CZ333499A3 - Promotory viru Chlorella - Google Patents

Abstract

Promotorové sekvence získané z Chlorella viru, genové konstrukty zahrnující promotorovou sekvenci vynálezu operačně připojenou kDNA sekvenci kódující strukturní gen. Dále se popisují vektory a hostitelské buňky pro expresi produktu kódovaného strukturním genemgenového konstruktu a buňky transformované heterolognímgenem operačně spojenýmk promotora

Description

hmvoofbty yi/uc tblordhv

Chlor&llst- virové· promotory

-333V 3

Oblast techniky

Tento vynález se týká nových promotorů izolovaný**, z Chlorella viru. Nové promotory jsou užitečné pro expresi heterolognich genů v hostitelských buňkách.

Dosavadní stav techniky

Genetické inženýrství umožňuje izolaci strukturního genu z jednoho organismu a expresi tohoto genu v jiném organismu. Exprese genu zahrnuje jak transkripci nukleové kyseliny do mRNA tak translaci mRNA - syntézu proteinu. Aby byl strukturní gen exprimován v novém organismu, musí být tento gen připojen k regulační sekvenci ve správné poloze pro signál k transkripci genu. Regulační sekvence obecně zahrnuje promotorovou sekvenci před strukturním genem (proti směru transkripce - upstream). Promotorové sekvence je sekvence DNA, která řídí transkripci strukturního genu. Sekvence nukleové kyseliny strukturního genu je transkribována do mediátorové RNA (messenger RNA - mRNA) a potom translatovaná do sekvence aminokyselin charakteristických pro specifický polypeptid nebo protein. Promotorové sekvence je typicky umístěná na 5' oblasti genu, před místem začátku transkripce strukturního genu.

Promotor může být indukovatelný nebo konstitututivní. Aktivita indukovatelného promotoru se zvýší jako odpověď na indukční činidlo a tím se také zvýší rychlost transkripce operabilně připojené kódující sekvence. Naproti tomu rychlost transkripce genu pod řízením konstitutivního promotoru není regulována. Je ale nutné uvést, že konstitutivní promotor se může změnit na indukovatelný promotor přidáním operátorové sekvence. Například lac operátor se přidá k T7promotoru bakteriofága a změní se tím z konstitutivního promotoru na promotor indukovatelný IPTG. (Rosenberg, et al. U.S. Patent No. 4 952 496). I když nejsou konstitutivní promotory pod řízením (control) indukčních Činidel, některé přesto poskytují vyšší hladiny transkripce než jiné. Vysoce aktivní promotory poskytující vysokou 1 • · • ·· ·· ···· »«

« · f · « I « » ( I • · » · · · · · « ·· • ·· ·· ·· ··· ·· « · úroveň transkripce genu můžou mít důležitou výhodu při komerční produkci genového produktu.

Obecně je schopnost promotoru řídit transkripci mimo svého přirozeného hostitele různá. Navíc rychlost transkripce určitého promotoru se může také lišit podle daného hostitele, ve kterém promotor funguje. Proto jsou potřebné nové promotory s vysokou úrovní transkripce v širokém spektru hostitelů.

Chlorella viry jsou skupinou virů, které infikují některé kmeny jednobuněčných eukaryotických zelených řas podobných Chlorella. (Van Etten, 1995, Mol. Cells. 5:99-106; Van Etten, et al., 19991, Microbiol. Rev. 55:586-620). Tyto viry patří mezi největší a nejkomplexnější známé viry; většinou tvoří mnohostěny o průměru 150-190 nm a obsahují více než 300 kb dvoupramenné DNA. Genom Chlorella viru může kódovat několik stovek genových produktů.

Ukázalo se, že izolované metyltransferázové promotory Chlorella viru fungují i v prokaryotických a eukaryotických hostitelských buněčných systémech. Tyto metyltransferázové promotory fungují dobře v některých buňkách baktérií a vyšších rostlin. Viz např. U.S.

Patent No. 5 563 328 a Mitra, et al., 1994, Plant Molec. Biol., 26:85-893 („Mitra"). Předkládaný vynález poskytuje nové promotorové sekvence izolované z Chlorella viru, které můžou indukovat vysokou úroveň genové exprese v prokaryotických nebo eukaryotických buňkách v širokém rozmezí teplot, např. od asi 21 °C do asi 37 °C.

Podstata vynálezu Předkládaný vynález poskytuje nové promotorové sekvence izolované z Chlorella viru (SEQ ID NOS:l-7). Vynález také poskytuje genové konstrukty obsahující promotorovou sekvenci vynálezu operabilně připojenou k DNA sekvenci strukturního genu. Dále vynález poskytuje vektory a hostitelské buňky pro expresi produktu kódovaného strukturním genem genového konstruktu vynálezu a buňky transformované heterologním genem operačně připojeným k promotoru.

Promotory vynálezu zahrnují indukovatelné promotory Chlorella, které jsou indukovatelné například po spojení s operátorovou sekvencí. V preferovaném případě Chlorella promotory vynálezu jsou spojené s lac operátorem. Chlorella promotory vynálezu vykazují 2

silnou promotorovou aktivitu v širokém rozsahu teplot, např. od asi 21 °C do asi 37 °C. Někdy je strukturním genem sekvence DNA (nepocházející z Chlorella viru) kódující protein pro produkci v hostitelských buňkách. Potom DNA sekvence nepocházející z Chlorella viru může být jakýkoliv vhodný strukturní gen, který kóduje peptid, protein, hormon, enzym atd. Příklady vhodných strukturních genů jsou např. peptid podobný glukagonu 1 (GLP-1 - glucagon like peptide 1), faktor uvolňující růstový hormon (GRF - growth hormon releasing factor), parathyroidní hormon (PTH), spojovací peptidy (interlinking peptides), amidační kódové sekvence (amidation code sequences), karbon anhydráza (carbonic anhydrase), beta galaktosidáza (beta-galactosidase) , chloramfenikol acetyl transferáza (CAT) , glutathion acetyltransferáza a podobně.

Pro expresi genového produktu je genový konstrukt vynálezu včleněn do vhodné hostitelské buňky. Hostitelské buňky jsou transformovány přímo nebo s použitím vektora. Někdy je vhodným vektorem pro prokaryotické buňky, jako např. E.coli kmen HB101 nebo JM109, plazmid pKK232-8.

Promotory vynálezu jsou užitečné v široké řadě prokaryotických a eukaryotických hostitelských buněk. Někdy jsou také promotory vynálezu použité pro podporu vysoké úrovně exprese genu v rostlinách včetně tabáku, pšenice a jiných rostlin.

Vynález dále poskytuje postup pro produkci proteinové směsi (protein composition). V tomto případě je proteinový produkt produkován v hostitelské buňce transformované genovým konstruktem vynálezu. Genový konstrukt zahrnuje promotorovou sekvenci vynálezu operačně připojenou ke strukturnímu genu kódujícímu protein, který má být produkován v hostitelských buňkách. Vynález také poskytuje metody pro vyhledávání a izolaci promotorové sekvence se silnými transkrípčnímu vlastnostmi,včetně zkrácených verzí promotorů Chlorella viru uvedených níže. Přehled obrázků na výkresech

Obrázek 1 je schematické znázornění mapy plazmidu pKK232-8. 3

Obrázek 2 je schematické znázorněni genových konstruktů používajících sedm promotorů Chlorella viru připojených k heterologní DNA sekvenci kódující CAT protein.

Obrázek 3 je porovnáním CAT aktivit u chloramfenikol-rezistentních E. coli transformovaných CAT genem operačně připojeným k promotorvé sekvenci cvp-10, cvp-13, cvp-15 a cvp-16.

Obrázek 4 je porovnáním promotorových aktivit promotoru Chlorella viru cvp-13 a tac promotoru vnesených do E. coli HB101 a kultivovaných za přítomnosti různých koncentrací chloramfenikolu.

Obrázek 5 je schématické znázornění mapy plasmidu pBN115-glp.

Obrázek 6 ukazuje SDS-PAGE gel produktů exprese GLP-1 z pBN115-glp a pBN115-glp/tac při různých teplotách.

Obrázek 7 je fotografie SDS polyakrylamidového gelu proteinů exprimovaných expresní kazetou obsahující 3 kopie GLP-1 a YX16 promotor nebo tac promotor, indukovaných a neindukovaných, rozpustný a nerozpustný protein při 27 °C a 37 °C.

Obrázek 8 je fotografie SDS polyakrylamidového gelu proteinů exprimovaných expresní kazetou tvořenou 8 kopiemi GLP-1 a YX15, YX16 nebo tac promotorem, indukovaných a neindukovaných, rozpustný a nerozpustný protein při 27 °C a 37 °C.

Obrázek 9 je schématické znázornění mapy plasmidu pBN951nk2[GLP(7-36)AFAM]8HAE(tac).

Detailní popis vynálezu Předkládaný vynález je zaměřený na nové sekvence nukleových kyselin izolovaných z genomu některých Chlorella virů, přičemž tyto izolované sekvence nukleových kyselin slouží jako transkripční promotory [SEQ ID NOS:l-7]. Objevené promotorové sekvence jsou operačně připojené ke strukturnímu genu pro řízení transkripce strukturního genu v prokaryotických nebo eukaryotických buňkách. Objevené promotorové sekvence, jak je ukázáno dále u bakteriálních hostitelských buněk, poskytují vysokou úroveň genové exprese v porovnání s původními nebo jinými nepůvodními promotory.

Objevené promotorové sekvence jsou operačně připojené ke strukturní genové sekvenci, čímž vznikne „genový konstrukt" nebo „expresní kazeta". V typickém případě bude sekvence strukturního 4 genu genového konstruktu sekvence heterologni. Zde použitý výraz „heterologní sekvence" označuje DNA sekvenci, která je odlišná od té, ke které je operačně připojená promotorová sekvence v Chlorella viru. Genový konstrukt také přednostně obsahuje zesilovače (enhancers), značky (markers), polyadenylované sekvence nebo jiné regulační sekvence nukleových kyselin. Je-li cílem produkce vylučovaného proteinu, kódujíc! sekvence strukturního genu přednostně zahrnuje sekvenci nukleové kyseliny kódující signální peptid.

Objevené genové konstrukty se používají pro expresi proteinového produktu kódovaného strukturním genem v hostitelské buňce. Genový konstrukt je včleněn do hostitelské buňky přímo nebo přes vektora použitím známých metod. Proteinový produkt zůstane po expresi uvnitř buňky nebo je (když je v genovémm konstruktu sekvence nukleové kyseliny kódující signální peptid) vylučován mimo buňku.

Promotorové sekvence Chlorella viru Následující sekvence byly izolovány z Chlorella virů a obsahují promotorovou sekvenci pro řízení transkripce strukturního genu. cvp-1 [SEQ ID N0:1]

CCCGGGGATC GCAGGGCATG GGCATTAAAA GAACTTTATG GAATCAAAAA TCTTAGTGAA TTTCCACCAC AGGTATATAG TCTTCAGGAC GCTAACGATG ATATCAACGA TTGTATCAAA GGTTATCGTT TGAGGCACTC ATATCAGGTA GTTTCTACAC AGAAACTTGA ACAACGCCTG GGAAAAGATC CTGAGCATAG TAACTTATAT ACTAGCAGAT GTTGTAACGA TGCTTTATAT GAATATGAAT TAGCACAACG ACAACTACAA AAACAACTTG ATGAATTTGA CGAAGATGGG TATGATTTTT TTCAGGCACG TATAAATACA TTAGATCCGT CGACCTGCAG CCAAGCTT cvp-3 [SEQ ID NO:2]

CCCGGGGATC TAATTCAGGG TGCGAATTTC TTGAACATCA AAGGTCTGTT GGACGTTTTG TGTGCAGCGG TTGCTGATCG CATTGAATCC ATCAATAAAC AGATTGGGGT AAATATCAAA CCCAGTTAGT CGGACATTAG AAGGATTTGT GAGACCACCA CATCCAACGA CACCTAATGG TGTTGTGAAT GATATATTAG AAATGTTACT TATCATTGAT ATTTGCATAA CACCATTTCC CTTTGCTTGA TTTCTACCTA TACTAATTGA TTGTATTGTA GTGCACGCGG CGTACTTACT 5 « ·· *· « · · · I » · « · · * ·· · · ····

TGTATTTGCC GTCTCAGACG TGCTTGATAA TAGTGTGGAA CTCGAGTATG ATCCGTCGAC CTGCAGCCAA GCTT cvp-6 [SEQ ID NO:3]

CCCGGGGATC ATCGAAAGCA ACTGCCGCAT TCGAAACTTC GACTGCCTCG TTATAAAGGT TAGTGAAAGC CATTGTATGT TATTACTGAG TTATTTAATT TAGCTTGCTT AAATGCTTAT CGTGTTGATA TGATAAATGA CAAATGATAC GCTGTATCAA CATCTCAAAA GATTAATACG AAGATCCGTC GACCTGCAGC CAAGCTT cvp-10 [SEQ ID NO:4]

CCCGGGGATC GTTTCTCAGG GCGTCCGGGA GCATATTTCA GACTTGTCCA GCCGTATGAG CATCACGTGC GCGTTCCTAG CAAGAGCGTG TACGTATATT CTTTCGCTCT AGAAGATGCA GATTCGAGAC AACCGAATGG ATCGAATCTA TTTGTACCCC GATATATATA GAATCTAGTC TAAACAAAAC GACCGCGGCT CTTGCCAATA AATGTGACGC AATTAACGCA TTCGTGAATG ATGACTTGTC CGCCCCGGTT CTTGACATTC TAAAAAAATG TGGAGTATCC TCGATCCGTC GACCTGCAGC CAAGCTT cvp-13 [SEQ ID NO:5]

CCCGGGGATC TGCGTATTGC GGGACTTTTG AGCATTTTCC AGAACGGATT GCCGGGACGT ATACTGAACC TCCAGTCCCT TTGCTCGTCG TATTTCCCAT AATATACATA TACACTATTT TAATTATTTA CACCGGTTGT TGCTGAGTGA TACAATGCAA ATTCCCTCCA CCGAGGAGGA TCGCGAACTG TCCAAATGTC TTCTTTCTGC AGCTCCATAC GGAGTCGTTA GGAAACATTC ACTTAATTAT AGGATCCGTC GACCTGCAGC CAAGCTT cvp-15 [SEQ ID NO:6]

CCCGGGGATC AGGCCTCGCT TATAAATATG GTATTGATGT ACTTGCCGGT GTGATTGACT CAGATTACAG AGGAGAGTTG AAAGCAATCC TTTACAATAC TACAGAACGT GACTATATTA TCAAAAAAGG CGATCAGCCA AGCTTCGTCG ACCTGCGATC CGTCGACCTG CAGCCAAGCT T cvp-16 [SEQ ID NO:7]

CCCGGGGATC GCAAAACTCA CAGTCAACAA ACCAAAACAC GGAATGAAGA AAGGAGAAAC TGTGATCATG TGGCAACAAG ATGGAGGTGT CATAGACTAC ATTTACCCTC CCTCTGATCA TCGAAAGCAA CTGCCGCATT CGAAACTTCG 6 • ·· · · · · é · *· l » t * · i * » · t ·· · · · · · · « «· ··· ·· · i · « • * ··· · · · * ··· · ·

ACTGCCTCGT TATAAAGGTT AGTGAAAGCC ATTGTATGTT ATTACTGAGT TATTTAATTT AGCTTGCTTA AATGCTTATC GTGTTGATAT GATAAATGAC AAATGATACG CTGTATCAAC ATCTCAAAAG ATTAATACGA AGATCCGTCG ACCTGCAGCC AAGCTT

Metoda, kterou byly tyto nové promotorové sekvence objeveny, je popsána podrobněji dále v příkladech. Stručně, připravily se restrikční DNA fragmenty z virových genomů pěti Chlorella virů, CA-4B, A1-1A, PBCV-1, SC-1A a NC-1A. (Van Etten, 1991, Microbiol. Rev. 55:586-620). Restrikční fragmenty byly vloženy do plasmidu pKK 232-8 metodou „shotgun klonování" s využitím známých postupů. (Sambrok et al., 1989, Molecular Cloning).

Plasmidový vektor pKK232-8 obsahuje chloramfenikol acetyltransferázový (CAT) gen bez promotoru a mnohočetné klonovací místo před místem pro vložení restrikčních fragmentů DNA. Poté se klonovaným pKK232-8 transformovaly E. coli a transformanty nesoucí promotorové sekvence se testovaly na resistenci vůči chloramfenikolu. Aby se získaly promotory s vysokou aktivitou, transformanty resistentní na chloramfenikol se dále testovaly s použitím zvyšujících se dávek chloramfenikolu v živném médiu.

Pojem „síla" u promotoru, jak je zde použit, se vztahuje k hladině transkripce řízené daným promotorem. „Silný" promotor poskytuje vyšší hladinu transkripce než slabý promotor. Slovní spojení „silný promotor" je tedy ekvivalentní s výrazem „promotor s vysokou aktivitou". Silné promotory jsou zvláště vhodné pro komerční produkci genového produktu.

