CZ438499A3 - Komposice rostlinného extraktu a způsob se schopností posilovat imunitu - Google Patents

Abstract

Komposice rostlinného extraktu áronu, extraktu granátového jablka, extraktu ibišku a extraktu čaje. Komposice rostlinného extraktu podle tohoto řešení vykazuje in vitro stimulaci transformace lymfocitů a produkce cytokinů a inhibici gp 120 vazby in vitro aje vhodná pro terapie a ošetřování imunitních poruch aHIV infekce.

Description

KOMPOSICE ROSTLINNÉHO EXTRAKTU A ZPŮSOB SE SCHOPNOSTÍ POSILOVAT IMUNITU

Oblast techniky

Tento vynález se obecně týká rostlinných extraktů, způsobů a ošetřování a zvláště pak komposice rostlinného nebo bylinného extraktu a způsobu, který má terapeutické účinky posilování imunity a antivirální efekty pro zesilování a stimulování přirozené imunitní odezvy u lidí.

Dosavadní stav techniky

Historie nauky o rostlinách je nerozvazatatelně propojena s moderní medicínou. Mnohé běžné moderní medikamenty se vyvinuly z prastarých léčitelských tradic spojených s určitými rostlinami. Léčivé vlastnosti mnoha rostlin byly identifikovány se specifickými chemickými sloučeninami, které byly isolovány, vyčištěny a v mnohých případech synteticky reprodukovány. Mnohé běžně známé drogy pocházejí původně z rostlin. Salicylová kyselina, předchůdce aspirinu, byla původně isolována z kůry vrby bílé a tavolníku. Chinin, užívaný při léčení malarie, byl získán z kůry chinovníku. Vinkristin, který se používá při ošetřování rakoviny, pochází z brčálu. Taxol, léčivo proti rakovině, byl původně isolován z kůry a jehlic pacifického tisu. Snad nejproslulejší je morfin a kodein, které pocházejí z opia máku. Morfin je dosud standardem, ke kterému se poměřují nová syntetická léčiva pro zmírňování bolesti.

Použití rostlin pro medicinální účely časově předchází historické záznamy. Proskurník lékařský, hyacint a řebříček obecný byly nalezeny pečlivě umístěny kolem kostí pravěkého muže v Iráku. Kořen proskurníku lékařského je uklidňující bylina s protizánětlivými vlastnostmi a je používán při ošetřování zanícených nebo podrážděných membrán sliznic. Hyacint se používá jako diuretikum k podnícení tkání, aby se z nich uvolňovala přebytečná voda. Řebříček obecný je dlouhou dobu oceňovaný prostředek pro snižování teploty a proti horečce, který byl kdysi používán tak široce, jako je dnes aspirin.

Moderní lékaři, zejména ve Spojených státech, mají sklon spoléhat na léčení syntetickými nebo chemicky připravenými medikamenty. Spíše než používat k léčení • ·

celé rostliny nebo rostlinné extrakty, mají farmakologové pro použití k léčení sklon identifikovat, isolovat, extrahovat a syntetizovat aktivní sloučeniny z rostlin. Avšak tento přístup má nevýhody. Vedle jednotlivých fysiologicky aktivních sloučenin přítomných v rostlinách jsou zde také minerály, vitaminy, glykosidy, oleje, alkaloidy, bioflavonoidy a další látky, které mohou mít význam pro podporu medicínských vlastností konkrétní rostliny. Tyto dodatkové látky mohou způsobovat synergický efekt, který neexistuje, když se vyčištěné fysiologicky aktivní sloučeniny používají samotné. K tomu navíc je toxicita vyčištěné fysiologicky aktivní sloučeniny obecně $ vyšší, než když fysilogicky aktivní sloučeniny jsou přítomny spolu s jinými rostlinnými látkami .

Účinnost různých rostlinných léčebných prostředků, extraktů, lektvarů a způsobů léčby je běžně známa a terapeutické rostlinné produkty jsou stále více považovány za žádoucí alternativy syntetických léčiv. Na příklad U. S. patent č. 4,446,130 publikuje použití extraktu žeň-šenu, který má stimulativní a diuretické účinky. U. S. patent č. 4,886,665 popisuje použití farmaceutického přípravku z ovsa a extraktu z kopřiv. U. S. patent č. 4,671,959 publikuje aplikaci přírodních olejů pro zmírňování stresu. U. S. patent č. 5,064,675 se týká komposice rostlinného extraktu, která má uklidňující účinek. U. S. patent č. 5,407,675 zveřejňuje rostlinný extrakt pro použití k ošetřování kůže na hlavě. U. S. patent č. 5,178,865 popisuje směs rostlinného extraktu, která in vitro zabraňuje infekci HIV (Human Immunodeficiency Virus). U. S. patent č. 5,500,340 a U. S. patent č. 5,294,443 uveřejňují použití rostlinných extraktů při snížené imunitě a autoimunních poruchách.

Lidská imunitní odezva je neobyčejně složitá a vyžaduje konstantní interakci mezi buňkami, které jsou do imunitního systému zapojeny. Mezibuněčná komunikace je usnadňována vylučováním mediátorových (messeger) proteinů známých jako cytokiny, které způsobují podněcování růstu buněk, podporují aktivaci buněk, řídí výměnu buněk, stimulují funkci makrofágu, ničí antigeny a mají i jiné funkce. Cytokiny obsahují obvykle lymfokiny, které jsou vylučovány T-lymfocyty a monokiny vylučované monocyty. Významnou třídou cytokinů jsou interferony, které jsou využívány k obraně proti virové infekci a růstu rakovinných buněk. Cytokiny zahrnují také interleukiny, které týkají diferenciace buněk a faktory nekrosy tumorů i faktory transformujícího růstu, které zúčastňují na zprostředkovávání zánětu a cytotoxických reakcí. Jinou významnou skupinou proteinů při lidské imunitní odezvě jsou • ·· • · flfl imunoglobuliny, které jsou vylučovány B lymfocyty. Imunoglobuliny slouží jako protilátky, které čelí virovým, bakteriálním a jiným antigenům.

Osoby, které trpí chorobami snížené imunity nebo stavy jako je virus lidské imunitní nedostatečnosti (HIV), rakovina, hepatitida, ledvinové selhání, diabetes, astma, artritida a podobně, často trpí snížením hladin lymfocytů a tomu odpovídajícím způsobem snížení hladiny cytokinů. Když se na příklad jednotlivec infikoval HIV, jsou v necharakteristicky nízkém počtu přítomny lymfocyty mající na povrchu buněk antigen známý jako CD4. Zatímco u zdravých jedinců tyto buňky s CD4 lymfocyty jsou přítomny v koncentracích kolem 800 buněk na mililitr séra, HIV nakažený jedinec vykazuje méně než 200 CD4 buněk na mililitr séra, když se vyvíjejí oportunní infekce. Specifické typy CD4 lymfocytů známé jako TH1 a TH2 buňky se zdají být zvláště významné v buňkami zprostředkovávané odezvě na HIV infekci. TH1 buňky produkují interleukin-2 (IL-2) a gamma interferon (IFNy). TH2 buňky produkují interleukiny -4, -5 a -10 (IL-4, IL-5 a IL-10). O cytokinech vylučovanými TH1 a TH2 buňkami se má za to, že mají jedna ke druhé oposiční efekt tak, že cytokiny vylučované TH1 buňkami působí regulačně na produkci cytokinů vylučovaných TH2 buňkami a naopak. Na počátku průběhu HIV infekce dominuje odezva TH1 a sekrece IL-2 TH1 buňkami zvyšuje aktivitu CD8 lymfocytů.

Přírodně se vyskytující interferony, interleukiny a immunoglobuliny vylučované lymfocyty jsou dobře uzpůsobeny pro regulaci lidské imunitní odezvy a ošetřování pacientů s imunodeficiencí nebo s potlačenou imunitou může být efektivní. Je známa průmyslová produkce interferonů, interleukinů a imunoglobulinů technikami genového inženýrství, přičemž geny odpovídající za produkci těchto proteinů jsou vloženy do bakterií, které se pak kultivují a sbírají. Interferony, interleukiny a immunoglobuliny vyloučené geneticky modifikovanými bakteriemi se potom vyčistí a podávají pacientům injekční stříkačkou nebo intravenosními metodami. Metoda orálního podávání pro poskytování interferonů, interleukinů a imunoglobulinů pacientům nebyla dosud realizována, protože žaludeční kyseliny a enzymy tyto proteiny štěpí dříve než se mohou dostat do krevního řečiště.

