 40 kDa.

Exprese fda v rostlinách tabáku

Pro transformaci tabákových rostlin byly použity dva konstrukty jeden obsahující fda gen fúzovaný s CTP1 Arabidopsis (pMON17524) (SEQ ID č.: 5, obr. 2) druhý fúzovaný se signálním peptidem EPSPS (CTP2) (PMON17542) (SEQ ID č.: 6, obr. 3), jak bylo popsáno v US patent 5,463,175. Vektor bez CTP-fda sekvencí pMON17227 (popsaný v PCT publikaci WO 92/04449), byl použit jako negativní kontrola. Transformační vektory pro transformaci rostlin byly vloženy do ABI kmene Agrobakteria. Vložení plazmidového vektoru do ABI kmene bylo provedeno pomocí triparentální konjugace pomocí pomocného plazmidu pRK2013 (Ditta et al., 1980).

Byly připraveny v růstových nádobkách pěstované linie tabákových transformantů a nejprve byl proveden jejich screening pomocí Western bio tu, aby byly identifikovány linie exprimující fda, a to pomocí kozí protilátky proti E.coli exprimující fda. Následně byly v listech linií tabáku exprimujících pMON17524 analyzovány nestrukturální sacharidy (sacharosa, glukosa, a hydrolysovaný škrob na glukosu) pomocí přístroje YSI moel 2700 Select Biochemistry Analyzer. V průběhu počáteční fáze kvetení byly z těchto rostlin brány také vzorky listů a byly v nich analyzovány denní změny obsahů nestruktumích sacharidů.

500 mg až 1 g čerstvých tabákových listů bylo sklizeno a extrahováno 5 ml horkého Nafosfátu (40 g/1 NaEEPCU a 10 g/1 ^EEPO* ve dvakrát deionizované vodě) homogenizací s Polytronem. Zkumavky centrifugo vány 12 minut při 3000 otáčkách za minutu a supernatant byl • · ···· · · ··· ······ ·· ···· ···· ··· · ·· ·· ·· «· oddělen pro analýzu rozpustných cukrů. Pelet byl rozsuspendován v 5 ml horkého Na-fosfátu rozmíchány na vortexu a zcentrifugovány, jak je popsáno výše. Supematant byl opatrně oddělen a spojen s dříve získanou frakcí supematantu a byla provedena analýza rozpustných cukrů (sacharosa, glukosa) pomocí přístroje YSI a vhodných membrán.

Škrob byl extrahován z peletu pomocí Megazym Kitu (Megazym, Australia). Do peletu bylo přidáno 200 μΐ 50% ethanolu a 3 ml termostabilní alfa-amylasy (300U) a směs byla promíchána na vortexu. Vzorky byly poté inkubovány ve vařící vodě 6 minut a promíchány po 2 a 4 minutách. Zkumavky byly poté umístěny ve vodě o teplotě 50°C a bylo přidáno 4 ml 200 mM acetátového pufru (pH 4,5) a následně 0,1 ml amyloglukosidasy (20 U). Inkubace trvala 1 hodinu. Zkumavky byly poté zcentrifugovány 15 minut při 3000 otáček za minutu. Ze supematantu byly odebrány alikvoty a analyzovány na glukosu pomocí YSI. Volná glukosa byla přepočítána na anhydro glukosu (tak jak se vyskytuje ve škrobu vynásobením poměrem 162/182). Celkový objem ve zkumavce byl 7,1 ml.

Jak je vidět z tabulky 1, exprese fda genu z tabáku korelovala z významným zvýšením hladiny škrobu v listech. Avšak z obrázku 4 je ukázán stanovený denní profil hladiny škrobu v listech exprimujících fda, kde je toto zvýšení patrné hlavně v ranné fázi fotoperiody, což je fáze, o které je známo, že listy zde mají nejvyšší fotosyntetickou aktivitu. Toto zvýšení hladiny škrobu nemá zdánlivě žádné negativní efekty na rostlinu, protože zvýšená hladina škrobu je odbourána během temné periody. Nebylo zaznamenáno žádné zvýšení steady-state hladin sacharosy, nebo glukosy v tabákových listech exprimujících fda z E.coli ve srovnání s kontrolou.

Tabulka 1

Hladina sacharidů v listech rostlin exprimujících fda transgen¹ (pMON17524)

	Silný expresor (>0.01% celkové bílkoviny)	slabý expresor (<0,01 %) (mg/g čerstvé váhy)	negativní kontrola
ŠKROB	35,08±3,20	23,25±3,20	16,69±2,92
SACHAROSA	0,86±0,25	0,86±0,25	0,66±0,19
GLUKOSA	l,58±0,17	l,58±0,20	l,68±0,26

¹ Vzorky listů byly sklizeny v poledne.

Další sada tabákových rostlin byla transformována pomocí konstruktu pMON17542 a rostliny byly pěstovány ve skleníku. Tabákové rostliny obsahující vektor bez QTP-fda sekvencí,

9 9 9 • « 9 9··

9 9 9 9 9 9

9 999 99 9 • 99 9 9 99 9 ·· ·9 99 ·· ρΜΟΝ 17227, byl použit jako negativní kontrola. Všechny pMON17542-linie byly testovány na expresi pomocí Western blotu, 18 z nich bylo sinými expresory (>0,01% celkového buněčného proteinu) a 15 linií bylo slabými expresory (<0,01 %). Patnáct rostlin obsahujících nulový vektor, pMON 17227, bylo použito jako kontrola. Plně rozvinuté listy z rostlin exprimující fda transgen a negativní kontroly byly testovány na export sacharosy odebíráním výměšku z floemu produkovaného listovým systémem. Získávání výměšku floemu je popsáno v Groussol et al. (1986). Listy byly sklizeny v 11:30 dopoledne a umístěny do média obsahujícího 5 mM EDTA při pH 6,0 a ponechány zde 4 hodiny za plného světla a vlhkosti. Médium byl poté ihned analyzováno a byla zde stanovena hladina sacharosy způsobem popsaným výše v metodách analýzy obsahu sacharidů. Jak je vidět v tabulce 2, bylo u rostlin exprimujících fda transgen pozorováno významné zvýšení exportu sacharosy ven z listů.

Toto zvýšení exportu sacharosy vlivem exprese fda v listech ukazuje na zvýšení kapacity asimilačních orgánů, pravděpodobně vlivem zvýšeného toku uhlíku přes Calvinův cyklus (jako odpověď na zvýšenou spotřebu triosa-fosfátů) a tedy zvýšení celkové spotřeby uhlíku v listech. Jak je patrné z tabulky 2, zvýšení hladiny sacharosy ve floemu koreluje s hladinou exprese fda.

Tabulka 2

Hladiny sacharosy ve výměšku floemu z oddělených listů fda transgenických tabákových rostlin (pMON17542)

	Příjem vody (μΐ/g čerstvé váhy/h)	Sachrosa ve výměšku floemu
(ng/listu)	(ng/g čerstvé váhy)
silný expresor fda	320±20	330±60	108+22
slabý expresor fda	340±10	210±10	77±3
kontrola	390±30	160±10	56±3

Jak je patrné z tabulky 3, předběžná analýza růstu a vývoje rostlin nezjistila žádný významný rozdíl v počtu listů, nebo tobolek u jedné rostliny, výšky rostliny, průměru stonku, nebo váhy semen u jedné rostliny, mezi rostlinami exprimujícími fda gen a za specifických růstových podmínek. Jak je však vidět z tabulky 4 mají fda transgenické rostliny významně vyšší hmotu kořenů. To může naznačovat že, za těchto podmínek, představují kořeny důležitější zásobní orgán, v němž se ukládá nadbytek sacharidů produkovaných listy. Navíc uváděné údaje ukazují, že zvýšení hmoty kořenů v přítomnosti fda genu E.coli není spojeno s žádnými negativními důsledky na růst výhonků, kvetení, nebo počet semen. Tedy toto zvýšení v růstu kořenů a konečné sušiny kořenů je žádoucím rysem rostliny, protože vede k rychlému usazení semenáčku po vyklíčení a větší «« ·99Λ »

• · «· ··· 9 9 « * · • · 9 9 9 9 9 9 9 t 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9

9 9 9 9 9 9 9 9 9

999 9 99 ·· ·· ftt schopnosti rostliny tolerovat sucho, chladový stres a další vlastnosti prostředí a přesazení. V různých rostlinách a za různých růstových podmínek je očekáváno zvýšení hmotnosti jiných částí rostlin (semena, plody, stonky, listy, hlízy, cibule, atd.) jak je to pozorováno u kořenů tabákových rostlin overexprimujícíchfda transgen.

Tabulka 3

Stanovení některých parametrů růstu a vývoje rostlin u tabáku exprimujícího fda transgen¹ (pMON17542)

	#tobolky/ rostlina	#listy/ rostlina	Výška rostliny (cm)	Váha semen (g/rostlina)
silní expresoři	162±40	25,4±0,8	65,3±3,1	18,8±2,4
kontrola	156±28	24,4±0,5	65,8±5,1	17,3±2,6

¹ Pro tuto analýzu bylo 14 linií silných expresorů srovnáváno s 15 kontrolními rostlinami.

Měření byly provedeny před sklizní semen (většina tobolek dosáhla dospělosti). Počet listů byl stanoven zjištěním počtu kolínek, aby byly vzaty do úvahy odpadlé lity.

Tabulka 4

Sušina kořenů tabákových rostlin exprimující fda E.coli transgen¹ (pMON17542)

	Sušina kořenů (g/rostlina)
silný expresor fda	64,0±3,9
slabý expresor fda	62,7±5,4
kontrola	31,7+1,6

¹ Kořeny z 5 silných a 7 slabých expresorových linií a 6 kontrolních rostlin byly odděleny opatrně promyty a poté umístěny v sušárně při teplotě 65 °C na nejméně 48 hodin. Kořeny byly vyjmuty ze sušárny ponechány ekvilibrovat v laboratoři 2 hodiny před stanovením sušiny.

Příklad 3

Transformace rostlin exprese fda v kukuřici

Nasměrování FDA proteinu

Vektory obsahující fda gen s nebo bez plastidového signálního peptidu byly připraveny tak, aby byly vhodné pro transformaci kukuřice a vhodné také pro transformaci dalších jednoděložných rostlin včetně rýže, pšenice, ječmene, cukrové třtiny, triticale (kříženec pšenice a žita), atd.

2δ :

• · · ·

Pro cytosolickou expresi fda genu v kukuřice byl připraven konstrukt, kde fda genová sekvence byla spojena s páteří vektoru obsahujícího zesílený CaMV 35S promotor (e35S; Kay et al., 1987), HSP70 intron (US patent 5,593,874), aNOS3' polyadenylační signální sekvenci (Fraley et al., 1983). Tato Notl kazeta [P-e35S/HSP70 intron/fda/NOS3'] která byla klonována do Notl místa pMON30460, transformačního vektoru jednoděložných rostlin, za vzniku rostlinného transformačního vektoru pMON13925, jak je ukázáno na obr. 5 pMON30460 obsahuje expresní kazetu pro selekční signální znak gen neomycin fosfotransferasy typu II (nptll) [P35S/NPTII/NOS3'] a unikátní Notl místo pro klonování žádaného genu. Konečný vektor (pMON13925) byl zkonstruován tak, že žádaný gen a gen selekčního signálního znaku byly klonovány ve stejném směru. Fragment vektoru obsahující expresní kazety pro tyto genové sekvence může být oddělen od bakteriálního selekčního znaku (Kan) a ori, purifikován pomocí gelové elektroforézy a použit pro transformaci rostlin.

Pro expresi fda genu v chloroplastech kukuřice byl připraven konstrukt, ve kterém byla fda genová sekvence spojena se sekvencí CTP malé podjednotky kukuřičné RUBISCO (Russell et al., 1993), a vložena do vektoru obsahujícího zesílený (CaMV) 35S promotor, HSP70 intron a NOS3' polyadenylační sekvenci. Tato Notl kazeta [P-e35S/HSP70 intron/mzSSuCTP/ fda/NOS3'] která byla klonována do Notl místa (ve stejné orientaci jako kazeta selekčního signálního znaku [P35S/NPTII/NOS3']) transformačního vektoru jednoděložných rostlin pMON30460, za vzniku rostlinného transformačního vektoru pMON 17590, jak je ukázáno na obr. 6. Fragment vektoru obsahující expresní kazety pro tyto genové sekvence může být oddělen od bakteriálního selekčního znaku (Kan) a ori, purifikován pomocí gelové elektroforézy a použit pro transformaci rostlin.

Pro expresi aldolasového genu v cytosolu-endospermu kukuřice fda genová sekvence klonována do vektoru (ve stejné orientaci jako kazeta selekčního signálního znaku [P35S/NPTII/NOS3']) obsahujícího promotor glutelinového genu P-osgtl (Zheng et al., 1993) za vzniku vektoru pMON 13936, jak je ukázáno na obr. 7. Fragment vektoru obsahující fda expresní kazetu [P-ostgl/HSP70 intron /fda/NOS3'] a expresní kazetu selekčního signálního znaku pro tyto genové sekvence může být oddělen od bakteriálního selekčního znaku (Kan) a ori, purifikován pomocí gelové elektroforézy a použit pro transformaci rostlin.

