CZ310035B6 - N-(furan-2-ylmethyl)-7H-purin-6-amin pro modulaci cirkadiánních rytmů - Google Patents

N-(furan-2-ylmethyl)-7H-purin-6-amin pro modulaci cirkadiánních rytmů Download PDF

Info

Publication number
CZ310035B6
CZ310035B6 CZ2019-757A CZ2019757A CZ310035B6 CZ 310035 B6 CZ310035 B6 CZ 310035B6 CZ 2019757 A CZ2019757 A CZ 2019757A CZ 310035 B6 CZ310035 B6 CZ 310035B6
Authority
CZ
Czechia
Prior art keywords
furan
ylmethyl
amine
purin
circadian
Prior art date
Application number
CZ2019-757A
Other languages
English (en)
Other versions
CZ2019757A3 (cs
Inventor
Jiří Voller
Palackého v Olomouci Univerzita
Martin Sládek
v. v. i. Fyziologický ústav AV ČR
Marián HAJDÚCH
Alena Sumová
Miroslav Strnad
Original Assignee
Univerzita Palackého v Olomouci
Jiří Voller
v. v. i. Fyziologický ústav AV ČR
Martin Sládek
Hajdúch Marián
Alena Sumová
Miroslav Strnad
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Univerzita PalackĂ©ho v Olomouci, Jiří Voller, v. v. i. Fyziologický ústav AV ČR, Martin Sládek, Hajdúch Marián, Alena Sumová, Miroslav Strnad filed Critical Univerzita PalackĂ©ho v Olomouci
Priority to CZ2019-757A priority Critical patent/CZ310035B6/cs
Priority to PCT/CZ2020/050094 priority patent/WO2021115502A1/en
Priority to EP20828753.2A priority patent/EP4072555B1/en
Priority to US17/781,629 priority patent/US20230039704A1/en
Publication of CZ2019757A3 publication Critical patent/CZ2019757A3/cs
Publication of CZ310035B6 publication Critical patent/CZ310035B6/cs

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/495—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with two or more nitrogen atoms as the only ring heteroatoms, e.g. piperazine or tetrazines
    • A61K31/505—Pyrimidines; Hydrogenated pyrimidines, e.g. trimethoprim
    • A61K31/519—Pyrimidines; Hydrogenated pyrimidines, e.g. trimethoprim ortho- or peri-condensed with heterocyclic rings
    • A61K31/52—Purines, e.g. adenine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/495—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with two or more nitrogen atoms as the only ring heteroatoms, e.g. piperazine or tetrazines
    • A61K31/505—Pyrimidines; Hydrogenated pyrimidines, e.g. trimethoprim
    • A61K31/506—Pyrimidines; Hydrogenated pyrimidines, e.g. trimethoprim not condensed and containing further heterocyclic rings
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/335—Heterocyclic compounds having oxygen as the only ring hetero atom, e.g. fungichromin
    • A61K31/34—Heterocyclic compounds having oxygen as the only ring hetero atom, e.g. fungichromin having five-membered rings with one oxygen as the only ring hetero atom, e.g. isosorbide
    • A61K31/341—Heterocyclic compounds having oxygen as the only ring hetero atom, e.g. fungichromin having five-membered rings with one oxygen as the only ring hetero atom, e.g. isosorbide not condensed with another ring, e.g. ranitidine, furosemide, bufetolol, muscarine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/045—Hydroxy compounds, e.g. alcohols; Salts thereof, e.g. alcoholates
    • A61K31/05—Phenols
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/095—Sulfur, selenium, or tellurium compounds, e.g. thiols
    • A61K31/10—Sulfides; Sulfoxides; Sulfones
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/13—Amines
    • A61K31/135—Amines having aromatic rings, e.g. ketamine, nortriptyline
    • A61K31/136—Amines having aromatic rings, e.g. ketamine, nortriptyline having the amino group directly attached to the aromatic ring, e.g. benzeneamine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/16—Amides, e.g. hydroxamic acids
    • A61K31/165—Amides, e.g. hydroxamic acids having aromatic rings, e.g. colchicine, atenolol, progabide
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/16—Amides, e.g. hydroxamic acids
    • A61K31/17—Amides, e.g. hydroxamic acids having the group >N—C(O)—N< or >N—C(S)—N<, e.g. urea, thiourea, carmustine
    • A61K31/175—Amides, e.g. hydroxamic acids having the group >N—C(O)—N< or >N—C(S)—N<, e.g. urea, thiourea, carmustine having the group, >N—C(O)—N=N— or, e.g. carbonohydrazides, carbazones, semicarbazides, semicarbazones; Thioanalogues thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/16—Amides, e.g. hydroxamic acids
    • A61K31/18—Sulfonamides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/185—Acids; Anhydrides, halides or salts thereof, e.g. sulfur acids, imidic, hydrazonic or hydroximic acids
    • A61K31/19—Carboxylic acids, e.g. valproic acid
    • A61K31/195—Carboxylic acids, e.g. valproic acid having an amino group
    • A61K31/197—Carboxylic acids, e.g. valproic acid having an amino group the amino and the carboxyl groups being attached to the same acyclic carbon chain, e.g. gamma-aminobutyric acid [GABA], beta-alanine, epsilon-aminocaproic acid or pantothenic acid
    • A61K31/198—Alpha-amino acids, e.g. alanine or edetic acid [EDTA]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/28—Compounds containing heavy metals
    • A61K31/282—Platinum compounds
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/335—Heterocyclic compounds having oxygen as the only ring hetero atom, e.g. fungichromin
    • A61K31/337—Heterocyclic compounds having oxygen as the only ring hetero atom, e.g. fungichromin having four-membered rings, e.g. taxol
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/335—Heterocyclic compounds having oxygen as the only ring hetero atom, e.g. fungichromin
    • A61K31/34—Heterocyclic compounds having oxygen as the only ring hetero atom, e.g. fungichromin having five-membered rings with one oxygen as the only ring hetero atom, e.g. isosorbide
    • A61K31/343—Heterocyclic compounds having oxygen as the only ring hetero atom, e.g. fungichromin having five-membered rings with one oxygen as the only ring hetero atom, e.g. isosorbide condensed with a carbocyclic ring, e.g. coumaran, bufuralol, befunolol, clobenfurol, amiodarone
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/40—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having five-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom, e.g. sulpiride, succinimide, tolmetin, buflomedil
    • A61K31/4025—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having five-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom, e.g. sulpiride, succinimide, tolmetin, buflomedil not condensed and containing further heterocyclic rings, e.g. cromakalim
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/40—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having five-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom, e.g. sulpiride, succinimide, tolmetin, buflomedil
    • A61K31/403—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having five-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom, e.g. sulpiride, succinimide, tolmetin, buflomedil condensed with carbocyclic rings, e.g. carbazole