Má se za to, že mnohé rostliny mají blahodárný efekt na lidský imunitní systém. Na příklad Echinacea purpurea a Echinacea angustifolia jsou považovány za stimulátory aktivity T-buněk. (Mowery D. B., The Scientifíc Validation of Herbal Medicine, Keats Publishing, lne., New Canaan Press, 1986, str. 118-119). O Astragulas membranaceous se myslí, že je u myší schopné stimulovat produkci

interferonu a imunoglobulinů A a G (IgA a IgG). (Kaiser J. D., Immune Power. A Comprehensive Treatment Program for HIV, St. Martirťs Press, New York, 1993, str. 59-60).

Avšak rostlinný nebo bylinný extrakt, který by vykonával stimulativní nebo zesilující účinek na lidský imunitní systém byl až dosud neznámý.

Proto tedy je tu potřeba komposice rostlinného extraktu, způsob komposice a metoda, která poskytne zdravotní doplněk a obecné ošetření osobám nebo zvířatth^ kteří mají choroby nebo stavy, které potlačují imunitní odezvu. Předkládaný vynález uspokojuje tyto potřeby stejně jako jiné a obecně překonává nedostatky, které v této oblasti nalézáme.

Podstata vynálezu

Předkládaný vynález představuje komposici rostlinného extraktu, způsob její přípravy a její použití pro stimulaci nebo posilování imunitní odezvy u lidí a zvířat. Názvy, klasifikace a zeměpisný původ ve vynálezu použitých rostlin a bylin jsou podány níže v Tabulce 1.

TABULKA 1

Název použité rostliny	Klasifikace	Původ	Část/části
Áron (Arům)	Araceae	Asie, Afrika, Evropa a Ameriky	Listy a/nebo kořeny
Marhaník obecný (Granátové jablko)	Punica granatum £e£fe/Punicaceae	Sýrie, Irák, Turecko, Itálie, jiné části světa	Slupky plodů
Čaj	Camelia Sinensis eeW^Theaceae, čajovitých	Čína, Japonsko, Východní Indie	Listy
Ibišek	Malvaceae, rod slézovitých	Afrika, Východní Indie, Čína	Květy

Jak je podrobněji níže popsáno, při přípravě komposice rostlinného extraktu podle vynálezu může být typicky použito čerstvé nebo sušené listí, semena, kůra, ovoce, slupka, květy a/nebo kořeny každé z hořejších rostlin nebo bylin. Avšak • · · · · ···· ·· · · · · · ······

5· · · · · · · ···· ·· ··· ···· ·· ·· preferované, k extrakci používané části áronu, granátového jablka, ibišku a čaje jsou ty, které ukazuje Tabulka 1. Obvykle jsou rostliny extrahovány horkou vodou, i když alternativně lze používat ethanolové roztoky a ethanol.

Obecně řečeno komposice rostlinného extraktu podle vynálezu obsahuje extrakt áronu (Arům). Jiné provedení podle vynálezu je komposice rostlinného extraktu, která obsahuje mezi přibližně deseti procenty a přibližně devadesáti procenty extraktu áronu a mezi přibližně deseti procenty a přibližně devadesáti procenty extraktu granátového jablka. Komposice rostlinného extraktu podle vynálezu může dále obsahovat mezi přibližně deseti procenty a přibližně devadesáti procenty extraktu ibišku a/nebo mezi přibližně deseti procenty a přibližně devadesáti procenty extraktu čaje. Je výhodné, když komposice rostlinného extraktu podle vynálezu obsahuje stejné podíly extraktu áronu, extraktu granátového jablka a extraktu čaje.

Komposice rostlinného extraktu podle vynálezu poskytuje zdravý a nutriční doplněk lidské stravy v tom, že obsahuje vitamin C, vitamin E, vitamin D2, vitamin D3, vitamin K, rozpuštěné minerály včetně fosforu, sodíku, draslíku, zinku, hořčíku a mědi a řadu blahodárně působících proteinů. Proteiny zahrnují různé cytokiny nebo cytokinům podobné proteiny a imunoglobulin nebo imunoglobulinu podobné proteiny, o kterých se soudí, že poskytují stimulující nebo zesilující efekt na imunitní systém. Komposice rostlinného extraktu podle vynálezu jako nutriční doplněk může být požívána orálně nebo může být aplikována místně.

v v

Experimě|tálm výsledky (diskutované mze) naznačuji, ze komposice rostlinného extraktu podle vynálezu je účinná při zesilování lidské imunitní odezvy. Pokusy in vitro ukazují, že komposice rostlinného extraktu podle vynálezu stimulují buňkou zprostředkovávanou imunitu stimulující blastogenesi nebo zárodečnou transformaci lymfocytů a zprostředkovávanou stimulaci produkce cytokinů v suspensích lymfocytů u normálních osob, pacientů s leukémií a pacientů trpících selháním ledvin. Počáteční experimentální výsledky také ukazují, že komposice rostlinného extraktu podle vynálezu je účinná při inhibici HIV infekce in vitro. Tyto experimenty a získaná data demonstrují, že komposice rostlinného extraktu podle vynálezu je užitečný zdroj nebo kandidát na potenciální terapie imunitních potíží.

Vhodný způsob zhotovení komposice rostlinného extraktu podle vynálezu se skládá z kroků přípravy extraktu áronu (Arům), přípravy a extraktu granátového

jablka, přípravy a extraktu ibišku, přípravy a extraktu čaje a spojení extraktů áronu, granátového jablka, ibišku a čaje.

Způsob použití vynálezu pro stimulaci buňkami zprostředkované imunity in vitro zahrnuje styk nebo exposici buněk s účinným množstvím preparátu složeným v podstatě z extraktu áronu, extraktu granátového jablka, extraktu ibišku a extraktu čaje.

Způsob použití vynálezu pro stimulaci blastogenese lymfocytů in vitro zahrnuje styk nebo exposici suspense lymfocytů s účinným množstvím preparátu složeným v podstatě z extraktu áronu, extraktu granátového jablka, extraktu ibišku a extraktu čaje.

Způsob použití vynálezu pro stimulaci produkce cytokinů v periferních mononukleárních krevních buňkách in vitro zahrnuje styk nebo exposici takových buněk s účinným množstvím preparátu složeným v podstatě z extraktu áronu, extraktu granátového jablka, extraktu ibišku a extraktu čaje.

Předmětem vynálezu je poskytnout komposici rostlinného extraktu a způsob, který je užitečným zdrojem nebo kandidátem pro terapie a ošetřování lidí a zvířat trpících imunosupresivními a autoimunními chorobami, potížemi, infekcemi nebo stavy.

Jiným předmětem vynálezu je poskytnout komposici rostlinného extraktu a způsob, který poskytuje nutriční výživový doplněk pro lidi a zvířata.

Jiným předmětem vynálezu je poskytnout komposici rostlinného extraktu a způsob, který stimuluje nebo zesiluje imunitní odezvu u lidí a zvířat.

Dalším předmětem vynálezu je poskytnout komposici rostlinného extraktu a způsob, který stimuluje buňkou zprostředkovanou imunitu in vitro.

Dalším předmětem vynálezu je poskytnout komposici rostlinného extraktu a způsob, který stimuluje buňkou zprostředkovanou imunitu u lidí a zvířat.

Jiným předmětem vynálezu je poskytnout komposici rostlinného extraktu a způsob, který in vitro stimuluje transformaci blastu nebo blastogenesi lymfocytů.

Jiným předmětem vynálezu je poskytnout komposici rostlinného extraktu a způsob, který stimuluje transformaci blastu nebo blastogenesi lymfocytů u lidí a zvířat.

Dalším předmětem vynálezu je poskytnout komposici rostlinného extraktu a způsob, který in vitro stimuluje produkci cytokinů v periferních mononukleárních krevních buňkách.

* 4 4

4 4

4 4 ·4 4 • 4

Dalším předmětem vynálezu je poskytnout komposici rostlinného extraktu a způsob, který stimuluje produkci cytokinu v periferních mononukleárních krevních buňkách u lidí a zvířat.

Jiným předmětem vynálezu je poskytnout komposici rostlinného extraktu a způsob, který stimuluje produkci cytokinu u lidí a zvířat.

Dalším předmětem vynálezu je poskytnout komposici rostlinného extraktu a způsob pro inhibici vazby gp120 na MT4 buňky in vitro.

Dalším předmětem vynálezu je poskytnout komposici rostlinného extraktu a způsob pro inhibici HIV infekce MT4 buněk in vitro.

Jiným předmětem vynálezu je poskytnout komposici rostlinného extraktu obsahující extrakt áronu, extrakt granátového jablka, extrakt ibišku a extrakt čaje pro inhibici HIV infekce u lidí.

Jiným předmětem vynálezu je poskytnout komposici rostlinného extraktu a způsob pro ošetřování imunosupresivních chorob , který je relativně netoxický.

Dalším předmětem vynálezu je poskytnout komposici rostlinného extraktu, ve které jsou obsaženy různé cytokiny a/nebo cytokinům podobné proteiny a imunoglobulin a/nebo imunoglobulinu podobné proteiny.

Dalším předmětem vynálezu je poskytnout komposici rostlinného extraktu, která obsahuje vitamin C, vitamin E, vitamin D2, vitamin D3, vitamin K, rozpuštěné minerály včetně fosforu, sodíku, draslíku, zinku, hořčíku a mědi a řadu blahodárně působících proteinů.

Další předměty a výhody vynálezu budou vyloženy v následujících částech specifikace, v nichž je uveden podrobný popis s tím účelem, aby bylo popsáno preferované provedení vynálezu bez toho, že by tím měl být omezen.

Přehled obrázků na výkresech

Předložený vynález bude úplněji pochopen odkazem na následující obrázky, které mají pouze ilustrativní charakter.

Obrázek 1 je grafickým znázorněním účinku komposice rostlinného extraktu podle vynálezu na blastogenesi normálních lymfocytů.

Obrázek 2 je grafickým znázorněním komposice účinku rostlinného extraktu podle vynálezu na blastogenesi lymfocytů pacientů s leukémií.

• · • · · · 0 0 0 0 0 0 0 0 • ·· 0 0 0 0 0 0 ♦ · · · · · 0 000000

0 · 0 0 0 0 0

0000 00 000 000· ·* «·

Obrázek 3 je grafickým znázorněním komposice účinku rostlinného extraktu podle vynálezu na blastogenesi lymfocytů pacientů s ledvinovým selháním.

Příklady provedení vynálezu

Předložený vynález se týká používání rostlinných extraktů z áronu (Arům), granátového jablka, ibišku a čaje a jejich různých kombinací pro zesilování nebo stimulaci imunitní odezvy u lidí a zvířat, pro ošetřování osob nebo zvířat trpících imunosupresivními a autoimunními chorobami nebo stavy a pro inhibici HIV infekce u lidí. Příklad 1 ukazuje způsob preparace a složení rostlinného extraktu z áronu (Arům), granátového jablka, ibišku a čaje. Příklad 2 se vztahuje na použití komposice rostlinného extraktu obsahujícího extrakt z áronu, extrakt z granátového jablka, extrakt ibišku a extrakt čaje pro zárodečnou transformaci suspensí normálních lymfocytů in vitro. Příklad 3 se vztahuje na použití komposice rostlinného extraktu obsahujícího extrakt z áronu, extrakt z granátového jablka, extrakt ibišku a extrakt čaje pro blastogenesi periferních krevních lymfocytů pacientů s akutní leukémií, in vitro. Příklad 4 se vztahuje na použití komposice rostlinného extraktu obsahujícího extrakt z áronu, extrakt z granátového jablka, extrakt ibišku a extrakt čaje pro blastogenesi periferních krevních lymfocytů pacientů s ledvinovým selháním, in vitro. Příklad 5 se vztahuje na použití komposice rostlinného extraktu obsahujícího extrakt z áronu, extrakt z granátového jablka, extrakt ibišku a extrakt čaje pro stimulaci produkce cytokinů v periferních krevních mononukleárních buňkách (PMBC) u normálních pacientů, in vitro. Příklad 6 se vztahuje na použití komposice rostlinného extraktu obsahujícího extrakt z áronu, extrakt z granátového jablka, extrakt ibišku a extrakt čaje pro inhibici vazby gp120 na MT-4 buňky in vitro, jak bylo změřeno vazbou s 0KT-4A. Příklad 7 se vztahuje na použití komposice rostlinného extraktu obsahujícího extrakt z áronu, extrakt z granátového jablka, extrakt ibišku a extrakt čaje pro inhibici vazby gp120 na MT-4 buňky in vitro, jak bylo změřeno s anti gp 120 mAb. Příklad 8 popisuje analytické zhodnocení spojených extraktů áronu (Arům), granátového jablka, ibišku a čaje.

Příklad 1

Příprava extraktu

Tento příklad popisuje přípravu a spojování extraktů áronu, granátového jablka, ibišku a čaje. Odkazuje se na Tabulku 1 nahoře, kde se uvádějí preferované části rostlin áronu, granátového jablka, ibišku a čaje použité pro extrakční pochody. Procesy uvedené níže mohou být zvětšeny na produkci větších množství extraktů. Podrobnosti uvedené pro přípravu v následujících výpisech vyjadřují v současné době preferovanou metodu přípravy extraktu a nemohou být považovány za limitující. K tomu, aby se v souhlase s vynálezem získaly vhodné extrakty áronu, granátového jablka, ibišku a čaje mohou být níže popisovaná množství a doby podstatně změněny.

1. Příprava extraktu z áronu (Arům)

Přibližně 20 gramů sušeného, jemně rozdrceného áronu a jeden litr destilované vody byly vloženy do nerezového tlakového hrnce a uzavřeny v něm nerezovým víkem. Potom byla směs zahřáta k varu (přibližně 100°C) a ponechána vařit kolem čtyřiceti pěti minut. Pak byla směs zahřáta na přibližně 130°C, vařena kolem 15 minut, na to ponechána ochladit pod 100°C, a tak se získal kapalný extrakt z áronu. Extrakt z áronu dokud byl ještě horký, byl používán způsobem, který je popsán níže.

2. Příprava extraktu z granátového jablka

Přibližně 60 gramů sušeného, jemně rozdrceného granátového jablka a jeden litr destilované vody byly vloženy do nerezového tlakového hrnce a uzavřeny v něm nerezovým víkem. Potom byla směs zahřáta k varu (přibližně 100°C) a ponechána vařit kolem čtyřiceti pěti minut. Pak byla směs zahřáta na přibližně 130°C, vařena kolem 15 minut, potom ponechána ochladit pod 100°C, a tak se získal kapalný extrakt z granátového jablka. Extrakt z granátového jablka dokud byl ještě horký, byl používán způsobem, který je popsán níže.

·· ·· · »· ·· • ·· · · · · · · · · • ·· · · · · · • · * · · · · ··· • » · · · · · ···· ·· ·Φ· ·♦♦· ·· ··

3. Příprava extraktu z ibišku

Přibližně 15 gramů sušeného, jemně rozdrceného ibišku a jeden litr destilované vody byly vloženy do nerezového tlakového hrnce a uzavřeny v něm nerezovým víkem. Potom byla směs zahřáta k varu (přibližně 100°C) a ponechána vařit kolem čtyřiceti pěti minut. Pak byla směs zahřáta na přibližně 130°C, vařena kolem 15 minut a potom ponechána ochladit pod 100°C, a tak se získal kapalný extrakt z ibišku. Extrakt z ibišku dokud byl ještě horký, byl používán způsobem, který je popsán níže.

4. Příprava extraktu z čaje

Přibližně 40 gramů sušeného, jemně rozdrceného čaje a jeden litr destilované vody byly vloženy do nerezového tlakového hrnce a uzavřeny v něm nerezovým víkem. Potom byla směs zahřáta k varu (přibližně 100°C) a ponechána vařit kolem čtyřiceti pěti minut. Pak byla směs zahřáta na přibližně 130°C, vařena kolem 15 minut a potom ponechána ochladit pod 100°C, a tak se získal kapalný extrakt z čaje. Extrakt z čaje dokud byl ještě horký, byl používán způsobem, který je popsán níže.

5. Příprava spojených extraktů z áronu a z granátového jablka

Přibližně 50 ml každého z extraktu áronu a z extraktu granátového jablka byly dokud byly ještě teplé až horké (přibližně mezi 40°C a 100°C) přeneseny do nerezového tlakového hrnce, uzavřeny v něm nerezovým víkem a za stálého míchání nebo třepání kolem 1,5 hodiny spolu zahřívány při přibližně 100°C. Takto získaná směs může být ochlazena a skladována při ochlazení anebo použita ještě teplá nebo horká k přípravě dalších kombinací extraktů jak je popsáno níže. Podle obecně identické procedury byly připraveny rovněž spojené extrakty z áronu a ibišku, z áronu a čaje, z granátového jablka a ibišku i z granátového jablka a čaje.

6. Příprava spojených extraktů z áronu, z granátového jablka, z ibišku a z čaje

Přibližně 100 ml spojených extraktů z extraktu áronu a z granátového jablka, připravených jako nahoře přibližně s 50 ml každého z extraktu ibišku připraveného jako nahoře a přibližně 50 ml extraktu z čaje připraveného jako nahoře, byly dokud byly ještě teplé až horké (přibližně mezi 40°C a 100°C) přeneseny do nerezového tlakového hrnce, uzavřeny v něm nerezovým víkem a za stálého míchání nebo třepání kolem 1,5 hodiny spolu zahřívány při přibližně 100°C. Takto získaná směs ·« ·♦ φ φφ φφ φφ • φφ · φφφ φ φ φφ φ φφφ φ ΦΦΦΦΦ φφ φφ φ φ φ φφφφφφ φφφ · φ φ φ φφφφ φφ φφφ φφφφ φφ φφ má zpravidla stejné podíly každého z extraktů z áronu, granátového jablka, ibišku a čaje popsané ze shora. Spojená směs extraktů z áronu, granátového jablka, ibišku a čaje může byla ochlazena na teplotu místnosti. Během ochlazování, byl ke spojené směsi, když měla přibližně 30°C až 60°C, přidán roztok pufru (Ix^HPOVNa^PCU), aby směs získala slabě kyselé pH. Je výhodné, když je pH spojených extraktů adjustováno asi na 4,0, lépe je 3,8, i když pH pod 7 je přijatelné. Spojené extrakty z áronu, granátového jablka, ibišku a čaje podle hořejšího postupu byly uchovávány za chlazení při přibližně 4°C. Ke spojeným extraktům může být jako konservační činidlo přidán benzoan sodný a pokud se to požaduje mohou být přidávány příchutě a potravinářská barviva.

Výsledky chemické analýzy spojené směsi extraktů z áronu, granátového jablka, ibišku a čaje jsou uvedeny níže v příkladu 8.

Hořejší postup byl použit k přípravě spojené směsi extraktů z áronu, granátového jablka a ibišku za vynechání extraktu z čaje. Hořejší postup byl použit také k přípravě spojené směsi extraktů z áronu, granátového jablka a čaje za vynechání extraktu z ibišku. Hořejší postup byl použit dále k přípravě spojené směsi extraktů z granátového jablka, ibišku a čaje za vynechání extraktu z áronu. Dále byl hořejší postup použit k přípravě spojené směsi extraktů z granátového jablka a ibišku za vynechání extraktů z áronu a čaje.

Příklad 2

Zárodečná transformace lymfocytů u normálních pacientů in vitro

Tento příklad popisuje účinek komposice rostlinného extraktu obsahující extrakt áronu, extrakt granátového jablka, extrakt ibišku a extrakt čaje, popsané v příkladu 1 na buňkou zprostředkovanou imunitu, která byla stanovována zárodečnou transformací nebo blastogenesí normálních lymfocytů in vitro.

Blastogenese je počáteční stupeň indukce buňkou zprostředkované imunity a je spojena s uvolňováním či vylučováním různých interleukinů, které jsou základem mezibuněčné interakce imunitního sytému. Buňkou zprostředkovaná imunita je zapojena do obranného systému lidského těla proti zhoubným nádorům, určitým virovým infekcím včetně HIV, mezibuněčným bakteriálním infekcím, stejně tak jako • h · · *

0 « » 0· • 00 ·

0 0 0 0

0 0 ·

0 0 0 «0 » 0

0* 0« • 0 0 0 0 0

0 0 0 « 0 0 ·0 0 000 • 0 0 0000 0 0 00 do regulace různých celulárních a humorálních imunologických interakcí a prevence autoimunních reakcí.

Zárodečná transformace byla měřena pomocí konvenčního testu lymfocytů, při němž ³H (tritiovaný) thymidin byl přidán do suspense lymfocytů, potom následovala inkubace, shromáždění buněk a změření radioaktivity nashromážděných buněk. Vysoká hodnota radioaktivity ukazuje, že lymfocyty podlehly transformaci a přijaly ³H thymidin.

Lymfocyty zdravé krve tří normálních pacientů byly získány separací hustotních gradientů na Ficoll Isopaque. Do mikrotitračních desek s mnoha jamkami upravených tak, že obsahovaly suspense lymfocytů v Hanksově soluci, doplněné 10 %-ním telecím plodovým sérem, penicilinem a streptomycinem, bylo do jamek každé z desek přidáno 5 μί, 10 μΙ a 20 μί spojené směsi extraktů áronu, granátového jablka, ibišku a čaje. Konečný objem suspense lymfocytů v každé jamce byl 0,2 ml. Potom byly mikrotitrační desky inkubovány 72 hodin při 37 °C v CO2 inkubátoru. Do každé jamky bylo potom přidáno 0,05 ml ³H (tritiovaného) thymidinu, následovala další inkubace 24 hodin při 37°C, po níž byly buňky sebrány automatickým hromadným sběračem a scintilačním počítačem byla změřena radioaktivita. Stimulační index byl vypočítán z průměru impulsů pro každou koncentraci spojeného extraktu. Výsledky uvádí Tabulka 2 a Obrázek 1.

TABULKA 2

	Průměr impulsů (Stupeň 3H absorpce)	Stimulační index
Nespojené extrakty	284 impulsů/min (pozadí)	0
Spojené extrakty 20 μί	815 impulsů/min	2,86
Spojené extrakty 10 μί	723 impulsů/min	2,54
Spojené extrakty 5 μί	463 impulsů/min	1,63

Výsledky uvedené v Tabulce 2 a na Obrázku 1 ukazují, že přídavek zvyšujících se množství spojených extraktů k suspensi lymfocytů má za následek zvyšující se množství nebo stupně transformace lymfocytů či blastogenese, což ukazuje zvýšený počet radiačních impulsů způsobený zvýšenou absorpcí ³H.

• ·

Výsledky ukazují, že komposice rostlinného extraktu obsahující směs extraktů áronu, granátového jablka, ibišku a čaje zesiluje nebo stimuluje buňkami zprostředkovávanou imunitu stimulací blastogenese a výslednou sekreci cytokinů u normálních osob. Dále tyto výsledky ukazují, že komposice rostlinného extraktu podle vynálezu je užitečným zdrojem nebo kandidátem pro potenciální terapie a ošetřování poruch imunity.

Příklad 3

In vitro blastogenese periferních krevních lymfocytů u pacintů s akutní leukémií

Tento příklad popisuje účinek komposice rostlinného extraktu obsahující extrakt áronu, extrakt granátového jablka, extrakt ibišku a extrakt čaje, popsané v příkladu 1 na buňkou zprostředkovanou imunitu, která byla dále stanovována in vitro zárodečnou transformací nebo blastogenesí lymfocytů u pěti pacientů trpících leukémií. Jako kontrola pro kalibraci nebo měření účinnosti spojených extraktů byl použit PHA (fytohemagglutinin), známý silný mitogen, který stimuluje transformaci lymfocytů.

Mikrotitrační desky s mnoha jamkami byly upraveny tak, že obsahovaly suspensi lymfocytů pěti pacientů trpících leukémií v Hanksově soluci, doplněné 10 %-ním telecím plodovým sérem, penicilinem a streptomycinem. Do jamek každé z desek přidáno 5 μΙ, 10 μΙ a 20 μΙ spojené směsi extraktů áronu, granátového jablka, ibišku a čaje. Jako kontrola byl potom do jamek přidán PHA (fytohemagglutinin) v koncentracích 1 : 50 a 1 : 100. Konečný objem suspense lymfocytů v každé jamce byl 0,2 ml. Mikrotitrační desky byly inkubovány 72 hodin při 37 °C v CO2 inkubátoru, potom bylo do každé jamky přidáno 0,05 ml ³H (tritiovaného) thymidinu, následovala další inkubace 24 hodin při 37°C. Buňky byly sebrány automatickým hromadným sběračem a scintilačním počítačem byla změřena radioaktivita. Stimulační index byl vypočítán pro každou koncentraci spojených extraktů. Výsledky uvádí Tabulka 3 a Obrázek 2.

• 0 • 0 ·

000 000

TABULKA 3

Pacient č.	Impulsy auto (kontrola)	Impulsy PHA 1: 100	Impulsy PHA 1: 50	Impulsy (Stimul. index) extrakty 20 μΙ	Impulsy (Stimul. index) extrakty 10 μΙ	Impulsy (Stimul. index) extrakty 5 μΙ
1	3236	3997	5949	9890 (3,0)	5179 (1,6)	4680 (1,14)
2	3462	4297	6288	8365 (2,4)	5340 (1,5)	4100 (1,18)
3	2384	4239	6857	7850 (3,2)	5100 (2,1)	4390 (1,8)
4	2222	4339	7600	7750 (4,48)	5060 (2,27)	4600 (2,07)
5	1890	3960	6010	7800 (4,1)	5960 (3,15)	3680 (1,94)

Výsledky uvedené v Tabulce 3 a na Obrázku 2 ukazují, že přídavek zvyšujících se množství spojených extraktů k suspensi lymfocytů pacientů trpících leukémií, má za následek zvyšující se množství transformace lymfocytů či blastogenese, což ukazuje zvýšený počet radiačních impulsů způsobený zvýšenou absorpcí ³H. Komposice rostlinného extraktu obsahující extrakt áronu, extrakt granátového jablka, extrakt ibišku a extrakt čaje způsobuje schopnost stimulovat transformaci lymfocytů, která je nejméně tak velká jako PHA. Stimulace zárodečné transformace vzrostla na 306 % Nejvyšší (20 μί) koncentrací·. Tyto výsledky ukazují, že komposice rostlinného extraktu obsahující extrakt áronu, extrakt granátového jablka, extrakt ibišku a extrakt čaje zesiluje nebo stimuluje buňkami zprostředkovávanou imunitu in vitro stimulací blastogenese a tedy výslednou sekreci cytokinů v lymfocytech pacientů trpících leukémií. Dále tyto výsledky ukazují, že komposice rostlinného extraktu podle vynálezu je užitečným zdrojem nebo kandidátem pro potenciální terapie a ošetřování poruch imunity.

Příklad 4

In vitro blastogenese periferních krevních lymfocytů u paciřítů s ledvinovým selháním

Tento příklad popisuje účinek komposice rostlinného extraktu obsahující extrakt áronu, extrakt granátového jablka, extrakt ibišku a extrakt čaje, popsané v příkladu 1 na buňkou zprostředkovanou imunitu, která byla dále stanovována in vitro zárodečnou transformací nebo blastogenesí lymfocytů u patnácti pacientů trpících ledvinovým selháním. Jako kontrola pro kalibraci nebo měření účinnosti spojených extraktů byl použit PHA (fytohemagglutinin) ve dvou koncentracích.

Mikrotitrační desky s mnoha jamkami byly upraveny tak, že obsahovaly suspensi lymfocytů patnácti pacientů s ledvinovým selháním v Hanksově soluci, doplněné 10 %-ním telecím plodovým sérem, penicilinem a streptomycinem. Do jamek každé z desek přidáno 5 μΙ, 10 μΙ a 20 μΙ spojené směsi extraktů áronu, granátového jablka, ibišku a čaje. Jako kontrola byl potom do jamek přidán PHA (fytohemagglutinin) v koncentracích 1 : 50 a 1 : 100. Konečný objem suspense lymfocytů v každé jamce byl 0,2 ml. Mikrotitrační desky byly inkubovány 72 hodin při 37 °C v CO2 inkubátoru, potom bylo do každé jamky přidáno 0,05 ml ³H (tritiovaného) thymidinu a následovala další inkubace 24 hodin při 37°C. Buňky byly sebrány automatickým hromadným sběračem a scintilačním počítačem byla změřena radioaktivita. Stimulační index byl vypočítán pro každou koncentraci spojených extraktů. Výsledky uvádí Tabulka 4 a Obrázek 3.

TABULKA 4

Pacient č.	Impulsy auto (kontrola)	Impulsy PHA 1: 100	Impulsy PHA 1: 50	Impulsy (Stimul. index) extrakty 20 μΙ	Impulsy (Stimul. index) extrakty 10 μΙ	Impulsy (Stimul. index) extrakty 5 μΙ
6	2050	4150	5090	7650 (3,7)	4535 (2,2)	4290 (2,09)
7	5232	6718	8350	9460 (1,81)	6240 (1,19)	5640 (1,08)

8	4643	5950	7980	9680 (2,08)	5980 (1,29)	5100 (1,10)
9	4150	5660	7790	8940 (2,15)	5710 (1,37)	5200 (1,25)
10	6939	7600	9800	10250 (1,4)	7800 (1,12)	7100 (1,02)
11	5765	6830	8910	10630 (1,8)	6920 (1,2)	5940 (1,03)
12	4531	5100	6030	7150 (1,57)	6120 (1,35)	5090 (1,12)
13	5920	5700	7080	7980 (1,30)	7030	5850 (0,9)
14	6203	6800	7503	8250 (1,30)	7105	6930 (0,89)
15	4539	5240	6015	7030 (1,548)	6090	5440 (1,19)
16	4605	5405	6250	7654 (1,66)	6320	5660 (1,229)
17	3260	4100	5209	6800 (2,805)	5400	4300 (1,319)
18	4620	5410	6430	7930 (1,71)	6250	5430 (1,175)
19	4330	5310	6100	7800 (1,801)	6050	5450 (1,25)
20	3236	4100	5260	7260 (2,24)	5380	4330 (1,338)

Výsledky uvedené v Tabulce 4 a na Obrázku 3 ukazují, že přídavek zvyšujících se množství spojených extraktů k suspensi lymfocytů pacientů s poruchami ledvin, má za následek zvyšující se množství transformace lymfocytů či blastogenese, což ukazuje zvýšený počet radiačních impulsů způsobený zvýšenou absorpcí ³H. Spojené extrakty áronu, granátového jablka, ibišku a čaje způsobují schopnost stimulovat transformaci lymfocytů, která je nejméně tak velká • · • φ φ · · · · φ · · φ φ ··· φ φ φφφφ φ φ φ φ · φ φ φφφφφφ φφφφφ φφ

1/ φφφφ φφ φφφ φφφφ φφ φφ jako ΡΗΑ. Stimulace zárodečné transformace vzrostla na 306 % nejvyšší (20 μΙ) koncentraci Tyto výsledky ukazují, že spojené extrakty áronu, granátového jablka, ibišku a čaje zesilují nebo stimulují buňkami zprostředkovávanou imunitu in vitro stimulací blastogenese a tedy výslednou sekreci cytokinů v lymfocytech pacientů s ledvinovým selháním. Dále tyto výsledky ukazují, že komposice rostlinného extraktu podle vynálezu je užitečným zdrojem nebo kandidátem pro potenciální terapie a ošetřování poruch imunity.

Příklad 5

Stimulace produkce cytokinů u normálních osob

Účinek komposice rostlinného extraktu obsahujícího extrakt áronu, extrakt granátového jablka, extrakt ibišku a extrakt čaje na produkci cytokinů lidskými periferními mononukleárními krevními buňkami (PMBC) byl měřen metodou, kterou popsali D. Schols a E. De Clencq v Human Immunodeficiency Virus Type gp120 Induces Anergy In Human Peripheral Blood Lymphocytes By Inducing Interleukin Production, J. Virol. sv. 70, str. 4953-4960 (1996), na jejíž obsah se zde odkazuje. Průměrné výsledky dvou normálních pacientů jsou uvedeny v Tabulce 5.

TABULKA 5

	% Spojených extraktů	IL-2 pg/ml	IL-4 pg/ml	IL-10 pg/ml	IFN-γ pg/ml
Medium	0%	<	nezjištěno	35	31
	10%	48	nezjištěno	502	197
	1%	<	nezjištěno	653	<
	0,1%	<	nezjištěno	232	<
PHA 2 pg/ml	0%	541	nezjištěno	178	969
	10%	1221	nezjištěno	471	926
	1%	585	nezjištěno	224	969
	0,1%	524	nezjištěno	203	740
a-CD3 1/1000	0%	370	nezjištěno	158	784

• · · » * «

• · · · · · ·

	10%	659	nezjištěno	475	605
	1%	272	nezjištěno	154	674
	0,1%	352	nezjištěno	139	590
PMA 10 ng/ml + Calo 1 ug/ml	0 %	1661	nezjištěno	<	1301
	10%	949	nezjištěno	<	1444
	1%		nezjištěno	<	1275
	0,1%		nezjištěno	<	1408

Jak je možno vidět v Tabulce 5 přítomnost komposice rostlinného extraktu obsahujícího extrakt áronu, extrakt granátového jablka, extrakt ibišku a extrakt čaje indukuje produkci podstatného množství interleukinu 10 (IL-10) a γ-interferonu (γ-IFN) než jsou hladiny vylučované v jamkách bez rostlinného extraktu. Interleukin 2 (IL-2) bylo možné detegovat v jamkách, kde byly spojené extrakty přítomny v koncentraci 10 %. Jak bylo zjištěno pomocí trypanové modři nebyla zaznamenána toxicita u kultury buněk při 10 % koncentraci spojených extraktů. Tyto výsledky ukazují, že spojené extrakty áronu, granátového jablka, ibišku a čaje zesilují nebo stimulují produkci cytokinů in vitro v PMBC normálních osob.. Dále tyto výsledky ukazují, že komposice rostlinného extraktu podle vynálezu je užitečným zdrojem nebo kandidátem pro potenciální terapie a ošetřování poruch imunity.

Příklad 6

Inhibice gp120 vazby na MT-4 buňky in vitro. Měřeno pomocí OKT-4A monoklonální protilátky.

Účinek komposice rostlinného extraktu obsahujícího extrakt áronu, extrakt granátového jablka, extrakt ibišku a extrakt čaje (spojené extrakty) na vazbu rgp120 na MT-4 buňky, jak bylo zjišťováno pomocí OKT-4A monoklonálních protilátek (mAb), byl určen metodou, kterou popsali J. Neyts, D. Reymen, D. Letourneur, J. Jozefonvicz, D. Schols, J. Este, G. Andrei, McKenna, M. Witvrouw, S. Ikeda, J. Clements a E. De Clercq v Differential Antiviral Activity of Derivatized Dextrans, Biochem. Pharmacol., sv. 50, str. 743-751 (1995), na jejíž obsah se zde • ·· « · · t * * · • · · · · · · ···· ·· ··· ···· ·· ·· odkazuje. Povlakový protein HIV gp120, který se váže na 0KT-4A epitop, blokuje kompetitivní vazbu 0KT-4A mAb. Spojené extrakty áronu, granátového jablka, ibišku a čaje blokují vazbu gp120 jak je ukázáno v Tabulce 6.

TABULKA 6

Vzorky v jamkách	OKT-4A mAb vazba (Relativní počet buněk)
Negativní kontroly	4
Positivní kontroly	600
gp120	7
50 % spojených extraktů	150
25 % spojených extraktů	100
12,5 spojených extraktů	90
6,25 % spojených extraktů	80
3,13 % spojených extraktů	30
1,57 % spojených extraktů	10
0,79 % spojených extraktů	8

Jak je možno vidět v Tabulce 6, vzrůstající množství komposice rostlinného extraktu obsahujícího extrakt áronu, extrakt granátového jablka, extrakt ibišku a extrakt čaje způsobuje zvýšenou inhibici vazby gp120 na MT-4 buňky. Tyto výsledky ukazují, že komposice rostlinného extraktu obsahující extrakt áronu, extrakt granátového jablka, extrakt ibišku a extrakt čaje . . je užitečným zdrojem nebo kandidátem pro potenciální anti-HIV terapie in vivo a ošetřování infikovaných hostitelů.

Příklad 7

Inhibice gp120 vazby na MT-4 buňky in vitro. Měřeno pomocí £/^^Ž?monoklonální protilátky.

Účinek komposice rostlinného extraktu obsahujícího extrakt áronu, extrakt granátového jablka, extrakt ibišku a extrakt čaje (spojené extrakty) na vazbu • · • ·· ♦ · · · • · · • · · · · » ····» ·· ·« rgp120 na MT-4 buňky, jak bylo zjišťováno pomocí monoklonálních protilátek (mAb), byl určen metodou, kterou popsali D. Schols, M. Baba, R. Pauwels a E. De Clercq v F/ow Cytometric Method To Demonstrate Whether Anti-HIV-1 Agents Inhibit Virion Binding To T4⁺ Celíš, na jejíž obsah se zde odkazuje. Spojené extrakty áronu, granátového jablka, ibišku a čaje blokují vazbu gp120, jak je ukázáno v Tabulce 7.

TABULKA 7

Vzorky v jamkách	Anti-gp 120 mAb vazba (Relativní počet buněk)
Negativní kontroly	4
Positivní kontroly	90
50 % spojených extraktů	60
10 % spojených extraktů	70
2 % spojených extraktů	40
0,4 % spojených extraktů	80
Dextran sulfát, 25 pg/ml (positivní kontrola)	50

Jak je možno vidět z tabulky, komposice rostlinného extraktu obsahujícího extrakt áronu, extrakt granátového jablka, extrakt ibišku a extrakt čaje inhibuje vazbu gp120 na MT-4 buňky. Tyto výsledky ukazují, že komposice rostlinného extraktu obsahující extrakt áronu, extrakt granátového jablka, extrakt ibišku a extrakt čaje je užitečným zdrojem nebo kandidátem pro potenciální anti-HIV terapie in vivo a ošetřování infikovaných hostitelů.

Příklad 8

Chemická analýza spojených extraktů

Pro zkoumání chemického složení komposice rostlinného extraktu obsahující extrakt áronu, extrakt granátového jablka, extrakt ibišku a extrakt čaje byly pro různé • · · • · · * ► · · vitaminy, tuky, barviva, proteiny, minerály a další sloučeniny použity konvenční analytické techniky. Tyto výsledky jsou shrnuty v Tabulce 8.

TABULKA 8

Předmět analýzy	Metoda	Výsledek
Celkový obsah tuku	Lyofilisace	3,689 g/10 ml
Obsah tuku, zbytek	Lyofilisace	3,50 g/100 ml
Obsah tuku, zbytek	Rotační odparka	4,83 g/100 ml
Nerozpustné podíly	Gravimetrie	0,198 g/100 ml
Obsah popele, vlhký 105°C	Gravimetrie	1,4 g/100 ml
Hodnota pH, nezředěno	Elekrometrie	5,20
Hodnota pH, 1:10/voda	Elekrometrie	5,47
Glycidy, celkem	Fotometrie	20 % v sušině
Makromolekuly	Gelová permeační chromatografie, gravimetrie	15 % v sušině
Proteiny celkem	Fotometrie	2,8 mg/100 ml
Polysacharidy, celkem	Fotometrie	7,8 % v sušině
Polysacharidy, nerozpustné	Fotometrie	0,1 % v sušině
Polysacharidy, rozpustné	Fotometrie	7,5 % v sušině
Nukleové kyseliny, celkem	Fotometrie	53,7 mg/100 ml
RNA	Fotometrie	28,4 mg/100 ml
DNA	Fotometrie	25,2 mg/100 ml
Polyfenoly	Fotometrie	<2 mg/100 ml
Lipidy, celkem	TLC	<0,1 %
Na	Zbarvení plamene	+++
K	Zbarvení plamene, KCIO4	+
Mg	Titanová žluť	++
Ca	Oxalát	++
Zn	Dithizon	+
Cu	Methocuproin	+
Fosfát	Molybdenát amonný	+++
Imunoglobulin A (IgA)	BIA s proteinovým G čipem, AC s jacalin sepharose	neprokazatelný

9 9 999

Imunoglobulin G (IgG)	BIA s imobilisovaným proteinem A	+
Imunoglobulin M (IgM)	BIA s imobilisovaným proteinem B	neprokazatelný
Imunoglobulin E (IgE)	Anti-lg na testovací desce	neprokazatelný
Adenosin	TLC	++
Guanosin	TLC	+
Thymidin	TLC	++
Ν,Ν-Dimethylguanosin	TLC	neprokazatelný
Adenin	TLC	+
Guanin	TLC	+
Cytosin	TLC	+
Thymin	TLC	+
Stearová kyselina	TLC	<1 mg/ml
Interleukin 4 (IL-4)	ELISA	34 pg/ml (NWG 50 pg/ml)
Interleukin 5 (IL-5)	ELISA	332 pg/ml (NWG 50 pg/ml)
Interleukin 6 (IL-6)	ELISA	69 pg/ml (NWG 30 pg/ml)
Interleukin 10 (IL-10)	ELISA	44 pg/ml (NWG 50 pg/ml)
Interleukin 12 (IL-12)	ELISA	1095 pg/ml (NWG 1000 pg/ml)
γ-lnterferon (IFN-γ)	ELISA	29 pg/ml (NWG 50 pg/ml)
Tumor nekrosis faktor a (TNFa)	ELISA	5,7 pg/ml (NWG 3 pg/ml)
Červená barva	UV/VIS	0,7 % sušiny
Zelená barva	UV/VIS	15,7 % sušiny
Žlutá barva	UV/VIS	<0,2 % sušiny
Modrá barva	UV/VIS	<0,1 % sušiny
Vitamin C	TLC, fotometricky	3 mg/100 ml
Vitamin E	TLC	+
Vitamin K	TLC	+
Vitamin D2	TLC	+
Vitamin D3	TLC	+
Endotoxiny	LAL test	14 IU

Jak je možno vidět z výsledků v Tabulce 8, komposice rostlinného extraktu obsahujícího extrakt áronu, extrakt granátového jablka, extrakt ibišku a extrakt čaje zahrnuje početné esenciální vitaminy včetně vitaminu C, vitaminu E, vitaminu K, vitaminu D2, vitaminu D3 stejně jako různé esenciální minerály a další blahodárně působící materiály a poskytuje tedy užitečný a nutriční dietní doplněk, když se orálně užívá.

Analytické výsledky uvedené v Tabulce 8 ukazují také, že v komposici rostlinného extraktu obsahujícího extrakt áronu, extrakt granátového jablka, extrakt ibišku a extrakt čaje jsou přítomny různé cytokiny a cytokinům podobné proteiny. Ve spojených extraktech áronu, granátového jablka, ibišku a čaje jsou zejména přítomna detegovatelná množství IL-4, IL-5, IL-6, IL-10, IL-12, IFN-γ, TNFa. Kromě toho se ukazuje, že v komposici rostlinného extraktu obsahujícího extrakt áronu, extrakt granátového jablka, extrakt ibišku a extrakt čaje jsou přítomny stopy IgG nebo imunoglobulinu podobný protein. Přítomnost lidského IL-4, IL-5, IL-6, IL-10, IL-12, IFN-γ, TNFa a IgG je poněkud nekonsistentní s rostlinným původem komposice rostlinného extraktu. Jsou však známy rostlinné protivirové faktory (AVF), které mají blízkou sekvenční homologii s lidským β-interferonem (INFp) a o nichž se má za to, že způsobují antivirovou aktivitu způsobem obdobným jako lidské interferony. Shora popsané positivní výsledky pro IL-4, IL-5, IL-6, IL-10, IL-12, IFN-γ, TNFa a IgG lze tedy přičíst interleukinům podobným proteinům, interferonům podobným proteinům, TNF podobným proteinům a imunoglobulinům podobným proteinům, které jsou přítomny v komposici rostlinného extraktu obsahujícího extrakt áronu, extrakt granátového jablka, extrakt ibišku a extrakt čaje. Tudíž označení komposice rostlinného extraktu obsahujícího extrakt áronu, extrakt granátového jablka, extrakt ibišku a extrakt čaje jak je zde používáno, mělo by být také chápáno jako zahrnující nebo obsahující IL-4, IL-5, IL-6, IL-10, IL-12, IFN-γ, TNFa a IgG stejně jako interleukinům podobné proteiny, interferonům podobné proteiny, TNF podobné proteiny a imunoglobulinům podobné proteiny.

Diskuse

Ze shora uvedené experimenty in vitro a výsledná data ukazují, že komposice rostlinného extraktu podle vynálezu je užitečným potenciálním zdrojem nebo kandidátem pro terapie zesilující imunitu a ošetřování lidí i zvířat trpící poruchami, • 0 00 Φ 00 00 00

0000 0000 0000 000 0 «0000

00 0 · · 000000

0 0 0 0 0 · 0000 00 000 0000 00 00 infekcemi nebo stavy chorob, včetně imunosupresivních stavů přičítaných leukémii, ledvinovému selhání, různým rakovinným onemocněním a nádorům, virovým infekcím, bakteriálním infekcím a parasitálním infekcím. Přesné(á) chemické(á) složení a farmakologický(é) mechanisnmus(y), jejichž výsledkem je stimulace zárodečné transformace a produkce cytokinů, stanovovány nebyly. Komposice rostlinného extraktu podle vynálezu může obsahovat jedinou farmakologicky účinnou ingredienci, komponentu nebo činidlo působící samotné, nebo spojení takových ingrediencí, komponent nebo činidel a/nebo biologické metabolity nebo jejich deriváty působící separátně nebo synergicky. In vivo terapie a ošetřování budou pravděpodobně založeny na ústně podávaných dávkách komposice rostlinného extraktu podle vynálezu v kapalné nebo tuhé formě. In vivo je rovněž možné podávání komposice rostlinného extraktu podle vynálezu rektálně, parenterálně, intravenosně, topicky, inhalací aerosolu nebo subkutánním způsobem. Komposice rostlinného extraktu může být in vivo podávána v příměsi nebo v kombinaci s vhodnými excipienty, nosiči, antivirovými činidly, imunitními modulátory, chemoterapeutickými činidly, protilátkami nebo jejich kombinacemi. Farmakologické preparáty podle vynálezu mohou mít jednotku dávky ve formě tablet, kapslí, čípků, ampulí anebo odměřovaných kapalných nebo aerosolových dávek.

V současné době se má za to, že farmakologicky účinná složka nebo složky podle vynálezu jsou přítomny v áronu a/nebo granátovém jablku. Počáteční pokusy naznačují, že samotný extrakt áronu, samotný extrakt granátového jablka a spojené extrakty áronu a granátového jablka mají určité imunitu zvyšující efekty. Avšak vhodné provedení vynálezu představují spojené extrakty áronu, granátového jablka stejně jako ibišku a čaje. Má se za to, že ibišek a čaj poskytují další složky nebo činidla, které působí jako excipienty nebo nosiče, nebo které spolu s komponentami poskytovanými áronem nebo granátovým jablkem mají synergický účinek. Kromě toho, preferovaný způsob získání komposice rostlinného extraktu obsahující extrakt áronu, extrakt granátového jablka, extrakt ibišku a extrakt čaje, při němž se spojené extrakty spolu zahřívají ve stupních popsaných v příkladu 1, je považován za výhodnější než pouhé míšení nebo spojování extraktu áronu, extraktu granátového jablka, extraktu ibišku a extraktu čaje navzájem bez dodatečného zahřívání.

Ze shora uvedené experimenty in vitro a výsledná data ukazují, že komposice rostlinného extraktu podle vynálezu je užitečným potenciálním zdrojem nebo kandidátem pro anti-HIV a další antivirové terapie a ošetřování lidí i zvířat trpících flfl flfl fl flfl • flfl fl · flflfl ♦ flflfl flfl fl flfl flfl flfl flfl* fl fl flfl fl fl · flflflfl fl flflflfl» flflfl flfl flfl flflflflflfl· flfl flfl

HIV, dalšími virovými infekcemi nebo komplikacemi či poruchami spojenými s takovými virovými infekcemi. Rostlinný extrakt podle vynálezu může potenciálně inhibovat nebo zabraňovat infekci buněk množstvím různých virů, včetně, ale ne jenom, virů herpes simplex, virů lidského papilomu (HPV), virů neštovic, virů vesikulární stomatftidy, coxsackie virů, syncyctiálních virů, cytomegaloviru, virů varicelly zoster. Anti-HIV aktivita rostlinného extraktu podle vynálezu může obsahovat jedinkou farmaceuticky aktivní ingredienci, složku nebo činidlo působící osamoceně, nebo spojení takových ingrediencí, složek nebo činidel a/nebo biologických metabolitů nebo jejich derivátů. In vivo terapie a ošetřování budou pravděpodobně založeny na ústně podávaných dávkách komposice rostlinného extraktu podle vynálezu v kapalné nebo tuhé formě. In vivo je rovněž možné podávání komposice rostlinného extraktu podle vynálezu rektálně, parenterálně, intravenosně, topicky, inhalací aerosolu nebo subkutánním způsobem. Jako ošetření při imunosupresivních léčeních může být komposice rostlinného extraktu in vivo podávána v příměsi nebo v kombinaci s vhodnými excipienty, nosiči, antivirovými činidly, imunitními modulátory, chemoterapeutickými činidly, protilátkami nebo jejich kombinacemi. Farmakologické preparáty podle vynálezu mohou mít jednotku dávky ve formě tablet, kapslí, čípků, ampulí anebo odměřovaných kapalných nebo aerosolových dávek.

V souhlase s tím je zřejmé, že tento vynález dává k disposici komposici rostlinného extraktu, která poskytuje doplněk výživy, který in vitro stimuluje buňkou zprostředkovanou imunitu, který in vitro stimuluje blastogenesi lymfocytů, který in vitro stimuluje produkci cytokinů lymfocyty, který in vitro inhibuje HIV infekci, a je (W&fco ťv Ji fe/ potenciálním kandidátem pro ošetřování a terapie zesilujícijimunitní odezvu u lidí i zvířat. Přestože shora uvedený popis obsahuje mnohé specifičnosti, nelze jej chápat jako omezující rozsah vynálezu, ale pouze jako poskytující ilustraci preferovaného provedení vynálezu v současné době. Rozsah vynálezu by měl být určován připojenými patentovými nároky a jejich legálními ekvivalenty.

Claims (38)

1. Komposice rostlinného extraktu pro stimulaci buňkou zprostředkovanéu imunity vyznačená tím, že obsahuje extrakt áronu.

2. Komposice rostlinného extraktu podle nároku 1 vyznačená tím, ž e obsahuje dále extrakt granátového jablka.

3. Komposice rostlinného extraktu podle nároku 1 vyznačená tím, že obsahuje dále extrakt ibišku.

4. Komposice rostlinného extraktu podle nároku 1 v y z načená tím, ž e obsahuje dále extrakt čaje.

5. Komposice rostlinného extraktu podle nároku 2 vyznačená tím, že obsahuje dále extrakt ibišku.

6. Komposice rostlinného extraktu podle nároku 2 vyznačená tím, ž e obsahuje dále extrakt čaje.

7. Komposice rostlinného extraktu podle nároku 5 vyznačená tím, ž e obsahuje dále extrakt čaje.

8. Komposice rostlinného extraktu pro stimulaci buňkou zprostředkované imunity vyznačená t í m, ž e obsahuje extrakt granátového jablka.

9. Komposice rostlinného extraktu podle nároku 8 vyznačená tím, ž e obsahuje dále extrakt ibišku.

10. Komposice rostlinného extraktu podle nároku 8 vyznačená tím, ž e obsahuje dále extrakt čaje.

11. Komposice rostlinného extraktu podle nároku 9 vyznačená tím, ž e obsahuje dále extrakt čaje.

............ - ------------------- ----- --' '' • 9 99 9 ·· ·♦ ·· *99» 9999 9999

9 99 9 999·· • · · · · · 9 999 9··

9 · · 9 9 · 9

27 .................

12. Způsob přípravy komposice rostlinného extraktu pro stimulaci buňkou zprostředkovávané imunity, vyznačený tím, že se skládá z následujících kroků:

a) příprava extraktu áronu vařením sušeného, jemně rozdrceného áronu ve vodě;

b) příprava extraktu granátového jablka vařením sušeného, jemně rozdrceného granátového jablka ve vodě; a

c) spojení řečeného extraktu áronu a řečeného extraktu granátového jablka a vaření řečených spojených extraktů áronu a granátového jablka.

13. Způsob přípravy komposice rostlinného extraktu podle nároku 12, vyznačený tím, že se skládá z následujících kroků:

a) příprava extraktu ibišku vařením sušeného, jemně rozdrceného ibišku ve vodě;

b) příprava extraktu čaje vařením sušeného, jemně rozdrceného čaje ve vodě; a

c) spojení řečeného extraktu ibišku a řečeného extraktu čaje s řečeným extraktem áronu a řečeným extraktem granátového jablka a vaření řečených spojených extraktů áronu, granátového jablka, ibišku a čaje.

14. Způsob stimulace buňkou zprostředkovávané imunity in vitro vyznačený tím, že zahrnuje kontakt buněk s účinným množstvím preparátu tvořeného v podstatě z extraktu áronu, extraktu granátového jablka, extraktu ibišku a extraktu čaje.

15. Způsob stimulace buňkou zprostředkovávané imunity in vitro podle nároku 14, vyznačený tím, že řečené buňky zahrnují buňky od normálních pacientů.

16. Způsob stimulace buňkou zprostředkovávané imunity in vitro podle nároku 14, vyznačený tím, že řečené buňky zahrnují buňky od pacientů trpících leukémií.

ΦΦ ΦΦ ► φ Φ 4 Φ ΦΦ Φ Φ 4

ΦΦ ·· *» φ φ ΦΦΦΦ Φ φφφφ φ Φ ΦΦΦ ΦΦΦ Φ · Φ φφφφ φφ ΦΦ

17. Způsob stimulace buňkou zprostředkovávané imunity in vitro podle nároku 14, vyznačený tím, že řečené buňky zahrnují buňky od pacientů trpících ledvinovým selháním.

18. Způsob stimulace blastogenese lymfocytů in vitro vyznačený tím, že zahrnuje kontakt suspensi lymfocytů s účinným množstvím preparátu tvořeného v podstatě z extraktu áronu, extraktu granátového jablka, extraktu ibišku a extraktu čaje.

19. Způsob stimulace buňkou zprostředkovávané imunity in vitro podle nároku 18 vyznačený tím, že řečené suspense lymfocytů obsahují lymfocyty od normálních pacientů.

20. Způsob stimulace buňkou zprostředkovávané imunity in vitro podle nároku 18 vyznačený tím, že řečené suspense lymfocytů obsahují lymfocyty od pacientů trpících leukémií.

21. Způsob stimulace buňkou zprostředkovávané imunity in vitro podle nároku 18 vyznačený tím, že řečené suspense lymfocytů obsahují lymfocyty od pacientů trpících ledvinovým selháním.

22. Způsob stimulace produkce cytokinů in vitro vyznačený tím, že zahrnuje kontakt periferních mononukleárních krvinek s účinným množstvím preparátu tvořeného v podstatě z extraktu áronu, extraktu granátového jablka, extraktu ibišku a extraktu čaje.

23. Způsob stimulace buňkou zprostředkovávané imunity in vitro podle nároku 22 vyznačený tím, že řečené periferní mononukleární krvinky jsou získány od normálních pacientů.

24. Způsob stimulace buňkou zprostředkovávané imunity in vitro podle nároku 22 vyznačený tím, že řečené periferní mononukleární krvinky jsou získány od pacientů trpících leukémií.

·· *· Φ ·· ·* «· • φ « · ·«·· · · · · • · Φ · * · · · «

25. Způsob stimulace buňkou zprostředkovávané imunity in vitro podle nároku 22 vyznačený tím, že řečené periferní mononukleární krvinky jsou získány od pacientů trpících ledvinovým selháním.

26. Způsob inhibice HIV infekce in vitro vyznačený tím, že zahrnuje kontakt buněk s účinným množstvím preparátu tvořeného v podstatě z extraktu áronu, extraktu granátového jablka, extraktu ibišku a extraktu čaje.

27. Způsob inhibice vazby gp120 na MT-4 buňky in vitro vyznačený tím, že zahrnuje kontakt MT-4 buněk s účinným množstvím preparátu tvořeného v podstatě z extraktu áronu, extraktu granátového jablka, extraktu ibišku a extraktu čaje.

28. Komposice rostlinného extraktu pro stimulaci buňkou zprostředkovávané imunity vyznačená tím, že obsahuje směs vodného extraktu áronu, vodného extraktu granátového jablka, vodného extraktu ibišku a vodného extraktu čaje.

29. Komposice rostlinného extraktu podle nároku 28 vyznačená tím, ž e řečená komposice obsahuje dále nejméně jeden cytokin.

30. Komposice rostlinného extraktu podle nároku 29 vyznačená tím, ž e řečený cytokin je interleukin.

31. Komposice rostlinného extraktu podle nároku 29 vyznačená tím, ž e řečený cytokin je interferon.

32. Komposice rostlinného extraktu podle nároku 28 vyznačená tím, ž e řečená komposice obsahuje dále nejméně jeden faktor nekrosy tumoru.

33. Komposice rostlinného extraktu podle nároku 28 vyznačená tím, ž e řečená komposice obsahuje dále nejméně jeden imunoglobulin.

•0 00 00

0 0 0 0

0 0 0 0

0 0 000 0«

00 00 ( · · · • 00

0 0 0 0

0 0 0 »000 00

00 00

34. Komposice rostlinného extraktu podle nároku 28 vyznačená tím, ž e řečená komposice obsahuje dále polysacharid.

35. Komposice rostlinného extraktu podle nároku 28 vyznačená tím, ž e řečená komposice obsahuje dále proteiny.

36. Komposice rostlinného extraktu podle nároku 28 vyznačená tím, ž e řečená komposice obsahuje dále RNA.

37. Komposice rostlinného extraktu podle nároku 28 vyznačená tím, ž e řečená komposice obsahuje dále DNA.

38. Komposice rostlinného extraktu podle nároku 28 vyznačená tím, ž e řečená komposice obsahuje přibližně stejné podíly řečených vodných extraktů.