Transformace rostlin kukuřice

Transgenické rostliny kukuřice vektorem pMON13925 (popsaný výše), nebo pMON17590 (popsaným výše) byly připraveny pomocí bombardování mikroprojektily, postupem v literatuře dobře známým (Fromm, 1990; Gordon-Kamm et al., 1990; Walters et al., 1992). Jako cílová tkáň • · ·

· 9 9 9 9 9 9 9 9 «4 4 · 9 9 9 9 9 9 9 9 byl použit embryogenní kalus pocházející z nedospělého embrya kukuřice. Plazmidová DNA byla precipitována z roztoku 1 mg/ml v TE pufru na M10 wolframových částicích pomocí postupu založeného na chloridu vápenatém a spermidinu přesně, jak je to popsáno v Klein et al. (1988). Kromě žádaného genu plazmid obsahoval také gen pro neomycin fosfotransferasu II (nptll) řízenou promotorem 35S z viru květákové mozaiky. Cílová tkáň embryogenického kalusu byla připravena pro přijetí DNA v kultivačním médiu osmoticky pufrovaném 0,2M manitolem a 0,2M sorbitolem asi dvě hodiny před bombardováním (Vain et al., 1993). Tkáň byla bombardována dvakrát wolframovými částečkami pokrytými DNA pomocí zařízení BioRad Particle Delivery System (PDS) 1000. Asi 16 hodin po bombardování byla tkáň přenesena do média stejného složení s tím rozdílem, že neobsahovalo manitol ani sorbitol a obsahovalo příslušné aminoglykosidové antibiotikum, například G418”, aby byly vebrány ty buňky, které obsahují exprimovaný 35S/nptII gen. Aktivně rostoucí tkáňový sektor byl přenášen do čerstvého selekčního média přibližně každé tři týdny. Asi 3 měsíce po bombardování byly z embryogenních kalusů, které přežily, regenerovány rostliny přesně, jak je popsáno v Duncan a Widholm (1988).

Aldolasová aktivita transgenická kukuřice

Pro měření aldolasové aktivity byly odebrány vzorky listů kukuřice a ihned zmraženy v suchém ledu. Aido laso vý enzym byl extrahován z listové tkáně rozetřením listu při 4°C v 1,2 ml extrakčního pufru (100 mM HEPES, pH 8,0, 5 mM MgCl₂, 100 mM KC1, 10 mM DTT, 1% BSA, mM PMSF, 10 pg/mL leupeptin, 10 pg/mL aprotinin). Extrakt byl centrifugo ván při 15000 x g, při 4°C 3 minuty v neodsoleném supernatantu byla stanovena enzymová aktivita. Tato extrakění metoda poskytla výtěžek asi 60% E.coli FDA aktivity.

Celková aktivita aldolasy byla stanovena v 0,98 ml reakční směsi, která obsahovala 100 mM EPPS-NaOH, pH 8,5, 1 mM fruktosa-bisfosfát, 0,1 mM NADH, 5 mM MgCl₂, 4 jednotky aglycerolfosfát dehydrogenasy, 15 jednotek triosafosfát isomerasy. Reakce byla zahájena přídavkem 20 pl extraktu listů. Výsledná data získaná z jednoho experimentu jsou uvedena v tabulce 5.

Tabulka 4

Aldolasová aktivita z listů transgenická kukuřice

Linie	A340/min/20 pl	Aktivita %
H99 (kontrola)	0,113	100
pMON 17590	0,233	206
pMON13925	0,215	222

• · ···· 9 9 ff

9 9 9 9 9 9

9 9 9 9 9 9 9

9 9 9 9 9 9 9

9 9 9 9 9 99

U primárních transformantů (RO rostlin) exprimujících E. coli FDA byl fenotyp pozorovatelný v případě, že byl protein cílen do chloroplastů. Listy byly chlorotické, ale semena byly normální. R1 rostliny byly pěstovány jak v polním tak skleníkovém experimentu. Škrob nebyl v listech za použití jodové zkoušky v listech detekován a opylení bylo opožděno. Má se za to, že fenotyp těchto rostlin kukuřice může být důsledkem promotoru (e35S) použitého v pMON17590 i pMON13925 vektorech, které nejsou pro expresi FDA v kukuřici výhodné. Protože zřejmě platí, že e25S způsobuje zvýšenou expresi v mezofylu a Calvinův cyklus se u C4 rostlin, například kukuřice, vyskytuje převážně v buňkách svazků cévních je výhodnější použití promotoru, který selektivně zvyšuje expresi v buňkách svazků cévních (například ssRUBISCO promotor). Byl připraven vektor obsahující takový promotor a zajišťující expresi FDA v kukuřici a tento vektor byl testován.

S výhodou byla pro kostrukci vektoru využita malá podjednotka RUBISCO (PmzSSU, specifický promotor buněk svazků cévních) a vektor byl použit pro specifickou expresi fda v kukuřici. Pro zlepšení metabolismu uhlíku v C4 rostlinách (například kukuřici) byla využita aldolasa typu I (fdaf, tedy fda bez železo simého klastru s vlastnostmi lišícími se od fdall. Gen pro aldolasu typu I byl amplifikován z genomu Staphylococcus aureus a aktivita byla ověřena. Poté byl zkonstruován transformační vektor pro expresi aldolas obou tříd (fdal a fdall) v specifických buňkách kukuřice. Byly připraveny následující kazety:

pMON13899: PmzSSU/hsp70/mzSSU CTP/fdal pMON13990: PmzSSU/hsp70/mzSSU CWIfdall pMON13988: P35S/hsp70//ífo/.

Tyto vektory byly použity pro transformaci kukuřice, jak bylo popsáno výše. Biochemická a fyziologická analýza primárních transformantů dovoluje identifikaci overexprese aldolasového genu, která vede ke zvýšení růstu, vývoje a výtěžku v kukuřici.

Tyto použité vektory pro transformaci kukuřice také způsobují cílenou expresi E.coli //genu v endospermu kukuřice. pMON13936 využívá gtl promotor z rýže, který zajišťuje expresi aldolasy v cytoplazmě buněk endospermu. Další vektor (pMON 36416) využívá stejný promotor spolu se signálním peptidem malé podjednotky RUBISCO, který zajišťuje lokalizaci proteinu v amyloplastu. Homozygotní linie transformantů, exprimujících cytosolickou aldolasu byly identifikovány (Homozygotnost 37 rostlin byla potvrzena pomocí western blotu) a semena z těchto rostlin byly sebrány pro analýzu složení zrn (vlhkost, proteiny, škrob, a olej). 53 pMON36416 primárních transformantů bylo testováno na expresi aldolasy v amyloplastech, 11 bylo pozitivních. Tyto • · • · · · · ·

rostliny byly testovány na homozygotnost selekce/propagace a zrna z těchto homozygotů byla použita pro analýzu složení.

Příklad 4

Transformace rostlin a exprese fda v bramborách.

Cílení exprese fda

Vektor pro expresi pMON17542 (popsaný dříve), ve kterém je fda gen pod kontrolou FMV promotoru a aldolasový enzym byl připojen k signálnímu chloroplastovému peptidu CTP2, byl použit pro Agrobacterium zprostředkovanou transformaci brambor.

Druhý vektor pro trasformaci brambor byl připraven klonováním Notl kazety [PFMV/CTP2//da/NOS3'] (popsanou výše) do jedinečného Notl místa pMON23616. pMON23616 je transformační vektor pro transformaci brambory obsahující oblast pravého okraje T-DNA nopalynového typu (Fraley et al., 1985), expresní kazetu pro gen neomycin fosfotransferasy typu II [P35S/NPTII/NOS3'] (selekční znak), unikátní Notl místo pro klonování žádané expresní kazety a oblast levého okraje T-DNA (Barker et al., 1983). Klonování Notl kazety [PFMV/CTP2//í/a/NOS3 j (popsanou výše) do Notl místa pMON23616 vedlo k přípravě transformačního vektoru brambor pMON17581, jak je ukázáno na obr. 8. Vektor pMON17581 byl připraven tak, že žádaný gen a gen selekčního signálního znaku byly přeloženy ve stejném směru.

Transformace brambor

Vektor pro transformaci rostlin byl mobilizován do ABI kmene Agrobacteria. Vložení rostlinného vektoru do ABI kmene bylo provedeno triparentální konjugací s využitím pomocného plazmidu pRK2013 (Ditta et al., 1980). Vektor pMON17542 byl použit pro transformaci Russet Burbank kalusu brambory zajišťovanou Agrobakteriem, pomocí metody popsané v PCT publikaci WO 96/03513 pro glyfosátovou selekci transformovaných linií.

Po transformaci vektorem pMON17542 byly transgenické brambory vybrány na glykosat a byly testovány na expresi E.coli aldolasy v listech pomocí Western bio tu. Bylo testováno 112 jednotlivých linií, bylo identifikováno 50 fda exprimujících linií (45%), s hladinami exprese fda mezi 0,12% a 1,2% celkového extraktovatelného proteinu.

Transformační vektor rostlin pMON 17581 byl použit pro Agrobakteriem zprostředkovanou transformaci HS31-638 kalusu brambor. HS31-638 je linie brambor Russet Burbank předtím transformovaná genem mutantní ADPglukosa fosforylasy (glgC16) z E.coli (U.S. patent 5,498,830). Kalus brambory byl transformován pomocí metody popsané v PCT publikaci WO • ·· · ·» ·

96/03513, využívající kanamycin (podaný v koncentraci 150-200 mg/1) místo glyfosatu jako selekčního činidla.

Transgenické rostliny brambor byly testovány na expresi fda genu v zárodcích listů z rostlinné tkáňové kultury. Pomocí analýzy western blotem (pomocí protilátek proti aldolase s

E.colí) tkáně listů z pMON17581 transformovaných linií bylo identifikováno 12 exprimujících linií z 56 testovaných. Exprese byla detekována jako protein migrující při asi 40 kDa, což je molekulová hmotnost podjednotky aldolasy (třídy II) E.coli a velikost proteinu pozorovaného při overexpresi aldolasy v E.coli.

Měření specifické hmotnosti transgenických rostlin brambor

Z 50 linií exprimujících fda získaných po transformaci pomocí pMON17542 byly připraveny tkáňové kultury a 8 kopií každé z linií bylo zasazeno do nádobek 35 cm v průměru a 30 cm hlubokých, obsahujících směs 1/2 Metro 350 medium, 1/4 jemného písku, 1/4 sadbového média Ready Earth. Jako kontrola byl z tkáňové kultury vysazen divoký typ odrůdy Russet Burbank. Všechny rostliny byly kultivovány přibližně 5 měsíců ve skleníku jehož denní teplota byla asi 2123°C, zatímco noční teplota byla přibližně 13°C. Rostliny byly v průběhu období aktivního růstu zalévány každý druhý den a hnojeny pomocí Peterova 20-20-20 komerčního hnojivá jednou týdně, v množstvích podobných jako při komerčních aplikacích. Hnojení bylo prováděno pouze po první 2 a 1/2 měsíce a poté bylo zcela zastaveno. Rostliny byly ponechány přirozenému stárnutí a při asi 50% seschnutí byly hlízy sklizeny.

Pro každou linii byly hlízy ze všech 8 květináčů dány dohromady a byla zjištěna jejich celková hmotnost. Poté byly pro každou linii dány dohromady hlízy větší než 30 g a byla stanovena jejich celková specifická hmotnost. Specifická hmotnost je hmotnost hlíz ve vzduchu dělených hmotností na vzduchu minus hmotností ve vodě. Výsledky těchto měření hmotností jsou uvedeny v tabulce 6.

Tabulka 6

Specifická hmotnost transgenických brambor

Linie č.	Celková hmotnost	% celkového přírůstku výtěžku	Hmotnost hlíz nad 30g	% nárůstu celkové hmotnosti hlíz nad 30g	Celková hmotnost hlíz nad 30g (% celkové hmotnosti)	Specifická hmotnost
RB	6609		4477		67,70%	1,087
40652	5138	negativní	1307	negativní	25,40%	1,08
40611	7170	8,5%	4533	1,3%	63,20%	1,083
40608	7470	13,0%	1070	neg	14,30%	1,081
40632	7776	21,8%	5453	21,8%	70,10%	1,088
40614	8688	31,5%	5468	22,2%	62,90%	1,083
40631	8800	33,2%	6188	38,2%	70,30%	1,084
40610	9746	47,0%	7777	73,0%	80%	1,087

Tato tabulka shrnuje výtěžky hlíz a specifickou hmotnost sedmi linií pěstovaných ve skleníku. Výsledek indikuje, že ve srovnání s kontrolou, všechny fda linie až na jednu vykazují zvýšený celkový výtěžek hlíz a čtyři linie mají zvýšené procento hlíz, které váží více něž 30 g. Pro hlízy nad 30 g je celkový výtěžek blízký kontrole a u dvou linií je vyšší než kontrola. To znamená, že pět ze šesti linií vykazuje vyšší celkový výtěžek a netvoří malé hlízy. Jinými slovy toto zvýšení celkového výtěžku odpovídá zvýšenému procentu větších hlíz (nad 30 g). Nepozorovali jsme však žádný nárůst specifické hmotnosti hlíz.

Pro shrnutí se zdá, že exprese fda v bramborách vede k většímu počtu hlíz na jednu rostlinu bez toho, že by zmenšila velikost hlíz. To představuje výhodu většího výtěžku takže zemědělci by mohli potenciálně být schopni produkovat stejné množství hlíz na menší ploše. Podobné experimenty budou provedeny také pro dílčí expresi fda s dalšími sacharidy metabolisujícími geny, například g/gC16, za účelem stanovém, jak taková kombinace ovlivní výtěžek hlíz, ukládám pevné hmoty a jejich celkovou specifickou hmotnost.

• · • · · · • * · · · • · · * · · · · · · • * · · · · · · « · ♦ « · *««»«·

3S, t ···· · · · »

Aido laso vá aktivita transgenických brambor

Po kultivaci podobu 3 měsíců (po sadbě) ve skleníku, byly odebrány vzorky listů od 6 linií z vyšší expresí fda získaných po transformaci s pMON17542 a byla zde stanovena aldolasová aktivita.

Za účelem měření aldolasové aktivity v listech brambor byly od každé linie odebrány dva vzorky listů a ihned zmrazený na suchém ledu. Aldolasa byla extrahována z 0,2 g tkáně listů rozetřením při 4°C v 1,2 ml extrakčního pufru: 100 mM HEPES, pH 8,0, 5 mM MgCl₂, 5 mM MnCh, 100 mM KC1, 10 mM DTT, 1% BSA, lmM PMSF, 10 pg/ml leupeptinu, 10 pg/ml aprotininu. V extraktu byla stanovena aldolasová aktivita, jak bylo popsáno výše.

Na aldolasovou aktivitu bylo testováno 6 nezávislých transgenických linií exprimujících fda. Exprese fda v listech je indikátorem exprese fda v celé rostlině, protože FMV promotor použitý pro zajištění exprese kódující DNA je konstitutivní ve většině, pokud ne ve všech tkáních rostliny brambory.