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/40—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having five-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom, e.g. sulpiride, succinimide, tolmetin, buflomedil
    • A61K31/403—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having five-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom, e.g. sulpiride, succinimide, tolmetin, buflomedil condensed with carbocyclic rings, e.g. carbazole
    • A61K31/404—Indoles, e.g. pindolol
    • A61K31/4045—Indole-alkylamines; Amides thereof, e.g. serotonin, melatonin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/41—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having five-membered rings with two or more ring hetero atoms, at least one of which being nitrogen, e.g. tetrazole
    • A61K31/4164—1,3-Diazoles
    • A61K31/4184—1,3-Diazoles condensed with carbocyclic rings, e.g. benzimidazoles
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/435—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom
    • A61K31/4353—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom ortho- or peri-condensed with heterocyclic ring systems
    • A61K31/437—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom ortho- or peri-condensed with heterocyclic ring systems the heterocyclic ring system containing a five-membered ring having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. indolizine, beta-carboline
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/435—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom
    • A61K31/44—Non condensed pyridines; Hydrogenated derivatives thereof
    • A61K31/4427—Non condensed pyridines; Hydrogenated derivatives thereof containing further heterocyclic ring systems
    • A61K31/4439—Non condensed pyridines; Hydrogenated derivatives thereof containing further heterocyclic ring systems containing a five-membered ring with nitrogen as a ring hetero atom, e.g. omeprazole
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/435—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom
    • A61K31/47—Quinolines; Isoquinolines
    • A61K31/4738—Quinolines; Isoquinolines ortho- or peri-condensed with heterocyclic ring systems
    • A61K31/4745—Quinolines; Isoquinolines ortho- or peri-condensed with heterocyclic ring systems condensed with ring systems having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. phenantrolines
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/435—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom
    • A61K31/47—Quinolines; Isoquinolines
    • A61K31/475—Quinolines; Isoquinolines having an indole ring, e.g. yohimbine, reserpine, strychnine, vinblastine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/655—Azo (—N=N—), diazo (=N2), azoxy (>N—O—N< or N(=O)—N<), azido (—N3) or diazoamino (—N=N—N<) compounds
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/66—Phosphorus compounds
    • A61K31/675—Phosphorus compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. pyridoxal phosphate
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K33/00—Medicinal preparations containing inorganic active ingredients
    • A61K33/24—Heavy metals; Compounds thereof
    • A61K33/243—Platinum; Compounds thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/20—Hypnotics; Sedatives
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2121/00—Preparations for use in therapy

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Anesthesiology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Inorganic Chemistry (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)

Abstract

Předmětem předkládaného řešení je N-(furan-2-ylmethyl)-7H-purin-6-amin pro použití pro modulaci cirkadiánního rytmu savců, zejména člověka, což zahrnuje prevenci a/nebo léčbu chorob a dysfunkcí souvisejících s poruchami cirkadiánního rytmu, ale i prevenci důsledků nesouladu cirkadiánního rytmu jedince s vnějším prostředím. Řešení dále zahrnuje kombinaci N-(furan-2-ylmethyl)-7H-purin-6-amin s chronoterapeutiky.

Description

/V-(furan-2-ylmethyl)-7//-purin-6-amin pro modulaci cirkadiánních rytmů
Oblast techniky
Vynález se týká využití N-(furan-2-ylmethyl)-7H-purin-6-aminu (kinetin, N'-fiirfiiryladcnin. 6furfurylaminopurin) pro modulaci cirkadiánních rytmů savců včetně člověka a jejich buněk, tkání a orgánů. Taková modulace je užitečná pro léčbu jak akutních, tak chronických dysfunkcí a nemocí cirkadiánního rytmu v důsledku jak genetických, tak socio-enviromentálních faktorů.
Dosavadní stav techniky
Cirkadiánní hodiny se vyvinuly jako adaptace na 24-hodinový sluneční den, a ačkoli se jejich mechanismus u různých organismů liší, patří mezi univerzální vlastnosti života. Umožňují předvídat pravidelně se měnící vnější podmínky. Fungují však také v aperiodických podmínkách s vlastní geneticky určenou cirkadiánní periodou. Jsou synchronizovatelné vnějším prostředím a řídí metabolické, fýziologické a behaviorální rytmy. U savců jsou cirkadiánní rytmy řízeny centrálním oscilátorem umístěným v suprachiasmatických jádrech hypotalamu, tzv. SCN, který je přímo synchronizován světlem a reguluje místní hodiny v periferních tkáních, jako je mozková kůra, hippocampus, sítnice, játra, ledviny, střeva nebo slinivka. Hlavní oscilátor v SCN, a také periferní oscilátory, jsou složeny ze vzájemně propojených transkripčních a (post)translačních zpětnovazebních smyček (TTFU) tvořených rodinami hodinových genů, jako jsou Per, Bmal, Clock, Rev-Erb, Ror a Cry. Hodinové geny pak rytmicky regulují velkou skupinu převážně tkáňově specifických hodinami řízených genů s různými funkcemi včetně regulace metabolismu, fotosyntézy nebo buněčného dělení.
Je zajímavé, že hodinové geny hrají roh v celé řadě dalších procesů. Například lidský ARNTL/BMAL1 pozitivně reguluje myogenezi a negativně reguluje adipogenezi prostřednictvím transkripční kontroly genů signální dráhy Wnt. Rovněž přispívá k normální funkci pankreatických beta-buněk a reguluje glukózou stimulovanou sekreci inzulínu. Dále reguluje signální dráhu mTORCl regulací exprese MTOR a DEPTOR. Exprese chemokinů v Ly6C monocytech je také regulována pomocí ARNTL/BMAL1 (Nguyen et al. 2013). Dále reguluje expresi genů podílejících se na růstu vlasů (Watabe et al. 2013). Hraje také důležitou roli v dospělé hipokampální neurogenezi tím, že časuje vstup neuronálních kmenových buněk do buněčného cyklu. Lidský PER2 hraje roh v metabolismu lipidů (tlumením proadipogenní aktivity PPARG) a v metabolismu glukózy (regulace hladin cirkulujícího inzulínu). PER2 přispívá k udržení kardiovaskulárních funkcí prostřednictvím regulace produkce NO a vazodilatačních prostaglandinů v aortě. Reguluje také absorpci glutamátu v synaptických vezikulech, absorpci mastných kyselin v játrech a podílí se na regulaci zánětlivých procesů.
