CZ315496A3 - Molekula nukleové kyseliny, vektor a transgenická rostlina - Google Patents

Description

Oblast techniky

9 Β B f- 0

Vynález se týká zvýšení odolnosti rostlin proti ^horobám, zvláště rezistence proti háďátkům. Dosavadní stav techniky io Háďátka (nematody) jsou malí červovití živočichové a mnoho z nich jsou parazity rostlin, zvířat nebo člověka, působících řadu onemocnění. Všechna háďátka jsou uzavřena do pevné elastické kutikuly, syntetizované pod ní uloženou hypodermis. Hlavní strukturální složkou kutikuly háďátka je kolagen, zesítěný disulfidovými vazbami a umístěný primárně v základní a vnitřní korové vrstvě. Vnější kůra, obsahující epikutikulu, je složena ze zesítěného proteinu, nazvaného kutikuiin.

Studie háďátek C. elegans a Ascaris spp. ukazují, že kutikulární kolageny háďátek se výrazně liší od intersticiálních kolagenů obratlovců v molekulové hmotnosti, uspořádání a způsobu zesítění. Výrazná odlišnost mezi odvozenými sekvencemi aminokyselin klonovaných C. elegans a kolagenovými geny obratlovců spočívá v tom, že kolageny háďátek mají relativně krátké (24 - 66) opakující se jednotky Gly-X-Y (naproti více než 300 u obratlovců) a tyto opakující se jednotky jsou přerušovány úseky, kde Gly není přítomen v každé třetí pozici; cysteinové zbytky poskytují možnost intermolekulárních disulfidických můstků. Pouze málo z mnoha

-2kolagenových genů v C. elegans však bylo detailně studováno a geny jiných háďátek téměř vůbec. (Seikirk et. al. 1989, Molec. Biochem. Parasitol. 32, 229-246; Cox et al. 1990 Exp. Parasitol. 70, 175-185).

Patogenní háďátka rostlin jsou hlavním problémem zemědělství, způsobujícím výrazné ztráty sklizně a výtěžku. Rostlinná tkáň a zvláště kořenová tkáň je poškozována pastvou háďátek. Taková pastva může způsobit mechanické poškození tkáně a doprovázející vstříknutí enzymů háďátek může způsobit další rozpad tkáně. Háďátkové infekce kořenů mají za následek vznik kořenových hálek a poruch růstu kořenů. Podobné příznaky doprovázejí infekci háďátky jiných částí rostlin.

Mezi důležitá háďátka patogenní pro rostliny patří háďátka způsobující nádory kořenů (root knot), jako je Meloidogyne (např. M. incognita)', háďátka způsobující cysty, jako Heterodera (např. H. glycines, H. schachtii) a Globodera (např. G. rostochiensis, G. pallida) zvláště na sóje, pšenici, cukrové řepě a bramborech; háďátka způsobující léze jako Pratylenchus; zavrtávající se háďátka jako Radopholus similis; háďátka stonků a hlíz, jako Ditylenchus (např. D. dipsaci); háďátka citrusů, jako Tylenchulus; háďátka hálek semen, jako Anguina; a háďátka listů, jako Aphelenchoides.

Infekce háďátky může být doprovázena bakteriální nebo houbovou infekcí. V takových komplexních onemocněních rostlin mohou vést škody, způsobené háďátky, ke zvýšení vážnosti infekce bakteriemi nebo houbami. Infekcí háďátky se zvyšuje vadnutí působením plísní Fusarium a Verticillium, odumírání působením Pythium, hniloba kořenů působením Rhizoctonia a Phytophtora, stejně jako bakteriální vadnutí, způsobené bakteriemi Pseudomonas solanacearum a Corynebacterium incidiosum. Navíc jsou různá háďátka (Xiphinema, Longidorus, Trichodorus a Paratrichodorus) vektory pro patogenní viry rostlin.

- 3 Pokusy ovlivnit infekci háďátky vedly u řady druhů plodin k vyvinutí (technikami konvenčního křížení) kultivarů rezistentních k háďátkům. V případě kultivarů, rezistentních k háďátkům způsobujícím cysty, je odolnost ve skutečnosti proti rozmnožování háďátek spíše než jejich invazi, takže může stále ještě dojít k poškození rostliny. U takových rostlin je proto také nutné provádět selekci na toleranci.

Množení háďátek, patogenních pro rostliny, bylo také ovlivňováno použitím obměny plodin, nebo použitím chemických nematicidů.

Komerčně používané nematicidy jsou obecně vždy fumiganty (např. halogenované alifatické uhlovodíky nebo methylizothiokyanátové prekurzorové sloučeniny) nebo nefumiganty (např. organofosfáty a oximkarbamáty). Použití chemických nematicidů je však spojeno se vzrůstajícím množstvím obtíží.

Nematicidy jsou vysoce toxické pro jiná zvířata, včetně člověka. Jsou tedy rizikové nejen pro uživatele, ale také pro prostředí. V USA byly některé nematicidy (např. DBCP, EDB, D-D, aldikarb a karbofuran) nalezeny ve spodních vodách. Pro své škodlivé účinky na člověka a jiné necílové organismy, jejich persistenci v půdě a jejich koncentraci ve spodní vodě byly po celém světě nematicidy staženy z trhu. Výsledkem toho je to, že dnes existuje naléhavá potřeba účinnějších a bezpečnějších prostředků pro potlačování háďátek, parazitujících na rostlinách.

Určitý zájem byl spojen s objevem, že mikroorganismy, izolované z půd, doplněných kolagenem nebo chitinem, byly účinné proti půdním háďátkům stejně jako kultivační médium, ve kterém miokroorganismy rostly. Příkladem takového mikroorganismu z kolagenem obohacené půdy je Cunninghamella elegans, jehož použití jako nematicidního organismu se popisuje v EP O 354 491. Houba

3o neparazituje na háďátkách, takže její působení se zdá být nepřímé. Filtráty kultury tohoto organismu byly při potlačování háďátek účinné a

-4 bylo zjištěno, že obsahují jak proteázovou, tak i kolagenázovou aktivitu (Galper et al. 1991 J. Nematology 23, 269-274). Tito autoři prohlašují: „Předpokládáme, že potlačení M. javanica přídavkem kolagenu do půdy je výsledkem produkce kolagenázy a následným poškozením kutikuly háďátka“.

Čisté proteázy a kolagenázy mají vliv na velké množství háďátek, parazitujících na rostlinách, in vitro (Miiler & Sands 1977, J. Nematol: 9, 192-197). Ačkoliv mnoho kolagenáz má proteolytickou aktivitu a četné proteázy mohou hydrolyzovat denaturovaný kolagen io (želatinu), v žádném případě není jisté, že účinek na háďátka je způsoben výhradně kolagenolytickou aktivitou.

Bylo zjištěno, že kolagenolytickou aktivitu má velké množství enzymů ze široké oblasti zdrojů. Zvláště intenzívně byl studován např. enzym bakterie Clostridium histolyticum a dvě novější publikace is popisují charakterizaci jiných bakteriálních kolagenáz s různými molekulárními strukturami (Takeuchi et. al., 1992 Biochem. J. 281, 703-708, Kato et. al., 1992, J. Bact. 174, 3889-3895). Jak je uvedeno výše, u nematicidních hub byly identifikovány enzymy s kolagenázovou aktivitou. Jiné kolagenázy byly nalezeny v mořských ježovkách (Lepage & Gache, 1990 EMBO J. 9, 3003-3012), krabech (Arnoux et. al., 1990, J. Computer Aided Design 4, 107-116), racích (Bode et al., 1992, Nátuře 358, 164-167) a hmyzu (Lecroisey et. al., 1987, J. Biol. Chem. 262, 7546-7551). Kolagenázy se také vyskytují u vyšších organismů.

Mezi nejlépe prostudovanou skupinou enzymů s kolagenolytickou aktivitou patří metaloproteázy, působící na matrix (matrix metalloproteases) (Matrisian, 1990 Trends in Genetics 6, 121125). Kolagenolytické metaloproteázy působící na matrix mají následující charakteristiku: 1) jsou to proteinázy, které degradují

3o alespoň jednu složku extracelulární matrix vyšších organismů; 2) obsahují iont zinku (proto název metaloproteázy) a jsou inhibovány

- 5 chelatačními prostředky; 3) jsou sekretovány v latentní proenzymové formě a pro proteolytickou aktivitu vyžadují aktivaci; 4) jsou inhibovány specifickými inhibitory metaloproteáz (TIMP); a 5) mají určitou sekvenční podobnost. Byly popsány tři podtřídy, každá podtřída má několik členů:

a) Intersticiální kolagenázy: (běžně nazývané „kolagenázy“, „kolagenázy typu 1“ nebo MMP1) degradují nativní kolageny typů I, II a III. Tyto kolageny (typ I - III) v nativní formě nejsou štěpeny stromelyzinem nebo gelatinázou. Enzym štěpí jednoduchou vazbu io mezi Gly-lle nebo Gly-Leu tři čtvrtiny délky podle kolagenové trojšroubovice. Molekula kolagenu se rozvine a je pak degradována jinými proteázami nebo metaloproteázami.

b) Gelatinázy: (nebo MMP2) přednostně degradují denaturovaný kolagen typu IV (kolagen spodní membrány), V a VII.

c) Stromelyzin: (nebo MMP3) má velmi širokou aktivitu, ale nedegraduje intersticiální kolagen. MMP3 má přibližně 54 % sekvenční identitu na úrovni aminokyselin a 71 % nukleotidovou podobnost k MMP1. Gelatináza je evolučně vzdálenější.

Je tedy mnoho rozdílných typů kolagenázy, každá s různými

2o vlastnostmi a charakteristikami.

Jeden z přístupů k biologickému boji proti háďátkům zahrnul expresi lidských kolagenázových genů v transgenních rostlinách, jak stručně popisuje Havstad et al., (1991, Abstract 345 of the Third International Congress of Plant Molecular Biology: Molecular Biology of Plant Growth and Development, Tucson Arizona, USA).

Ve dvou typech konstruktů byly použity a exprimovány v rostlinách tři rozdílné kolagenázové cDNA. Kolagenázy byly (i) kolagenáza (exprimována konstruktem pCol 185.2, Goldberg et al. 1986), enzym typu MMP-1, (ii) gelatináza (exprimována konstruktem pGel 186.2 Collier et al. 1988), enzym typu MMP-2 a (iii) stromelyzin,

- 6 exprimovaný konstruktem pStrom, (Wilhelm et. al. 1987), enzym typu MMP-3. Enzymy, kódované těmito DNA konstrukty, byly tyto dva:

a) Prepro enzymy, které tedy měly (v sekvenci) signální peptid, peptid prokoiagenázu, maturní enzym kolagenázu. Kódovací oblast konstruktu byla následována nepřekládanou 3'-oblastí, která obsahuje přídavné sekvence poly(A), jejichž zdrojem není rostlina.

b) Maturní kolagenázová sekvence „s nebo bez“ sekvence poly(A), jejímž zdrojem není rostlina.

Nejvyšší úrovně exprese byly hlášeny pro maturní pStrom s io rostlinným poly(A).

V abstraktu se uvádí, že „právě se analyzují rostliny, transformované úplnými konstrukty pStrom a pCol 185.2 a provádí se přizpůsobení pGel 186.2 pro expresi v rostlinách. Provádí se testy účinnosti proti háďátkům s Meloidogyne (nádory kořenů) a is Pratylenchus“. Pokud mohli autoři předkládaného vynálezu zjistit, nebyly dosud publikovány žádné výsledky. Vzhledem k době, která do nynějška uplynula, by se zdálo, že Havstad et. al. nebyli schopni získat transgenní rostliny se zvýšenou odolností proti háďátkům. Podle toho objev Havstada a dalších nemůže být pokládán za oprávněný.

Podstata vynálezu

Jedním předmětem vynálezu je molekula nukleové kyseliny, schopná zvýšit odolnost rostliny proti infekci háďátky, obsahující sekvenci nukleotidů, kódující polypeptid s kolagenázovou aktivitou nebo jeho prekurzor, přičemž nukleotidová sekvence je operativně připojena k promotoru, který je v rostlinách aktivní.

Pro účely tohoto vynálezu se termín kolagenáza vztahuje k jakémukoliv enzymu, schopnému degradace kolagenu. S výhodou je

- 7 kolagenáza nebo její prekurzor metaloproteáza, výhodněji metaloproteáza působící na matrix a nejvýhodněji metaloproteáza typu I působící na matrix.

Příkladem vhodného výchozího materiálu je sekvence 5 metaloproteázy působící na matrix typu 1 (MMP), ukázaná na obr. 1. Konkrétní sekvence, identifikovaná na obr. 1, kóduje aktivní metaloproteázu působící na matrix (tj. bez pre-pro-sekvence). Taková sekvence může být modifikována, takže přímo kóduje aktivní formu enzymu, exprimovatelnou v rostlinách. Toho lze snadno dosáhnout io modifikací sekvence nukleotidů tak, aby zahrnovala startovací kodon ATG (kódující methionin), v podstatě těsně přiléhající k 5'konci, a ve správném čtecím rámci sekvenci, kódující maturní enzym MMP.

Je proto výhodné, když sekvence nukleotidů kóduje polypeptid, který neobsahuje „pre-pro“ části kolagenázového enzymu, a tím is nevyžaduje žádné úpravy (processing) pro dosažení kolagenolytické aktivity.

Je žádoucí přizpůsobit různými způsoby molekulu nukleové kyseliny, aby se zlepšila exprese sekvence, kódující kolagenolytický polypeptid nebo prekurzor v rostlinách.

2o Příklady změn pro zlepšení exprese v hostitelských rostlinách zahrnují změny sekvence v blízkosti ATG kodonu, zvláště bezprostředně přiléhající k 5'konci ATG kodonu, takže se sekvence stane bližší sekvenci pro iniciační kodon rostliny. Sekvence bude také výhodně obsahovat polyadenylační signál, odvozený z rostlinného zdroje.

Navíc ke zlepšení úrovně exprese maturní kolagenázy v hostitelských rostlinách jsou možné jiné změny sekvence, které do proteinu zavedou případné další požadované vlastnosti. Nukleotidová sekvence může být např. změněna tak, aby lépe napodobovala použití

3o rostlinného kodonu, a mezi kodon ATG a sekvenci, kódující maturní kolagenázu, mohou být vloženy vedoucí (nebo signálové) sekvence.

- 8 Pro účely předkládaného vynálezu se nepokládá přítomnost vedoucí (leader) sekvence za zabraňující označení polypeptidu jako „maturního“, jestliže samotné odstranění vedoucí sekvence postačuje k získání plně aktivní kolagenázy.

Taková vedoucí nebo signálová sekvence obvykle obsahuje patatinovou signální sekvenci (patatin signál sequence), ale vhodné by také mohly být jiné signální sekvence, známé odborníkům v oboru, které směřují protein ven z rostlinné buňky, jako např. z rostlinného genu vztahujícího se k patogenezi („PR“).

Molekula nukleové kyseliny podle vynálezu může být s výhodou vektor. Takový vektor bude obsahovat nukleotidovou sekvenci, kódující polypeptid s kolagenázovou aktivitou nebo jeho prekurzor (s výhodou kolagenolytickou metaloproteázu), která bude operativně spojena s promotorem, aktivním v rostlinách. Vektor bude s výhodou is dále obsahovat počátek replikace účinný v bakteriích a/nebo regulační signály, rozpoznávané v rostlinách.

Odborníkům v oboru a z literatury je známo velké množství vhodných promotorů, které jsou aktivní v rostlinách. Ty zahrnují konstitutivní, a ještě lépe inducibilní promotory. S výhodou by měl být

2o promotor indukován jako odpověď na napadení háďátkem.

V jednom z provedení molekula také obsahuje prostředek pro zabránění exprese polypeptidu s kolagenázovou aktivitou v bakterii. Ten zahrnuje typicky mezerníkový (spacer) fragment, umístěný mezi sekvencí, která kóduje kolagenázu, a sousedním bakteriálním promotorem. To umožňuje manipulaci v bakterii s těmi nukleotidovými sekvencemi, kódujícími polypeptidy s kolagenolytickou aktivitou, u kterých bylo zjištěno, že jsou pro běžně používané laboratorní bakteriální kmeny toxické. Vhodný mezerníkový fragment může být odvozen od genu pro beta-glukanázu ječmene.

3o Molekula podle vynálezu může být zavedena do rostliny nebo její části s použitím odborníkům v oboru známých technik (např.

- 9 transformace nebo elektroporace). Dalším předmětem vynálezu je tedy způsob zvýšení rezistence rostliny vůči háďátkům, který zahrnuje zavedení molekuly nukleové kyseliny podle vynálezu do rostliny, takže způsobí její expresi v rostlině, nebo zvýšení exprese polypeptidu s kolagenázovou aktivitou nebo jeho prekurzoru.

Ještě dalším předmětem vynálezu je transgenní rostlina nebo její potomstvo, která má zvýšenou rezistenci vůči háďátkům, obsahující molekulu nukleové kyseliny podle vynálezu.

V dalším aspektu poskytuje vynález způsob snížení nebo 10 odstranění háďátek, infikujících rostliny, z určité oblasti půdy, který zahrnuje pěstování rostlin, odolných k háďátkům, obsahujících molekulu nukleové kyseliny podle vynálezu v této oblasti.

Háďátka nejsou schopna se v takových rostlinách rozmnožovat, takže množství háďátek v oblasti se bude snižovat. V principu pokud by v oblasti bylo velmi málo rostlin, vnímavých k háďátkům, bylo by možné odstranit z oblasti všechny háďátka, infikující rostliny.

Vynálezu je možno snadněji porozumět podle následujících příkladů a obrázků.

Příklady provedeni vynálezu

Změna genu typu I MMP, abv kódoval aktivní enzym

Byla izolována DNA, kódující pre-pro-formu MMP typu I, jejíž maturní forma má sekvenci, ukázanou na obr. 1 (nukleotidová sekvence Seq. ID. No. 1, aminokyselinová sekvence Seq. ID No.

2).Tato sekvence DNA byla upravena pro expresi v rostlinách, jak je popsáno níže.

Fragment DNA kódující aktivní MMP, popisovaný výše, nemá iniciační kodon syntézy proteinu (protože protein je in vivo syntetizován jako pre-pro-protein), takže bezprostředně v protisměru

- 10 (upstream) od sekvence pro maturní enzym byl umístěn kodon ATG (Met), aby byl v rostlině exprimován aktivní polypeptid MMP. Tento klon byl označen MET COL. Způsob byl navržen tak, aby byl minimalizován počet přebytečných aminokyselin, umístěných před maturním enzymem, a tak byl minimalizován obsah nadbytečných aminokyselin v enzymu.

S klonem MMP typu I o téměř plné délce byla provedena polymerázová řetězová reakce (PCR). Přední oligonukleotid (RS-5, Seq. ID No. 3) byl navržen tak, aby obsahoval místo SamHI, context io rostlinného iniciačního kodonu (Lutcke et. al., 1987 EMBO. J. 6, 4348), kodon ATG a sekvence, homologní k 5'konci maturní sekvence

MMP:

sekvence MMP

RS-5 5'-CGC GGATCC AACA ATG TTTGTTCTCACTCCAGGG-3' fíamHI context Met F V L T P G

Reverzní primer (MOH-32, Seq. ID No. 4) byl navržen tak, aby obsahoval místo Sa/I, terminační kodon a sekvence, homologní s 3'koncem genu MMP:

MOH-32 5'-G GTCGAC TAA TTTTTCCTGCAGTTGAAC-3'

Sa/I stop Ν K R CNF kodon sekvence MMP

Bylo provedeno třicet cyklů PCR, v každém cyklu 30 s při 94 °C, min při 45 °C a 2 min při 72 °C .

Vzniklý fragment 1,1 kb byl klonován do míst BamHl-Sall vektoru BS (Bluescript Stratagene) a byl úplně sekvenován, aby bylo zajištěno, že předpovězená sekvence aminokyselin klonu MET COL je

3o identická se sekvencí podle obr. 1.

MET COL byl potom přenesen jako fragment fíamHl-Kpnl do 35 S promotoru - Nos terminátorové kazety PBI-220.5 a poté přenesen do

- 11 Bin 19 (Bevan, M. W. 1984 Nucleic Acid Res. 12, 8711-8721) jako fragment HindiII-EcoRI.

Fuze patatinové signální sekvence

Sekvence, kódující MMP, byla dále přizpůsobena pro expresi v rostlinách zahrnutím sledu nukleotidů, kódujícího rostlinnou signální sekvenci (pro vytvoření konstruktu označeného PAT COL).

Účelem vytvoření těchto konstruktů je nasměrovat enzym MMP do extracelulární části rostlinné buňky, aby napadl kutikulu háďátka.

a) Byl připraven konstrukt, který umístil patatinovou signální io sekvenci (Iturriaga et. al., 1989 Plant Cell 1, 381-390) bezprostředně v protisměru (upstream) vůči maturní sekvenci MMP. Fuze („+1“) obsahuje patatinovou signální sekvenci a první aminokyselinu maturního patatinového proteinu připojenou k N konci maturního MMP. Konstrukt je ukázán níže. Používá se běžného jednopísmenového kódu pro aminokyseliny.

signální sekvence (Seq. ID No. 5) +1 MATT RSF LIL FFMILATTSSTCA - T - FVL ...

patatin sekvence MMP

2o Patatinová vedoucí sekvence byla klonována pomocí PCR z lambda pat 18 (Bevan et. al., 1986 Nucl. Acids Res. 14, 4625-4638 a

Goldsbrough, 1989 Ph.D. thesis „A molecular analysis of Patatin gene expression“, Council for National Academie Awards, London), který obsahuje 5-kb od 5'konce patatinového genu v pUC.

Dopředný oligonukleotid (RS-1, Seq. ID No. 6) obsahoval místo

SamHI, rostlinný context a sekvence, homologní k 5'konci patatinové kódovací oblasti:

- 12 RS-1 5'-CGC GGATCC AACA ATG GCA ACT ACT AAA TCT-3' SamHI context Μ A T T K S

Patatin

Ke klonování signální sekvence plus první aminokyseliny maturního patatinového genu byl použit reverzní oligo (RS-3) ve spojení RS-1 (Seq. ID No. 7):

Dra\ io +1 RS-3 5'-AGT TCA ACA TGT GCT ACG TTT AAA GCG-3'

S S T C A T F signální sekvence

Oligonukleotid byl navržen tak, aby obsahoval místo Dral.

Štěpení Dral poskytne kodon TTT kódující fenylalanin (tj. první zbytek maturního MMP).

b) Produkty PCR byly čištěny a štěpeny BamHI a Dral.

c) 5'sekvence maturního MMP bez prvního kodonu Phe byly rovněž klonovány pomocí PCR s použitím dopředného primeru s místem SnaBI (RS-4, Seq. ID No. 8) a sekvencí homologních k MMP a reverznímu primeru MOH-32.

SnaBI

RS-4 5'- GCG TACGTA CTC ACT CCA GGG AAC CCT-3'

VLTPGNP

Sekvence RS-4 se mírně odlišuje od sekvence cDNA, ve které je zbytek valinu kódován kodonem GTA v primeru namísto GTT. Tato změna byla provedena, aby bylo zavedením místa SnaBI umožněno klonování. Štěpením SnaBI vzniká kodon GTA, kódující valin (tj. druhou aminokyselinu maturního MMP), takže změnou nukleotidové sekvence se nezmění kódovaná sekvence aminokyselin.

- 13 d) Produkt PCR byl štěpen SnaBI a Sa/I a klonován do míst SnaBI-Sa/l vektoru BS modifikovaného tak, aby obsahoval namísto Kpn\ jediné štěpicí místo SnaBI.

Klon byl úplně sekvenován, aby bylo zajištěno, že 5 předpovězená sekvence aminokyselin je identická k sekvenci podle obr. 1.

Inzert byl odstraněn štěpením SnaBI a Sa/I a ligován s PCR produkty patatinové signální sekvence z b) (viz obr. 3), a potom vložen do BS, štěpeného BamHI a Sa/I. Fuzní produkty byly io sekvenovány pro ověření správnosti konstrukce.

Obr. 3 ukazuje konstrukci MET COL a PAT COL. Ze sekvence, kódující pre-pro-kolagenázu byly odstraněny signální sekvence a ’pro’ sekvence, čímž vznikla sekvence, kódující maturni polypeptid, který má na 5'konci přidaný startkodon ATG, za vzniku MET COL. Pro vytvoření PAT COL byla k 5'konci MET COL fúzována patatinová vedoucí sekvence.

Když byl fuzní konstrukt klonován do vektoru pBI220.5 (jako fragment BamHl-Kpnl), byly získány transformanty, které však v kapalné kultuře a na zásobních plotnách rostly špatně. Transformanty poskytovaly velmi nízká množství plazmidové DNA. Potom byl klonován do Bin 19 fuzní konstrukt 35S-Nos jako fragment H/ndlIiEcoRI. Tento vektor byl použit pro transformaci kmenu agrobakterie (LB4404, GV 2260 a 3850), ale transformanty byly získávány pouze s velmi nízkou frekvencí a často obsahovaly přeuspořádanou DNA. Tato data ukazují, že fuzní konstrukt a/nebo fuzní produkt mají na E. coli a Agrobacterium škodlivý vliv. Fuzní konstrukt byl proto klonován do modifikovaného vektoru PBI 220.5. Vektor byl modifikován vložením Sph\ fragmentu o délce 540 bp do polylinkeru Sph\ mezi promotor lacZ a CaMV 35S. 540 bp „spacer“ fragment Sphl byl odvozen z

3o promotorové oblasti proti směru (upstream) genu (1-3, 1-4) betaglukanázy ječmene a obsahuje 12 bp DNA vektoru PUC na 5'konci.

- 14 Sekvence (Seq. ID No. 9) je ukázána na obr. 2. Očekávalo se, že tímto způsobem modifikovaný vektor pBI 220.5 zabrání transkripci fuzního proteinu z promotoru lacZ, která by mohla být příčinou akumulace potenciálně škodlivého fuzního polypeptidu v bakteriálních buňkách. Byly získány transformanty, obsahující fuzní konstrukt, a tento konstrukt byl klonován do Bin 19 jako fragment Hind\II-EcoRI. Vektor byl potom použit pro transformaci agrobakterie a byly získány transformanty s očekávanou strukturou plazmidu.

Všechny kmeny agrobakterie rostly na médiu YEP se vhodnými io antibiotiky. Konstrukty MMP ve vektoru Bin 19 byly zavedeny do kmene agrobakterie GV 2260 elektroporací a selekce transformantů byla prováděna kanamycinem.

Úprava (Processing) in vitro

Jako templáty pro in vitro transkripci RNA s použitím standardních postupů byly použity fuzní konstrukty MET COL a PAT COL ve vektoru BS. Transkripty in vitro byly překládány v králičím retikulocytárním in vitro translačním systému v přítomnosti (4b, 4c) nebo nepřítomnosti (4a) psích pankreatických mikrozomů. Produkty

2o byly odděleny na standardních 10 % akrylamidových gelech (SDS PAGE) a detekovány autoradiografií (obr. 4). Produkty MET-COL („Met“) jsou na pravé straně každého gelu, produkty PAT-COL („Pat“) na levé.

Obrázky 4a - c ukazují, že převažující translační produkt konstruktu MET COL má zdánlivou molekulovou hmotnost (Mwt) 41 kD (velká šipka), která těsně odpovídá očekávané velikosti. U velikostí 38 kD a 32 kD (malé šipky) jsou detekovány menší pruhy, které mohou odpovídat degradačním produktům. Převažující translační produkt konstruktu PAT COL má zdánlivou molekulovou hmotnost 42 kD

3o (velká šipka 4a), odpovídající fúzi patatinové signální sekvence - MMP

I. Při přídavku 0,7 μΙ (4b) a 1,4 μΙ (4c) mikrozomů se velikost pruhů

- 15 sníží na velikost kolagenázového (maturního) peptidů, což ukazuje, že proběhla správná úprava patatinové signální sekvence. Výsledky ukazují, že v extracelulárním prostoru rostlinných buněk bude přítomen kolagenázový protein.

Transformace rostlin

Do rostlin byly zavedeny výše popsané MMP expresní vektory.

Rostliny byly původně odvozeny z hlízových klíčků a jde o široce rozšířené variety Désirée a Maris Piper (nebo kontrolní rostliny

83 N28-47). Rostliny byly pěstovány jako výhonové kultury in vitro (shoot cuitures) při 24 °C za trvalého osvětlení (70 μΕ m s) ve skleněných zkumavkách 150 x 25 mm, volně uzavřených víčky Magenta (Magenta Corp., Chicago, III. USA). Z 5 až 6 týdnů starých rostlin byly odebrány nodální stonkové řízky s jedním listem a pěstovány v médiu MS (Marashige and Skoog), obsahujícím 1 % sacharózy a zpevněném 0,9 % agarem (Sigma) a doplněném (po autoklávování) STS, které zvyšovalo růst rostlin a produkovalo větší listy. STS (thiosíran stříbrný) byl připraven přídavkem 12 mM AgNO₃ ke stejnému objemu 96 mM Na₂S₂O₃ a po přípravě zásobního roztoku (6 mM nebo 1,5 mg/ml) byl používán v koncentraci 1 pg/ml.

Z rostlinek byly po pěti až šesti týdnech subkultivace odebrány listové explantáty; rozříznuty podél báze (odstranění řapíku a nižších 1 až 2 mm báze listu) a zbytek listu byl použit při transformačních experimentech. Ty byly prováděny přesně podle: Visser et al. (1989

Plant Mol. Biol. 12, 329-337) s malou změnou publikovaného protokolu. Stručně, explantáty byly přes noc položeny na povrchu kapalného M387. Médium (M387) obsahovalo MS soli a vitamíny, doplněné: 10 g/l sacharózy: 80 mg/l NH₄NO₃; 147 mg/l CaCI₂; 10 mg/l NAA; a 10 mg/l BAP. Další den byly explantáty ponořeny v přes noc pěstované kultuře A. tumefaciens po dobu 15 min, osušeny a položeny na pevné médium M379 pro indukci hojivého pletiva (MS soli)

- 16 doplněného vitaminy s: 1 g/l sacharózy; 4 g/l mannitolu; 0,0175 mg/l IAA; 2,25 mg/l BA a 0,8 % agaru pro zpevnění. Po dvou dnech kokultivace byly explantáty položeny na plotny s 500 pg/ml cefotaximu (Claforan Roussel) a o pět až sedm dní později byly explantáty přeneseny do média M 384 pro indukci výhonů: MS doplněné 15 g/l sacharózy: 2,25 mg/l BAP; 5 mg/l giberelinu GA3; 200 mg/l cefotaximu a 50 pg/ml kanamycinu. Každé tři nebo čtyři týdny byly explantáty přeneseny do čerstvého média M384 s 200 pg/ml cefotaximu a 50 pg/l kanamycinu. Transformované výhony byly odstraněny z explantátů a io pěstovány in vitro jak se popisuje výše a potom byly přeneseny do půdy k dalšímu růstu. Další detaily metody jsou popsány u Higgins et. al. (1992 Plant Sci. 82, 109-118) a Hulme et. al. (1992 Plant Cell.

Tiss. and Org. Cult. 31, 161-167).

is Testy odolnosti proti háďátkům

Byly provedeny dva typy testů na odolnost proti háďátkům s použitím háďátka bramborové cysty G.pallida Pa2l3: testy v kořenáčích (pot tests) na celých rostlinách ve skleníku; a testy v nádobách (canister tests) na kořenech, rostoucích na hlízových

2o explantátech. Rostliny, které ve skleníku ukázaly rezistenci, byly znovu testovány testy v nádobách.

Testy odolnosti v květináčích

Rostliny rostly v zamořené půdě, získané z lože háďátek, 25 udržovaného zvláště pro tento účel. Protože koncentrace cyst v loži byla vysoká, půda byla smísena s rašelinou aby vznikla koncentrace přibližně 20 vajíček a larev na gram půdy. Na dno 9 cm květináče bylo vloženo přibližně 2,5 cm směsi půdy s kompostem a květináč byl pak naplněn sterilizovaným zahradním kompostem. Rostliny z tkáňové

3o kultury byly pěstovány v květináčích a rostly pod světly (fotoperioda

- 17 14 hod) při přibližně 20 °C po dobu 8 až 10 týdnů. Potom byly rostliny vyjmuty z květináčů a hodnocena přítomnost cyst v kořenovém bálu. Zachovány byly pouze klony se středním výsledkem méně než jedna cysta na kořenový bal.

Testy odolnosti v nádobách

Hlízy z transgenických rostlin ze skleníku byly použity pro určení rezistence proti háďátkům v testu v uzavřené nádobě. (Phillips et. al., 1990 Ann. Appl. Biol. 96, 317-322). Z každé transgenické rostliny byly io odebrány čtyři replikáty (REP 1-4). Po šesti týdnech bylo počítáno množství viditelných samiček. Výsledky jsou uvedeny v tabulce 1 a shrnuty níže.

Výsledky testů odolnosti proti háďátkům

Výsledky ze dvou konstruktů jsou uvedeny v tab. 1, kde je buď s maturním kolagenázovým gelem fúzována patatinová signální sekvence (PET COL), nebo kde je maturní kolagenázový konstrukt (MET COL) použit bez signální sekvence.

Konstrukty PAT COL: Bylo testováno celkem 61 transformantů Maris Piper a v testech v nádobách bylo zjištěno osm odolných klonů. Bylo testováno 27 transformantů Désirée a osmnáct z nich bylo rezistentních.

Konstrukty MET COL: Na odolnost bylo testováno ve sklenících celkem 86 transformantů Maris Piper. Z nich sedm bylo vybráno pro opakované testování v nádobách, z nichž čtyři (#2, #25, #31 a #89) měly střední úroveň rezistence.

- 18 Testováno bylo také 9 rostlin Désirée (dvě v testech v květináčích a sedm v nádobách), ale žádná z nich nebyla rezistentní.

Celkový výsledek: Rezistentní linie (na G.pallida Pa 2/3)

Konstrukt	Maris Piper	Désirée
MET COL	4/86	0/9
PAT COL	8/61	18/77

Z těchto výsledků je jasné (i z výsledků v tab. 1), že PAT COL poskytuje u obou variet brambor vyšší míru rezistence než MET COL a že velmi vysoké úrovně rezistence se vyskytují pouze u konstruktů PAT COL. Ve všech případech byly úrovně rezistence vyšší než u běžným způsobem křížené částečně odolné variety (83 N 28-47). io Variace, kterou můžeme pozorovat mezi jednotlivými transformanty při použití stejného konstruktu se při expresi transgenických organismů běžně vyskytuje a připisuje se vlivům polohy (position effects). Důvod, proč bylo získáno více rezistentních rostlin Désirée než Maris Piper není jasný, ale může být způsoben relativně snadnou transformovatelností Désirée, jejímž výsledkem může být vyšší počet transgenů na rostlinu.

Výsledky testů v nádobách jsou graficky zobrazeny v obr. 5 až

7. Obr. 5 je sloupcový graf, ukazující počet cyst G.pallida u rezistentních transgenických linií Désirée PAT COL ve srovnání s kontrolními varietami Désirée, Maris Piper a částečně odolných rostlin 83 N. Podobně ukazuje obr. 6 množství cyst u rezistentních transgenních rostlin PAT COL Maris Piper a obr. 7 ukazuje počet cyst u rezistentních transgenních rostlin MET COL Maris Piper.

Zvláště povzbuzující je, že tam, kde transgenní rostliny měly rezistenci na G.pallida, úroveň rezistence může být výjimečně vysoká.

- 19 Tabulka 1

1. Konstrukt: PAT-COL

a. Kultivar: Désirée

V nádobách bylo testováno 77 transformantů

KLON	REP 1	REP 2	REP 3	REP 4	STŘED
44 i	-	0	-	0	0
29ii	0	0	-	0	0
48	0	-	0	0	0
6 Iii	0	-	0	0	0
55i	0	-	-	0	0
70i	0	1	5	l	1.75
64 i	0	0	2	4	1.5
67Ϊ	-	7	0	1	2.67
9iii	-	6	2	1	3.0
8Bi	3	2	-	1	2.0
Si	5	1	-	0	2.0
59i	0	0	1	0	0.25
15i	-	-	8	0	4
28i	17	0	-	1.	6.0
76i	12	11	11	0	8.5
I7i	13	0	2	0	3.7S
66i	12	0	0	0	3.0
54i	-	-	22	9	15.5
59 jiných klonů	>20
Désirée j (citlivé)	>100	>100	>100	>100	>100

- 20 Tabulka 1 (pokračování)

b. Kultivar. Maris Piper

V nádobách bylo testováno 61 transformantú

KLON	REP 1	REP 2	REP 3	REP 4	STŘED
32ii	-	-	0	3	1.5
9i	1	2	1	1 '	1.25
9ii	23	22	6	-	17.0
6i	4	13	20	32	17.25
4i	30	13	3	6	13.5
IBi	2	18	6	4	7.5
17i	18	31	29	20	24.5
18i	0	3	7	21	7.75
53 jiných klonů	>20
Maris Piper (citlivé)	>100	>100	>100	>100	>100

- 21 Tabulka 1 (pokračování)

2. Konstrukt: MET-COL

a. Kultivar: Désirée bylo testováno 9 transformantů (2 v květináčích, 7 v nádobách): 5 žádné z nich nebyly rezistentní

b. Kultivar: Maris Piper transformantů bylo testováno v nádobách; 5 linií bylo vybráno jako možná rezistentních a použito k testům v nádobách io

KLON	REP 1	REP 2	REP 3	REP 4	STŘED
#2	27	14	-	-	20.5
#25	5	14	23	15	14.25
#31	0	8	21	27	14.0
#89	16	19	4	5	11.0
1 jiný klon	>20
Maris Piper (citlivé)	>100	>100	>100	>100	>100
83N28-47 (částečně rezistentní)	76	30	70	84	77.5

- 22 VÝPIS SEKVENCÍ (1) Obecné informace:

(i) Žadatel: (A) Jméno: Unilever PLC (B) Ulice: Unilever House, Blackfriars (C) Město: Londýn (E) Země: Velká Británie (F) PSČ: EC4P 4BQ (ii) Název vynálezu: Molekula nukleové kyseliny, vektor a io transgenická rostlina (iii) Počet sekvencí: 9 (iv) Počítačová forma:

(A) Typ media: Floppy disk (B) Počítač: IBM PC compatible (C) Operační systém: PC-DOS/MS-DOS (D) Software: Patentln Release #1.0, Version #1.30 (EPO) (2) INFORMACE PRO SEQ ID NO:1:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 1110 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární

25

(xi) 1

POP

IS S

EKV

ENC

E: SEQ 1

D N1

0:1:

TTT

GTT

CTC

ACT

CCA

GGG

AAC CCT

CGG

TGG

GAG

AAC

ACA

CAC CTG

ACC

Phe

Val

Leu

Thr

Pro

Gly

Asn Pro

Arg

Trp

Glu

Asn

Thr

His Leu

Thr

1

5

10

15

TAC

AGG

ATT

GAA

AAT

TAC

ACA CCA

GAT

CTG

TCA

AGA

GAA

GAT GTG

GAC

Tyr

Arg

Ile

Glu

Asn

Tyr

inr Pro

Asp

Leu

Ser

Arg

Glu

Asp Val

Asp

20

25

30

CGT ι

GCC

ATT

GAG

AAA

GCC

TTT

CAA

CTC

TGG

AGC

AAT

GTC

TCA

CCC

TTG

144

Arg .

Ala

Ile

Glu

Lys

Ala

Phe

Gin

Leu

Trp

Ser

Asn

Val

Ser

Pro

Leu

35

40

45

ACC

TTC

ACC

AAG

GTC

TCC

GAG

GGT

CAA

GCA

GAC

ATA

ATG

ATA

TCC

TTT

192

Thr

Phe

Thr

Lys

Val

Ser

Glu

Gly

Gin

Ala

Asp

Ile

Met

Ile

Ser

Phe

50

55

60

GTC

AGG

GGA

GAT

CAT

CGT

GAC

AAT

TCT

CCC

TTT

GAT

GGA

CCT

GGA

GGA

240

Val

Arg

Gly

Asp

His

Arg

Asp

Asn

Ser

Pro

Phe

Asp

Gly

Pro

Gly

Gly

65

70

75

80

AAC

στ

GCT

CAT

GCT

TTT

CAG

CCA

GGC

CCA

GGT

ATT

GGA

GGG

GAT

GCT

288

Asn

Leu

Ala

His

Ala

Phe

Gin

Pro

Gly

Pro

Gly

Ile

Gly

Gly

Asp

Ala

85

90

95

CAT

TTT

GAT

GAA

GAT

GAA

AGG

TGG-

ACC

AAA

AAT

TTC

AGA

GAT

TAT

AAC

336

His

Phe

Asp

Glu

Asp

Glu

Arg

Trp

Thr

Lys

Asn

Phe

Arg

Asp

Tyr

Asn

100

105

110

TTG

TAT

CGT

GTG

GCT

GCT

CAT

GAA

CTG

GGC

CAT

TCC

CIT

GGC

CTT

TCT

384

Leu

Tyr

Arg

Val

Ala

Ala

His

Glu

Leu

Gly

His

Ser

Leu

Gly

Leu

Ser

115

120

125

CAT

TCC

ACT

GAC

ATT

GGG

GCT

KG

ATG

TAC

CCC

AAC

TAC

ATC

TAC

ACT

432

His

Ser

Thr

Asp

Ile

Gly

Ala

Leu

Met

Tyr

Pro

Asn

Tyr

Ile

Tyr

Thr

130

135

140

GGT

GAT

GTT

CAG

CTG

TCC

CAA

GAT

GAC ATT

GAT

GGC

ATC

CAG

GCC

ATC

480

Gly

Asp

Val

Gin

Leu

Ser

Gin

Asp

Asp Ile

Asp

Gly

Ile

Gin

Ala

Ile

145

150

155

160

TAT

GGA

CCT

TCC

GAA

AAC

CCC

GTT

CAG CCA

AGT

GGC

CCA

CAA

ACC

CCA

528

Tyr

Gly

Pro

Ser

Glu

Asn

Pro

Val

Gin Pro

Ser

Gly

Pro

Gin

Thr

Pro

165

170

175

CAA

GTG

TGT

GAT

AGT

AAG

CTA

ACT

TTT GAT

GCT

ATA

ACT

ACA

CTT

CGG.

576

Gin

Val

Cys

Asp

Ser

Lys

Leu

Thr

Phe Asp

Ala

Ile

Thr

Thr

Leu

Arg

180

185

190

GGA

GAA

CTA

ATG

TTC

TTT

AAA

GAC

AGG TTC

TAC

ATG

CGC

ACA

AAT

TCC

624

Gly

Glu

Leu

Met

Phe

Phe

Lys

Asp

Arg Phe

Tyr

Met

Arg

Thr

Asn

Ser

195

200

205

TTC

TAC

CCT

GAA

GTG

GAG

CTC

AAT

TTC ATT

TCT

GTG

TTC

TGG

CCA

CAA

672

Phe

Tyr

Pro

Glu

Val

Glu

Leu

Asn

Phe Ile

Ser

Val

Phe

Trp

Pro

Gin

210

215

220

GTG

CCA

AAT

GGA

CTT

CAA

GCT

GCT

TAT GAG

ATT

GCC

GAT

AGA

GAT

GAA

720

Val

Pro

Asn

Gly

Leu

Gin

Ala

Ala

Tyr Glu

Ile

Ala

Asp

Arg

Asp

Glu

225

230

235

240

- 24 GTC CGG KT KC AAA GGT AAC AAG TAC TGG GCT GK AGG GGG CAG GAT 768

Val Arg Phe Phe Lys Gly Asn Lys Tyr Trp Ala Val Arg Gly Gin Asp

245 250 255

GTG CTA TAC GGA TAC CCC AAG GAC ATC CAC AGA TCC TK GGC KC CCT 816

Val Leu Tyr Gly Tyr Pro Lys Asp Ile His Arg Ser Phe Gly Phe Pro

260 265 270

AGT

ACT

GTG

AAG

AAT

ATC

GAT GCT

GCT

GK

TK

GAG

GAA

GAT

ACT

GGG

864

Ser

Thr

Val

Lys

Asn

Ile

Asp Ala

Ala

Val

Phe

Glu

Glu

Asp

Thr

Gly

275

280

285

AAA

ACA

TAC

KC

KT

GK

GCT CAC

GAA

TGC

TGG

AGG

TAT

GAT

GAA

TAT

912

Lys

Thr

Tyr

Phe

Phe

Val

Ala His

Glu

Cys

Trp

Arg

Tyr

Asp

Glu

Tyr

290

295

300

AAA

CAA

TCC

ATG

GAT

ACA

GGT TAT

CCC

AAA

ATG

ATA

GCA

GAA

GAA

KT

960

Lys

Gin

Ser

Met

Asp

Thr

Gly Tyr

Pro

Lys

Met

Ile

Ala

Glu

Glu

Phe

305

310

315

320

CCT

GGG

AK

GGC

AAC

AAA

GK GAT

'GCT

GK

KC

CAG

AAA

GAC

GGA

KT

1008

Pro

Gly

Ile

Gly

Asn

Lys

Val Asp

Ala

Val

Phe

Gin

Lys

Asp

Gly

Phe

325

330

335

CTA

TAT

KC

KC

CAT

GGA

ACA AGG

CAG

TAC

CAA

TK

GAT

KC

AAA

ACG

1056

Leu

Tyr

Phe

Phe

His

Gly

Thr Arg

Gin

Tyr

Gin

Phe

Asp

Phe

Lys

Thr

340

345

350

AAG

AGA

AK

KG

ACT

CTC

CAA AAA

GCT

AAT

AGC

TGG

KC

AAC

TGC

AGG

1104

Lys

Arg

Ile

Leu

Thr

Leu

Gin Lys

Ala

Asn

Ser

Trp

Phe

Asn

Cys

Arg

355

360

365

AAA AAT 1Π0

Lys Asn

370 (2) INFORMACE PRO SEQ ID NO:2:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 370 aminokyselin (B) TYP: aminokyselinová (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: protein

- 25 (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:2:

Phe Val	Leu Thr	Pro Gly Asn Pro Arg Trp	Glu Asn	Thr	His Leu	Thr
1				5	10			15
Tyr Arg	Ile Glu	Asn Tyr Thr Pro Asp	Leu	Ser Arg	Glu	Asp Val	Asp
			20	25				30
Arg	Ala	Ile	Glu	Lys Ala Phe Gin Leu	Trp	Ser Asn	Val	Ser Pro	Leu
		35		40			45
Thr	Phe	Thr	Lys	Val Ser Glu Gly Gin	Ala	Asp Ile	Met	Ile Ser	Phe
	50			55		60
Val	Arg Gly Asp	His Arg Asp Asn Ser	Pro	Phe Asp Gly	Pro Gly Gly
65				70		75			80
Asn	Leu	Ala	His	Ala Phe Gin Pro Gly	Pro	Gly Ile Gly Gly Asp	Ala
				85	90			95
His	Phe	Asp	Glu	Asp Glu Arg Trp Thr	Lys	Asn Phe	Arg Asp Tyr	Asn
			100	105				110
Leu	Tyr Arg	Val	Ala Ala His Glu Leu	Gly	His Ser	Leu	Gly Leu	Ser
		115		120			125
His	Ser	Thr	Asp	Ile Gly Ala Leu Met	Tyr	Pro Asn	Tyr	Ile Tyr	Thr
	130			135		140
Gly Asp	Val	Gin	Leu Ser Gin Asp.-Asp	Ile	Asp Gly	Ile	Gin Ala	Ile
145				150		155			160
Tyr Gly	Pro	Ser	Glu Asn Pro Val Gin	Pro	Ser Gly	Pro	Gin Thr	Pro
				165	170			175
Gin	Val	Cys Asp	Ser Lys Leu Thr Phe	Asp	Ala Ile	Thr	Thr Leu	Arg
			180	185				190
Gly	Glu	Leu	Met	Phe Phe Lys Asd Arg	Phe	Tyr Met	Arg	Thr Asn	Ser
		195		200			205
Phe	Tyr	Pro	Glu	Val Glu Leu Asn Phe	Ile	Ser Val	Phe	Trp Pro	Gin
	210			215		220
Val	Pro	Asn	Gly	Leu Gin Ala Ala Tyr Glu	Ile Ala	Asp Arg Asp	Glu
225				230		235			240
Val	Arg	Phe	Phe	Lys Gly Asn Lys Tyr Trp	Ala Val	Arg Gly Gin Asp
				245	250			255
Val	Leu	Tyr Gly Tyr Pro Lys Asp Ile	His	Arg Ser	Phe Gly Phe	Pro
			260	265				270
Ser	Thr	Val	Lys Asn Ile Asp Ala Ala	Val	Phe Glu Glu Asp Thr	Gly
		275		280			285

Lys Thr Tyr Phe Phe Val Ala His Glu Cys Trp Arg Tyr Asp Glu Tyr 290 295 300

Lys Gin 305

Ser

Met Asp Thr 310

Gly Tyr Pro Lys

Met Ile Ala 315

Glu Glu

Phe 320

Pro

Gly

Ile Gly

Asn

Lys

Val

Asp

Ala

Val

Phe Gin

Lys Aso Gly

Phe

325

330

335

Leu

Tyr

Phe

Phe

HlS

Gly

Thr

Arg

Gin

Tyr Gin

Phe

Asp

Phe

Lys

Thr

340

345

350

Lys

Arg

Ile

Leu

Thr

Leu

Gin

Lys

Ala

Asn

Ser

Trp

Phe

Asn

Cys

Arg

355

360

365

Lys Asn 370 (2) INFORMACE PRO SEQ ID NO:3: io (i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 34 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární is (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:3:

CGCGGATCCA ACAATGTTTG KCTCACTCC AGGG

2) INFORMACE PRO SEQ ID NO:4:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 28 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:4:

GGTCGACTAA TTTTTCCTGC AGTTGAAC

- 27 (2) INFORMACE PRO SEQ ID NO:5:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 27 aminokyselin 5 (B) TYP: aminokyselina (C) TYP ŘETĚZCE:

(D) TOPOLOGIE: lineární (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:5:

Met Ala Thr Thr Lys Ser Phe Leu Ile Leu Phe Phe Met Ile Leu Ala 15 10 15

Thr Thr Ser Ser Thr Cys Ala Thr Phe Val Leu 20 25 (2) INFORMACE PRO SEQ ID NO:6: is (i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 31 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:6:

CGCGGATCCA ACAATGGCAA CTACTAAATC T (2) INFORMACE PRO SEQ ID NO:7: 25 (i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 27 párů baží

- 28 (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:7:

AGTTCAACAT GTGCTACGTT TAAAGCG 27 (2) INFORMACE PRO SEQ ID NO:8:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

io (A) DÉLKA: 27 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:8:

GCGTACGTAC TCACTCCAGG GAACCCT 27 (2) INFORMACE PRO SEQ ID NO:9:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 540 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:9:

GCATGCCTGC AGGTCGACCT CCATTCTGCC CCTACGATAT TCCTGGCCCG TTTTGTTTAA 60

TAAATCCAGC TAGCTAGTGC CGTGCAAGTA CTACACAATT TATGCCATAC CATTGATTGG 120

- 29 CGATGGCACT CTTAAGTGTA CACGTACTGT AAAAATACAT GTATTCTTÍC TAGCATAATT 180 GATGTACCAA CTATCAAGTG TAACACTTTA ATAGAGTAGA TTGGTGTAGA GTTAGTTGGT 240 AAACCAAGCA AATCAGGGAG GGTAAAAGAT TCACTGCACT GGAAGCTAGT CAAAGTTCAT 300 TCCTTCCTTT AAGGTTATCT AGTTCCTTTT TCTCCTTGCT CGTGGTAGAG TAGCTAGTAG 360 CTAGTGACAA GTCGGTCAAG GCGCCGGCCG TGAAAATAGC AATGTTCCTC GGCCGTGTGC 420 GTGCATCTGA CACCAACTCG TGACTGTAAC AAAAACAATA TATAAGTGCT GCATCAGCCA 480 CCAAAGTCTA GAGAGAAAGA GATAAAAAAA ATGCGCAAAG CTAGAGGCTT ACACGCATGC 540 io Přehled obrázků na výkresech

Obr. 1 ukazuje sekvenci nukleotidů, kódující maturní enzym MMP typu I spolu se sekvencí aminokyselin maturního polypeptidu.

Obr. 2 ukazuje sekvenci mezerníkového (spacer) fragmentu, použitého 15 při konstrukci vektoru, který se neexprimoval v bakterii.

Obr. 3 shrnuje způsob konstrukce plazmidů MET COL a PAT COL.

Obr. 4 ukazuje in vitro úpravu polypeptidu, exprimovaného konstruktem PAT COL.

Obr. 5 až 7 ukazují sloupcové grafy počtu cyst háďátek v rezistentních 2o transgenických rostlinách, obsahující nukleotidovou sekvenci podle vynálezu, ve srovnání s kontrolními rostlinami.

Claims (14)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Molekula nukleové kyseliny schopná zvýšit rezistenci 5 rostliny proti háďátkům, která obsahuje sekvenci nukleotidů, kódující polypeptid s kolagenázovou aktivitou nebo jeho prekurzor, přičemž uvedená nukleotidová sekvence je operativně připojena k promotoru aktivnímu v rostlinách.
2. 2 Molekula nukleové kyseliny podle nároku 1, kde sekvence nukleotidů kóduje metaloproteázu nebo její prekurzor.

   15
3. 3. Molekula nukleové kyseliny podle nároků 1 nebo 2, kde sekvence nukleotidů kóduje metaloproteázu působící na matrix (matrix metalloprotease, MMP) nebo její prekurzor.
4. 4. Molekula nukleové kyseliny podle některého z nároků 1 až

   20 3, kde sekvence nukleové kyseliny kóduje metaloproteázu působící na matrix typu I (MMP-I) nebo její prekurzor.
5. 5. Molekula nukleové kyseliny podle některého z

   25 předcházejících nároků, kde sekvence nukleové kyseliny kóduje maturní polypeptid s kolagenázovou aktivitou.

   - 31
6. 6. Molekula nukleové kyseliny podle některého z předcházejících nároků, kde sekvence nukleové kyseliny kóduje polypeptid se signální sekvencí.
7. 7. Molekula nukleové kyseliny podle některého z předcházejících nároků, kde sekvence nukleové kyseliny kóduje polypeptid, který má signální sekvenci z patatinového genu nebo z genu, vztahujícího se k patogenezi rostliny (plant pathogenesis related, PR gene).
8. 8. Molekula nukleové kyseliny podle některého z předcházejících nároků, která obsahuje sekvenci nukleotidů, kódující v podstatě sekvenci aminokyselin podle obr. 1.
9. 9. Molekula nukleové kyseliny podle některého z předcházejících nároků, která v podstatě obsahuje sekvenci nukleové kyseliny podle obr. 1.

   2o
10. 10. Molekula nukleové kyseliny podle některého z předcházejících nároků, která dále obsahuje mezerníkový (spacer) fragment.
11. 11. Molekula nukleové kyseliny podle některého z 25 předcházejících nároků, která obsahuje mezerníkový fragment s promotorem, aktivním v rostlinách.

    - 32 12

    Molekula nukleové kyseliny předcházejících nároků, která sekvenci podle obr. 2.

    Vektor, vyznačující se molekulu nukleové kyseliny předcházejících nároků.

    podle některého z obsahuje v podstatě tím, že obsahuje podle některého z
12. 14. Způsob zvýšení rezistence rostliny proti háďátkům, io vyznačující se tím, že zahrnuje vnesení molekuly nukleové kyseliny podle některého z předcházejících nároků do rostliny, takže způsobí expresi nebo zvýšení exprese polypeptidu s kolagenázovou aktivitou nebo jeho prekurzoru v rostlině.
13. 15. Transgenická rostlina nebo její potomstvo se zvýšenou rezistenci proti háďátkům, vyznačující se tím, že obsahuje molekulu nukleové kyseliny podle některého z nároků 1 až 13.
14. 16. Způsob snížení výskytu nebo odstranění háďátek, infikujících rostliny z plochy půdy, vyznačující se tím, že zahrnuje pěstování rostlin odolných k háďátkům, obsahujících molekulu nukleové kyseliny podle některého z nároků 1 až 13, na této ploše.

    - 33 17. Způsob podle nároku 16, vyznačující se tím, že dále zahrnuje snížení výskytu nebo vymýcení rostlin citlivých k háďátkům na určitém území, pokud se tam vyskytují.