Je cenné, že pro promotorovou funkci nemusí být nutná kompletní sekvence nukleové kyseliny, které jsou uvedené jako SEQ IS NOS:1-7. S použitím metod popsaných výše a uvedených dále v Příkladech je možné objevené promotorové sekvence dále upravit, např. zkrátit nebo modifikovat a následně testovat tak, aby se upřesnily aktivní promotorové oblasti. Příprava genových konstruktů

Podle vynálezu zahrnuje genový konstrukt nejméně jednu kódující sekvenci strukturního genu, která je operačně připojena k řídící oblasti transkripce. Oblast řídící transkripci zahrnuje promotory a 7 jiné řídící elementy, jako například zesilovače, regulační prvky, polyadenylové sekvence, oblasti iniciující transkripci a sekvence ukončující transkripci. Každá ze sekvencí SEQ ID NOS: 1-7 obsahuje promotorovou sekvenci a může také obsahovat další regulační prvky. Metody pro operační připojení promotorové sekvence k sekvenci strukturního genu jsou známé a uvedené například v Itakuri, et al., 1977, Science 198:1056-1063.

Strukturní gen genového produktu podle vynálezu bude typicky kódovat proteinový nebo polypeptidový produkt. Jakýkoliv známý nebo později objevený strukturní gen, který kóduje požadovaný protein, je operačně připojený k promotorové sekvenci vynálezu s použitím známých metod. Příklady známých strukturních genů vhodných pro použití s promotory vynálezu zahrnují sekvence nukleových kyselin kódující glukagonu podobný peptid 1 (glucagon-like peptide 1, GLP-1), faktor uvolňující růstový hormon (growth hormon releasing factor - GRF), parathyroidní hormon (PTH), karbon anhydrázu, beta-galaktosidasu, chloramfenikol acetyltransferasu (CAT), glutathion acetyltransferasu, vzájemně propojené peptidy, amidované sekvence (amidation sequences) a podobné strukturní geny.

Proto je někdy promotorové sekvence operačně připojená k DNA kódující sekvenci karbon anhydrázy, například lidskou karbon anhydrázu. V jiném případě je promotorové sekvence vynálezu připojená k DNA sekvenci kódující více kopií požadovaného proteinu. Příklad vhodného strukturního genu o více kopiích pro glukagonu podobný peptid-1 (GLP-1) je uveden v U.S. Patent No. 5 595 887.

Metody pro změny genu

Jakmile je vytvořen genový konstrukt, je buď včleněn přímo do hostitelské buňky, nebo nakloňován do vhodného vektora pro transformaci hostitelské buňky.

Metody pro transformování buněk jsou známé a preferované metody se liší podle typu hostitelské buňky, která má být transformována. Zde používaný termín „hostitelská buňka" se vztahuje k buňce, ve které bude nakonec strukturní gen genového konstruktu exprimován.

Pro prokaryotické a eukaryotické hostitelské buňky včetně bakteriálních, kvasinkových a živočišných hostitelských buněk preferované metody transformace zahrnují metody využívající 8

zmrazováni/rozmrazováni, precipitaci chloridem vápenatým, precipitaci fosforečnanem vápenatým, plasmidy, transformace protoplastů, transformace zprostředkovaná liposomy, elektroporace a ostatní známé metody transformace. U rostlinných buněk mezi preferované metody transformace patří transformace zprostředkovaná Agrobacterium, elektroporace, bombardování mikročásticemi, fůze protoplastů a kombinace těchto a jiných známých transformačních metod.

Hostitelské buňky

Promotory vynálezu jsou užitečné u širokého spektra hostitelských buněk, včetně prokaryotických a eukaryotických hostitelských buněk. Mezi vhodné bakteriální hostitelské buňky pro expresi genového konstruktu vynálezu patří Escherichia coli,

Bacillus subtilis a Streptomyces. Rostlinné a živočišné hostitelské buňky včetně buněk kvasničných, jako jsou tabákové, pšeničné nebo jiné rostlinné buňky, embryonální, tumorové a jiné živočišné buňky a podobně jsou také vhodné pro vytvořené promotory.

Mezi vhodné vektorové systémy pro vnesení genových konstruktů do hostitelských buněk patří například plasmidy, viry, fágy a umělé kvasniční chromozomy (YAC). Mezi vhodné plasmidy pro transformaci bakteriální hostitelské buňky genovým konstruktem vynálezu patří pKK232-8 nebo pB0304, jak je popsáno dále v příkladech.

Metody pro vnesení cizích genů do rostlin jsou známé a můžou se použít pro včlenění genového konstruktu vynálezu do rostlinného hostitele; patří mezi ně biologické a fyzikální protokoly transformace rostlin. Příklady jsou uvedené například v Miki et al., 1993, „Proceduře for Introducing Foreign DNA Into Plants", In: Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology, Glick and Thompson, eds., CRC Press, lne., Boča Raton, strany 67-78. Vybrané metody se liší podle hostitelské rostliny a zahrnují chemické transfekční metody, jako je přenos za pomoci fosforečnanu vápenatého, přenos zprostředkovaný mikroorganismy jako například Agrobacterium (Horsch, et al., Science 227:1229-1231, 1985), elektroporaci, mikro-injekce a biolistické ostřelování (biolistic bombardment). 9

Expresní vektory a metody in-vitro kultur pro rostlinné buňky nebo transformace a regenerace rostlin jsou známé a dostupné. Příklady jsou například v Gruber et al., 1993, „Vectors for Plant Transformation", In: Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology, Glick and Thompson, eds., CRC Press, lne., Boča Raton, strany 89-119. Příklady provedeni vynálezu

Vynález je podrobněji popsán na následujících příkladech, které ale nejsou míněné jako jediné možné. Příklad 1

Tvorba virových DNA fragmentů

Virovou DNA extrahovanou z pěti Chlorella virů CA-4B; Al-IA; PBCV-1; SC-1A; a NC-1A poskytnul Dr. Van Etten z University of Nebraska. Extrahovaná virová DNA (1,5 ug každé) byla spojena a štěpením enzymem Sau3Al (New England Biolabs, Beverly, MA) v (100 ul objemu) lOOmM NaCl, 10 mM Bis Tris Propane-HCl, 10 mM MgCl2, lmM dithiothreitol a 100 ug/ml BSA se připravily fragmenty virové DNA. Směs byla inkubována 120 minut při 37 °C a reakce se zastavila přidáním 10 mM EDTA. Fragmenty Sau3Al byly vyprecipitovány z reakční směsi etanolem a promyté etanolem. Příklad 2

Klonování fragmentů do pKK232-8

Sau3Al virové fragmenty, získané postupem popsaným v Příklady 1, se nakloňovaly v BamHI místě do plazmidu pKK232-8 „shootgun" klonovací technikou popsanou v Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning. Plazmid pKK232-8 byl získán od Pharmacia (Piscataway, NJ). Mapa pKK232-8 je schematicky znázorněna na obrázku 1. Příprava DNA, vložení a ligace byly provedeny podle Sambrook et al. (viz výše), nebo podle firemních návodů.

Fragmenty virové DNA Chlorella se naligovaly do 1 ug pKK232-8, který se předtím rozštěpil BamHI a opracoval telecí střevní alkalickou fosfatázou (calf intestine alkaline phosphatase - CIP). Tím vznikly rekombinantní plasmidy označené pCVP-1, pCVP-3, pCVP-6, 10

• · ·««· ·· t« • * I * · « pCVP-10, pCVP-13, pCVP-15 a pCVP-16. Obrázek 2 schematicky znázorňuje sedm promotorů Chlorella virů operačně připojených k heterolognimu CAT genu. (zkratky: Sm - Smál; Sa - Sáli; H -HindiII; CAT - chloramfenikol acetyl transferázový gen). T4 DNA ligáza byla od BRL (Rockville, MD). PKK232-8 je odvozen od pBR322. Ten obsahuje bezpromotorový chloramfenikol acetyltransferázový (CAT) gen a před klonovacim místem (proti směru transkripce) pro vložení restrikčních fragmentů DNA. Buňky E. coli transformované pKK232-8 jsou resistentní k ampicilinu, ale (pokud není vložen před ke CAT genem DNA fragment obsahující promotor pro indukci CAT) citlivé k chloramfenikolu.

Je-li takovýto promotor vložen, buňky nesoucí rekombinantní plasmid exprimují CAT a tím získají rezistenci k chloramfenikolu. PKK232-8 je zkonstruován tak, aby se omezil vliv zbytkové resistence k chloramfenikolu a zvýšila se schopnost zjišťovat silné promotory. Pro omezení zbytkové resistence je CAT gen obklopen účinnými terminátory transkripce, které zablokují transkripci CAT genu z jiných promotorů přítomných v plasmidu. Stop kodóny translace jsou včleněny vzhledem ke všem třem čtecím rámcům mezi klonovacími místy a iniciačním kodon CAT genu, aby se zabránilo translaci přes náhodný ATG startovací kodón, který mohl být včleněn klonovaným promotorovým fragmentem. CAT gen také obsahuje své vlastní místa pro navázání ribozómů a ATG startovací kodón, což umožňuje účinnou translaci mRNA pro CAT. Příklad 3

Transformace E. coli a výběr transformantů

Transformace kmenů E. coli HB101 a JM109 se provedla metodou popsanou v Sambrook et al., 1989, viz výše. Kmeny E. coli se získaly od firmy Promega (Madison, WI).

Transformované E. coli se testovaly na rezistenci k ampicilinu (která ukazovala na transformaci pKK232-8) a na rezistenci k chloramfenikolu, která ukazovala na včlenění promotoru. Síla vloženého promotoru byla ohodnocena měřením růstů buněk za přítomnosti vzrůstajícího množství chloramfenikolu.

Pozitivní kolonie se izolovaly na miskách s LB médiem (Luria Broth) obsahujících 30 ug/ml ampicilinu a různé koncentrace 11

chloramfenikolu (5, 10, 20, 30 a 100 ug/ml). Vybrané kolonie E. coli, které byly rezistentní ke 100 ug/ml chloramfenikolu, se dále použily k inokulaci LB média s 200, 400, 600, 700 a 900 ug/ml chloramfenikolu. Růst buněk se monitoroval měřením ODeoo kultur. Získalo se několik tisíc transformantů resistentních k chloramfenikolu v koncentraci 30 ug/ml. Počet transformantů resistentních k chloramfenikolu se dramaticky zmenšil se zvyšující se koncentrací antibiotik. Jenom asi 500 transformantů bylo resistentních k chloramfenikolu v koncentraci 100 ug/ml a pouze 36 transformantů vykazovalo rezistenci k chloramfenikolu v koncentraci 500 ug/ml. Buňky transformované kontrolním pKK232-8 bez vloženého promotoru nebyly rezistentní k chloramfenikolu v koncentraci 5 ug/ml a vyšší. 36 transformantů, které vykázaly rezistenci k chloramfenikolu v koncentraci 500 ug/ml, se dále vystavilo působení chloramfenikolu o koncentracích 500 ug, 700 ug a 900 ug/ml. Sedm transformantů vykazovalo normální růst v LB médiu s koncentrací chloramfenikolu 700 ug/ml a pomalejší růst za přítomnosti chloramfenikolu o koncentraci 900 ug/ml (obr. 2). Příklad 4

Porovnání CAT aktivity indukované promotory Chlorella viru

Porovnávala se CAT aktivita vykazovaná transformanty chloramfenikol resistentních promotorů z Chlorella viru z příkladu 3. Čtyři ze sedmi chloramfenikol rezistentních transformantů E. coli (CVP-10, CVP-13, CVP-15 a CVP-16) se pěstovaly za přítomnosti chloramfenikolu o koncentraci 600 ug/ml. Měřením density buněk (OD5oo) v různých časových intervalech se monitoroval růst buněk. Jak je vidět na obr. 3, čtyři transformanty vykazovaly podobný růst buněk, což naznačovalo podobnou úroveň exprese CAT aktivity ve všech kulturách. Příklad 5

Purifikace plasmidové DNA

Plasmidová DNA se purif i kovala z těch kolonií, které vykazovaly nejvyšší hladinu chloramfenikolové rezistence (700 až 900 ug/ml) s použitím „Wizard miniprep plasmid DNA purification kit" od firmy 12

Promega (Promega Co., Madison, WI) nebo „DNA purification kit” od firmy Quiagen (Quiagen lne., Chatsworth, CA). Analýza plasmidů štěpením restrikčními endonukleázami ukázala, že všechny plasmidy obsahovaly vložený DNA fragment.

Plasmidy se rozštěpily Smál a HindlII a podrobily elektroforéze na 7,5% polyakrylamidovém gelu nebo 0,8% agarózovém gelu. Elektroforézové gely ukázaly sedm fragmentů virových promotorů o velikostech mezi 100 a 400 bp, jak ukazuje schématicky obr. 2. Přiklad 6

Sekvenováni promotorových fragmentů

Sedm fragmentů virové DNA obsahujících promotory (cvp-1, cvp-3, cvp-6, cvp-10, cvp-13, cvp-15 a cvp-16) se pro sekvenováni vystřihlo z pKK232-8 vektoru enzymy Smál a HindiII a subklonovalo do pUC19 nebo pBluescriptSK(+)II. Sekvenováni DNA prováděla sekvenační laboratoř University of Nebraska Lincoln (UNL) na LICOR sekvenceru. Sekvence se určily v obou směrech Sangerovou dideoxy terminační metodou.

Sekvenční analýza všech sedmi Chlorella virových fragmentů ukázala Sau3Al místa na obou koncích insertu Chlorella viru vně klonovacích míst vektora pKK232-8. Velikost DNA sekvence sedmi promotorových fragmentů se shodovala s velikostí restrikčních fragmentů určenou elektroforézou na polyakrylamidovém gelu. SEQ ID NO: DNA fragment z Chlorella viru 1 cvp-1 2 cvp-6 3 cvp-6 4 cvp-10 5 cvp-13 6 cvp-15 7 cvp-16

Známé promotorové sekvence E. coli obsahují 3 kritické prvky: dvě hexamerové sekvence (-35 oblast a -10 oblast) a 16-18 bp velkou oblast mezi nimi. S použitím lac, iacUV5, trp, tac a PL 13 promotorových konsensuálních sekvenci jako referenci se přidělily předpokládané -35 a -10 oblasti každému ze sedmi virových promotorů. Jak je vidět v tab. 1, tyto hexamerové sekvence jsou buď identické s (nebo jenom málo odlišné) konsensuálnimi sekvencemi známých promotorů E. coli. Například sekvence oblasti -35 cvp-10 (TTGACA) nebo cvp-15 (TTTACA) je identická s oblastmi vyskytujícími se u trp (TTGACA) nebo lac (TATGTT). Šest ze sedmi izolovaných virových promotorů vynálezu má mezi domnělými -35 a -10 oblastmi oblast o velikosti 16-18 bp. Jak virový promotor cvp-13 tak lac promotor mají identické -35 hexamerové sekvence (TTTACA), přesně shodnou (18 bp velkou) oblast mezi -35 a -10 oblastmi a velmi podobnou -10 hexamerovou sekvenci (TACAAT pro cvp-13 a TATAAT pro lac). promotorový konsensus -35 pozice -10 pozice TTGACA TATAAT SEQ ID NO: cvp-1 CAAAAACAACTTGATGA ATTTGACGAAGATGGGTATGATTTTTTTCAGGC 10 cvp-3 TCAGACGTGCTTGATAATAG TGTGGAACTCGAGTATGATCCG TCGACCT 11 cvp-6 GCTTATCGTGTTGATATGATAAATGACAAAT GATACGCTGTATCAACA 12 cvp-10 GCCCCGGTTCTTGACATTCTAAAAAAATGTGGAGTATCCTCGATCCGTCGA 13 cvp-13 AT T T TAAT TAT T TACAC C GGTT GTT GCT GAGT GATACAAT GCAAATT CCCT 14 cvp-15 AAAGCAATCCTTTACAATAC TACAGAACGTGACTATATTATCAAAAAAGG 15 cvp-16 ACTGCCTCGTTATAAAGGTTAGTGAAAGCCATTGTATGTTATTACTGAGTT 16 lac CACCCCAGGCTTTACACTTTATGCTTCCGGCTCGTATGTTGTG TGGAATT 17 lacVV5 CACCCCAGGCTTTACACTTTATGCTTCCGGCTCGTATAATGTG TGGAATT 18 trp AAATGAGCTGTTGACAATTAATCATCGAACTA GTTAACTAGTACGCAAGT 19 tac AAATGAGCTGTTGACAATTAATCAT CGGCTCGTATAATGTG TGGAATT 20 PL TCTGGCGGTGTTGACATAAATACCACT GGGGGTGATACTGAG CACATCA 21

Tučné „A" označuje počátek transkripce.

Zkratky: lac - lac promotor, IacUV5 - lacUV5 promotor, trp -trp promotor, tac - tac promotor, PL - PL promotor bakteriofága lambda Příklad 7

Porovnání promotorové aktivity cvp-13 a tac tac promotor je velmi silný promotor E. coli (de Boer, et al., 1983, Proč. Nati. Acad. Sci. 80:21-25), který je široce využíván pro expresi genů jak ve výzkumu, tak v průmyslu. Pro porovnání promotorové aktivity cvp-13 a promotorové aktivity tac ve stejném 14 pokusném systému byl zkonstruován tac promotorový plasmid odvozený od pKK232-8.

Dva komplementární oligomery obsahujíc! tac sekvence 5'-GGGAAATGAGCTGTTGACAATTAATCATGGCTCGTATAATGTGTGGAAGCTT-3· [SEQ ID NO:8] a 5'-CCCTTTACTCGACAACTGTTAATTAGTAGCCGAGCATATTACACACCTTCG-3' [SEQ ID NO:9] se hybridizovaly a včlenily do pKK232-8 před CAT genem (proti směru transkripce) mezi Smál a ffindlll. Výsledným plasmidem pTAC-cat se transformovaly E. coli HB101. Buňky obsahující buď pTAC-cat nebo pCVP-13 se pěstovaly za přítomnosti chloramfenikolu o koncentracích 100, 300 nebo 600 ug/ml. Resistence k antibiotiku se monitorovala měřením hustot rostoucích buněk v rozdílných časových intervalech. Jak je vidět na obr. 4, při všech třech úrovních koncentrace chloramfenikolu ukázal cvp promotor vyšší promotorovou aktivitu než tac promotor. Příklad 8

Konstrukce regulovaných virových promotorů

Sedm fragmentů virových promotorů izolovaných z virových genomů Chlorella vykázalo silnou promotorovou aktivitu v E. coli. Jejich promotorové aktivity nebyly ale regulovatelné a mohly tedy jenom konstitutivně řídit expresi proteinu. Pro několik promotorů byl vyvinut postup pro přeměnu konstitutivního promotoru na inducibilní promotor fůzí promotoru s lac operátorem, jako například pro promotory genů ribozomální RNA (Brosius and Holý, 1984, PNAS USA 81:6929-6933) a pro promotor genu pro lipoprotein (Nakamura et al., 1982, EMBO J. 1:771-775). Tyto modifikované hybridní promotory jsou potlačeny genovým produktem lac I genu (lac represorem), jehož specifická vazba k lac operátoru inhibuje počátek transkripce a který je možné potlačit induktorem, jako je isopropyl b-D-thiogalaktosid (IPTG); ten zabrání navázání represorového proteinu k lac operátoru.

Pro posouzení, jestli se Chlorella virové promotory můžou změnit na inducibilní, se lac operátor spojil s Chlorella virovými promotory cvp-1, cvp-15 a cvp-16. Firma Operon Technology lne. 15 (Alameda, CA) chemicky nasyntetizovala dva komplementární nukleotidy obsahující sekvence lac operátora a vhodné restrikční místa.

Sekvence těchto nukleotidů jsou následující: 5'-TCGACCGGGTACCTCGCGAGGAATTGTGAGCGGATAACAATTCCTCTAGA-3' [SEQ ID NO:22] 5'-AGCTTCTAGAGGAATTGTTATCCGCTCACAATTCCTCGCGAGGTACCCGG-3' [SEQ ID NO:23]

Po denaturaci a hybridizaci byly výsledné oligoduplexy vloženy před virový promotore v Sáli a ffindlll místech pKK232-8. Klony pKK232-8 obsahující hybrid virový promotor/operátor před CAT genem se použily k transformaci E. coli HB101 bez lad funkce. Měřením odolnosti transformovaných buněk k chloramfenikolu se zjistily podobné hladiny promotorové aktivity, jako u promotorů bez lac operátoru. To naznačuje, že úprava virálních promotorů fůzí s lac operátorem nesníží sílu promotoru. Fůzní promotory s lac operátorem cvp-1, cvp-15 a cvp-16 byly označeny jako YX-1, YX-15 a YX-16. Příklad 9

Exprese peptidu podobnému glukagonu (Glucagon-like Peptide, GLP-1) expresním vektorem YX-15 A. Konstrukce expresního vektora s YX-15, pBN115-glp Pro subklonování virových promotorů (YX-1, YX-15 a YX-16) do expresního vektora (které vyžadují pro klonování restrikční místa BglII a Xbal) byly promotorové fragmenty modifikovány pomocí polymerázové řetězové reakce (PCR) s použitím následujících oligonukleotidů syntetizovaných firmou Operon Technology lne.: 5'-GGGTTCGAAGATCTAATTCCCGGGGATC-31 [SEQ ID NO:24] 5'-TGCATTTCTAGAATTGTGAATTGTTATCCGCTCA-3' [SEQ ID NO:25]

Plasmid pGEX-2T, který má počátek replikace z pBR322, láci gen, gen pro resistenci k ampicilinu a expresní kazetu fůzního genu tac promotor/glutathion S-transferáza (GST) je od firmy Pharmacia Biotech lne. (Pistacaway, NJ). Restrikčními enzymy Fsp-1 a Smál se nejprve odstranil 1,2 kb velký fragment odpovídající tac/GST kazetě pGEX-2T a potom nahradil DNA fragmentem obsahujícím 16 • ·· *«·«·« ·· ···* * i * «·*«

«» I · «··· « * * I « · « » · ( · · · ' » · ·· + *· · * · % · ·»« ♦ · 4* ·»# M *♦

BglII/Xbal/Nhel/Xhol restrikční místa, která se můžou použít jako klonovací místa. Výsledný plasmid se označil jako pBN115. GLP-1 je peptidový hormon tvořený 29 zbytky. V E. coli byl exprimován vytvořený syntetický gen s 8 kopiemi GLP-1. Pro testování exprese GLP-1 za řízení YX-15 se vytvořila expresní kazeta YX-15/GLP-1 fůzí BglII-Xbal fragmentu (obsahující YX-15) s Xbal-Xhol fragmentem obsahujícím jednak vazebné místo pro ribozomy a dále 8 kopií GLP-1 genu. Tato YX-15/GLP-1 expresní kazeta se potom vložila do pBN115 v místech BglII a Xhol; tím vznikl pBN115-glp ( obr. 5) . Jako kontrolní expresní vektor se použil pBN-115glp/tac, který se připravil výměnou YX-15 v BglII a Xbal místech pBN115-glp za tac promotor obsahující lac operátor. Promotor tac může být také účinně regulován pomocí IPTG. B. Exprese GLP-1

Hostitelské buňky E. coli (kmen HMS174, Novagen, lne.,

Milwauke, WI) se transformovaly za přítomnosti ampicilinu jak pBN115-glp tak pBNl15-glp/tac. Exprese GLP-1 se indukovala IPTG v koncentracích 0,1 mM až 2 mM při teplotách 37 °C až 21 °C. Po 15 hodinách od indukce se použily buňky v dalším postupu. Celkové buněčné proteiny se analyzovaly pomocí SDS-PAGE (obr. 6). Produkce GLP-1 se vyhodnotila naskenováním na zařízení Personál Color Scanner s využitím počítačových programů Adobe Photoshop a NIH Image Analysis. Jak ukázuje tab. 1, skenování gelu ukázalo, že hladina exprese GLP-1 z pBN115-glp při 37 °C činila více než 46% z celkových buněčných proteinů oproti 35% celkových proteinů u pBN115-glp/tac. Množství buněk odpovídající jedné jednotce optické density při vlnové délce 600 nm (O.D.eoo) produkovalo u pBN115-glp o 40% více proteinů než u pBN115-glp/tac. Výsledky jasně ukazují na možné využití YX-15 jako silného promotoru pro produkci vysokých hladin rekombinantních proteinů v E. coli. 17 • · · · · · · · 4 • · · · · « ·

• » · · ····

Tabulka 1 YX-15 řízená exprese GLP-1 v E. coli.

Indukce Intensita proteinového proužku odpovídaníčího GLP-1 tac YX-15 bez indukce 84 (7%) 385 (35%) 37 °C 1089 (100%) 1544 (141%) 27 °C 55 (5%) 1248 (114%) 21 °C neurčeno 830 (76%)

Pro každé měření byly proteiny extrahovány z buněk s hodnotou ODsoo 0,25 a analyzovány na 16% PAGE gelu (obr. 6). Po obarvení Coomassie blue se stanovila intensita proteinových proužků naskenováním na zařízení Personál Color Scanner s použitím programů Adobe Photoshop a NIH Image Analysis. Procenta v závorkách representují hladinu exprese GLP-1 vztaženou k expresní hladině GLP-1 produkovaného pod kontrolou tac promotoru při 37 °C.

C. Indukce pomocí IPTG I když je možné detekovat základní hladinu exprese GLP-1 v HMS174 s pBN115-glp i v nepřítomnosti IPTG, po přidání IPTG se úroveň exprese zvýší 4x. Ve srovnání s tím přidání IPTG k pBN115-glp/tac zvýšilo tvorbu GLP-1 13x. To naznačuje, že exprese GLP-1 z pBN115-glp nereaguje na indukci IPTG. Regulace exprese GLP-1 u pBN115-glp je ale menší než z pBN115-glp/tac.

Inducibilita různých koncentrací IPTG (0; 0,25; 0,5; 1,0 a 2,0 mM) se zjišťovala expresí GLP-1 při 37 °C. Podobně vysoké úrovně produkce GLP-1 se dosáhlo u pBN115-glp při koncentracích IPTG v rozsahu od 2 mM do 0,1 mM. To ukazuje, že i tak nízká koncentrace IPTG jako 0,1 mM je dostatečná k indukci vysoké exprese GLP-1. U všech testovaných koncentrací IPTG byla produkce GLP-1 u pBN115-glp vždy větší než produkce GLP-1 u pBN115-glp/tac, což ukazuje na větší promotorovou aktivitu YX-15 ve srovnání s tac. D. Vliv teploty

Teplota kultivace zásadně ovlivňuje výkonnost mikroorganismů. Běžně se používá pro produkci rekombinantních proteinů v E. coli 18 » ·»·· • · • · ♦ · s úspěchem indukční teplota 37 °C; nižší teploty jsou ale někdy výhodnější, například když jsou problémy s aktivitou proteinů a s tvorbou neaktivních proteinových agregátů. Při nižších teplotách je ale rychlost transkripce a translace (jakožto biochemických procesů) výrazně snížena a tím se také sníží množství cílového proteinu.

Proto je při nižších teplotách pro produkci vysokých hladin proteinů nezbytné využívat vysoce účinné promotory. Před tímto vynálezem nebyly takovéto E. coli promotory dostupné. Běžně používané promotory, jako například tac promotor nebo T7 promotor jsou velmi aktivní při 37 °C, ale podstatně slabší při nižších teplotách, jak je to dokumentován dále na údajích pro tac promotor.

Porovnávala se promotorové aktivita YX-15 při teplotě 37 °C a 21 °C srovnáním produkce GLP-1. Výsledky potvrzují (viz tab. č. 1 výše), že YX-15 promotor byl schopen vyvolat vysokou hladinu exprese GLP-1 při teplotách v rozmezí od 37 °C do 21 °C. Expresní hladiny dosažené při použití YX-15 při 27 °C byly dokonce o trochu vyšší, než u kombinace tac promotor a 37 °C. Snížení hladiny exprese GLP-1 řízené YX-15 při 27 °C a 21 °C činilo v porovnání s 37 °C 20% a 50%. V porovnání s tím u tac promotoru došlo k 95% snížení exprese při 27 °C oproti expresi při 37 °C. Při 21 °C nebyla u tac promotoru exprese vůbec detekovatelná. Příklad 10

Funkce virových promotorů v rostlinách Při testech, jestli isolované virové proteiny fungují také v rostlinách, bylo 7 promotorových fragmentů vloženo do beta-glukuronidázového (GUS) expresního vektora pBI221 (Clotech Laboratories, lne., Palo Alto, CA) před GUS gen, jako náhrada CaMV 35S promotoru. Výsledné plasmidy se metodou odstřelování mikročásticemi vnesly do tabákových listů a pšeničných nevyvinutých embryí. Transformované explantáty se potom testovaly na GUS expresi histochemicky, spočítáním modrých GUS skvrn na testovaných explantátech. Pozitivní kontrolní explantáty se transformovaly pBI221, který obsahuje CaMV 35S promotor.

Jak je vidět v tabulce 2, pozitivní výsledky v GUS testu se daly pozorovat s promotorem cvp-15, ale ne u ostatních šesti promotorů. 19

Tabulka 2 vektor rozmezí průměrů GUS skvrn/explantát/plat* tabák pšenice PBI221(CaMV 35S) 2,6 - 9,5 7,6 - 17,2 PBI221 - YX-15 0,7 - 1,5 0,4 - 1,6 * n=3 experimenty Příklad 11

Exprese GLP konstruktů s pYX16 za nízkých teplot

Expresní plasmid pBN115-glp (8 kopií GLP-1) popsaný výše v příkladu 9 řídí expresi 8 kopií GLP-1 (7-36) expresní kazety s YX15 promotorem (cvp-15 s lac operátorem). Druhý plasmid obsahující YX16 promotor (cvp-16 s lac operátorem) a 3 kopie GLP-1 (7-36) se připravil výměnou BglII/Xbal promotorového fragmentu ve vektoru pBN115 za odpovídající fragment z YX-16 promotoru. Také se vyměnila kazeta s 8 kopiemi GLP-1 za kazetu se 3 kopiemi GLP-1 náhradou Xbal-Xhol fragmentu. Výsledný konstrukt pGEXlnk2 (3kopie GLP)YX16 obsahuje stejný plasmidový základ jako pBN115, kromě toho, že promotor YX15 je nahrazen YX16.

Také se připravil konstrukt s YX16 promotorem a 8 kopiemi GLP-1 (7-36) odvozením z expresního plasmidu pBN53. Promotor YX16 byl klonován do tohoto konstruktu jako BglII/Xbal fragment. Výsledný plasmid, pBN531nk28copyGLP YX 16, je odolný tetracyklinu a obsahuje laclq gen pro represi neindukované exprese. Plasmid pBN95 je identický s plasmidem pBN53 s tím rozdílem, že místo laclq genu obsahuje lac I gen. Tato změna má za následek nižší hladinu exprese produktu genu Lac I v pBN95 a následně nižší hladiny represe neindukovaného proteinu při použití tohoto vektora.

Expresní vektory byly transformovány do buněk E. coli s využitím metod a materiálů použitých v příkladu 9. Exprese GLP-1 se indukovala IPTG jak je popsáno v příkladu 9 při teplotách 27 eC a 37 °C.

Vzorky proteinů odebrané z buněčných kultur po indukci tac nebo YX16 promotorů řídících 3 kopie GLP-1(7-36) nebo 8 kopií GLP-1 (7-36) byly separovány na 16% TrisTricine SDS-PAGE gelu a obarveny Coomassie blue. 20

Data na obr. 7 ukazují, že YX16 promotor funguje dobře při 27 °C, zatímco tac promotor je při této teplotě neaktivní. Prekursor peptidu GLP je rozpustný při 27 °C, ale nerozpustný při 37 °C.

Data uvedená na obr. 8 ukazují, že jak YYX15 tak YX16 promotory fungují při 27 °C, zatímco tac promotor je při této teplotě neaktivní. Data ukazují, že YX16 funguje při nízkých teplotách (27 °C) u dvou nezávislých cílových peptidů. Výše uvedené specifikace, příklady a data poskytují úplný popis přípravy a použití jednotlivých složek vynálezu. Protože mnoho využití vynálezu se může provést v souhlase s duchem a v rámci vynálezu, vynález spočívá v požadavcích dále připojených. 21

Seznam sekvenci (1) Obecné informace: (i) Žadatel: Bionebraska, lne. (ii) Název vynálezu: Chlorella virové promotory (iii) Počet sekvenci: 25 (iv) Korespondenční adresa: (A) Adresa: Merchant, Gould, Smith, Edell, Welter & Schmidt (B) Ulice: 3100 Norwest Center, 90 South 7th Street (C) Město: Mineapolis

(D) Stát: MN

(E) Země: USA (F) PSČ (ZIP): 55402 (v) Forma vhodná pro počítačové zpracování (A) Typ média: disketa (B) Počítač: IBM PC kompatibilní

(C) Operační systém: DOS (D) Software: FastSEQ Verze 2.0 (vi) Současné údaje o žádosti (A) Číslo žádosti: (B) Datum registrace: 19. březen 1998 (C) Klasifikace: (vii) Předcházející údaje o žádosti: (A) Číslo žádosti: 08/821,559 (B) Datum registrace: 21. března 1997 (viii) Informace o právním zástupci/agentovi: (A) Jméno: Kettelberger, Denise m. (B) Číslo registrace: 33,924 (C) Reference/počet soudních případů: 8648.63WOI1 (ix) Telekomunikační informace: (A) Telefon: 612-332-5300 (B) Telefax: 612-332-9081 22 « · (C) Telex: (2) Informace o SEQ ID NO:1: (i) Charakteristika sekvence (A) Délka: 358 párů bázi (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet řetězců: jeden (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: cDNA (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO:l CCCGGGGATC GCAGGGCATG GGCATTAAAA GAACTTTATG GAATCAAAAA TCTTAGTGAA 60 TTTCCACCAC AGGTATATAG TCTTCAGGAC GCTAACGATG ATATCAACGA TTGTATCAAA 120 GGTTATCGTT TGAGGCACTC ATATCAGGTA GTTTCTACAC AGAAACTTGA ACAACGCCTG 180 GGAAAAGATC CTGAGCATAG TAACTTATAT ACTAGCAGAT GTTGTAACGA TGCTTTATAT 240 GAATATGAAT TAGCACAACG ACAACTACAA AAACAACTTG ATGAATTTGA CGAAGATGGG 300 TATGATTTTT TTCAGGCACG TATAAATACA TTAGATCCGT CGACCTGCAG CCAAGCTT 358 (2) Informace o SEQ ID NO:2: (i) Charakteristika sekvence (A) Délka: 374 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet řetězců: jeden (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: cDNA (Xi) Popis sekvence: SEQ ID NO:2: CCCGGGGATC TAATTCAGGG TGCGAATTTC TTGAACATCA AAGGTCTGTT GGACGTTTTG 60 TGTGCAGCGG TTGCTGATCG CATTGAATCC ATCAATAAAC AGATTGGGGT AAATATCAAA 120 CCCAGTTAGT CGGACATTAG AAGGATTTGT GAGACCACCA CATCCAACGA CACCTAATGG 180 TGTTGTGAAT GATATATTAG AAATGTTACT TATCATTGAT ATTTGCATAA CACCATTTCC 240 CTTTGCTTGA TTTCTACCTA TACTAATTGA TTGTATTGTA GTGCACGCGG CGTACTTACT 300 TGTATTTGCC GTCTCAGACG TGCTTGATAA TAGTGTGGAA CTCGAGTATG ATCCGTCGAC 360 CTGCAGCCAA GCTT 374 (2) Informace o SEQ ID NO:3: (i) Charakteristika sekvence

(A) Délka: 207 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet řetězců: jeden (D) Topologie: lineární Typ molekuly: cDNA 23 (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO:3: CCCGGGGATC ATCGAAAGCA ACTGCCGCAT TCGAAACTTC GACTGCCTCG TTATAAAGGT 60 TAGTGAAAGC CATTGTATGT TATTACTGAG TTATTTAATT TAGCTTGCTT AAATGCTTAT 120 CGTGTTGATA TGATAAATGA CAAATGATAC GCTGTATCAA CATCTCAAAA GATTAATACG 180 AAGATCCGTC GACCTGCAGC CAAGCTT 207 (2) Informace o SEQ ID NO:4: (i) Charakteristika sekvence (A) Délka: 317 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet řetězců: jeden (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: cDNA (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO:4: CCCGGGGATC GTTTCTCAGG GCGTCCGGGA GCATATTTCA GACTTGTCCA GCCGTATGAG 60 CATCACGTGC GCGTTCCTAG CAAGAGCGTG TACGTATATT CTTTCGCTCT AGAAGATGCA 120 GATTCGAGAC AACCGAATGG ATCGAATCTA TTTGTACCCC GATATATATA GAATCTAGTC 180 TAAACAAAAC GACCGCGGCT CTTGCCAATA AATGTGACGC AATTAACGCA TTCGTGAATG 290 ATGACTTGTC CGCCCCGGTT CTTGACATTC TAAAAAAATG TGGAGTATCC TCGATCCGTC 300 GACCTGCAGC CAAGCTT 317 (2) Informace o SEQ ID NO:5: (i) Charakteristika sekvence (A) Délka: 277 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet řetězců: jeden (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: cDNA (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO:5: CCCGGGGATC TGCGTATTGC GGGACTTTTG AGCATTTTCC AGAACGGATT GCCGGGACGT 60 ATACTGAACC TCCAGTCCCT TTGCTCGTCG TATTTCCCAT AATATACATA TACACTATTT 120 TAATTATTTA CACCGGTTGT TGCTGAGTGA TACAATGCAA ATTCCCTCCA CCGAGGAGGA 180 TCGCGAACTG TCCAAATGTC TTCTTTCTGC AGCTCCATAC GGAGTCGTTA GGAAACATTC 290 ACTTAATTAT AGGATCCGTC GACCTGCAGC CAAGCTT 277 (2) Informace o SEQ ID NO:6: (i) Charakteristika sekvence (A) Délka: 181 párů bázi (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet řetězců: jeden (D) Topologie: lineární 24 • · • · • ·

(ii) Typ molekuly: cDNA (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO:6: CCCGGGGATC AGGCCTCGCT TATAAATATG GTATTGATGT ACTTGCCGGT GTGATTGACT 60 CAGATTACAG AGGAGAGTTG AAAGCAATCC TTTACAATAC TACAGAACGT GACTATATTA 120 TCAAAAAAGG CGATCAGCCA AGCTTCGTCG ACCTGCGATC CGTCGACCTG CAGCCAAGCT 180 T 181

Informace o SEQ ID NO:7: (i) Charakteristika sekvence (A) Délka: 316 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet řetězců: jeden (D) Topologie: lineární

(ii) Typ molekuly: cDNA (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO:7: CCCGGGGATC GCAAAACTCA CAGTCAACAA ACCAAAACAC GGAATGAAGA AAGGAGAAAC 60 TGTGATCATG TGGCAACAAG ATGGAGGTGT CATAGACTAC ATTTACCCTC CCTCTGATCA 120 TCGAAAGCAA CTGCCGCATT CGAAACTTCG ACTGCCTCGT TATAAAGGTT AGTGAAAGCC 180 ATTGTATGTT ATTACTGAGT TATTTAATTT AGCTTGCTTA AATGCTTATC GTGTTGATAT 290 GATAAATGAC AAATGATACG CTGTATCAAC ATCTCAAAAG ATTAATACGA AGATCCGTCG 300 ACCTGCAGCC AAGCTT 316 (2) Informace o SEQ ID NO:8: (i) Charakteristika sekvence (A) Délka: 52 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet řetězců: jeden (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: cDNA (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO:8 GGGAAATGAG CTGTTGACAA TTAATCATGG CTCGTATAAT GTGTGGAAGC TT 52 (2) Informace o SEQ ID NO:9: (i) Charakteristika sekvence (A) Délka: 51 párů bázi (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet řetězců: jeden (D) Topologie: lineární 25

• · ···· · · • t · ♦ · é • · ··· * i « • » «·· · · ·· · · · · ·

(ii) Typ molekuly: cDNA (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO:9: CCCTTTACTC GACAACTGTT AATTAGTAGC CGAGCATATT ACACACCTTC G 51 (2) Informace o SEQ ID NO:10: (i) Charakteristika sekvence (A) Délka: 49 párů bázi (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet řetězců: jeden (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: cDNA (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO:10: CAAAAACAAC TTGATGATTT GACGAAGATG GGTATGATTT TTTTCAGGC (2) Informace o SEQ ID NO:11: (i) Charakteristika sekvence (A) Délka: 49 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet řetězců: jeden (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: cDNA (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO:11: TCAGACGTGC TTGATAATAG TGTGGAACTC GAGTATGATC CGTCGACCT (2) Informace o SEQ ID NO:12: (i) Charakteristika sekvence (A) Délka: 48 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet řetězců: jeden (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: cDNA (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO:12: GCTTATCGTG TTGATATGAT AAATGACAAA TGATACGCTG TATCAACA 48 26 (2) Informace o SEQ ID NO:13: (i) Charakteristika sekvence (A) Délka: 51 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet řetězců: jeden (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: cDNA (Xi) Popis sekvence: SEQ ID NO:13:

GCCCCGGTTC TTGACATTCT AAAAAAATGT GGAGTATCCT CGATCCGTCG A (2) Informace o SEQ ID NO:14: (i) Charakteristika sekvence (A) Délka: 51 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet řetězců: j eden (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: cDNA (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO:14:

ATTTTAATTA TTTACACCGG TTGTTGCTGA GTGATACAAT GCAAATTCCC T (2) Informace o SEQ ID NO:15: (i) Charakteristika sekvence (A) Délka: 50 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet řetězců: jeden (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: cDNA (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO:15: AAAGCAATCC TTTACAATAC TACAGAACGT GACTATATTA TCAAAAAAGG (2) Informace o SEQ ID NO:16: (i) Charakteristika sekvence (A) Délka: 51 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet řetězců: jeden 27 ··« » » • · · (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: cDNA (xi) Popis sekvence: SEQ ID N0:16: ACTGCCTCGT TATAAAGGTT AGTGAAAGCC ATTGTATGTT ATTACTGAGT T 51 (2) Informace o SEQ ID NO:17: (i) Charakteristika sekvence (A) Délka: 50 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet řetězců: jeden (D) Topologie: lineární

(ii) Typ molekuly: cDNA (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO:17: CACCCCAGGC TTTACACTTT ATGCTTCCGG CTCGTATGTT GTGTGGAATT 50 (2) Informace o SEQ ID NO:18: (i) Charakteristika sekvence (A) Délka: 50 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet řetězců: jeden (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: cDNA (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO:18 CACCCCAGGC TTTACACTTT ATGCTTCCGG CTCGTATAAT GTGTGGAATT 50 (2) Informace o SEQ ID NO:19: (i) Charakteristika sekvence (A) Délka: 50 párů bázi (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet řetězců: jeden (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: cDNA (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO:19 AAATGAGCTG TTGACAATTA ATCATCGAAC TAGTTAACTA GTACGCAAGT 50 28 (2) Informace o SEQ ID NO:20: (i) Charakteristika sekvence (A) Délka: 48 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet řetězců: jeden (D) Topologie: lineární

(ii) Typ molekuly: cDNA (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO:20: 48

AAATGAGCTG TTGACAATTA ATCATCGGCT CGTATAATGT GTGGAATT (2) Informace o SEQ ID NO:21: (i) Charakteristika sekvence 49 (A) Délka: 49 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet řetězců: j eden (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: cDNA (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO:21

TCTGGCGGTG TTGACATAAA TACCACTGGG GGTGATACTG AGCACATCA (2) Informace o SEQ ID NO:22: (i) Charakteristika sekvence (A) Délka: 50 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet řetězců: j eden (D) Topologie: lineární

(ii) Typ molekuly: cDNA (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO:22:

TCGACCGGGT ACCTCGCGAG GAATTGTGAG CGGATAACAA TTCCTCTAGA (2) Informace o SEQ ID NO:23: (i) Charakteristika sekvence (A) Délka: 50 párů bázi (B) Typ: nukleová kyselina 29 50 • · · · · · ♦ * · · (C) Počet řetězců: jeden

(D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: cDNA (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO:23: AGCTTCTAGA GGAATTGTTA TCCGCTCACA ATTCCTCGCG AGGTACCCGG 50 (2) Informace o SEQ ID NO:24: (i) Charakteristika sekvence (A) Délka: 28 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet řetězců: jeden (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: cDNA (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO:24: GGGTTCGAAG ATCTAATTCC CGGGGATC 28 (2) Informace o SEQ ID NO:25: (i) Charakteristika sekvence (A) Délka: 34 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet řetězců: jeden (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: cDNA (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO:25

TGCATTTCTA GAATTGTGAA TTGTTATCCG CTCA 34

Claims (37)

1. ** ····=h/ W- 2nY P A T E N T 0 V É N Á R 0 κ y 1. Izolované sekvence nukleové kyseliny podle Sekvence ID No. 1.
2. 2. Izolované sekvence nukleové kyseliny podle Sekvence ID No. 2.
3. 3. Izolované sekvence nukleové kyseliny podle Sekvence ID No. 3.
4. 4. Izolované sekvence nukleové kyseliny podle Sekvence ID No. 4.
5. 5. Izolované sekvence nukleové kyseliny podle Sekvence ID No. 5.
6. 6. Izolované sekvence nukleové kyseliny podle Sekvence ID No. 6.
7. 7 . Izolované sekvence nukleové kyseliny podle Sekvence ID No. 7.
8. 8 . Promotor sestávající se ze : sekvencí nukleových kyselin podle Sekvencí ID No. 1, 2, 3, 4, 5, 6 nebo 7. Ί>ν?
9. 9. Genový konstrukt zahrnující promotor operačně připojený ke strukturnímu genu; daný promotor zahrnuje sekvenci nukleových kyselin podle Sequence ID No. 1, 2, 3, 4, 5, 6 nebo 7.
10. 10. Genový konstrukt nároku 9, kde daný strukturní gen kóduje karbon anhydrázu.
11. 11. Genový konstrukt nároku 9, kde daná karbon anhydráza je lidskou karbon anhydrázou.
12. 12. Genový konstrukt nároku 9, kde daný strukturní gen kóduje glukagonu podobný peptid-1 (glucagon-like peptide-1, GLP-1), faktor uvolňující růstový hormon (growth hormone releasing factor, GRF) nebo parathyroidní hormon (parathyroid hormone, PTH) .
13. 13. Hostitelská buňka obsahující genový konstrukt skládající se z promotoru operačně připojenému k strukturnímu genu, přičemž daný promotor obsahuje nukleotidové sekvence podle Sekvencí ID No. 1, 2, 3, 4, 5, 6 nebo 7.
14. 14. Hostitelskou buňku nároku 13, kde je daná hostitelská buňka buňkou prokaryotickou.
15. 15. Hostitelskou buňku nároku 14, kde je danou prokaryotickou buňkou E. coli.
16. 16. Hostitelskou buňku nároku 14, kde daná E. coli buňka zahrnuje HB101, JM109, BL21 nebo HMS174.
17. 17. Proces produkce proteinových směsí zahrnující: transformaci hostitelské buňky sekvencí nukleové kyseliny daného genu zahrnující promotor operačně připojený k heterologní DNA sekvenci (daný promotor se skládá ze Sequence ID Nos. 1, 2, 3, • ·» »····· ·· »· ···* * * ♦ · « · · • · t · «··· · * · 1 » t ··· I ··· * · Ψ • · k c · * · ti I »·+ >» · · ··· 1« ·· 4, 5, 6 nebo 7) a expresi heterologní DNA sekvence v hostitelské buňce pro produkci proteinové směsi.
18. 18. Proces pro produkci proteinové směsi zahrnujici: expresi nukleové kyseliny v hostitelské buňce, kde je příslušná exprese řízena promotorem operačně připojeným k heterologní sekvenci nukleové kyseliny, přičemž daný promotor zahrnuje nukleotidovou sekvenci z Sequence ID Nos. 1, 2, 3, 4, 5, 6 nebo 7.
19. 19. Sekvenci nukleové kyseliny zahrnující: promotor obsahující sekvenci nukleové kyseliny označenou jako SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6 nebo 7; lac operátor a strukturní gen kde jsou promotor, operátor a strukturní gen operačně spojené.
20. 20. Sekvenci nukleové kyseliny nároku 1, kde promotor obsahuje sekvenci nukleové kyseliny označené jako SEQ ID NO:15.
21. 21. Inducibilní promotor zahrnující sekvenci nukleové kyseliny označenou jako SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6 nebo 7.
22. 22. Inducibilní promotor zahrnující sekvenci nukleové kyseliny označenou jako SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6 nebo 7 operativně připojený k lac operátoru.
23. 23. Inducibilní promotor nároku 22, zahrnující sekvenci nukleové kyseliny označenou jako SEQ ID NO:15 a lac operátor.
24. 24. Hostitelskou buňku obsahující inducibilní promotor nároku 22.
25. 25. Hostitelskou buňku nároku 24, která je buňkou rostlinnou.
26. 26. Hostitelskou buňku nároku 24, která je buňkou prokaryotickou.
27. 27. Hostitelskou buňku nároku 24, kde se jedná o buňku E. coli.
28. 28. Sekvence nukleové kyseliny obsahující: Chlorella promotor; lac operon; a strukturní gen, kde promotor, operon a strukturní gen jsou operačně spojené.
29. 29. Sekvence nukleové kyseliny nároku 28, kde strukturní gen obsahuje sekvenci nukleové kyseliny kódující glukagonu podobný peptid 1 (glucagon-like peptide 1), faktor uvolňující růstový hormon (growth hormone releasing factor), parathyroidní hormon (parathyroid hormone), karbon anhydrázu (carbonic anhydrase), beta galaktosidázu (beta-galactosidase), chloramfenikol • ·· ·· ·»·· ♦· ·· • · · * · # ·»«,· • · · · » ··· · » ♦ ·· · » · t ··· -«· Φ 9 · · · · · · * « · ··· »» ·* ··« *· *· acetyltransferázu (chloramfenikol acetyltransferase) nebo glutation acetyltransferázu (glutathione acetyltransfersase) .
30. 30. Rostlina, která má ve svém genomu nukleovou kyselinu nároku 28.
31. 31. Rostlina, která má ve svém genomu inducibilni promotor nároku 22.
32. 32. Metoda produkce proteinu v hostitelské buňce, která zahrnuje tyto kroky: transformaci hostitelské buňky sekvenci nukleové kyseliny obsahující Chlorella promotor; lac operátor a strukturní gen kódující protein; a inkubacie transformované buňky za podmínek dostatečných pro expresi proteinu ze strukturního genu.
33. 33. Metoda nároku 32, kde jsou dané transformované buňky inkubovány při teplotách v rozsahu 21 °C - 37 °C.
34. 34. Metoda nároku 33, kde jsou dané transformované buňky inkubované při teplotě nižší než 37 °C.
35. 35. Metoda nároku 32, kde jsou dané transformované buňky inkubovány při teplotách v rozsahu 21 °C - 30 °C.
36. 36. Promotor nároku 28, kdy promotor působí při teplotách v rozsahu 21 °C - 37 °C.
37. 37. Promotor nároku 36, kdy promotor působí při teplotách nižších než 37 °C.