Hodinami regulované geny a proteiny mohou tvořit i více než 20 % celkového transkriptomu a proteomu v závislosti na tkáni. Jejich rytmická regulace umožňuje buňkám, tkáním a orgánům koordinovaně provádět fyziologické procesy, předvídat a připravovat se na změny prostředí. Synchronizace jednotlivých oscilátorů v periferních tkáních pomocí SCN prostřednictvím hormonálních a neuronálních signálů umožňuje přesnou koordinaci a integraci různých fýziologických funkcí.
Při absenci vnějších podnětů (například ve stálé tmě) je endogenní perioda cirkadiánního rytmu u lidí v průměru o něco delší než 24 hodin. U zcela slepých subjektů neschopných synchronizace světlem takováto perioda často chronicky přetrvává. Výsledkem jsou vzhledem k vnějšímu času volně běžící spánkové fáze těchto subjektů, což je u nich často spojené s negativními metabolickými, kognitivními a emocionálními důsledky.
- 1 CZ 310035 B6
Nesoulad cirkadiánních hodin s vnějším časem je také typickým rysem moderního života. Letecká doprava umožňuje rychlé cestování přes časová pásma, což má za následek pásmovou nemoc (jet lag). Umělé světlo umožňuje aktivitu nezávislé na přirozeném světle, které účinně synchronizuje centrální oscilátor v SCN. Osobní preference specifické spánkové fáze (tzv. chronotyp) a sociální faktory ovlivňují časování aktivity a tyto jsou spolu často v rozporu, což má za následek tzv. sociální jet lag (tj. chronický rozdíl mezi fází spánku ve volných dnech a pracovních dnech), který má negativní vliv na zdraví (Roenneberg a Merrow, 2008 [doi:0.1016/j.smrv.2007.07.005]). Obzvláště důležitý faktor způsobující cirkadiánní desynchronizaci je práce na směny kvůli její prevalenci (více než 17 % pracovní síly v EU jsou noční pracovníci). Důsledkem jsou časté problémy se spánkem, únava a snížená manuální a mentální výkonnost. Jet lag, sociální jet lag i práce na směny výrazně ovlivňují fýziologické funkce a zvyšují výskyt civilizačních chorob (Roennberg 2012 [doi:10.1016/j.cub.2012.03.038]; Roenneberg a Merrow 2016 [doi: 10.1016/j.cub.2016.04.011]). Jet lag a poruchy spánku spojené s prací na směny patří mezi spánkové poruchy podle mezinárodní klasifikace (G47.25 a G47.26, Thorpy, 2012 [doi: 10.1007/sl3311-012-0145-6]). Častí směnoví pracovníci také vykazují zvýšené riziko deprese, metabolického syndromu (Costa et al. 2016 [doi: 10.1080/07420520802114193]), rakoviny prsu, prostaty a konečníku (Sulli et al. 2019 [doi:./10.1016/j.trecan.2019.07.002]). Z toho důvodu Mezinárodní agentura WHO pro výzkum rakoviny (IARC) zařadila v roce 2007 cirkadiánní narušení mezi pravděpodobné lidské karcinogeny (skupina 2A).
Oprava narušených cirkadiánních rytmů nebo korekce jejich nesouladu s vnějším časem by mohla sloužit k terapii nebo zmírnění symptomů v řadě dysfunkcí a chorob. Mezi ně patří ty, u kterých je dysfunkce nebo nesoulad cirkadiánních hodin primární příčinou (dědičný syndrom pokročilé spánkové fáze FASPS, ASPD). Zlepšení spánku by mohlo být důležitým důsledkem takové terapie, protože délka spánku a jeho kvalita samy o sobě ovlivňují incidenci metabolických chorob. Úprava zkrácené periody a časné fáze rytmů způsobené samotným fýziologickým procesem stárnutí by mohla být velmi účinným způsobem terapie a prevence spánkových problémů spojených se stářím, díky nimž každý pátý senior užívá léky na spaní. Taková terapie by také mohla pomoci v případě subklinických, ale subjektivně špatně snášených problémů spojených s jet lagem, jako je nedostatek spánku, únava a ztráta soustředění a výkonu. Tato cirkadiánní terapie může být dokonce prospěšná u asymptomatických pacientů, u nichž jsou narušeny periferní rytmy například v důsledku nepravidelného stravování.
Cirkadiánní dysfunkce může být hodnocena měřením fýziologických (jako je tělesná teplota, srdeční aktivita, aktigrafie) nebo biochemických parametrů (melatonin, metabolity, RNA, hladiny proteinů v tělesných tekutinách). V případě dědičného onemocnění může být diagnostikováno pomocí DNA diagnostiky založené na PCRnebo sekvenování.
Modulátory cirkadiánního rytmu mohou být také použity preventivně k urychlení správného nastavení cirkadiánního systému po cestování přes časová pásma nebo při plánované změně aktivity (např. příprava na směnný provoz nebo jiné společenské aktivity).
Současným přístupům k léčbě poruch cirkadiánního rytmu dominují různé varianty terapie jasným světlem a použití melatoninu nebo syntetických agonistů melatoninových receptorů. Tyto metody však mají také významné nevýhody. Terapie jasným světlem je pro mnoho uživatelů považována za velmi nepohodlnou, protože vyžaduje vystavení se velmi vysokým úrovním světla v přesných časových oknech každý den (Zee et al., 2013 [doi: 10.1212/01.CON.0000427209.21177.aa.]). U nevidomých pacientů je vyloučená. Melatonin je účinný u jen některých pacientů s poruchami spánku. Nemá pravděpodobně významný efekt například na pacienty trpící FASPS, ASPD nebo jet lagem po cestování směrem na západ. Může vyvolat nežádoucí ospalost. Navíc existuje velká individuální variabilita v reakci na melatonin. Další nevýhoda světla nebo melatoninu je, že jejich účinek na fázi rytmů je přímo závislý na okamžité fázi centrálních hodin v SCN. Například světlo během subjektivního dne nijak nepůsobí
-2CZ 310035 B6 na fázi SCN (neresponzivní zóna fázově-responzní křivky), je proto nutné ho časovat do brzkých ranních nebo pozdních večerních hodin.
Novým účinným způsobem úpravy cirkadiánních rytmů by proto mohlo být přímé působení na molekulární cirkadiánní mechanismus. Například inhibitor CK15 (PF670462, Pfizer) velmi účinně prodlužuje periodu in vitro a in vivo u myší. Využití zahrnují poruchy rytmů způsobené předbíháním fáze (jet lag, poruchy spojené se stárnutím nebo prací na směny) a/nebo zkrácením periody (FASPS, ASPD). Důležitým zjištěním je, že PF670462 je možné využit i pro obnovení fýziologických rytmů zásadně narušených v důsledku genetického vyřazení VIP receptorů v SCN (které zkracuje periodu a způsobuje ztrátu rytmu podobně jako některé neurodegenerativní choroby) nebo v důsledku působení stálého světla (které také nejprve ovlivní periodu a poté způsobí snížení amplitudy vedoucí k úplné ztrátě rytmů) u myší (Meng et al. 2010[doi:/10.1073/pnas. 1005101107]). Jiným příkladem látky působící přímo na molekulární mechanismus je nobiletin (He, Nohara a kol. 2016 [doi:10.1016/j.cmet.2016.03.007]), který zvyšuje amplitudu rytmů na molekulární úrovni působením na jaderné receptory ROR a byl nedávno využit k zamezení vzniku metabolického syndromu u diabetického modelu myší a obnovení fýziologických rytmů v játrech myší krmených vysoce tučnou dietou (He, Nohara a kol. 2016 [doi: 10.1016/j.cmet.2016.03.007]), nebo ke snížení kognitivních defektů způsobených stálým světlem a midazolamem u myšího modelu deliria (Gile, Scott a kol. 2018 [doi: 10.1097/CCM.0000000000003077]). Podobná terapie cílící přímo na molekulární mechanismus bude prospěšná u řady poruch spojených s nej různějšími typy cirkadiánních dysfunkcí vyžadujících správnou synchronizaci, úpravu délky periody, jednorázové nastavení nové fáze, nebo zvýšení celkové integrity rytmů (viz výše). Navíc na rozdíl od terapií pomocí světla nebo melatoninu, terapie za využití látek cílících přímo molekulární mechanismus nevyžaduje SCN, je stejně efektivní ve dne i v noci a její časování pravděpodobně významně neovlivní její účinek, který může být snadno modulován pomocí změny dávky.
Je známo, že různé fýziologické procesy ovlivněné farmakologickými látkami vykazují cirkadiánní variabilitu. Patří mezi ně například metabolismus a buněčné dělení. Podobně mnoho proteinů interagujících s farmakologickými látkami vykazuje variabilní expresi během denního cyklu.
Účinnost farmakoterapie nebo její toxicita může potom záviset na časování. Například časování NSAID u osteoartritických pacientů pomáhá regulovat jejich toxicitu (Levi a Schibler 2007 [doi: 10.1146/annurev.pharmtox.47.120505.105208]), v čase se mění také účinnost statinů (Muck a kol. 2000) a různých chemoterapeutik (Dakup a kol. 2018 [doi:10.18632/oncotarget.24539]). Známá je také časová závislost účinku a toxicity radioterapie (Chán et al. 2017 [doi: 10.21037/apm.2016.09.07]). Při tom období vhodné k podání léčiva z hlediska maximální účinnosti nebo minimální toxicity může často kolidovat se spánkem pacienta nebo být mimo dobu vhodnou pro zdravotnického pracovníka provádějícího ošetření. Za těchto okolností by mohlo být užitečné posunout vnitřní cirkadiánní fázi pacienta tak, aby vnější čas vhodný pro léčbu lépe odpovídal cirkadiánní fázi kompatibilní s maximálním terapeutickým výsledkem. K tomuto účelu lze podat farmakologické činidlo modulující cirkadiánní rytmus. Přesné dávkování takového činidla umožní nejen ovlivnit periodu, ale také přesně načasovat výslednou fázi rytmů pacienta. Toto nebo jiné farmakologické činidlo může být také použito pro korekci cirkadiánní fáze po skončení léčby.
Podstata vynálezu
Vynález se týká /V-(fúran-2-ylmethyl)-7H-purin-6-aminu (kinetin, /V-fúrfuryladenin) pro použití pro modulaci cirkadiánních rytmů savců, zejména člověka.
Cirkadiánní rytmus je vnitřní cirkadiánní rytmus organismu nebo jeho buněk, tkání a orgánů. Modulace cirkadiánních rytmů zahrnuje modulaci amplitudy, periody a/nebo fáze cirkadiánního
-3 CZ 310035 B6 cyklu. Všechny tyto parametry jsou důležité pro udržování homeostázy, včetně správného fungování metabolismu a kvality spánku.
Vynález je založen na zjištění, že jV-(furan-2-ylmethyl)-7H-purin-6-amin
1) moduluje aktivitu a koncentraci molekulárních komponent savčího buněčného cirkadiánního oscilátoru, a
2) moduluje periodu a amplitudu cirkadiánního rytmu. Modulací periody je navíc možné docílit posunu fáze cirkadiánního rytmu. Toto zjištění vede k celé řadě terapeutických aplikací.
Zásadní výhodou V'-(furan-2-ylmcthyl)-7//-purin-6-aminii i oproti řadě bioaktivních látek včetně jiných íV-substituováných purinů a jejich biosterů je jeho nízká toxicita. Rattan et Clark (Biochem. Biophys. Res. Comm. 1994, vol. 201(2), 665-672 [doi: 10,1006/bbrc. 1994,17521) prokázali, že lidské fibroblasty je možné pěstovat v přítomnosti vysokých koncentrací této látky po dobu jejich replikativního života bez negativních důsledků. Látka se pod názvem Kinerase používá v klinicky testované kosmetice a v orální formě se testuje v terapii onemocnění hereditámí senzorické a autonomní neuropatie (Hereditary sensory and autonomie neuropathy, klinická zkouška NCT02274051).
Manipulace amplitudy, periody, a v případě jednorázového či krátkodobého podávání (<5 dní) i fáze, dosažitelná podáváním V'-(furan-2-ylmcthyl)-7//-piirin-6-aminii je schopna korigovat onemocnění a dysfunkce cirkadiánních rytmů.
Dysfunkce cirkadiánního rytmu je jakákoliv odchylka od normálního rytmu centrálního nebo periferního cirkadiánního oscilátoru. Zahrnuje také narušení vzájemné fyziologické synchronizace jednotlivých oscilátorů v těle. Tato dysfunkce může být důsledkem abnormální funkce komponent buněčného oscilátoru v důsledku genetických nebo epigenetických poruch, stejně tak jako změn vnitřního prostředí například v důsledků nemoci nebo stárnutí.
Onemocnění cirkadiánního rytmu a onemocnění, kde je přítomna dysfunkce cirkadiánního rytmu, zahrnují syndrom předběhnuté spánkové fáze (ASPD), včetně jeho dědičné formy (FASPS), pásmovou nemoc, sociální jet lag, cirkadiánní dysfunkci spojenou s prací na směny. A-(furan-2ylmethyl)-7H-purin-6-amin lze podávat preventivně i terapeuticky.
Modulace abnormálních vzorců cirkadiánních rytmů podáváním A-(furan-2-ylmcthyl)-7//-purin6-aminu koriguje sníženou kvalitu spánku (zlepšuje kvalitu spánku). Toto snížení může být vnímáno pouze subjektivně a nemusí dosáhnout klinického stádia. Kvalitou spánku je spokojenost se spánkovou zkušeností integrující aspekty iniciace spánku, udržení spánku, množství spánku a osvěžující efekt spánku. Jejím snížením je pak subjektivní pocit, že některý z těchto parametrů je nedostatečný, nebo objektivní pozorování změn těchto parametrů. Kvalita spánku může být posuzována pomocí dotazníků např. dotazníku Pittsburghské university o kvalitě spánku (Pittsburgh Sleep Quality Index, PSQI) nebo měřením (aktigrafie, polysomnografie). Cílová onemocnění spánku s narušenými cirkadiánními rytmy (kód G47.2 podle klasifikace ICD-10-CM 2020 Coding Guide™) zahrnují FASPS a ASPD.
Prodloužení periody cirkadiánního cyklu pomocí A-(furan-2-ylmcthyl)-7//-piirin-6-aminii má terapeutický efekt zejména v případě onemocnění, kde je perioda cirkadiánního cyklu zkrácena a/nebo dochází k předbíhání fáze jako je FASPS a ASPD. Zde je výhodné dlouhodobé podávání (více než 5 dní). Aplikace A-(furan-2-ylmcthyl)-7//-piirin-6-aminii koriguje také abnormální spánkové vzorce spojené se stárnutím, kdy dochází ke zkracování periody, předbíhání fáze (ASPD spojený se stárnutím), změně amplitudy a desynchronizaci periferních rytmů.
Opakované podání látky prodlužující periodu lze také použít k obnovení nebo stabilizaci cirkadiánního rytmu narušeného abnormálními světelnými podmínkami, či postižením částí CNS
-4CZ 310035 B6 relevantních pro generování cirkadiálního rytmu geneticky (Meng et al. 2010 [doi: 10.1073/pnas.1005101107]).
Modulace periody a/nebo fáze (posun fáze po jednorázovém nebo krátkodobém prodloužení periody) dovoluje předcházet nebo léčit onemocnění a stavy způsobené nesouladem vlastního cirkadiánního rytmu osoby nebo zvířete s vnějším prostředím. Pro preventivní a/nebo terapeutické účinky proti pásmové nemoci (jet-lag), sociálnímu jet-lagu, a/nebo poruchám spánku způsobeným prací na směny (shift-work disorder) je výhodné podávat řV-(fúran-2-ylmethyl)-7Hpurin-6-amin jednorázově nebo krátkodobě (jednorázově nebo opakovaně po dobu 1 až 5 dní). Výhodou jednorázového a krátkodobého podávání je menší zatížení organismu včetně metabolických systémů léčivem.
Předmětem vynálezu je také A-(fúran-2-ylmethyl)-7H-purin-6-amin pro použití pro modulaci odpovědi savců, včetně člověka, a jejich buněk, tkání a orgánů (in vitro nebo in vivo) ke stimulům ovlivňujícím cirkadiánní rytmus. V-(furan-2-ylmcthyl)-7//-purin-6-amin a stimulus mohou být aplikovány zároveň, například ve formě kombinovaného přípravku, nebo následně (sekvenčně).
Stimulem může být světlo, včetně umělého světla a včetně různých modalit světelné terapie. Kombinace V-(furan-2-ylmcthyl)-7//-piirin-6-aminii a světla má příznivý efekt na poruchy spánku a nálady včetně syndromu předběhnuté spánkové fáze (ASPD) (včetně jeho formy spojené se stářím a jeho dědičné formy (FASPS)), jet-lagu, sociálního jet-lagu, cirkadiánní dysfunkce spojené s prací na směny.
Stimulem může být další chronoterapeutikum. Chronoterapeutikum je látka, která moduluje cirkadiánní rytmus, případně mění jeho citlivost ke změně působením dalších stimulů.
Ve výhodném provedení je předmětem vynálezu kombinace A-(furan-2-ylmcthyl)-7//-purin-6aminu a chronoterapeutika vybraného ze skupiny zahrnující: inhibitory CSNK1D, inhibitory CSNK1A, inhibitory CSNK1E, inhibitory GSKbeta, inhibitory ALK5, aktivátory AMPK, aktivátory SIRT1, ligandy CRY, agonisty PPARG, regulátory exprese BMAL1, ligandy vasopresinoveho receptoru, REV-ERB agonisty, RORa/γ agonisty. S výhodou je toto další chronoterapeutikum vybrané ze skupiny zahrnující agonisty melatoninového receptoru včetně melatoninu, ramelteonu, tasimelteonu a agomelatinu. Tyto kombinace mají obvykle aditivní nebo synergický efekt na periodu a/nebo fázi, ale přídavek kinetinu může měnit i amplitudu. V některých případech, jako je kombinace s chronoterapeutikem harminem, přídavek kinetinu zkracuje periodu oproti stavu, kdy je použit samotný harmin. Kinetin lze tedy použít k jemnější modulaci účinku dalších chronoterapeutik.
A-(furan-2-ylmcthyl)-7//-piirin-6-amin i další účinná látka (chronoterapeutikum) se v přípravcích mohou vyskytovat mimo jiné ve formě farmaceuticky akceptovatelných solí či solvátů. Farmaceuticky akceptovatelné soli A-(furan-2-ylmcthyl)-7//-piirin-6-aminii vznikají protonací jednoho z dusíků anorganickou nebo organickou kyselinou. Příklady solí s anorganickými kyselinami zahrnují hydrochloridy, hydrobromidy, hydrojodidy, sulfáty, nitráty, fosfáty, hydrogenfosfáty, dihydrogenfosfáty, karbonáty, hydrogenkarbonáty, perchloráty. Příklady solí s organickými kyselinami zahrnují soli s jednosytnými či vícesytnými kyselinami s lineárním nebo větveným řetězcem s 2 až 20 uhlíky, jako jsou například laktát, maleát, oxalát, fúmarát, tartarát, malát, maleát, citrát, sukcinát, glykolát, nikotinát, benzoát, salicylát, askorbát, pamoát; sulfonát, methansulfonát, ethansulfonát, 2-hydroxyethansulfonát, benzensulfonát, p-toluensulfonát, 2naftalensulfonát, 3-fenylsulfonát a kafrsulfonát, aspartát nebo glutamát.
Kombinované farmaceutické přípravky pro současné podání obsahují účinné množství A-(furan2-ylmcthyl)-7//-purin-6-aminu a další účinné látky (chronoterapeutika), případně jejich farmaceuticky akceptovatelných solí nebo jiné jejich formy, samostatně nebo ve směsi s jednou nebo více pomocnými látkami jako jsou nosiče, plniva, rozpouštědla, látky umožňující degradaci
-5CZ 310035 B6 tablet, lubrikanty, látky zvyšující integritu, pigmenty, stabilizátory, konzervanty, antioxidanty, látky zvyšující rozpustnost. Přípravek může obsahovat pomocné látky zvyšující penetraci přes biologické bariéry například přes kůži. Kromě současného podání lze ale podat účinné látky samostatně (sekvenčně), v časovém rozestupu. Pak je každá z těchto účinných látek obsažena v samostatné dávkové formě, obvykle spolu s jednou nebo více pomocnými látkami
V upřednostňovaném provedení jsou tyto přípravky lékové formy pro perorální aplikaci. Pouze u cytostatik, kde je standardní formou infúze, je upřednostňovanou formou infuze. V jiném důležitém provedení jde o lékové formy pro transdermální, inhalační nebo nasální aplikaci. V dalších provedeních jde o lékové formy pro jiné formy parenterální aplikace jako je například intravenózní, intramuskulámí, subkutánní, nebo pro topické podání.
Lékové formy pro perorální aplikaci zahrnují potahované i nepotahované tablety, měkké a tvrdé želatinové tobolky, matricové tablety, roztoky, emulze, suspenze, sirupy, prachy a granule pro rekonstituci, žvýkací a efervescentní tablety. Lékové formy pro parenterální aplikaci zahrnují roztoky, emulze, suspenze a disperze, prachy a granule pro rekonstituci. Další uvažované lékové formy zahrnují supositoria, formy pro transdermální penetraci, implantáty, a formy pro insuflaci a inhalaci. Topické formy zahrnují krémy, gely, masti a náplasti.
Objasnění výkresů
Obr. 1: A'-(furan-2-ylmcthyl)-7//-purin-6-amin (látka 1) reguluje expresi genu BMAL1 a prodlužuje periodu cirkadiánního rytmu lidských buněk U2OS transdukovaných transkripčním cirkadiánním reportérem mBmall-Luc (příklad 1).
Obr. 2: A-(fúran-2-ylmethyl)-7H-purin-6-amin (látka 1) prodlužuje periodu a moduluje amplitudu cirkadiánní exprese transkripčního hodinového reportéru Per2-Luc v myších NIH3T3 buňkách (příklad 2).
Obr. 3: A-(fúran-2-ylmethyl)-7H-purin-6-amin (látka 1) prodlužuje periodu a moduluje amplitudu v organotypických explantech hypotalamického suprachiasmatického jádra (SCN). Reprezentativní záznamy luminiscence přímo ukazují hladinu PER2 proteinu, černé šipky značí čas přidání látky do média (A). Cirkadiánní perioda (B) a amplituda (C) se změnila po podání látky v dané koncentraci (příklad 3).
Obr. 4: A-(furan-2-ylmcthyl)-7//-purin-6-amin (látka 1) moduluje expresi Bmall-Luc reportéru během prvních 5 až 15 hodin po přidání do média (příklad 4).
Obr. 5: A-(furan-2-ylmcthyl)-7//-purin-6-amin(látka 1) moduluje expresi Per2-Luc reportéru během prvních 1 až 12 hodin po přidání do média (příklad 5).
Obr. 6: A-(furan-2-ylmethyl)-7H-purin-6-amin (látka 1) moduluje efekt dalších chronoterapeutik na expresi Bmall-Luc reportéru v U2OS buňkách. V médiu byla přítomna látka modulující cirkadiánní rytmy spolu s A-(furan-2-ylmethyl)-7H-purin-6-aminem (50 μΜ, černá linie) nebo spolu se stejným množstvím DMSO vehikula (šedá). Podle typu přidané látky lze pozorovat aditivní (A) nebo synergistický efekt na prodloužení periody (B,C,D,E); v případě harminu (F) došlo naopak ke zkrácení periody po přidání A-(fúran-2-ylmethyl)-7H-purin-6-aminu. Mechanismus působení látek byl následující: PF670 (PF-670462) - neselektivní inhibitor CKld/e; T0901317 - agonista ROR; KL001 - inhibitor CRY1 degradace; Rosiglitazon agonista PPARG, SR9009 - agonista REV-ERBa/b; harmin - inhibitor DYRK1 a modulátor Bmall transkripce (příklad 6).
Obr. 7. Vliv kombinace A-(fúran-2-ylmethyl)-7H-purin-6-aminu (+) nebo DMSO vehikula (-) s cytostatiky na viabilitu nádorové linie A549 (příklad 7).
-6CZ 310035 B6
Obr. 8. Vliv /V-(furan-2-ylmethyl)-7H-purin-6-aminu na růst fibroblastů BJ. Počet buněk v jamkách 24-jamkové desky po 14 dnech (příklad 9).
Příklady uskutečnění vynálezu
Příklad 1: /V-(furan-2-ylmethyl)-7H-purin-6-amin prodlužuje periodu cirkadiánního rytmu lidských buněk
Buňky lidského osteosarkomu U2OS byly pěstovány ve standardním DMEM s 10% fetálním telecím sérem. Buňky U2OS byly transdukovány pomocí lentivirových částic obsahujících reportér pLV6-Bmall-Luc (Steven Brown, Addgene plasmid # 68833) a selektovány pod Blasticidinem. Buněčná linie byla klonálně expandována a pro další experimenty byla použita jediná monoklonální buněčná linie. Buňky byly kultivovány v 384-jamkové destičce v růstovém médiu do 90+ % konfluence. Testovaná sloučenina nebo vehikulum (DMSO) byly aplikovány do záznamového média s 100 U/ml penicilinu, 100 pg/ml streptomycinu, Ix GlutaMAX (ThermoFisher, Waltham, MA, USA), 10% fetální telecí sérum (Sigma) a 0,1 mM Luciferin-EF (Promega Madison, WI, USA). Záznam luminiscence proběhl každou hodinu během dalších 144 hodin v Luminoskanu Ascent (ThermoFisher) Analýza cirkadiánního rytmu byla provedena pomocí cosinorové analýzy. Výsledky jsou zobrazeny na obrázku 1.
Tento experiment demonstruje, že V'-(furan-2-ylmcthyl)-7//-piirin-6-amin prodlužuje periodu cirkadiánního rytmu lidských buněk a může být použit k manipulaci s fází cirkadiánního rytmu například s cílem synchronizovat vnitřní cirkadiánní hodiny se solárním časem. Celkový efekt na cirkadiánní oscilace nepřímo, ale jednoznačně, prokazuje, že V'-(furan-2-ylmcthyl)-7//-piirin-6amin je možné použít i k časové modulaci koncentrace a aktivity dalších komponent oscilátoru včetně kritických komponent BMAL1, PER2, CRY and CLOCK v čase, protože tyto jsou nezbytnou součástí mechanismu generujícího rytmickou expresi použitého luminiscenčního reportéru. Nutně také dochází k ovlivnění koncentrace a hladiny dalších proteinů, jejichž rytmická exprese je řízena oscilátorem v mozku i periferních tkáních (tzv. hodinami kontrolované geny). Vliv jV-(furan-2-ylmethyl)-7H-purin-6-aminu na aktivitu komponent oscilátoru a podřízených genů také znamená ovlivnění fýziologických procesů buňky těmito geny a proteiny řízených.
Příklad 2: /V-(furan-2-ylmethyl)-7H-purin-6-amin prodlužuje periodu cirkadiánního rytmu myších buněk
Myší embryonální fibroblasty NIH3T3 buňky byly pěstovány ve standardním DMEM s 10% fetálním telecím sérem. Buňky NIH3T3 byly transfekovány 1 pg Per2-Luc reportéru (Qing Jun Meng, 2009) pomocí Gene Juice (Novagen) a selektovány pod hygromycinem. Buněčná linie byla klonálně expandována a pro další experimenty byla použita jediná monoklonální buněčná linie. Buňky byly kultivovány v 96-jamkové destičce v růstovém médiu do 90+ % konfluence. Testovaná sloučenina nebo vehikulum (DMSO) byly aplikovány do záznamového média s 100 U/ml penicilinu, 100 pg/ml streptomycinu, Ix GlutaMAX (ThermoFisher, Waltham, MA, USA), 10% fetální telecí sérum (Sigma) a 0,1 mM Luciferin-EF (Promega Madison, WI, USA). Záznam luminiscence proběhl každou hodinu během dalších 144 hodin v Luminoskanu Ascent (ThermoFisher) Analýza cirkadiánního rytmu byla provedena pomocí cosinorové analýzy. Výsledky jsou zobrazeny na obrázku 2.
Experiment demonstruje, že /V-(furan-2-ylmethyl)-7H-purin-6-amin prodlužuje periodu cirkadiánního rytmu myších buněk a může být použit k manipulaci s fází cirkadiánního rytmu například s cílem synchronizovat vnitřní cirkadiánní hodiny se solárním časem. Celkový efekt na cirkadiánní oscilace nepřímo, ale jednoznačně, prokazuje, že /V-(furan-2-ylmethyl)-7H-purin-6amin je možné použít i k časové modulaci koncentrace a aktivity dalších komponent oscilátoru
-7 CZ 310035 B6 včetně kritických komponent Bmall, Per2, Cry and Clock, protože tyto jsou nezbytnou součástí mechanismu generujícího rytmickou expresi použitého luminiscenčního reportéru. Nutně také dochází k ovlivnění koncentrace a hladiny dalších proteinů, jejichž rytmická exprese je řízena oscilátorem v mozku i periferních tkáních (tzv. hodinami kontrolované geny). Vliv /V-(fůran-2ylmethyl)-7H-purin-6-aminu na aktivitu komponent oscilátoru a podřízených genů také znamená ovlivnění fýziologických procesů buňky těmito geny a proteiny řízených.
Příklad 3: N-(furan-2-ylmcthyl)-7//-piirin-6-amin prodlužuje periodu a moduluje amplitudu cirkadiánní exprese hodinového reportéru PER2::Luc v explantovaných suprachiasmatických jádrech hypotalamu transgenní myší linie, centrálních hodinách savců.
Samci a samice myší mPer2Luc (kmen B6.129S6- Per2tmlJt / J, JAX, USA) (Yoo et al., 2004) byly udržovány v cyklu světlo/tma s 12 hodinami světla a 12 hodinami tmy (LD12: 12), zabity mezi 12:00 a 15:00, tj. 6 až 9 hodin po rozsvícení světel, rychlou cervikální dislokací v anestezii isofluranem, jejich mozky byly vyjmuty a pomocí vibratomu (Leica, Wetzlar, Německo) připraveny plátky SCN o tloušťce 250 μτη v ledovém HBSS médiu (Sigma-Aldrich, St. Luis, MO, USA). Byly připraveny dva explantáty obsahující SCN z každého mozku. Jednotlivé SCN explantáty byly poté umístěny na Millicell Culture Inserts (Merck, Darmstadt, Německo) uvnitř 35 mm Petriho misek s testovanou sloučeninou nebo DMSO vehikulem v 1 ml vzduchem pufrovaného záznamového média doplněného 100 U/ml penicilinu, 100 pg/ml streptomycinu, Ix GlutaMAX (ThermoFisher, Waltham, MA, USA), 5% fetálním telecím sérem (Sigma) a 0,1 mM Luciferinu-EF (Promega Madison, WI, USA). Misky byly utěsněny vakuovou vazelínou a skleněnými krycími sklíčky a umístěny uvnitř přístroje LumiCycle (Actimetrics) pro bioluminiscenční záznam. Analýza rytmu byla provedená v softwaru Lumicycle Analysis (Actimetrics).
Výsledky jsou zobrazeny na obrázku 3.
Příklad demonstruje, že jV-(furan-2-ylmethyl)-7H-purin-6-amin prodlužuje periodu cirkadiánního rytmu a moduluje periodu v komplexní tkáni centrálního pacemakeru a může být použit k manipulaci s fází cirkadiánního rytmu například s cílem synchronizovat vnitřní cirkadiánní hodiny se solárním časem. Celkový efekt na cirkadiánní oscilátor nepřímo, ale jednoznačně, prokazuje, že látku je možné použít i k modulaci koncentrace a aktivity dalších komponent oscilátoru včetně kritických komponent Bmal, Per2, Cry and Clock v čase. Nutně také dochází k ovlivnění koncentrace a hladiny dalších proteinů, jejichž rytmická exprese je řízena oscilátorem v mozku i periferních tkáních (tzv. hodinami kontrolované geny). Vliv řV-(fůran-2-ylmethyl)-7Hpurin-6-aminu na aktivitu komponent oscilátoru a podřízených genů také znamená ovlivnění fýziologických procesů buňky těmito geny a proteiny řízených.
Příklad 4: jV-(fůran-2-ylmethyl)-7H-purin-6-amin reguluje expresi of Bmall genu a proteinu
Buňky lidského osteosarkomu U2OS byly pěstovány ve standardním DMEM s 10% fetálním telecím sérem. Buňky U2OS byly transdukovány pomocí lentivirových částic obsahujících reportér pLV6-Bmall-Luc (Steven Brown, Addgene plasmid # 68833) a selektovány pod Blasticidinem. Buněčná linie byla klonálně expandována a pro další experimenty byla použita jediná monoklonální buněčná linie. Buňky byly kultivovány v 384-jamkové destičce v růstovém médiu do 90+ % konfluence. Testovaná sloučenina nebo vehikulum (DMSO) byly aplikovány do záznamového média s 100 U/ml penicilinu, 100 pg/ml streptomycinu, Ix GlutaMAX (ThermoFisher, Waltham, MA, USA), 10% fetální telecí sérum (Sigma) a 0,1 mM Luciferin-EF (Promega Madison, WI, USA). Záznam luminiscence proběhl každou hodinu během dalších 144 hodin v Luminoskanu Ascent (ThermoFisher). Výsledky jsou zobrazeny na obrázku 4.
Příklad demonstruje, že A'-(furan-2-ylmcthyl)-7//-piirin-6-amin reguluje expresi Bmall genu v lidských buňkách. Změna hladiny mRNA Bmall se projeví na hladině jeho proteinu. Protože tento protein řídí expresi dalších genů cirkadiánního oscilátoru a přímo aktivuje expresi řady
-8CZ 310035 B6 dalších genů obsahujících E-box v jejich regulační DNA oblasti a vykazujících cirkadiánní oscilace, jV-(fúran-2-yhnethyl)-7H-purin-6-amin má vliv i na jejich expresi.
Příklad 5: A-(fúran-2-ylmethyl)-7H-purin-6-amin reguluje expresi Per2 genu a proteinu
Myší embryonální fibroblasty NIH3T3 buňky byly pěstovány ve standardním DMEM s 10% fetálním telecím sérem. Buňky NIH3T3 byly transfekovány 1 pg Per2-Luc reportéru (Qing Jun Meng, 2009) pomocí Gene Juice (Novagen) a selektovány pod hygromycinem. Buněčná linie byla klonálně expandována a pro další experimenty byla použita jediná monoklonální buněčná linie. Buňky byly kultivovány v 96-jamkové destičce v růstovém médiu do 90+ % konfluence. Testovaná sloučenina nebo vehikulum (DMSO) byly aplikovány do záznamového média s 100 U/ml penicilinu, 100 pg/ml streptomycinu, lx GlutaMAX (ThermoFisher, Waltham, MA, USA), 10% fetální telecí sérum (Sigma) a 0,1 mM Luciferin-EF (Promega Madison, WI, USA). Záznam luminiscence proběhl každou hodinu během dalších 144 hodin v Luminoskanu Ascent (ThermoFisher). Výsledky jsou zobrazeny na obrázku 4.
Příklad demonstruje, že A-(furan-2-ylmethyl)-7H-purin-6-amin reguluje expresi Per2 genu v myších buňkách. Změna hladiny mRNA se projeví i na hladině proteinu PER2. Protože tento protein řídí expresi dalších genů cirkadiánního oscilátoru a inhibuje expresi řady dalších genů vykazujících cirkadiánní oscilace, /V-(fúran-2-ylmethyl)-7H-purin-6-amin má vliv i na jejich expresi.
Příklad 6: A-(fůran-2-ylmethyl)-7H-purin-6-amin moduluje odpověď buněk k dalším stimulům ovlivňujícím cirkadiánní rytmus
Buňky lidského osteosarkomu U2OS byly pěstovány ve standardním DMEM s 10% fetálním telecím sérem. Buňky U2OS byly transdukovány pomocí lentivirových částic obsahujících reportér pLV6-Bmall-Luc (Steven Brown, Addgene plasmid # 68833) a selektovány pod Blasticidinem. Buněčná linie byla klonálně expandována a pro další experimenty byla použita jediná monoklonální buněčná linie. Buňky byly kultivovány v 384-jamkové destičce v růstovém médiu do 90+ % konfluence. Testovaná sloučenina nebo vehikulum (DMSO) byly aplikovány do záznamového média s 100 U/ml penicilinu, 100 pg/ml streptomycinu, Ix GlutaMAX (ThermoFisher, Waltham, MA, USA), 10% fetální telecí sérum (Sigma) a 0,1 mM Luciferin-EF (Promega Madison, WI, USA). Záznam luminiscence proběhl každou hodinu během dalších 144 hodin v Luminoskanu Ascent (ThermoFisher) Analýza cirkadiánního rytmu byla provedena pomocí cosinorové analýzy. Příklad demonstruje, že A-(furan-2-ylmcthyl)-7//-purin-6-amin v kombinaci s látkami prodlužujícími cirkadiánní periodu působícími různými mechanismy účinku má aditivní či dokonce synergistický efekt na délku cirkadiánní periody v lidských buňkách a může být využit pro zvýšení účinku těchto látek. Naopak, v závislosti na mechanismu působení, u některých látek (zde harmin) dojde po přidání A-(furan-2-y 1 methyl)-7//-purin-6aminu ke zkrácení periody, může být, proto využit k negativní modulaci účinku tohoto typu látek.
Příklad 7: A-(furan-2-ylmcthyl)-7//-purin-6-amin sensitizuje nádorové buňky k cytostatikům
Resazurin je modrá slabě fluorescentní látka, která je metabolicky aktivními buňkami ireverzibilně redukována na červený vysoce fluorescentní resofúrin a používá se proto k hodnocení viability. V testu byl sledován vliv působení cytostatik na viabilitu nádorové linie A549 po předchozí expozici A-(furan-2-ylmcthyl)-7//-piirin-6-aminii (finální koncentrace 100 mikromol).
Lidská nádorová linie A549 byla pěstována ve standardním DMEM s 10% fetálním telecím sérem.
1000 buněk bylo vyseto do jednotlivých jamek 384 jamkové mikrotitrační destičky ve 30 mikrolitrech média RPMI. Po 24 hodinách byl k buňkám přidán dexamethason (100 nmolámí
-9CZ 310035 B6 finální koncentrace) s cílem synchronizovat cirkadiánní oscilátor a jV-(furan-2-ylmethyl)-7Hpurin-6-amin (100 mikromolámí finální koncentrace) nebo DMSO vehikulum. