CZ37081U1 - Antibakteriální fosfátový kostní cement - Google Patents

Description

Antibakteriální fosfátový kostní cement

Oblast techniky

Předmětem technického řešení je plně vstřebatelný, antibakteriální fosfátový kostní cement pro léčbu infikovaných defektů kostí obsahující biokeramickou a polymerní složku modifikovanou antibiotikem.

Dosavadní stav techniky

Kostní defekty s významnou ztrátou kostní hmoty, jako jsou otevřené zlomeniny, infekce kloubních náhrad a osteomyelitida, patří mezi nejobtížněji řešitelné komplikace v ortopedii a traumatologii. Ztráta kostní hmoty při hluboké infekci nebo při nutnosti radikálního debridementu představují stále složitý klinický problém. Navzdory vysokým klinickým a ekonomickým dopadům a navzdory významnému pokroku v pokročilém materiálovém výzkumu zůstává léčba těchto poranění neuspokojivá.

Již více než 60 let se v ortopedii používá akrylátový cement na bázi poly(methyl methakrylátu) (PMMA) nejčastěji jako kostní lepidlo pro fixace implantátů nebo jako dočasná či trvalá výplň dutin kostí. Kostní PMMA cement obohacený o antibiotika (ATB) je v současné době nezastupitelným prostředkem v prevenci a terapii infekcí pohybového aparátu. Antibiotikum vhodné k impregnaci cementu musí být termálně i chemicky stabilní, dostupné v práškové formě, baktericidní a širokospektré. Nesmí vyvolávat alergické reakce nebo rezistenci bakterií, a dále nesmí výrazně zhoršovat mechanické vlastnosti cementu. Antibiotikem impregnovaný kostní cement se užívá k léčbě a prevenci infekce kloubní náhrady, k léčbě osteomyelitidy i infikovaných defektů měkkých tkání, k výplni kostních defektů nebo k tvorbě nitrodřeňových cementových hřebů. Hlavními komplikacemi užití ATB cementů je potenciální toxicita antibiotik, indukce antibiotické rezistence a alergická reakce. PMMA/ATB díky kombinaci své pevnosti, tvárnosti a schopnosti vylučovat antibiotika do přilehlých tkání po určitou dobu v postupně se snižujících koncentracích zatím nebyl žádným materiálem předčen. Současný výzkum je zaměřen jak na další zefektivnění vlastností PMMA a ovlivnění farmakokinetiky i farmakodynamiky uvolňování antibiotik z cementu, tak i na hledání dalších materiálů, které by měly stejné výhody, a navíc byly biodegradabilní.

V současné době nejsou na trhu dostupné injektovatelné degradovatelné kostní cementy s přídavkem antibiotika. Nejvíce používané antibiotikum vankomycin lékaři nejčastěji aplikují ve dvou formách. Buď se přímo zamíchá do plniva síranu vápenatého (CaSO4) nebo do PMMA kostního cementu, který je sice injektovatelný, ale samotný materiál není degradovatelný a nelze zajistit postupné uvolňování antibiotika. Hlavní nevýhodou u CaSO4 (např. komerční materiál STIMULAN®) je jeho nízká mechanická pevnost a rychlá degradace, kdy dochází k rychlému uvolnění velkého množství antibiotika, a tedy skokovému nárůstu terapeutické dávky, která může být toxická. Navíc není možné tento materiál injektovat tenkou jehlou, většinou je implantován v podobě vytvrzených granulí s definovaným obsahem antibiotika. V případě PMMA kostního cementu dochází k vytvrzení materiálu za účasti polymerizační reakce exotermního charakteru, což má za následek rychlý nárůst teploty až do 120 °C. Hrozí zde tedy dvě rizika, a to jak poškození, až nekróza okolní tkáně v důsledku vysoké teploty vyvolané exotermní reakcí, tak i k poškození samotného antibiotika. Z těchto důvodů jsou často zapotřebí následné reoperace.

Současná omezení kalcium fosfátových cementů (CPC) používaných v oblasti regenerace kostí jsou v jejich křehkosti, špatné injektovatelnosti, rozpadu v tělesných tekutinách (nízké koheze) a pomalé biologické rozložitelnosti.

- 1 CZ 37081 U1

Podstata technického řešení

Předmětem předkládaného technického řešení je vstřebatelný, injektovatelný, porézní kostní cement s řízenou dobou degradace obsahující jako biokeramickou práškovou matrici fosforečnan vápenatý, a dále obsahující vodný roztok kopolymeru na bázi kyseliny polymléčné, polyglykolové a polyethylenglykolu. Další složkou cementu je antibiotikum vhodné k léčbě osteomyelitidy, vybrané ze skupiny oxacilin, ampicilin, klindamycin, gentamicin, vankomycin a daptomycin.

Vylepšení vlastností kostního cementu spočívá v přídavku termosenzitivního, biologicky odbouratelného, tixotropního kopolymeru na bázi kyseliny polymléčné, polyglykolové a polyethylenglykolu (PLGA-PEG-PLGA), který podléhá gelovatění za fyziologických podmínek.

Obvykle příprava kostního cementu probíhá tak, že se ve vodném roztoku polymeru rozpustí antibiotikum, a přidá se práškový fosforečnan vápenatý. Po ručním či elektrickém smísení složek je kostní cement injektovatelný jehlou, s dobou tuhnutí cca 5 až 15 minut. Antibiotikum se z takového kostního cementu uvolňuje postupně a zachovává se jeho účinnost.

Výhodou je možnost jednoduché a přímé aplikace kostního cementu pomocí injekční stříkačky do asymetrické infekční rány, cílené na léčbu osteomyelitidy. Kostní cement s antibiotikem postupně antibiotikum uvolňuje, léčí infekci, a zároveň je postupně odbouráván přímo v těle na netoxické produkty a postupně je přetvářen novou kostní tkání.

Polymer se vnáší do kostních cementů ve formě vodného roztoku o koncentraci od 10 do 30 % hmotn. Jako rozpouštědlo může být použita voda, případně další hypotonické, izotonické a hypertonické roztoky, jakými jsou fyziologický roztok (0,9% (hmotn./obj.) vodný roztok NaCl), Hartmannův roztok, Ringerův roztok, Hankův roztok, Plasmalyte roztok, Ringerfundin, Darrowův roztok, pufry.

S výhodou je jako kopolymer použit blokový kopolymer (D,L-polylaktid-co-polyglykolid)-b-polyethylenglykol-b-(D,L-polylaktid-co-polyglykolid) (PLGA-PEG-PLGA), kde je při obecném vzorci (PLAx/PGAy)-PEGz-(PLAx/PGAy) polymerační stupeň z pro PEG v rozmezí 22 až 35, 2x pro LA v rozmezí 16 až 41 a 2y pro GA v rozmezí 6 až 18, zvláště pak tento kopolymer s polymerizačním stupněm z (PEG) = 34, 2x (LA) = 20 a 2y (GA) = 6, tj. hmotnostním poměrem PLGA/PEG = 2,5 a molárním poměrem LA/GA = 3,0.

Zvláště výhodné je použití kopolymeru na bázi kyseliny polymléčné, polyglykolové a polyethylenglykolu v koncentraci 15 % hmotn. při použití fyziologického roztoku (0,9% (hmotn./obj.) vodný roztok NaCl) jako rozpouštědla.

Vodný roztok kopolymeru je zde označován také jako kapalná fáze.

Do kapalné fáze se při přípravě kostního cementu vnáší antibiotikum vhodné k léčbě osteomyelitidy. Alternativně se antibiotikum může vnést do práškové fáze přímo před zamícháním kostního cementu. Jako antibiotika mohou být použita antibiotika proti grampozitivním i gramnegativním bakteriím, především ale proti bakteriím vyskytujícím se u kostních infekcí, jakou jsou methicilin-rezistentní Staphylococcus aureus (MRSA), S. epidermidis, kmeny Streptococcus a Pseudomonas aeruginosa.

Zejména vhodná koncentrace antibiotika v kostním cementu je od 0,5 do 10 % hmotn. S výhodou je koncentrace antibiotika od 1 do 5 % hmotn. vztaženo na celou hmotnost kostního cementu, nejvýhodnější koncentrace je 1 %. hmotn.

Výhodné je použití antibiotika vankomycin vneseného do kostního cementu v kapalné fázi.

- 2 CZ 37081 U1

Prášková fáze (matrice) je založena na biokeramice, tedy fosforečnanu vápenatém. Pod pojmem fosforečnan vápenatý se míní bezvodá forma i hydráty fosforečnanu vápenatého. S výhodou je fosforečnan vápenatý vybrán z forem:

alfa-fosforečnan trivápenatý (alfa-TCP, n-Ca3(PO4)2, Ca/P = 1,5), beta-fosforečnan trivápenatý (beta-TCP, β-Ca3(PO4)2, Ca/P = 1,5), amorfní fosforečnan vápenatý (ACP, CaxHy(PO4)z.nH2O, kde n = 3-4,5, 15-20% H2O, Ca/P = 1,2-2,2) a jejich směsi. Pro dané použití má prášková matrice velikost částic v rozmezí 1 až 100 mikrometrů.

Prášková matrice s výhodou obsahuje čistý alfa-fosforečnan trivápenatý, může obsahovat i beta fázi v hmotnostním poměru 1:4 (alfa:beta) až 1:6.

Fosforečnan vápenatý má s výhodou velikost částic do 200 mikrometrů, výhodněji v rozmezí 1 až 200 mikrometrů.

Vstřebatelný kostní cement se připraví ručním či elektrickým smísením kapalné a práškové fáze tak, že výsledný kostní cement je injektovatelný jak samotnou injekční stříkačkou, tak tenkou jehlou (do velikosti 26G) s dobou tuhnutí 5 až 15 minut. Hmotnostní poměr kapalné a práškové fáze (L/P) se může pohybovat v rozmezí 0,3 až 0,65. S výhodou pak pro aplikaci injekční jehlou 26G je použití hmotnostního poměru kapalné a práškové fáze v rozmezí 0,5 až 0,6.

Předmětem předkládaného technického řešení je dále sada pro přípravu kostního cementu, která obsahuje:

- kopolymer na bázi kyseliny polymléčné, polyglykolové a polyethylenglykolu, popřípadě ve formě vodného roztoku,

- fosforečnan vápenatý,

- antibiotikum vybrané ze skupiny oxacilin, ampicilin, klindamycin, gentamicin, vankomycin a daptomycin.

Příklady uskutečnění technického řešení

Obecný postup přípravy kostního cementu

Kostní cement byl připraven smícháním kapalné (L) a práškové (P) fáze v poměru L/P = 0,5. Kapalnou fázi představuje roztok triblokového kopolymeru na bázi degradovatelné kyseliny polymléčné (PLA) a polyglykolové (PGA) a rozpustného poly(ethylen glykolu) (PLGA-PEG-PLGA) o koncentraci 15 % hmotn. Jako rozpouštědlo byl použit fyziologický roztok (0,9% (hmotn./obj.) NaCl). Triblokový kopolymer s teoretickou molekulovou hmotností 5250 g^mol ¹ byl připraven při 130 °C polymerací za otevření kruhu pod inertní atmosférou (dle Vojtova L. et al: Int. J. Mol. Sci. 2019, 20(2), 391; https://doi.org/10.3390/ijms20020391). Jako prášková fáze byl použit komerčně dostupný alfa-fosforečnan trivápenatý (TCP) s velikostí částic do 200 mikrometrů. Ve srovnávacích příkladech nebylo přidáno antibiotikum, v příkladech odpovídajících technickému řešení bylo antibiotikum vankomycin přidáváno do kapalné fáze. Kostní cement byl připraven smísením kapalné fáze a pevné fáze a homogenizací.

Z připravené směsi bylo připraveno 10 vzorků. Směs byla nadávkována ve stejném objemu injekční stříkačkou do mikrozkumavky typu Eppendorf s kulatým dnem a vzorek byl předvytvrzen ve vlhku v inkubátoru při 37 °C po dobu 45 minut. Poté byl vzorek zalit 3 ml temperovaného fosfátového pufru s pH 7,4 (PBS) a vytvrzován při 37 °C v časových intervalech (1, 3, 6, 10 hodin

- 3 CZ 37081 U1 a 1, 2, 3, 4, 7 a 21 dní). V jednotlivých intervalech bylo pokaždé odebráno celé množství PBS a ke vzorkům bylo napipetováno 3 ml nového temperovaného PBS.

Pro jednotlivé příklady uvádíme tabulku s informacemi o homogenizaci a obsahu antibiotika. Příklady A a B jsou srovnávací příklady a nespadají do rozsahu technického řešení.

Příklad	Homogenizace	Obsah vankomycinu (% hmotn.)
A	ruční míchání špachtlí, 30 sekund	—
B	elektrický šlehač 5000 ot/min, 20 sekund	—
1	ruční míchání špachtlí, 30 sekund	1 % hmotn.
2	elektrický šlehač 5000 ot/min, 20 sekund	1 % hmotn.
3	elektrický šlehač 10 000 ot/min, 20 sekund	1 % hmotn.
4	elektrický šlehač 5000 ot/min, 20 sekund	0,5 % hmotn.
5	elektrický šlehač 5000 ot/min, 20 sekund	3 % hmotn.

Připravené materiály byly dále podrobeny dalším testům a charakterizacím:

U Příkladu A a Příkladu B byl sledován vliv způsobu míchání na konzistenci cementové pasty při její aplikaci (dynamická viskozita), a dále pak porozita výsledného kostního cementu.

Dynamická viskozita byla měřena pomocí rotačního reometru ARES G2 (TA Instruments) s geometrii deska-deska s průměrem 20 mm a Peltierovou deskou. Mezera měření byla nastavena na 1000 μm. Měření probíhalo po dobu 60 minut při 23 °C v lineární frekvenční oblasti (1 Hz) a aplikaci nízké hodnoty deformace (0,5 %). Výsledky dynamické viskozity v čase 0, 10 a 60 minut jsou znázorněny v Tabulce 1. V případě Příkladu B (kostní cement míchaný elektrickým šlehačem při 5000 otáčkách) vzrostla dynamická viskozita oproti Příkladu A (míchaným ručně) 6x, 3^X a 1,8x v časech 0, 10 a 60 minut.

Tabulka 1: Dynamická viskozita kostních cementů Příkladu A a Příkladu B po zamíchání ručně a elektrickým šlehačem při 5000 otáčkách.

Dynamická viskozita (kPa.s)
Příklad/ čas (min)	0	10	60
Příklad A	3,5	32,9	86,7
Příklad B	20,7	97,9	152,9

Porozita byla stanovena pomocí pocítačové mikrotomografie (mikro-CT) a pomocí ImageJ programu. U Příkladu B, kdy se vzorek míchal elektrickým šlehačem při 5000 otáčkách, rychlé míchání zvýšilo porozitu vzorku 1,5^x na hodnotu 15,4±1,6 % ve srovnáním s ručním mícháním (Příklad A), kde byla porozita 10,2±1,6 %.

Způsob homogenizace ovlivňuje konzistenci cementové pasty a pórovitost výsledného kostního cementu, což má i vliv na případné uvolňování přidaných antibiotik a resorpci materiálů. Při všech testovaných parametrech však jsou materiály vhodné pro použití jako kostní cementy.

U Příkladu B a Příkladu 2 byl pomocí rentgenové práškové difrakce (Rigaku SmartLab 3kW, Rigaku, Japonsko) sledován vliv přídavku antibiotika na přeměnu původní práškové fáze (α-TCP) na hydroxyapatit s deficitem vápníku v časových intervalech 1, 2, 3, 7 a 14 dní. Difrakční obrazce byly měřeny od 5° do 50°. Z intenzit vybraných píků byla vypočtena konverze, která je znázorněna v Tabulce 2. Z hodnot je zřejmé, že přídavek antibiotika nemá vliv na výslednou konverzi, která po 2 týdnech dosáhla 97,5 %.

- 4 CZ 37081 U1

Tabulka 2: Procentuální konverze α-TCP na CDHA v čistém kostním cementu (Příklad B) a v kostním cementu s 1 % hmotn. antibiotika (Příklad 2).

Čas	Konverze hydroxyapatit s deficitem vápníku (%)
Příklad B	Příklad 2
1 den	70,6	68,9
2 dny	78,2	77,3
3 dny	83,5	80,0
Čas	Konverze hydroxyapatit s deficitem vápníku (%)
Příklad B	Příklad 2
7 dní	96,0	95,3
14 dní	97,4	97,5

U Příkladu 1, Příkladu 2 a Příkladu 3, kostních cementů s přídavkem 1 % hmotn. antibiotika míchaných ručně a elektrickým šlehačem při 5000 a 10000 otáčkách/min byl sledován vliv míchání kostních cementů na konzistenci připravené cementové pasty, uvolňování antibiotika a porozitu vytvrzených kostních cementů.

V případě cementové pasty míchané ručně pomocí špachtle (Příklad 1), byla výsledná cementová pasta před aplikací kašovité konzistence. Výsledná struktura u cementové pasty míchané elektrickým šlehačem při 5000 otáčkách (Příklad 2) byla výrazně hladší. Cementová pasta připravena při otáčkách 10000 (Příklad 3) byla měkká a měla poněkud tekutější charakter.

Uvolňování antibiotika bylo sledováno pomocí UV/Vis spektroskopie z výluhů odebraných v určených intervalech (Tabulka 3). Pro každý typ bylo připraveno 10 vzorků. Po zalití připraveného vzorku 3 ml temperovaného fosfátového pufru s pH 7,4 (PBS) a vytvrzování při 37 °C bylo v jednotlivých intervalech (1, 3, 6, 10 hodin a 1, 2, 3, 4, 7 a 21 dní) odebráno celé množství PBS (eluční medium) a ke vzorkům bylo napipetováno 3 ml nového temperovaného PBS. Uvolňování antibiotika bylo sledováno měřením absorbance elučního média při 280 nm pomocí spektrofotometru Jasco V-730. Eluční médium a roztok PBS, který sloužil jako slepý pokus, byly měřeny ve vysoce přesné spektrofotometrické kyvetě Hellma vyrobené z křemene Suprasil se světelnou dráhou 10 mm. Pro měření byla použita deuteriová lampa. Fixní vlnová délka a režimy absorpce UV/Vis byly nastaveny s časovým intervalem 0,24 s. Kalibrační křivka byla měřena v rozmezí koncentrací 0 až 200 pg/ml. Výsledné hodnocení, kdy se zjistilo, jaké množství (%) antibiotika se uvolnilo z celkového množství antibiotika ve vzorku v určitých časových intervalech, bylo provedeno kumulativní metodou a hodnoty byly získány pomocí Lambert-Beerova zákona.

Tabulka 3: Množství uvolněného vankomycinu v závislosti na čase

Čas	Uvolněné antibiotikum (%)
	Příklad 1	Příklad 2	Příklad 3
0 h	0	0	0
1 h	14,9 ± 2,8	15,9 ± 3,2	22,1 ± 4,1
3 h	21,4 ± 3,5	22,9 ± 4,3	32,2 ± 3,7

- 5 CZ 37081 U1

Čas	Uvolněné antibiotikum (%)
	Příklad 1	Příklad 2	Příklad 3
6 h	23,2 ± 2,8	27,0 ± 5,8	33,5 ± 3,5
10 h	23,8 ± 2,8	27,5 ± 5,8	36,7 ± 5,9
1 d	26,8 ± 2,7	34,0 ± 6,1	40,5 ± 5,5
2 d	42,4 ± 3,2	49,6 ± 5,5	54,3 ± 4,9
3 d	55,6 ± 3,3	60,9 ± 5,0	64,2 ± 4,4
7 d	78,0 ± 4,1	80,1 ± 5,6	81,0 ± 4,6
21 d	89,0 ± 5,3	89,4 ± 6,2	92,9 ± 4,9

Z Tabulky 3 je patrné, že typ míchání cementové pasty má mírný vliv na množství uvolněného antibiotika během prvních hodin. Mezi ručním mícháním a mícháním elektrickým šlehačem při 5000 otáčkách není významnější rozdíl oproti vzorkům, které byly připraveny při 10000 otáčkách. Od 1 do 3 dnů je patrné, že nejpomaleji (v nejmenším množství) se uvolňuje antibiotikum ze vzorků míchaných ručně, následně pak při 5000 a 10000 otáčkách. Od 7 dne není významný rozdíl mezi jednotlivými typy. Po 21 dnech se uvolní ze vzorků přibližně 90 % antibiotika.

Porozita připravených kostních cementů byla stanovena pomocí počítačové tomografie (HeliScan, Thermofisher) a vypočítána z 2D snímků pomocí ImageJ programu. Srovnání je znázorněno v Tabulce 4. U kostního cementu míchaného ručně (Příklad 1) a elektrickým šlehačem při 5000 otáčkách (Příklad 2) porozita vzrostla jen mírně z 8,1 % na 10,9 %, oproti kostnímu cementu míchaného elektrickým šlehačem při 10000 otáčkách (Příklad 3) s porozitou 15,1 %.

Tabulka 4: Vliv způsobu homogenizace kapalné a práškové fáze na velikost pórů a porozity vytvrzeného kostního cementu.

Srovnání	Míchání	Velikost pórů (um)	Porozita (%)
Příklad 1	manuálně	117,1 ± 54,2	8,1 ± 2,2
Příklad 2	5000	89,6 ± 24,2	10,9 ± 0,9
Příklad 3	10000	67,2 ± 4,9	15,1 ± 1,2

U Příkladu 4, Příkladu 2 a Příkladu 5, kostních cementů míchaných elektrickým šlehačem při 5000 otáčkách/min s přídavkem 0,5; 1 a 3 % hmotn. antibiotika byl sledován vliv koncentrace antibiotika na jeho uvolňování (Tabulka 5).

Tabulka 5: Množství uvolněného vankomycinu v závislosti na čase a koncentraci antibiotika

Čas	Množství uvolněného antibiotika (%)
	Příklad 4	Příklad 2	Příklad 5
0 h	0	0	0
1 h	11,7 ± 2,3	15,9 ± 3,2	11,0 ± 4,5
3 h	32,1 ± 10,5	22,9 ± 4,3	18,8 ± 2,2
6 h	35,4 ± 9,3	27,0 ± 5,8	19,2 ± 2,5
10 h	35,8 ± 9,1	27,5 ± 5,8	20,1 ± 3,3
1 d	40,6 ± 8,5	34,0 ± 6,1	23,9 ± 6,3
2 d	44,8 ± 7,5	49,6 ± 5,5	33,6 ± 6,2
3 d	46,7 ± 7,0	60,9 ± 5,0	42,0 ± 6,1
7 d	48,6 ± 6,0	80,1 ± 5,6	55,0 ± 6,4
21 d	52,7 ± 5,4	89,4 ± 6,2	68,2 ± 3,5

- 6 CZ 37081 U1

Množství antibiotika má vliv na rychlost jeho uvolňování z kostního cementu. Uvolňování antibiotika z kostních cementů odpovídá dvěma fázím. V první fázi (do 10 h), která je obecně popsána jako vyplachování antibiotika spojené s jeho uvolňováním z povrchu cementu, nejprve došlo k nárazovému uvolnění a rychlost první fáze byla nepřímo závislá na koncentraci - rychlejší uvolňování bylo u nižší koncentrace. Naopak druhá fáze byla významnější při vyšších koncentracích antibiotika. Vliv koncentrace léčiva na množství uvolněného VCM je zřejmý z Tabulky 3. Navzdory nižšímu procentu uvolňování léčiva má Příklad 5 s 3 % hmotn. antibiotika podobný kinetický profil jako v Příkladu 2 (1 % hmotn.). Obě koncentrace vykazují kinetické uvolňování prvního řádu. Nejnižší 0,5 % hmotn. koncentrace antibiotika (Příklad 4) připomíná kinetickou reakci druhého řádu. Uvolňování vankomycinu z kostního cementu s 3 % hmotn. antibiotika (Příklad 5) probíhá ve dvou fázích. V první fázi se léčivo uvolňuje z povrchu kostního cementu. V této fázi bylo během prvních 12 hodin uvolněno 20,1 % antibiotika. Ve druhé fázi se začne léčivo uvolňovat stávajícími póry. Tato fáze je zpočátku rychlejší a množství uvolňování se zvyšuje na 50,5 %. Ve druhé fázi nastává plato, až do 96. hodiny, kdy začíná degradovat polymer a dochází k uvolňování dalšího ATB. Po 21 dnech došlo k uvolnění 68,2 % antibiotika. Rychlost uvolňování antibiotika u Příkladu 2 (1 % hmotn. antibiotika) se během experimentu postupně zvyšovala, ale většina antibiotika bylo uvolněno po 7 dnech. Zatímco při nejvyšší koncentraci (Příklad 5) se hodnota neustálila ani po 21 dnech. U Příkladu 4 (0,5 % hmotn. antibiotika) došlo ke skokovému uvolnění antibiotika v prvních 24 h (40,6 %), postupně pokračovalo s difúzí a degradací na 52,7 %. Koncentrace antibiotika zde dosáhla maxima po 3 dnech, poté již nedošlo k významnému zvýšení.

U Příkladu B, Příkladu 4, Příkladu 2 a Příkladu 2 (s koncentracemi antibiotika 0; 0,5; 1 a 3 % hmotn.) byla sledována diskovou difúzní metodou antibakteriální aktivita injektovatelných kostních cementů. Pro danou metodu byly zvoleny bakteriální kmeny Staphylococcus aureus (CCM 4223) SA - kontrolní antibiotikum penicilín, Escherichia coli (CCM 3954) EC - kontrolní antibiotikum amoxycilin a methicilin rezistentní Staphylococcus aureus (CCM 7110) MRSA kontrolní antibiotikum vankomycin. Bakteriální kultury byly zředěny na 1 až 2*108 CFU/ml (kolonie formující jednotky/ml) ve fyziologickém roztoku a naneseny na připravené Petriho misky s MH agarem. Na misky s bakteriální kulturou byly vzorky aplikovány injekční stříkačkou a následně upraveny do požadovaného tvaru disku. Petriho misky byly inkubovány při 37 °C 18 h. Následně byly odečteny průměry vzorků a vzniklých inhibičních zón se vzorky a tyto hodnoty byly přepočítány na inhibiční zóny v mm. Výsledky jsou shrnuty v Tabulce 6.

Tabulka 6: Vliv koncentrace vankomycinu na inhibiční zony proti bakteriálním kmenům SA, MRSA a EC.

Vzorek	Koncentrace ATB (hmotn.%)	Bakteriální kmen / Inhibiční zóna (mm)
SA	MRSA	EC
Příklad B	0	0	0	0
Příklad 4	0,5	6,62 ± 0,15	8,15 ± 0,08	0,54 ± 0,07
Příklad 2	1	7,25 ± 0,36	8,35 ± 0,21	1,35 ± 0,10
Příklad 5	3	8,16 ± 0,48	9,49 ± 0,12	3,43 ± 0,42
	kontrola	4,91 ± 0,05	5,51 ± 0,10	8,08 ± 0,13

Z tabulky je zřejmě, že koncentrace 0,5 % hmotn. vankomycinu (Příklad 4) je účinná vůči bakteriálních kmenům SA a MRSA, a dostatečně účinná i pro bakteriální kmen EC od koncentrace 1 % hmotn. vankomycinu (Příklad 2). Samotný injektovatelný kostní cement (Příklad B) není antibakteriální vůči sledovaným kmenům.

- 7 CZ 37081 U1

Průmyslová využitelnost

Technické řešení se týká plně vstřebatelného, injektovatelného antibakteriálního fosfátového kostního cementu pro rychlou léčbu a regeneraci infikovaných defektů kostí obsahující 5 biokeramickou a polymerní složku modifikovanou antibiotikem. Antibakteriální fosfátový kostní cement je určen pro klinické použití v traumatologii, ortopedii či stomatologii pro vyplnění defektu po odstranění infekční kosti např. po úrazu, po extrakci nádoru, po reoperaci endoprotézy, vlivem degenerativních změn atd.

Claims (8)

1. Antibakteriální fosfátový kostní cement, vyznačující se tím, že obsahuje fosforečnan vápenatý, vodný roztok kopolymeru na bázi kyseliny polymléčné, polyglykolové a polyethylenglykolu, a antibiotikum vhodné k léčbě osteomyelitidy, vybrané ze skupiny oxacilin, ampicilin, klindamycin, gentamicin, vankomycin a daptomycin.

2. Kostní cement podle nároku 1, vyznačující se tím, že vodný roztok kopolymeru má koncentraci v rozmezí od 10 do 30 % hmotn., přičemž vodné rozpouštědlo je vybráno ze skupiny voda, fyziologický roztok, Hartmannův roztok, Ringerův roztok, Hankův roztok, Plasmalyte roztok, Ringerfundin, Darrowův roztok, a pufry.

3. Kostní cement podle nároku 1 nebo 2, vyznačující se tím, že kopolymerem je blokový kopolymer (D,L-polylaktid-co-polyglykolid)-b-polyethylenglykol-b-(D,L-polylaktid-co-polyglykolid), kde je při obecném vzorci (PLAx/PGAy)-PEGz-(PLAx/PGAy) polymerační stupeň z pro PEG v rozmezí 22 až 35, 2x pro LA v rozmezí 16 až 41 a 2y pro GA v rozmezí 6 až 18, obzvláště tento kopolymer s polymerizačním stupněm z (PEG) = 34,

2x (LA) = 20 a 2y (GA) = 6, tedy hmotnostním poměrem PLGA/PEG = 2,5 a molárním poměrem LA/GA = 3,0.

4. Kostní cement podle kteréhokoliv z nároků 1 až 3, vyznačující se tím, že koncentrace antibiotika v kostním cementu je od 0,5 do 10 % hmotn., s výhodou je koncentrace antibiotika v kostním cementu od 1 do 5 % hmotn. , vztaženo na celou hmotnost kostního cementu.

5. Kostní cement podle kteréhokoliv z nároků 1 až 4, vyznačující se tím, že fosforečnan vápenatý je vybrán z forem: alfa-fosforečnan trivápenatý, beta-fosforečnan trivápenatý, amorfní fosforečnan vápenatý a jejich směsi.

6. Kostní cement podle kteréhokoliv z nároků 1 až 5, vyznačující se tím, že fosforečnan vápenatý má velikost částic do 200 mikrometrů.

7. Kostní cement podle kteréhokoliv z nároků 1 až 6, vyznačující se tím, že hmotnostní poměr vodného roztoku kopolymeru vůči fosforečnanu vápenatému je v rozmezí 0,3 až 0,65.

8. Sada pro přípravu kostního cementu podle kteréhokoliv z nároků 1 až 8, vyznačující se tím, že obsahuje:

- kopolymer na bázi kyseliny polymléčné, polyglykolové a polyethylenglykolu, popřípadě ve formě vodného roztoku,

- fosforečnan vápenatý,

- antibiotikum vybrané ze skupiny oxacilin, ampicilin, klindamycin, gentamicin, vankomycin a daptomycin.