Tabulka 7 shrnuje data kvantifikující expresi proteinu v každé ze sledovaných linií a procentuelní aktivitu pro každou individuální linii.

Tabulka 7

Aldolasová aktivita z listů transgenických brambor Russet Burbank

Linie	Exp. č.l Akt (U/gFW)	%Akt	Exp. č.2 Akt(U/gFW)	%Akt	Průměrné % aktivity
Kontrola	4,461	100	4,732	100	100
40608	6,969	156	8,055	170	163
40610	8,489	190	7,326	155	173
40652	5,812	130	6,367	135	132
40632	5,257	118	4,244	90	104
40631	5,764	129	4,968	105	117
40611	5,715	128	5,836	123	126

Stejnoměrnost rozložení pevné hmoty v transgenické bramboře

Dvacetpět linií odrůdy Russet Burbank exprimujících fda (linie brambor označené „Maestro“) získané po transformaci vektorem pMON17542, a patnáct linií Russet Burbank Simple Solid, rovněž obsahujích glgCló (PCT Publikace WO 91/19806 a US Patent 5,498,830), exprimující fda »· 9 99 9 • · · β • 9 · · 9 9 9 9

9 · 9 9 9 9 » · 9 9 9 9 9 9 · • · 9 9 9 9 9 9

99 99 99 (linie brambor označené „Segal“), získané po transformaci vektorem pMON 17581, byly testovány v polním experimentu na dvou rozdílných místech. Na každém z těchto míst bylo vyhodnoceno 36 rostlin z každé linie (trojí opakování při 12 rostlinách na jednu linii) a byla u nich hodnocena stejnoměrnost rozložení pevné hmoty v hlízách. Při sklizni byly hlízy přetříděny na každém z míst a byly vybrány hlízy od 280 - 340 gramů a devět hlíz z každého opakování bylo analyzováno po skupinách třech hlíz.

Pro typickou 280-340 gramovou hlízu mající v průměru 7-8 centimetrů byla určena distribuce škrobu vyjmutím centrálního podélného plátku (13 mm) z každé hlízy. Plátky byly poté oloupány položeny naplocho na podložku, kde byla vyřezána vnitrní část hlízy 14 mm korkovrtem. Tkáň od dřeně ke kůře byla vyříznuta maximálně 50 mm korko vrtem. Zbývající korovou tkání byl asi 8 mm široký prstenec nejblíže vnější oblasti plátku.

Poté byla stanovena specifická hmotnost zvážením jak dřeňového tak korového výřezu na vzduchu a poté ve vodě:

specifická hmotnost = hmotnost na vzduchu/(hmotnost na vzduchu - hmotnost ve vodě)

Po výpočtu specifické hmotnosti byl na základě následující rovnice stanoven obsah pevné hmoty:

-214,9206+(218,1852* Specifická hmotnost)

Stupeň stejnoměrnosti rozložení pevné hmoty (Index stejnoměrnosti pevné hmoty) byl stanoven vypočtením poměru pevné hmoty v dřeni ku kůře (pevná hmota dřeně děleno pevná hmota kůry). Tři skupiny po třech hlízách z každé parcely byly zprůměrovány a poté byl vypočítán průměr ze tří opakování pro dané pole.

Analýza předchozích několika polních pokusů stanovení stejnoměrnosti pevné hmoty (data neuvedena) ukázala, že netrasgenní, brambory Russet Burbank divokého typu, mají typický poměr pevné hmoty dřeně vzhledem ke kůře v intervalu 68% - 72%, v závislosti na oblasti pěstování a způsobu pěstování. Tabulka 8-11 ukazuje poměry pevné hmoty dřeně vzhledem ke kůře u jednotlivých očíslovaných linií, vyšší hodnota poměru pevné hmoty dřeně vzhledem ke kůře indikuje vyšší stupeň stejnoměrnosti rozložení pevné hmoty.

Tabulky 8 a 9 ukazují výsledky z jednoho pokusného pole (místo 1) pro Segal respektive

Maestro, a ilustrují, že nejlepší linie Segal a Maestro mají nejvyšší stejnoměrnost rozložení pevné hmoty tedy nejvyšší poměr pevné hmoty dřeně vzhledem ke kůře, vyšší než kontrola Russet • · · · · · · · » ·· ··· ······ &Λ · · · · · · · · · *· · * » ♦ · ♦· *·

Burbank, která vykazuje 68,4%, některé linie vykazují poměr pevné hmoty dřeně vzhledem ke kůře 82%.

Tabulky 10 a 11 ukazují výsledky z dalšího pokusného pole (místo 2) pro Segal respektive Maestro a ilustrují, že nejlepší linie Segal a Maestro mají nejvyšší stejnoměrnost rozložení pevné hmoty tedy nejvyšší poměr pevné hmoty dřeně k vzhledem ke kůře, vyšší než kontrola Russet Burbank, některé linie vykazují poměr pevné hmoty dřeně ku kůře 88%. V polním pokusu 2, měla kontrola Russet Burbank atypicky, abnormálně vysoký poměr pevné hmoty dřeně ku kůře 79,3%, jehož nejpravděpodobnější příčinou byly environmentální růstové podmínky. Výsledky z míst a2 demonstrují, že exprese fda E.coli Russet Burbank samotného, nebo spolu s g/gC16, zvyšuje stejnoměrnost rozložení pevné hmoty v hlíze dokonce i za růstových podmínek, kdy stejnoměrnost pevné hmoty v hlíze je už extrémně vysoká u netransgenických Russet Burbank. Fda se tedy projevuje i když pěstitelské podmínky jsou již zaměřeny na abnormálně vysokou hladinou stejnoměrnosti pevné hmoty.

Tabulka 8. Index stejnoměrnosti pevné hmoty: Poměr obsahu pevné hmoty v dřeni ku kůře. Linie Segal Russet Burbank. Místo 1

Linie	Poměr
S-29	79,1
S-9	75,8
S-20	71,3
S-15	71,3
S-21	70,5
S-5	70,2
S-18	70,0
RB kontrola	68,4
S-32	68,3
S-16	65,6

Tabulka 9. Index stejnoměrnosti pevné hmoty: Poměr obsahu pevné hmoty v dřeni ku kůře. Linie Maestro Russet Burbank. Místo 1

Linie	Poměr
M-13	74,0
M-12	73,6
M-l	73,4
M-3	73,0
M-6	72,4
M-9	71,2
M-ll	70,6
M-l 8	70,5
M-17	69,9

• 9 99 9 • · · 9 9 9 9

9 9 * 9 9 9 9 • · · · * · · 9

9 9 9 9 9 9 9

M-19	69,4
M-5	69,3
M-20	68,9
RB kontrola	68,4
M-8	68,3
M-43	67,7
M-23	67,3
M-7	67,0
M-39	66,6
M-22	66,0
M-10	65,4
M-27	61,4

Tabulka 10. Index stejnoměrnosti pevné hmoty: Poměr obsahu pevné hmoty v dřeni ku kůře. Linie Segal Russet Burbank. Místo 2

Linie	Poměr
S-33	87,4
S-54	87,1
S-05	86,8
S-29	85,1
S-21	84,3
S-16	83,2
S-20	81,5
S-18	80,7
S-32	80,6
RB kontrola	79,3
S-09	79,0

Tabulka 11. Index stejnoměrnosti pevné hmoty: Poměr obsahu pevné hmoty v dřeni ku kůře. Linie Maestro Russet Burbank. Místo 2

Linie	Poměr
M-04	87,7
M-18	83,9
M-17	83,8
M-03	83,7
M-09	83,4
M-15	83,2
M-29	82,9
M-44	82,3
M-08	82,2
M-43	81,6
M-22	81,1
M-05	80,8
M-01	80,5
M-20	80,2

1⁶ · • · · · · · · • 9 ····· • · · · · · · · • · «« · » * ·

M-45	79,6
M-39	79,5
M-27	79,5
RB kontrola	79,3
M-13	78,9
M-22	78,8
M-19	78,7
M-07	78,2
M-12	77,9
M-23	77,3
M-06	76,5
M-10	75,0
M-ll	74,1

Účinek aldolasy na poměr pevné hmoty dřeně a kůry v liniích Segal je o něco méně dramatický, než v liniích Maestro. Má se za to, tento fenotyp je způsoben expresí fda na pozadí, kdy rostlina Russet Burbank exprimuje g/gC16 na relativně nízkých až středních hladinách, a že kombinace fda a g/gC16 má vylepšený kladný účinek. Řezy ze středu brambor (obr. 9) třech linií Segal s zlepšenou stejnoměrnost rozložení pevné hmoty ukazují vyšší uložení škrobu uvnitř vnitřní oblasti hlízy. Zvláště zvýšení objemu kůry doprovázený přemístěním xylemového prstence směrem k centru hlízy, spolu s více matnou tkání dřeně vlivem zvýšeného obsahu škrobu, jsou u transgenických linií evidentní. Tyto fyziologické změny mohou být důsledkem zvýšení v transportu sacharosy z asimilačních do zásobních orgánů, které mohou mít vliv na distribuci součástí floemu během vývoje hlízy, nebo dostupnosti sacharosy pro biosyntézu škrobu v hlíze.

Příklad 5

Transformace rostlin a exprese FDA v rostlině bavlny

E.coli fda vektory pMONl 7524 [FMV/CTPl//ífa] (obr. 2) apMON17542 [FMV/CTP2//ďa] (obr. 3) byly transformovány do bavlny pomocí Agrobacteria, jak bylo popsáno v Umbeck et al., (1987) a v U.S. patentu 5004863. Protein byl nasměrován do chloroplastů pomocí buď Arabidopsis SSU CTP1 (pMON17524), nebo Arabidopsis EPSPS (pMON17542) chloroplastového signálního peptidu.

Exprese aldolasy v bavlně

Pět týdnů staré kalusy transformované oběma vektory byly analyzovány pomocí Western blotu a pomocí stanovém aldolasy. Western blot indikoval velké množství proteinu na pozici FDA standardu plné délky a menší množství na stejné pozici v extraktu kontrolního kalusu. Zdá se, že protein byl dobře exprimován. Pro ověření, že FDA byl exprimován ve tkáních a pro srovnání • · fl · flfl · · · · .£7 • · fl · fl fl · • fl fl flfl·· fl fl fl · fl flfl · • flfl · · · · · flfl flfl flfl flfl aktivity byly kalusy transformované dvěma vektory extrahovány v pufru, který měl předejít ztrátě aktivity produktu transgenu. Byl přidán BSA na konečnou koncentraci 1 mg/ml. Stanovení aktivity aldolasy bylo provedeno s, nebo bez 25 mM EDTA, které inhibuje enzym z E.coli, ale ne rostlinný enzym. Výsledky stanovení jsou ukázány v tabulce 12.

Tabulka 12

Aldolasová aktivita v kalusech bavlníku a listech bavlníku

ΔΑ340 e'³/mg protein/5 min

Kolonie č.

Kontroly

Bavlníkové listy (Coker) neinokulované kalusy inokulo vaně kalusy (E3 5 S/GUS) 1

FDA kalusy pMON17542 1 pMON17524 2

-EDTA +EDTA zvýšení správného sbalení

4,0	4,2	-
7,7	5,6	1,3X
6,8	6,1	-
3,5	4,0	-
3,5	2,3	1,5X
5,5	2,6	2,IX
9,2	3,8	2,4X
19,8	3,6	5,5X
15,2	5,8	2,6X
12,5	4,0	3,IX
14,4	2,9	4,9X
4,1	1,2	3,5X

Výsledky naznačují, že exprese fda genu v kalusu bavlníku je dobrá. Téměř všechny kalusy mají alespoň dvakrát vyšší aldolasovou aktivitu ♦ 9 9 · *9

Í8

9

9

9

9 9 »9

9 9 · <9 9 ·9 9

9 9 9

9 9

SEZNAM SEKVENCÍ (1) OBECNÉ INPROMACE:

(i) PŘIHLAŠOVATEL: GERARD BARRY NORDINECHEIKH GANESH Kishore (ii) NÁZEV VYNÁLEZU: Exprese Fructosa 1,6 Bisphosfát Aldolasy v transgenických rostlinách (iii) POČET SEKVENCÍ: 6 (iv) KONTAKTNÍ ADRESA:

(A) ADRESA: Arnold, White & Durkee (B) ULICE: P.O. Box 4433 (C) CITY: Houston (D) STÁT: Texas (E) ZEMĚ: Spojené státy americké (F) ZIP: 77210-4433 (v) ELEKTRONICKÁ PROMA:

(A) TYP MEDIA: Flopy disk (B) POČÍTAČ: IBM PC kompaktibilni (C) OPERAČNÍ SYSTÉM: PC-DOS/MS-DOS (D) SOFTWARE: Patentln Release č.1.0, Version č.1.30 (vi) ÚDAJE PŘIHLÁŠKY:

(A) ČÍSLO PŘIHLÁŠKY: US neznámé (B) DATUM VYPLNĚNÍ: v příloze (C) KLASIFIKACE: neznámá (vi) ÚDAJE PŘEDBĚŽNÉ PŘIHLÁŠKY:

(A) ČÍSLO PŘIHLÁŠKY: US 60/049,995 (B) DATUM VYPLNĚNÍ: Červen 17, 1997 (viii) ZÁSTUPCE/ÚDAJE AGENTA:

(A) JMÉNO: Patricia A. Kammerer (B) REGISTRAČNÍ ČÍSLO: 29,775 (C) REFERENCE/JEDNACÍ ČÍSLO: MOBT086 (ix) TELEKOMUNIKAČN9 INPROMACE:

(A) TELEFONE: (713) 787-1400 (B) TELEFAX: (713) 787-1440 (2) INPROMACE PRO SEQ ID č:l: (i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 1080 párů bází (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET ŘEŤEZCÚ: jeden (D) TOPOLOGIE: lineární (xi) VYPIŠ SEKVENCE:

TTTTTGATTT

ATGTCTAAGA

GTTTTCCAGG

120

GACTCCATCA

180

TTCTCCAACG

240

GGTGCTGCTA

300

TATGGTGTTC

360

TAGCAAAAGA

ACGCCGTACT

GTGGTGCTTC

TCCTGGGCGC

CGGTTATCCT

SEQ ID C:l:

CGTAAAACCT

AAACAACTTC

GGAAACCGCT

CTTTATCGCT

GATCTCTGGT

GCACACTGAC

GGCGTAATCA

GCACTGCCAG

GCTAAAGTTA

GGTAAAGGCG

GCGCATCACG

CACTGCGCGA

CTGGTGATGA

CAGTAAACTG

AAGCGCCGGT

TGAAATCTGA

TTCACCAGAT

AGAAACTGCT

GTACAGAAA

GTCGGTACT

ATCGTTCAG

GTTCCGCAG

GCTGAACAT

CCGTGGATC ···· ··♦· • · • · • · « ► Φ*

GACGGTCTGT 420	TGGACGCGGG	TGAAAAACAC	TTCGCAGCTA	CCGGTAAGCC	GCTGTTCTCT
TCTCACATGA 480	TCGACCTGTC	TGAAGAATCT	CTGCAAGAGA	ACATCGAAAT	CTGCTCTAAA
TACCTGGAGC 540	GCATGTCCAA	AATCGGCATG	ACTCTGGAAA	TCGAACTGGG	TTGCACCGGT
GGTGAAGAAG 600	ACGGCGTGGA	CAACAGCCAC	ATGGAOGCTT	CTGCACTGTA	CACCCAGCCG
GAAGACGTTG 660	ATTACGCATA	CACCGAACTG	AGCAAAATCA	GCCCGCGTTT	CACCATCGCA
GCGTCCTTCG 720	GTAACGTACA	CGGTGTTTAC	AAGCCGGGTA	ACGTGGTTCT	GACTCCGACC

*	ATCCTGCGTG 780	ATTCTCAGGA	ATATGTTTCC	AAGAAACACA	ACCTGCCGCA	CAACAGCCTG
	AACTTCGTAT 840	TCCACGGTGG	TTCCGGTTCT	ACTGCTCAGG	AAATCAAAGA	CTCCGTAAGC
	TACGGCGTAG 900	TAAAAATGAA	CATCGATACC	GATACCCAAT	GGGCAACCTG	GGAAGGCGTT
	CTGAACTACT 960	ACAAAGCGAA	CGAAGCTTAT	CTGCAGGGTC	AGCTGGGTAA	CCCGAAAGGC
	GAAGATCAGC 1020	CGAACAAGAA	ATACTACGAT	CCGCGCGTAT	GGCTGCGTGC	CGGTCAGACT
	TCGATGATCG CTCGTCTGGA GAAAGCATTC 1080 (2) INPROMACE PRO SEQ ID Č:2: (i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:	CAGGAACTGA	ACGCGATCGA	CGTTCTGTAA

(A) DÉLKA: 359 aminokyselin (B) TYP: aminokyselinová (C) POČET ŘETĚZCŮ:

(D) TOPOLOGIE: lineární (xi) VÝPIS SEKVENCE: SEQ ID Č:2

Met

Ser Lys

Ile

Phe 5

Asp

Phe

Val

Lys

Pro 10

Gly

Val

Ile

Thr

Gly 15

Asp

Asp

Val

Gin

Lys

Val

Phe

Gin

Val

Ala

Lys

Glu

Asn

Asn

Phe

20

25

30

Ala

Leu

Pro

Ala

Val

Asn

Cys

Val

Gly

Thr

Asp

Ser

Ile

Asn

Ala

35

40

45

Val

Leu

Glu

Thr

Ala

Ala

Lys

Val

Lys

Ala

Pro

Val

Ile

Val

Gin

50

55

60

Phe

Ser

Asn

Gly

Gly

Ala

Ser

Phe

Ile

Ala

Gly

Lys

Gly

Val

Lys

65

70

75

Ser

Asp

Val

Pro

Gin

Gly

Ala

Ala

Ile

Leu

Gly

Ala

Ile

Ser

Gly

80

85

90

Ala

His

His

Val

His

Gin

Met

Ala

Glu

His

Tyr

Gly

Val

Pro

Val

95

100

105

Ile

Leu

His

Thr

Asp

His

Cys

Ala

Lys

Lys

Leu

Leu

Pro

Trp

Ile

110

115

120

Asp

Gly

Leu

Leu

Asp

Ala

Gly

Glu

Lys

His

Phe

Ala

Ala

Thr

Gly

125

120

135

Lys

Pro

Leu

Phe

Ser

Ser

His

Met

Ile

Asp

Leu

Ser

Glu

Glu

Ser

140

145

150

Leu

Gin

Glu

Asn

Ile

Glu

Ile

Cys

Ser

Lys

Tyr

Leu

Glu

Arg

Met

155

160

165

Ser

Lys

Ile

Gly

Met

Thr

Leu

Glu

Ile

Glu

Leu

Gly

Cys

Thr

Gly

• 4» · · *· »·*· ··

170

175

180

Gly

Glu

Glu

Asp

Gly

Val

Asp

Asn

Ser

His

Met

Asp

Ala

Ser

Ala

185

190

195

Leu

Tyr

Thr

Gin

Pro

Glu

Asp

Val

Asp

Tyr

Ala

Tyr

Thr

Glu

Leu

200

205

210

Ser

Lys

Ile

Ser

Pro

Arg

Phe

Thr

Ile

Ala

Ala

Ser

Phe

Gly

Asn

215

220

225

Val

His

Gly

Val

Tyr

Lys

Pro

Gly

Asn

Val

Val

Leu

Thr

Pro

Thr

230

235

240

Ile

Leu

Arg

Asp

Ser

Gin

Glu

Tyr

Val

Ser

Lys

Lys

His

Asn

Leu

245

250

255

Pro

His

Asn

Ser

Leu

Asn

Phe

Val

Phe

His

Gly

Gly

Ser

Gly

Ser

260

265

270

Thr

Ala

Gin

Glu

Ile

Lys

Asp

Ser

Val

Ser

Tyr

Gly

Val

Val

Lys

275

280

285

Met

Asn

Ile

Asp

Thr

Asp

Thr

Gin

Trp

Ala

Thr

Trp

Glu

Gly

Val

290

295

300

Leu

Asn

Tyr

Tyr

Lys

Ala

Asn

Glu

Ala

Tyr

Leu

Gin

Gly

Gin

Leu

305

310

315

Gly

Asn

Pro

Lys

Gly

Glu

Asp

Gin

Pro

Asn

Lys

Lys

Tyr

Tyr

Asp

320

325

330

Pro

Arg

Val

Trp

Leu

Arg

Ala

Gly

Gin

Thr

Ser

Met

Ile

Ala

Arg

335

340

345

Leu

Glu

Lys

Ala

Phe

Gin

Glu

Leu

Asn

Ala

Ile

Asp

Val

Leu

350

355

(2) INPROMACE PRO SEQ ID Č:3:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 30 párů bází (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET ŘEŤEZCÚ: jeden (D) TOPOLOGIE: Lineární (xi) VÝPIS SEKVENCE: SEQ ID Č:3:

GGGGCCATGG CTAAGATTTT TGATTTCGTA (2) INPROMACE PRO SEQ ID Č:4:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 34 párů bází (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET ŘEŤEZCÚ: jeden (D) TOPOLOGIE: Lineární (xi) VÝPIS SEKVENCE: SEQ ID Č:4:

CCCCGAGCTC TTACAGAACG TCGATCGCGT TCAG (2) INPROMACE PRO SEQ ID Č:5:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 10847 párů bází (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET ŘETĚZCŮ: dvoj řetězcová (D) TOPOLOGIE: Lineární (xi) VÝPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:5:

CGATAAGCTT GATGTAATTG GAGGAAGATC AAAATTTTCA ATCCCCATTC 51 TTCGATTGCT TCAATTGAAG TTTCTCCGAT GGCGCAAGTT AGCAGAATCT

• ···· ·· ··«·

• · #·

101

151

201

251

301

351

401

451

501

551

601

651

701

751

801

851

901

951

1001

1051

1101

1151

1201

1251

1301

1351

1401

1451

1501

1551

1601

1651

1701

1751

1801

1851

1901

1951

2001

2051

2101

2151

2201

2251

2301

2351

2401

2451

2501

2551

2601

2651

2701

2751

2801

2851

GCAATGGTGT

CAACGCAAAT

AGCTTATCCG

TAATTGGCTC

GCGTGCATGC

CTCTGGTCTT

ACAGGTCCTT

GGTCTTTTGG

TATGGGTGCC

TTGGTAACGG

GCTGCAACTG

CGATAGCACT

GTGTGTTGAA

GGTGATCGTC

CACCTACAGG

TTGCTGGTCT

ACTCGTGACC

CGTTGAGACT

GTAAGCTCAC

GCTTTCCCAT

CCTTAACGTT

AGGAAATGGG

GAAGACGTGG

TGTTCCAGAA

CTGTTGCAGC

GAACTCCGTG

CAAGCTCAAC

GTGGTCGTCC

GCTACCCACC

CGTTTCTGAA

GCTTCCCAGA

CTCTCCGACA

CGGATCCAGC

CAATGCATCA

ATTATGGCAT

ATTTACTGTG

TGGATGGAGA

TTAATATTAT

ATAAGAGATA

GCCTCTAATG

CATTATGCTT

TGCAAATGTT

GAACTTTCCT

GCTTTATAAT

TTTTTTAATG

CGACCTGCAG

AGCAGCATTC

TATTCAAATT

TTTGTAAGGA

AGTCTCCAAA

AATCAAAGTA

AGAAAAAGAC

AATCTTGTCA

ATGGTGCAGA

GCAAAGATAA

GAAAAGAGCT

GCAGAACCCA

CTCCCTTATC

ATTTCGTCGT

TGAGCTTCGT

TTCACGGTGC

TCTGGAACCG

CATGTTTGGA

AAGGTGAAGA

AGAATCCGTA

TGGACTCCTT

GTTGCCGTTT

TTCATTGGTG

CCCACTTCGC

TTCCAGTTAC

GTACCTATGG

CAACACCCCA

ACACTGAAAA

GATGCTGACG

CGGTCAAGTG

TGGTTGCTGC

TTGATGAACC

TGCCGACATC

CTGACTTGCG

GACCGTGCTC

TGCATTCGCT

TTAAGGAAAG

GGTGTTGATT

TGACGGTAAG

TCGATCACCG

AACCCTGTTA

GTTCATGGAT

CTAAGGCTGC

TTTCGTTCGT

GTTTCATTGC

TGGGAAAACT

TTTTTTATTC

AGAGTTAATG

TTGTTTTTTC

TGCAAACATT

ACCGAAGTTA

ATTCACTAGG

ACTGAATACA

TTATGTAATT

TATAGTTATA

CATTTTATGA

CCACTCGAAG

CAGATTGGGT

GGTATCGCCA

AGAATTCTCA

CCATTAGCCA

AACTACTGTT

ATCCACCGAA

ACATCGAGCA

ATTGTTAGGC

AGCAGATTCC

GTCCTGACAG

TCTCTTATCT

GGTTTCTCTG

CGTGGGGATT

CCTCTTAAGG

AAGCAGCCGT

TCCGTATTCC

GGTCTCGCTA

TGTTATCAAC

AGGAAGGTGA

GCTCCTGAGG

GACTATGGGT

ACGCTTCTCT

GAAATGGGTG

CTTGCGTGGA

CTTCCGCTCA

GGTATCACCA

GATGCTTCAA

GTGTGCGTAC

ATTGATGTTC

CTTGCTTGTT

CAACCCGTAC

GAAGTGATCA

TGTTCGTTCT

CTTCTATGAT

GAAGGTGCTA

CGACCGTCTT

GCGATGAAGG

GGTCTCGGTA

TATCGCTATG

CTGTTGATGA

TTGATGGCTG

TTGATGAGCT

ATCATCGGTT

GCACACACCA

GTTTTTCTTG

GGTTTTCGCT

AATGATATGG

TCTTATTTGT

TTGTTTTGAG

ATATGAGGAG

CAACAAATAT

AGTATGTCCT

TTCCAGAATC

CTCATGGATT

CTTGCCAATT

CGGCCGCGTT

TCAATCAACA

AAACCAAGAA

GTCCAAAGCC

AAAGCTACAG

CCAGCACATG

GACTTAAAGT

GCTGGCTTGT

GCACCTACCA

TCTAGTACAA

CCCACTCACT

CCAATCTCTC

AAGACGCAGC

GAAGAAGAGT

TCATGTCTTC

CCAGCAACTG

AGGTGACAAG

GCGGTGAAAC

ACTGGTAAGG

TACTTGGATC

CTCCTCTCGA

CTTGTTGGTG

CACTAAGCGT

TGCAGGTGAA

CCAAAGACTC

AGTGAAGTCC

CTGTTATCGA

GGTTTTGGTG

CATCCGTCTT

CAGGTGATCC

CCAGGTTCCG

TGGTCTCATC

ACCCACGTCT

TCTACTTTGA

CGACGAGTAT

CCGTTATGAA

TCTGCTGTCG

TGAGACTTCT

ACGCTTCTGG

AGCTTCCTCG

TGCTACTATG

GTCTTGGAGC

CAAGAATTCG

TCGACAACGT

GAATCCTACT

TACCATTTGT

ATCGAACTGT

TCCTTTTGTT

TGTGTGTTGA

TAAAAATGTG

TAAAACACTT

ATTTTCAGAC

CTTGTGTTTT

CTTGTCAGAT

TGTAGTTGAG

GATTGACAAC

CAAGCTTGAG

AGGTACGAGC

GGAACTCCCA

TCAACAAGGT

GAGATCAATG

CATCATGGTC

TAGTGGGCAT

GGGGACCAGA

AAAGCATCTT

GTGGGGAACA

AATGCGTATG

GAAATCCAGT

AGCATCCACG

GGGATGACGT

TGTTTCCACG

CTCGTAAGTC

TCTATCTCCC

TCGTATCACC

CTATGCAAGC

ATTGATGGTG

TTTCGGTAAC

TTTACGATTT

CCAATGGGTC

GTCTGAAGAC

CAACGCCAAT

GCTGTTCTGC

GCCAATCATG

CTAACCTTAC

GAAGGTCGTG

ATCCTCTACT

ACGTCACCAT

TTGACTCTGC

TGCTGGTGGA

AGGGTGTTAC

CCAATTCTCG

CGGTTTGGAA

CAAACGGTCT

CTCGTCGTGC

AGCAGCTGTC

TTATGGGTCT

ATCGCTACTA

TAAGATCGAA

AGCTCGGTAC

TCGTCAAGTT

GAGTTCGAGT

TGTGCTTGTA

GAAATGGAAA

CATTCTCAAA

ATTTGAAATT

TCAAATCGTG

GTAGTTGTAC

CTAGAAAAGC

AGACATTTAT

TCTAATCATT

TATGAAAATA

ATGCATCAAT

CTCAGGATTT

CATATCACTT

TCCTCAAAGG

CAGGGTACAG

AAGAATCTTC

AGTAAGTTTC

CTTTGAAAGT

CAAAAAAGGA

TGCCTTTATT

AAATAACGTG

ACGAACGCAG • 999

·9··

9 9 9 9 9 9

9 9 9 ·99

9 999 99 9 • 99 9 9 99 9

99 99 9·

2901

2951

3001

3051

3101

3151

3201

3251

3301

3351

3401

3451

3501

3551

3601

3651

3701

3751

3801

3851

3901

3951

4001

4051

4101

4151

4201

4251

4301

4351

4401

4451

4501

4551

4601

4651

4701

4751

4801

4851

4901

4951

5001

5051

5101

5151

5201

5251

5301

5351

5401

5451

5501

5551

5601

5651

TGACGACCAC

TGAAGGATCA

GCTTCCTCTA

CACTATGGTC

CCACCCGCAA

AGAGTTAACT

GACTCTCTCT

GCATGCAGGC

ACTGGTGATG

CGCACTGCCA

TGGAAACCGC

GGTGGTGCTT

GGGTGCTGCT

TGGCTGAACA

AAGAAACTGC

CTTCGCAGCT

CTGAAGAATC

CGCATGTCCA

TGGTGAAGAA

ACACCCAGCC

AGCCCGCGTT

CAAGCCGGGT

AATATGTTTC

TTCCACGGTG

CTACGGCGTA

GGGAAGGCGT

CAGCTGGGTA

TCCGCGCGTA

AGAAAGCATT

ACCGGATCCA

GATTGAATCC

AATTACGTTA

GAGATGGGTT

TAGAAAACAA

TCATCTATGT

GTGGTGGCCG

GTGAATGTAG

TATTGCTTTC

AATGTACTTT

GAAAAAAAAT

CTCATTGCTG

AATATATCCT

GGTTTCTACG

TGAGCCATGT

TGATCCACAT

CGTTCGCGCG

GGGTTCGAGA

GGGCGCAGCC

GGTTAAAAGA

AATGCTGGAT

CCCCTCATCT

CATCTGTCAG

CCCCAGGCTT

TTTCGCCGAT

GCCTGCCCCT

GTCAACGTCC

AAAAGAATTC

TCAGATACTG

TGCTCTCTTC

GCTCCTTTCA

GGCTAACAAC

GCATGCAGGT

TACCTTCCTG

CATGGCTAAG

ACGTACAGAA

GCAGTAAACT

TGCTAAAGTT

CCTTTATCGC

ATCCTGGGCG

TTATGGTGTT

TGCCGTGGAT

ACCGGTAAGC

TCTGCAAGAG

AAATCGGCAT

GACGGCGTGG

GGAAGACGTT

TCACCATCGC

AACGTGGTTC

CAAGAAACAC

GTTCCGGTTC

GTAAAAATGA

TCTGAACTAC

ACCCGAAAGG

TGGCTGCGTG

CCAGGAACTG

ATTCCCGATC

TGTTGCCGGT

AGCATGTAAT

TTTATGATTA

AATATAGCGC

TACTAGATCG

CATCGATCGT

ACACGTCGAA

GCCTATAAAT

CATTTTATAA

TGGTAATTAC

ATCCATGTAG

GCCGCCGCTG

CAGAACTGAG

GCACCTTCCC

GGGACTTTTc

GGGCGCCAGC

AGGGGGGGCA

CTGGTTAAAA

CAGGTTAGCG

TTTCTGCCTG

GTCATCACTC

TAGTCGCGCC

GTCCACATCA

TTGCGAGGCT

CATCTGTCAA

GCCCCTCATC

CCTCTATATA

AACCAATCCT

CGCTACTATG

ACGGACTTAA

GACATTACTT

GTGGCCTCCG

ACCTTACCGA

ATTTTTGATT

AGTTTTCCAG

GCGTCGGTAC

AAAGCGCCGG

TGGTAAAGGC

CGATCTCTGG

CCGGTTATCC

CGACGGTCTG

CGCTGTTCTC

AACATCGAAA

GACTCTGGAA

ACAACAGCCA

GATTACGCAT

AGCGTCCTTC

TGACTCCGAC

AACCTGCCGC

TACTGCTCAG

ACATCGATAC

TACAAAGCGA

CGAAGATCAG

CCGGTCAGAC

AACGCGATCG

GTTCAAACAT

CTTGCGATGA

AATTAACATG

GAGTCCCGCA

GCAAACTAGG

GGGATCGATC

GAAGTTTCTC

ATAAAGATTT

ACGACGGATC

TAACGCTGCG

TCTTTCTTTT

ATTTCCCGGA

CCGCTTTGCA

CCGGTTAGGC

CCCAACACGG

CTAGCTTGGC

TGGGGGGATG

CCCCCCTTCG

ACAAGGTTTA

GTGGCCGAAA

TGGACAGCCC

TGCCCCTCAA

CCTCAAGTGT

TCTGTGGGAA

GGCCAGCTCC

CGCCGCGCCG

TGTCAGTGAG

AGAAGGCATT

TCTAGAAGAT

GTTGCCTCTC

GTCCTCCGCT

CCATCACAAG

ATTGGAAAGA

TTCCGGTGGT

TCGTAAAACC

GTAGCAAAAG

TGACTCCATC

TTATCGTTCA

GTGAAATCTG

TGCGCATCAC

TGCACACTGA

TTGGACGCGG

TTCTCACATG

TCTGCTCTAA

ATCGAACTGG

CATGGACGCT

ACACCGAACT

GGTAACGTAC

CATCCTGCGT

ACAACAGCCT

GAAATCAAAG

CGATACCCAA

ACGAAGCTTA

CCGAACAAGA

TTCGATGATC

ACGTTCTGTA

TTGGCAATAA

TTATCATATA

TAATGCATGA

ATTATACATT

ATAAATTATC

CCCGGGCGGC

ATCTAAGCCC

CCGAATTAGA

GTAATTTGTC

GACATCTACA

TCTCCATATT

CATGAAGCCA

CCCGGTGGAG

AGATAATTTC

TGAGCGACGG

TGCCATTTTT

GGAGGCCCGC

GCGTGCGCGG

TAAATATTGG

AACGGGCGGA

CTCAAATGTC

GTGTCAAGGA

CAATACCGCA

ACTCGCGTAA

ACGTCGCCGG

GGTGAGTCGG

GGCCAAGTTT

CATTCCCATT

CTCCACAATG

CGGCTCAGGC

CCCTTCCCAG

CAACGGCGGA

AGAAGTTTGA

CGCGTCAACT

TGGCGTAATC

AAAACAACTT

AACGCCGTAC

GTTCTCCAAC

ACGTTCCGCA

GTTCACCAGA

CCACTGCGCG

GTGAAAAACA

ATCGACCTGT

ATACCTGGAG

GTTGCACCGG

TCTGCACTGT

GAGCAAAATC

ACGGTGTTTA

GATTCTCAGG

GAACTTCGTA

ACTCCGTAAG

TGGGCAACCT

TCTGCAGGGT

AATACTACGA

GCTCGTCTGG

AGAGCTCGGT

AGTTTCTTAA

ATTTCTGTTG

CGTTATTTAT

TAATACGCGA

GCGCGCGGTG

CGCCACTCGA

CCATTTGGAC

ATAATTTGTT

GTTTTATCAA

TTTTTGAATT

GACCATCATA

TTTACAATTG

CTTGCATGTT

CATTGAGAAC

GGCAACGGAG

GGGGTGAGGC

GTTACCGGGA

TCACGCGCCA

TTTAAAAGCA

AACCCTTGCA

AATAGGTGCG

TCGCGCCCCT

GGGCACTTAT

AATCAGGCGT

CCGAAATCGA

CCCCTCAAGT

TCCGCGTGGT ···· ·· ···· • · * * • · * ·

5701

5751

5801

5851

5901

5951

6001

6051

6101

6151

6201

6251

6301

6351

6401

6451

6501

6551

6601

6651

6701

6751

6801

6851

6901

6951

7001

7051

7101

7151

7201

7251

7301

7351

7401

7451

7501

7551

7601

7651

7701

7751

7801

7851

7901

7951

8001

8051

8101

8151

8201

8251

8301

8351

8401

8451

ATCCACAACG

CGTTTCTGGC

GGGCAACCAG

GAGAGCCTTC

TCGTCGCCGC

GTGCCGGCAG

CGCGACGATG

TCGCTCAAGC

CAGGCCATTA

GGCGTTCGCG

CTTCCGGCGG

GTAGATGACG

CAGCCTAACT

CCTCGGCGAG

TACCTTGTCT

CTCGACCTGA

AAGAATTGGA

ACCCTTGGCA

CGGCGCATCT

GCTCCTGTCG

AGCAGAATGA

AAAACGTCTG

TTCGTAAAGT

GGATCTGCAT

GTATTAACGA

CCGCATCCAT

CATGTTCATC

GGTATCATTA

GTGACCAAAC

CCAGACATTA

AGGCAGACAT

AGCTGCCTCG

GCTCCCGGAG

AAGCCCGTCA

ATGACCCAGT

GCATCAGAGC

GCACAGATGC

CGCTCACTGA

GCTCACTCAA

AGGAAAGAAC

AGGCCGCGTT

CACAAAAATC

AAGATACCAG

CGACCCTGCC

GTGGCGCTTT

CGTTCGCTCC

GCTGCGCCTT

GACTTATCGC

GTATGTAGGC

ACACTAGAAG

TTCGGAAAAA

TAGCGGTGGT

GATCTCAAGA

AACGAAAACT

CTTCACCTAG

GTATATATGA

CCGGCGGCCG

GCGTTTGCAG

CCCGGTGAGC

AACCCAGTCA

ACTTATGACT

CGCTCTGGGT

ATCGGCCTGT

CTTCGTCACT

TCGCCGGCAT

ACGCGAGGCT

CATCGGGATG

ACCATCAGGG

TCGATCACTG

CACATGGAAC

GCCTCCCCGC

ATGGAAGCCG

GCCAATCAAT

GAACATATCC

CGGGCAGCGT

TTGAGGACCC

ATCACCGATA

CGACCTGAGC

CTGGAAACGC

CGCAGGATGC

AGCGCTGGCA

ACCGCCAGTT

ATCAGTAACC

CCCCCATGAA

AGGAAAAAAC

ACGCTTCTGG

CTGTGAATCG

CGCGTTTCGG

ACGGTCACAG

GGGCGCGTCA

CACGTAGCGA

AGATTGTACT

GTAAGGAGAA

CTCGCTGCGC

AGGCGGTAAT

ATGTGAGCAA

GCTGGCGTTT

GACGCTCAAG

GCGTTTCCCC

GCTTACCGGA

CTCATAGCTC

AAGCTGGGCT

ATCCGGTAAC

CACTGGCAGC

GGTGCTACAG

GACAGTATTT

GAGTTGGTAG

TTTTTTGTTT

AGATCCTTTG

CACGTTAAGG

ATCCTTTTAA

GTAAACTTGG

GCCGCGGTGT

GGCCATAGAC

GTCGGAAAGG

GCTCCTTCCG

GTCTTCTTTA

CATTTTCGGC

CGCTTGCGGT

GGTCCCGCCA

GGCGGCCGAC

GGATGGCCTT

CCCGCGTTGC

ACAGCTTCAA

GACCGCTGAT

GGGTTGGCAT

GTTGCGTCGC

GCGGCACCTC

TCTTGCGGAG

ATCGCGTCCG

TGGGTCCTGG

GGCTAGGCTG

CGCGAGCGAA

AACAACATGA

GGAAGTCAGC

TGCTGGCTAC

TTGACCCTGA

GTTTACCCTC

CGTATCGTGA

CAGAAATTCC

CGCCCTTAAC

AGAAACTCAA

CTTCACGACC

TGATGACGGT

CTTGTCTGTA

GCGGGTGTTG

TAGCGGAGTG

GAGAGTGCAC

AATACCGCAT

TCGGTCGTTC

ACGGTTATCC

AAGGCCAGCA

TTCCATAGGC

TCAGAGGTGG

CTGGAAGCTC

TACCTGTCCG

ACGCTGTAGG

GTGTGCACGA

TATCGTCTTG

AGCCACTGGT

AGTTCTTGAA

GGTATCTGCG

CTCTTGATCC

GCAAGCAGCA

ATCTTTTCTA

GATTTTGGTC

ATTAAAAATG

TCTGACAGTT

CTCGCACACG

GGCCGCCAGC

GTCGATCGAC

GTGGGCGCGG

TCATGCAACT

GAGGACCGCT

ATTCGGAATC

CCAAACGTTT

GCGCTGGGCT

CCCCATTATG

AGGCCATGCT

GGATCGCTCG

CGTCACGGCG

GGATTGTAGG

GGTGCATGGA

GCTAACGGAT

AACTGTGAAT

CCATCTCCAG

CCACGGGTGC

GCGGGGTTGC

CGTGAAGCGA

ATGGTCTTCG

GCCCTGCACC

CCTGTGGAAC

GTGATTTTTC

ACAACGTTCC

GCATCCTCTC

CCCTTACACG

ATGGCCCGCT

CGAGCTGGAC

ACGCTGATGA

GAAAACCTCT

AGCGGATGCC

GCGGGTGTCG

TATACTGGCT

CATATGCGGT

CAGGCGCTCT

GGCTGCGGCG

ACAGAATCAG

AAAGGCCAGG

TCCGCCCCCC

CGAAACCCGA

CCTCGTGCGC

CCTTTCTCCC

TATCTCAGTT

ACCCCCCGTT

AGTCCAACCC

AACAGGATTA

GTGGTGGCCT

CTCTGCTGAA

GGCAAACAAA

GATTACGCGC

CGGGGTCTGA

ATGAGATTAT aagttttaaa

ACCAATGCTT

GCTTCGACGG

CCAGCGGCGA

CGATGCCCTT

GGCATGACTA

CGTAGGACAG

TTCGCTGGAG

TTGCACGCCC

CGGCGAGAAG

ACGTCTTGCT

ATTCTTCTCG

GTCCAGGCAG

CGGCTCTTAC

ATTTATGCCG

CGCCGCCCTA

GCCGGGCCAC

TCACCACTCC

GCGCAAACCA

CAGCCGCACG

GCATGATCGT

CTTACTGGTT

CTGCTGCTGC

GTTTCCGTGT

ATTATGTTCC

ACCTACATCT

TCTGGTCCCG

AGTAACCGGG

TCGTTTCATC

GAGGCATCAA

TTATCAGAAG

GCGGATGAAC

GCTTTACCGC

GACACATGCA

GGGAGCAGAC

GGGCGCAGCC

TAACTATGCG

GTGAAATACC

TCCGCTTCCT

AGCGGTATCA

GGGATAACGC

AACCGTAAAA

TGACGAGCAT

CAGGACTATA

TCTCCTGTTC

TTCGGGAAGC

CGGTGTAGGT

CAGCCCGACC

GGTAAGACAC

GCAGAGCGAG

AACTACGGCT

GCCAGTTACC

CCACCGCTGG

AGAAAAAAAG

CGCTCAGTGG

CAAAAAGGAT

TCAATCTAAA

AATCAGTGAG ···· ·· «··· • · • ·· · · · · ♦ • · · · · · · · * ·· · · · · ·· · • ···· · · · ·

8501 GCACCTATCT CAGCGATCTG TCTATTTCGT TCATCCATAG TTGCCTGACT 8551 CCCCGTCGTG TAGATAACTA CGATACGGGA GGGCTTACCA TCTGGCCCCA 8601 GTGCTGCAAT GATACCGCGA GACCCACGCT CACCGGCTCC AGATTTATCA 8651 GCAATAAACC AGCCAGCCGG AAGGGCCGAG CGCAGAAGTG GTCCTGCAAC 8701 TTTATCCGCC TCCATCCAGT CTATTAATTG TTGCCGGGAA GCTAGAGTAA 8751 GTAGTTCGCC AGTTAATAGT TTGCGCAACG TTGTTGCCAT TGCTGCAGGT 8801 CGGGAGCACA GGATGACGCC TAACAATTCA TTCAAGCCGA CACCGCTTCG 8851 CGGCGCGGCT TAATTCAGGA GTTAAACATC ATGAGGGAAG CGGTGATCGC 8901 CGAAGTATCG ACTCAACTAT CAGAGGTAGT TGGCGTCATC GAGCGCCATC 8951 TCGAACCGAC GTTGCTGGCC GTACATTTGT ACGGCTCCGC AGTGGATGGC 9001 GGCCTGAAGC CACACAGTGA TATTGATTTG CTGGTTACGG TGACCGTAAG 9051 GCTTGATGAA ACAACGCGGC GAGCTTTGAT CAACGACCTT TTGGAAACTT 9101 CGGCTTCCCC TGGAGAGAGC GAGATTCTCC GCGCTGTAGA AGTCACCATT 9151 GTTGTGCACG ACGACATCAT TCCGTGGCGT TATCCAGCTA AGCGCGAACT 9201 GCAATTTGGA GAATGGCAGC GCAATGACAT TCTTGCAGGT ATCTTCGAGC 9251 CAGCCACGAT CGACATTGAT CTGGCTATCT TGCTGACAAA AGCAAGAGAA 9301 CATAGCGTTG CCTTGGTAGG TCCAGCGGCG GAGGAACTCT TTGATCCGGT 9351 TCCTGAACAG GATCTATTTG AGGCGCTAAA TGAAACCTTA ACGCTATGGA 9401 ACTCGCCGCC CGACTGGGCT GGCGATGAGC GAAATGTAGT GCTTACGTTG 9451 TCCCGCATTT GGTACAGCGC AGTAACCGGC AAAATCGCGC CGAAGGATGT 9501 CGCTGCCGAC TGGGCAATGG AGCGCCTGCC GGCCCAGTAT CAGCCCGTCA 9551 TACTTGAAGC TAGGCAGGCT TATCTTGGAC AAGAAGATCG CTTGGCCTCG 9601 CGCGCAGATC AGTTGGAAGA ATTTGTTCAC TACGTGAAAG GCGAGATCAC 9651 CAAGGTAGTC GGCAAATAAT GTCTAACAAT TCGTTCAAGC CGACGCCGCT 9701 TCGCGGCGCG GCTTAACTCA AGCGTTAGAT GCTGCAGGCA TCGTGGTGTC 9751 ACGCTCGTCG TTTGGTATGG CTTCATTCAG CTCCGGTTCC CAACGATCAA 9801 GGCGAGTTAC ATGATCCCCC ATGTTGTGCA AAAAAGCGGT TAGCTCCTTC 9851 GGTCCTCCGA TCGAGGATTT TTCGGCGCTG CGCTACGTCC GCKACCGCGT 9901 TGAGGGATCA AGCCACAGCA GCCCACTCGA CCTCTAGCCG ACCCAGACGA 9951 GCCAAGGGAT CTTTTTGGAA TGCTGCTCCG TCGTCAGGCT TTCCGACGTT 10001 TGGGTGGTTG AACAGAAGTC ATTATCGTAC GGAATGCCAA GCACTCCCGA 10051 GGGGAACCCT GTGGTTGGCA TGCACATACA AATGGACGAA CGGATAAACC 10101 TTTTCACGCC CTTTTAAATA TCCGTTATTC TAATAAACGC TCTTTTCTCT 10151 TAGGTTTACC CGCCAATATA TCCTGTCAAA CACTGATAGT TTAAACTGAA 10201 GGCGGGAAAC GACAATCTGA TCCCCATCAA GCTTGAGCTC AGGATTTAGC 10251 AGCATTCCAG ATTGGGTTCA ATCAACAAGG TACGAGCCAT ATCACTTTAT 10301 TCAAATTGGT ATCGCCAAAA CCAAGAAGGA ACTCCCATCC TCAAAGGTTT 10351 GTAAGGAAGA ATTCTCAGTC CAAAGCCTCA ACAAGGTCAG GGTACAGAGT 10401 CTCCAAACCA TTAGCCAAAA GCTACAGGAG ATCAATGAAG AATCTTCAAT 10451 CAAAGTAAAC TACTGTTCCA GCACATGCAT CATGGTCAGT AAGTTTCAGA 10501 AAAAGACATC CACCGAAGAC TTAAAGTTAG TGGGCATCTT TGAAAGTAAT 10551 CTTGTCAACA TCGAGCAGCT GGCTTGTGGG GACCAGACAA AAAAGGAATG 10601 GTGCAGAATT GTTAGGCGCA CCTACCAAAA GCATCTTTGC CTTTATTGCA 10651 AAGATAAAGC AGATTCCTCT AGTACAAGTG GGGAACAAAA TAACGTGGAA 10701 AAGAGCTGTC CTGACAGCCC ACTCACTAAT GCGTATGACG AACGCAGTGA 10751 CGACCACAAA AGAATTCCCT CTATATAAGA AGGCATTCAT TCCCATTTGA 10801 AGGATCATCA GATACTGAAC CAATCCTTCT AGAAGATCTA AGCTTAT (2) INPROMACE PRO SEQ ID Č:6:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 10901 párů bází (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET ŘETĚZCŮ: dvoj řetězcová (D) TOPOLOGIE: lineární (xi) VÝPIS SEKVENCE: SEQ ID Č:6:

• 9999

9 · · • · 9 · • 9 9 ·

9 9 9

9 9 · «9 99

101

151

201

251

301

351

401

451

501

551

601

651

701

751

801

851

901

951

1001

1051

1101

1151

1201

1251

1301

1351

1401

1451

1501

1551

1601

1651

1701

1751

1801

1851

1901

1951

2001

2051

2101

2151

2201

2251

2301

2351

2401

2451

2501

2551

2601

2651

2701

2751

CGATAAGCTT

TTCGATTGCT

GCAATGGTGT

CAACGCAAAT

AGCTTATCCG

TAATTGGCTC

GCGTGCATGC

CTCTGGTCTT

ACAGGTCCTT

GGTCTTTTGG

TATGGGTGCC

TTGGTAACGG

GCTGCAACTG

CGATAGCACT

GTGTGTTGAA

GGTGATCGTC

CACCTACAGG

TTGCTGGTCT

ACTCGTGACC

CGTTGAGACT

GTAAGCTCAC

GCTTTCCCAT

CCTTAACGTT

AGGAAATGGG

GAAGACGTGG

TGTTCCAGAA

CTGTTGCAGC

GAACTCCGTG

CAAGCTCAAC

GTGGTCGTCC

GCTACCCACC

CGTTTCTGAA

GCTTCCCAGA

CTCTCCGACA

CGGATCCAGC

CAATGCATCA

ATTATGGCAT

ATTTACTGTG

TGGATGGAGA

TTAATATTAT

ATAAGAGATA

GCCTCTAATG

CATTATGCTT

TGCAAATGTT

GAACTTTCCT

GCTTTATAAT

TTTTTTAATG

CGACCTGCAG

AGCAGCATTC

TATTCAAATT

TTTGTAAGGA

AGTCTCCAAA

AATCAAAGTA

AGAAAAAGAC

AATCTTGTCA

ATGGTGCAGA

GATGTAATTG

TCAATTGAAG

GCAGAACCCA

CTCCCTTATC

ATTTCGTCGT

TGAGCTTCGT

TTCACGGTGC

TCTGGAACCG

CATGTTTGGA

AAGGTGAAGA

AGAATCCGTA

TGGACTCCTT

GTTGCCGTTT

TTCATTGGTG

CCCACTTCGC

TTCCAGTTAC

GTACCTATGG

CAACACCCCA

ACACTGAAAA

GATGCTGACG

CGGTCAAGTG

TGGTTGCTGC

TTGATGAACC

TGCCGACATC

CTGACTTGCG

GACCGTGCTC

TGCATTCGCT

TTAAGGAAAG

GGTGTTGATT

TGACGGTAAG

TCGATCACCG

AACCCTGTTA

GTTCATGGAT

CTAAGGCTGC

TTTCGTTCGT

GTTTCATTGC

TGGGAAAACT

TTTTTTATTC

AGAGTTAATG

TTGTTTTTTC

TGCAAACATT

ACCGAAGTTA

ATTCACTAGG

ACTGAATACA

TTATGTAATT

TATAGTTATA

CATTTTATGA

CCACTCGAAG

CAGATTGGGT

GGTATCGCCA

AGAATTCTCA

CCATTAGCCA

AACTACTGTT

ATCCACCGAA

ACATCGAGCA

ATTGTTAGGC

GAGGAAGATC

TTTCTCCGAT

TCTCTTATCT

GGTTTCTCTG

CGTGGGGATT

CCTCTTAAGG

AAGCAGCCGT

TCCGTATTCC

GGTCTCGCTA

TGTTATCAAC

AGGAAGGTGA

GCTCCTGAGG

GACTATGGGT

ACGCTTCTCT

GAAATGGGTG

CTTGCGTGGA

CTTCCGCTCA

GGTATCACCA

GATGCTTCAA

GTGTGCGTAC

ATTGATGTTC

CTTGCTTGTT

CAACCCGTAC

GAAGTGATCA

TGTTCGTTCT

CTTCTATGAT

GAAGGTGCTA

CGACCGTCTT

GCGATGAAGG

GGTCTCGGTA

TATCGCTATG

CTGTTGATGA

TTGATGGCTG

TTGATGAGCT

ATCATCGGTT

GCACACACCA

GTTTTTCTTG

GGTTTTCGCT

AATGATATGG

TCTTATTTGT

TTGTTTTGAG

ATATGAGGAG

CAACAAATAT

AGTATGTCCT

TTCCAGAATC

CTCATGGATT

CTTGCCAATT

CGGCCGCGTT

TCAATCAACA

AAACCAAGAA

GTCCAAAGCC

AAAGCTACAG

CCAGCACATG

GACTTAAAGT

GCTGGCTTGT

GCACCTACCA

AAAATTTTCA

GGCGCAAGTT

CCAATCTCTC

AAGACGCAGC

GAAGAAGAGT

TCATGTCTTC

CCAGCAACTG

AGGTGACAAG

GCGGTGAAAC

ACTGGTAAGG

TACTTGGATC

CTCCTCTCGA

CTTGTTGGTG

CACTAAGCGT

TGCAGGTGAA

CCAAAGACTC

AGTGAAGTCC

CTGTTATCGA

GGTTTTGGTG

CATCCGTCTT

CAGGTGATCC

CCAGGTTCCG

TGGTCTCATC

ACCCACGTCT

TCTACTTTGA

CGACGAGTAT

CCGTTATGAA

TCTGCTGTCG

TGAGACTTCT

ACGCTTCTGG

AGCTTCCTCG

TGCTACTATG

GTCTTGGAGC

CAAGAATTCG

TCGACAACGT

GAATCCTACT

TACCATTTGT

ATCGAACTGT

TCCTTTTGTT

TGTGTGTTGA

TAAAAATGTG

TAAAACACTT

ATTTTCAGAC

CTTGTGTTTT

CTTGTCAGAT

TGTAGTTGAG

GATTGACAAC

CAAGCTTGAG

AGGTACGAGC

GGAACTCCCA

TCAACAAGGT

GAGATCAATG

CATCATGGTC

TAGTGGGCAT

GGGGACCAGA

AAAGCATCTT

ATCCCCATTC

AGCAGAATCT

GAAATCCAGT

AGCATCCACG

GGGATGACGT

TGTTTCCACG

CTCGTAAGTC

TCTATCTCCC

TCGTATCACC

CTATGCAAGC

ATTGATGGTG

TTTCGGTAAC

TTTACGATTT

CCAATGGGTC

GTCTGAAGAC

CAACGCCAAT

GCTGTTCTGC

GCCAATCATG

CTAACCTTAC

GAAGGTCGTG

ATCCTCTACT

ACGTCACCAT

TTGACTCTGC

TGCTGGTGGA

AGGGTGTTAC

CCAATTCTCG

CGGTTTGGAA

CAAACGGTCT

CTCGTCGTGC

AGCAGCTGTC

TTATGGGTCT

ATCGCTACTA

TAAGATCGAA

AGCTCGGTAC

TCGTCAAGTT

GAGTTCGAGT

TGTGCTTGTA

GAAATGGAAA

CATTCTCAAA

ATTTGAAATT

TCAAATCGTG

GTAGTTGTAC

CTAGAAAAGC

AGACATTTAT

TCTAATCATT

TATGAAAATA

ATGCATCAAT

CTCAGGATTT

CATATCACTT

TCCTCAAAGG

CAGGGTACAG

AAGAATCTTC

AGTAAGTTTC

CTTTGAAAGT

CAAAAAAGGA

TGCCTTTATT • ····

ΒΒ · • Β »6 : · • ΒΒ ·

ΒΒ ·»·· • · • Β

Β ·

Β Β e Β

2801

2851

2901

2951

3001

3051

3101

3151

3201

3251

3301

3351

3401

3451

3501

3551

3601

3651

3701

3751

3801

3851

3901

3951

4001

4051

4101

4151

4201

4251

4301

4351

4401

4451

4501

4551

4601

4651

4701

4751

4801

4851

4901

4951

5001

5051

5101

5151

5201

5251

5301

5351

5401

5451

5501

5551

GCAAAGATAA

GAAAAGAGCT

TGACGACCAC

TGAAGGATCA

CGATAAGCTT

TTCGATTGCT

GCAATGGTGT

CAACGCAAAT

AGCTTATCCG

TAATTGGCTC

GCGTGCATGC

AATCACTGGT

ACTTCGCACT

GTACTGGAAA

CAACGGTGGT

CGCAGGGTGC

CAGATGGCTG

CGCGAAGAAA

AACACTTCGC

CTGTCTGAAG

GGAGCGCATG

CCGGTGGTGA

CTGTACACCC

AATCAGCCCG

TTTACAAGCC

CAGGAATATG

CGTATTCCAC

TAAGCTACGG

ACCTGGGAAG

GGGTCAGCTG

ACGATCCGCG

CTGGAGAAAG

CGGTACCGGA

TTAAGATTGA

GTTGAATTAC

TTATGAGATG

GCGATAGAAA

GGTGTCATCT

TCGAGTGGTG

GGACGTGAAT

TGTTTATTGC

TCAAAATGTA

AATTGAAAAA

CATACTCATT

ATTGAATATA

TGTTGGTTTC

GAACTGAGCC

GGAGTGATCC

AGGCCGTTCG

GGGAGGGTTC

GCCAGGGCGC

AGCAGGTTAA

TGCAAATGCT

TGCGCCCCTC

CCCTCATCTG

TTATCCCCAG

AGCAGATTCC

GTCCTGACAG

AAAAGAATTC

TCAGATACTG

GATGTAATTG

TCAATTGAAG

GCAGAACCCA

CTCCCTTATC

ATTTCGTCGT

TGAGCTTCGT

AGGCcatggC

GATGACGTAC

GCCAGCAGTA

CCGCTGCTAA

GCTTCCTTTA

TGCTATCCTG

AACATTATGG

CTGCTGCCGT

AGCTACCGGT

AATCTCTGCA

TCCAAAATCG

AGAAGACGGC

AGCCGGAAGA

CGTTTCACCA

GGGTAACGTG

TTTCCAAGAA

GGTGGTTCCG

CGTAGTAAAA

GCGTTCTGAA

GGTAACCCGA

CGTATGGCTG

CATTCCAGGA

TCCAATTCCC

ATCCTGTTGC

GTTAAGCATG

GGTTTTTATG

ACAAAATATA

ATGTTACTAG

GCCGCATCGA

GTAGACACGT

TTTCGCCTAT

CTTTCATTTT

AAATTGGTAA

GCTGATCCAT

TCCTGCCGCC

TACGCAGAAC

ATGTGCACCT

ACATGGGACT

CGCGGGGCGC

GAGAAGGGGG

AGCCCTGGTT

AAGACAGGTT

GGATTTTCTG

ATCTGTCATC

TCAGTAGTCG

GCTTGTCCAC

TCTAGTACAA

CCCACTCACT

CCTCTATATA

AACCAATCCT

GAGGAAGATC

TTTCTCCGAT

TCTCTTATCT

GGTTTCTCTG

CGTGGGGATT

CCTCTTAAGG

TAAGATTTTT

AGAAAGTTTT

AACTGCGTCG

AGTTAAAGCG

TCGCTGGTAA

GGCGCGATCT

TGTTCCGGTT

GGATCGACGG

AAGCCGCTGT

AGAGAACATC

GCATGACTCT

GTGGACAACA

CGTTGATTAC

TCGCAGCGTC

GTTCTGACTC

ACACAACCTG

GTTCTACTGC

ATGAACATCG

CTACTACAAA

AAGGCGAAGA

CGTGCCGGTC

ACTGAACGCG

GATCGTTCAA

CGGTCTTGCG

TAATAATTAA

ATTAGAGTCC

GCGCGCAAAC

ATCGGGGATC

TCGTGAAGTT

CGAAATAAAG

AAATACGACG

ATAATAACGC

TTACTCTTTC

GTAGATTTCC

GCTGCCGCTT

TGAGCCGGTT

TCCCCCCAAC

TTTCCTAGCT

CAGCTGGGGG

GGCACCCCCC

AAAAACAAGG

AGCGGTGGCC

CCTGTGGACA

ACTCTGCCCC

CGCCCCTCAA

ATCATCTGTG

GTGGGGAACA

AATGCGTATG

AGAAGGCATT

TCTAGAAGAT

AAAATTTTCA

GGCGCAAGTT

CCAATCTCTC

AAGACGCAGC

GAAGAAGAGT

TCATGTCTTC

GATTTCGTAA

CCAGGTAGCA

GTACTGACTC

CCGGTTATCG

AGGCGTGAAA

CTGGTGCGCA

ATCCTGCACA

TCTGTTGGAC

TCTCTTCTCA

GAAATCTGCT

GGAAATCGAA

GCCACATGGA

GCATACACCG

CTTCGGTAAC

CGACCATCCT

CCGCACAACA

TCAGGAAATC

ATACCGATAC

GCGAACGAAG

TCAGCCGAAC

AGACTTCGAT

ATCGACGTTC

ACATTTGGCA

ATGATTATCA

CATGTAATGC

CGCAATTATA

TAGGATAAAT

GATCCCCGGG

TCTCATCTAA

ATTTCCGAAT

GATCGTAATT

TGCGGACATC

TTTTTCTCCA

CGGACATGAA

TGCACCCGGT

AGGCAGATAA

ACGGTGAGCG

TGGCTGCCAT

GATGGGAGGC

TTCGGCGTGC

TTTATAAATA

GAAAAACGGG

GCCCCTCAAA

TCAAGTGTCA

GTGTCAATAC

GGAAACTCGC

AAATAACGTG

ACGAACGCAG

CATTCCCATT

CTAAGCTTAT

ATCCCCATTC

AGCAGAATCT

GAAATCCAGT

AGCATCCACG

GGGATGACGT

TGTTTCCACG

AACCTGGCGT

AAAGAAAACA

CATCAACGCC

TTCAGTTCTC

TCTGACGTTC

TCACGTTCAC

CTGACCACTG

GCGGGTGAAA

CATGATCGAC

CTAAATACCT

CTGGGTTGCA

CGCTTCTGCA

AACTGAGCAA

GTACACGGTG

GCGTGATTCT

GCCTGAACTT

AAAGACTCCG

CCAATGGGCA

CTTATCTGCA

AAGAAATACT

GATCGCTCGT

TGTAAGAGCT

ATAAAGTTTC

TATAATTTCT

ATGACGTTAT

CATTTAATAC

TATCGCGCGC

CGGCCGCCAC

GCCCCCATTT

TAGAATAATT

TGTCGTTTTA

TACATTTTTG

TATTGACCAT

GCCATTTACA

GGAGCTTGCA

TTTCCATTGA

ACGGGGCAAC

TTTTGGGGTG

CCGCGTTACC

GCGGTCACGC

TTGGTTTAAA

CGGAAACCCT

TGTCAATAGG

AGGATCGCGC

CGCAGGGCAC

GTAAAATCAG

5601

5651

5701

5751

5801

5851

5901

5951

6001

6051

6101

6151

6201

6251

6301

6351

6401

6451

6501

6551

6601

6651

6701

6751

6801

6851

6901

6951

7001

7051

7101

7151

7201

7251

7301

7351

7401

7451

7501

7551

7601

7651

7701

7751

7801

7851

7901

7951

8001

8051

8101

8151

8201

8251

8301

8351 • ·«··· ·· * • ·

φφ φφφ» • · · • φ φ • · · » • e φ · ·· φφ φφ • * · φ • · · · φ φ ♦ · · • · · · φφ ·*

GCGTTTTCGC

TCGAGCCTGC

AAGTGTCAAC

TGGTATCCAC

ACGGCGTTTC

GCGAGGGCAA

CCTTGAGAGC

ACTATCGTCG

ACAGGTGCCG

GGAGCGCGAC

GCCCTCGCTC

GAAGCAGGCC

TGCTGGCGTT

CTCGCTTCCG

GCAGGTAGAT

TTACCAGCCT

GCCGCCTCGG

CCTATACCTT

CCACCTCGAC

CTCCAAGAAT

ACCAACCCTT

CACGCGGCGC

TCGTGCTCCT

GGTTAGCAGA

CTGCAAAACG

GTGTTTCGTA

TTCCGGATCT

ATCTGTATTA

CCCGCCGCAT

CGGGCATGTT

CATCGGTATC

TCAAGTGACC

GAAGCCAGAC

GAACAGGCAG

CCGCAGCTGC

TGCAGCTCCC

AGACAAGCCC

AGCCATGACC

TGCGGCATCA

TACCGCACAG

TCCTCGCTCA

ATCAGCTCAC

ACGCAGGAAA

AAAAAGGCCG

GCATCACAAA

TATAAAGATA

GTTCCGACCC

AAGCGTGGCG

AGGTCGTTCG

GACCGCTGCG

ACACGACTTA

CGAGGTATGT

GGCTACACTA

TACCTTCGGA

CTGGTAGCGG

AAAGGATCTC

CGATTTGCGA

CCCTCATCTG

GTCCGCCCCT

AACGCCGGCG

TGGCGCGTTT

CCAGCCCGGT

CTTCAACCCA

CCGCACTTAT

GCAGCGCTCT

GATGATCGGC

AAGCCTTCGT

ATTATCGCCG

CGCGACGCGA

GCGGCATCGG

GACGACCATC

AACTTCGATC

CGAGCACATG

GTCTGCCTCC

CTGAATGGAA

TGGAGCCAAT

GGCAGAACAT

ATCTCGGGCA

GTCGTTGAGG

ATGAATCACC

TCTGCGACCT

AAGTCTGGAA

GCATCGCAGG

ACGAAGCGCT

CCATACCGCC

CATCATCAGT

ATTACCCCCA

AAACAGGAAA

ATTAACGCTT

ACATCTGTGA

CTCGCGCGTT

GGAGACGGTC

GTCAGGGCGC

CAGTCACGTA

GAGCAGATTG

ATGCGTAAGG

CTGACTCGCT

TCAAAGGCGG

GAACATGTGA

CGTTGCTGGC

AATCGACGCT

CCAGGCGTTT

TGCCGCTTAC

CTTTCTCATA

CTCCAAGCTG

CCTTATCCGG

TCGCCACTGG

AGGCGGTGCT

GAAGGACAGT

AAAAGAGTTG

TGGTTTTTTT

AAGAAGATCC

GGCTGGCCAG

TCAACGCCGC

CATCTGTCAG

GCCGGCCGCG

GCAGGGCCAT

GAGCGTCGGA

GTCAGCTCCT

GACTGTCTTC

GGGTCATTTT

CTGTCGCTTG

CACTGGTCCC

GCATGGCGGC

GGCTGGATGG

GATGCCCGCG

AGGGACAGCT

ACTGGACCGC

GAACGGGTTG

CCGCGTTGCG

GCCGGCGGCA

CAATTCTTGC

ATCCATCGCG

GCGTTGGGTC

ACCCGGCTAG

GATACGCGAG

GAGCAACAAC

ACGCGGAAGT

ATGCTGCTGG

GGCATTGACC

AGTTGTTTAC

AACCCGTATC

TGAACAGAAA

AAACCGCCCT

CTGGAGAAAC

ATCGCTTCAC

TCGGTGATGA

ACAGCTTGTC

GTCAGCGGGT

GCGATAGCGG

TACTGAGAGT

AGAAAATACC

GCGCTCGGTC

TAATACGGTT

GCAAAAGGCC

GTTTTTCCAT

CAAGTCAGAG

CCCCCTGGAA

CGGATACCTG

GCTCACGCTG

GGCTGTGTGC

TAACTATCGT

CAGCAGCCAC

ACAGAGTTCT

ATTTGGTATC

GTAGCTCTTG

GTTTGCAAGC

TTTGATCTTT

CTCCACGTCG

GCCGGGTGAG

TGAGGGCCAA

GTGTCTCGCA

AGACGGCCGC

AAGGGTCGAT

TCCGGTGGGC

TTTATCATGC

CGGCGAGGAC

CGGTATTCGG

GCCACCAAAC

CGACGCGCTG

CCTTCCCCAT

TTGCAGGCCA

TCAAGGATCG

TGATCGTCAC

GCATGGATTG

TCGCGGTGCA

CCTCGCTAAC

GGAGAACTGT

TCCGCCATCT

CTGGCCACGG

GCTGGCGGGG

CGAACGTGAA

ATGAATGGTC

CAGCGCCCTG

CTACCCTGTG

CTGAGTGATT

CCTCACAACG

GTGAGCATCC

TTCCCCCTTA

TAACATGGCC

TCAACGAGCT

GACCACGCTG

CGGTGAAAAC

TGTAAGCGGA

GTTGGCGGGT

AGTGTATACT

GCACCATATG

GCATCAGGCG

GTTCGGCTGC

ATCCACAGAA

AGCAAAAGGC

AGGCTCCGCC

GTGGCGAAAC

GCTCCCTCGT

TCCGCCTTTC

TAGGTATCTC

ACGAACCCCC

CTTGAGTCCA

TGGTAACAGG

TGAAGTGGTG

TGCGCTCTGC

ATCCGGCAAA

AGCAGATTAC

TCTACGGGGT

CCGGCCGAAA

TCGGCCCCTC

GTTTTCCGCG

CACGGCTTCG

CAGCCCAGCG

CGACCGATGC

GCGGGGCATG

AACTCGTAGG

CGCTTTCGCT

AATCTTGCAC

GTTTCGGCGA

GGCTACGTCT

TATGATTCTT

TGCTGTCCAG

CTCGCGGCTC

GGCGATTTAT

TAGGCGCCGC

TGGAGCCGGG

GGATTCACCA

GAATGCGCAA

CCAGCAGCCG

GTGCGCATGA

TTGCCTTACT

GCGACTGCTG

TTCGGTTTCC

CACCATTATG

GAACACCTAC

TTTCTCTGGT

TTCCAGTAAC

TCTCTCGTTT

CACGGAGGCA

CGCTTTATCA

GGACGCGGAT

ATGAGCTTTA

CTCTGACACA

TGCCGGGAGC

GTCGGGGCGC

GGCTTAACTA

CGGTGTGAAA

CTCTTCCGCT

GGCGAGCGGT

TCAGGGGATA

CAGGAACCGT

CCCCTGACGA

CCGACAGGAC

GCGCTCTCCT

TCCCTTCGGG

AGTTCGGTGT

CGTTCAGCCC

ACCCGGTAAG

ATTAGCAGAG

GCCTAACTAC

TGAAGCCAGT

CAAACCACCG

GCGCAGAAAA

CTGACGCTCA ·· · · • · · ·

8401 GTGGAACGAA AACTCACGTT AAGGGATTTT GGTCATGAGA TTATCAAAAA 8451 GGATCTTCAC CTAGATCCTT TTAAATTAAA AATGAAGTTT TAAATCAATC 8551 TGAGGCACCT ATCTCAGCGA TCTGTCTATT TCGTTCATCC ATAGTTGCCT 8601 GACTCCCCGT CGTGTAGATA ACTACGATAC GGGAGGGCTT ACCATCTGGC 8651 CCCAGTGCTG CAATGATACC GCGAGACCCA CGCTCACCGG CTCCAGATTT 8701 ATCAGCAATA AACCAGCCAG CCGGAAGGGC CGAGCGCAGA AGTGGTCCTG 8751 CAACTTTATC CGCCTCCATC CAGTCTATTA ATTGTTGCCG GGAAGCTAGA 8801 GTAAGTAGTT CGCCAGTTAA TAGTTTGCGC AACGTTGTTG CCATTGCTGC 8851 AGGTCGGGAG CACAGGATGA CGCCTAACAA TTCATTCAAG CCGACACCGC 8901 TTCGCGGCGC GGCTTAATTC AGGAGTTAAA CATCATGAGG GAAGCGGTGA 8951 TCGCCGAAGT ATCGACTCAA CTATCAGAGG TAGTTGGCGT CATCGAGCGC 9001 CATCTCGAAC CGACGTTGCT GGCCGTACAT TTGTACGGCT CCGCAGTGGA 9051 TGGCGGCCTG AAGCCACACA GTGATATTGA TTTCCTGGTT ACGGTGACCG 9101 TAAGGCTTGA TGAAACAACG CGGCGAGCTT TGATCAACGA CCTTTTGGAA 9151 ACTTCGGCTT CCCCTGGAGA GAGCGAGATT CTCCGCGCTG TAGAAGTCAC 9201 CATTGTTGTG CACGACGACA TCATTCCGTG GCGTTATCCA GCTAAGCGCG 9251 AACTGCAATT TGGAGAATGG CAGCGCAATG ACATTCTTGC AGGTATCTTC 9301 GAGCCAGCCA CGATCGACAT TGATCTGGCT ATCTTGCTGA CAAAAGCAAG 9351 AGAACATAGC GTTGCCTTGG TAGGTCCAGC GGCGGAGGAA CTCTTTGATC 9401 CGGTTCCTGA ACAGGATCTA TTTGAGGCGC TAAATGAAAC CTTAACGCTA 9451 TGGAACTCGC CGCCCGACTG GGCTGGCGAT GAGCGAAATG TAGTGCTTAC 9501 GTTGTCCCGC ATTTGGTACA GCGCAGTAAC CGGCAAAATC GCGCCGAAGG 9551 ATGTCGCTGC CGACTGGGCA ATGGAGCGCC TGCCGGCCCA GTATCAGCCC 9601 GTCATACTTG AAGCTAGGCA GGCTTATCTT GGACAAGAAG ATCGCTTGGC 9651 CTCGCGCGCA GATCAGTTGG AAGAATTTGT TCACTACGTG AAAGGCGAGA 9701 TCACCAAGGT AGTCGGCAAA TAATGTCTAA CAATTCGTTC AAGCCGACGC 9751 CGCTTCGCGG CGCGGCTTAA CTCAAGCGTT AGATGCTGCA GGCATCGTGG 9801 TGTCACGCTC GTCGTTTGGT ATGGCTTCAT TCAGCTCCGG TTCCCAACGA 9851 TCAAGGCGAG TTACATGATC CCCCATGTTG TGCAAAAAAG CGGTTAGCTC 9901 CTTCGGTCCT CCGATCGAGG ATTTTTCGGC GCTGCGCTAC GTCCGCKACC 9951 GCGTTGAGGG ATCAAGCCAC AGCAGCCCAC TCGACCTCTA GCCGACCCAG 10001 ACGAGCCAAG GGATCTTTTT GGAATGCTGC TCCGTCGTCA GGCTTTCCGA 10051 CGTTTGGGTG GTTGAACAGA AGTCATTATC GTACGGAATG CCAAGCACTC 10101 CCGAGGGGAA CCCTGTGGTT GGCATGCACA TACAAATGGA CGAACGGATA 10151 AACCTTTTCA CGCCCTTTTA AATATCCGTT ATTCTAATAA ACGCTCTTTT 10201 CTCTTAGGTT TACCCGCCAA TATATCCTGT CAAACACTGA TAGTTTAAAC 10251 TGAAGGCGGG AAACGACAAT CTGATCCCCA TCAAGCTTGA GCTCAGGATT 10301 TAGCAGCATT CCAGATTGGG TTCAATCAAC AAGGTACGAG CCATATCACT 10351 TTATTCAAAT TGGTATCGCC AAAACCAAGA AGGAACTCCC ATCCTCAAAG 10401 GTTTGTAAGG AAGAATTCTC AGTCCAAAGC CTCAACAAGG TCAGGGTACA 10451 GAGTCTCCAA ACCATTAGCC AAAAGCTACA GGAGATCAAT GAAGAATCTT 10501 CAATCAAAGT AAACTACTGT TCCAGCACAT GCATCATGGT CAGTAAGTTT 10551 CAGAAAAAGA CATCCACCGA AGACTTAAAG TTAGTGGGCA TCTTTGAAAG 10601 TAATCTTGTC AACATCGAGC AGCTGGCTTG TGGGGACCAG ACAAAAAAGG 10651 AATGGTGCAG AATTGTTAGG CGCACCTACC AAAAGCATCT TTGCCTTTAT 10701 TGCAAAGATA AAGCAGATTC CTCTAGTACA AGTGGGGAAC AAAATAACGT 10751 GGAAAAGAGC TGTCCTGACA GCCCACTCAC TAATGCGTAT GACGAACGCA 10801 GTGACGACCA CAAAAGAATT CCCTCTATAT AAGAAGGCAT TCATTCCCAT 10851 TTGAAGGATC ATCAGATACT GAACCAATCC TTCTAGAAGA TCTAAGCTTA 10901 T

Claims (23)

1. Rekombinantní dvouřetězcová molekula DNA obsahující

a) promotor funkční v buňkách rostlin, a

b) DNA sekvenci kódující polypeptid mající enzymatickou aktivitu fruktosa-1,6bisfosfát aldolasy, přičemž funkčně připojená k tomuto promotoru ve stejné orientaci.

2. Molekula DNA podle nároku 1, kde DNA sekvence kódující polypeptid mající enzymatickou aktivitu fruktosa-l,6-bisfosfát aldolasy je odvozena od prokaryotického organismu.

3. Molekula DNA podle nároku 2, kde prokaryotickým organismem je Escherichia coli.

4. Molekula DNA podle nároku 1, kde DNA sekvence kódující polypeptid mající enzymatickou aktivitu fruktosa-l,6-bisfosfát aldolasy je alespoň z 60% identická s prokaryotickou DNA sekvencí kódující fruktosa-l,6-bisfosfát aldolasu třídy II.

5. Molekula DNA podle nároku 1, kde DNA sekvence kódující polypeptid mající enzymatickou aktivitu fruktosa-l,6-bisfosfát aldolasy je sekvence schopná hybridizovat s kódující oblastí označenou jako SEQ ID NO. 1.

6. Molekula DNA podle nároku 1, kde DNA sekvence kódující polypeptid mající enzymatickou aktivitu fruktosa-l,6-bisfosfát aldolasy je alespoň z 60% identická s kódující oblastí označenou jako SEQ ID NO. 1.

7. Molekula DNA podle nároku 1, kde DNA sekvence kódující polypeptid mající enzymatickou aktivitu fruktosa-l,6-bisfosfát aldolasy je alespoň z 70% identická s kódující oblastí označenou jako SEQ ID NO. 1.

8. Molekula DNA podle nároku 1, kde DNA sekvence kódující polypeptid mající enzymatickou aktivitu fruktosa-l,6-bisfosfát aldolasy je alespoň z 80% identická s kódující oblastí označenou jako SEQ ID NO. 1.

• 4 4 ·

9. Molekula DNA podle nároku 1, kde DNA sekvence kódující polypeptid mající enzymatickou aktivitu fruktosa-l,6-bisfosfát aldolasy obsahuje kódující oblast označenou jako SEQ ID NO. 1, nebo kóduje stejný peptid jako SEQ ID NO. 1 v souladu s degenerací genetického kódu.

10. Transgenická rostlinná buňka obsahující ve svém genomu rekombinantní DNA molekulu podle některého z nároků 1 až 9.

11. Transgenická rostlina obsahující rostlinné buňky podle nároku 10.

12. Transgenická rostlina podle nároku 11, kde rostliny vykazují vlastnosti vybrané ze skupiny obsahující zvýšené rychlosti fotosyntézy, zvýšené výtěžky, zvýšené rychlosti růstu a zlepšené stejnoměrné rozložení pevné hmoty ve srovnání s rostlinami, které neobsahují rekombinantní DNA molekuly.

13. Transgenická rostlina podle nároku 11, která je plodinou.

14. Transgenická rostlina podle nároku 11, vybraná ze skupiny sestávající z kukuřice, pšenice, rýže, rajčete, brambory, mrkeve, sladké brambory, zástupce rodu Dioscorea, artičoku, vojtěšky, arašíd, ječmene, bavlny, sójy, řepky, slunečnice, cukrové řepy, jabloně, hrušně, pomeranče, broskve, cukrové řepy, jahody, maliny, banánu, grepy, jitrocele, tabáku, salátu, kasavy, brukvovité zeleniny, lesních druhů a zahradních druhů.

15. Transgenická rostliny podle nároku 11, kde touto rostlinou je brambora.

16. Potravinářský výrobek vyrobený z brambor podle nároku 15.

17. Potravinářský výrobek podle nároku 16, kterými jsou bramborové hranolky, nebo bramborové lupínky.

18. Propagační materiál odvozený od transgenických rostlin podle nároku 11.

• · · · • ♦ · · • ♦ · ♦ © ** ©· · · • · · · · • © · · · © · · · · · • « © · © © ♦ * ·»

19. Způsob pro zvýšení rychlosti fotosyntézy, který zahrnuje transformaci buněk pomocí molekul DNA podle některého z nároků 1 až 9 a regeneraci transformovaných buněk za vzniku transgenických rostlin.

20. Způsob pro zvýšení výtěžku rostlin, který zahrnuje transformaci buněk pomocí molekul DNA podle některého z nároků 1 až 9 a regeneraci transformovaných buněk za vzniku transgenických rostlin.

21. Způsob pro zvýšení rychlosti růstu rostlin, který zahrnuje transformaci buněk pomocí molekul DNA podle některého z nároků 1 až 9 a regeneraci transformovaných buněk za vzniku transgenických rostlin.

22. Způsob pro zvýšení stejnoměrnosti rozložení pevné hmoty v rostlinách, který zahrnuje transformaci buněk pomocí molekul DNA podle některého z nároků 1 až 9 a regeneraci transformovaných buněk za vzniku transgenických rostlin.

23. Zlepšení způsobu výroby hranolků, nebo lupínků z brambor, zahrnující využití brambor, které overexprimují fda transgen zajišťující vyšší stejnoměrnost rozložení pevné hmoty v bramborách.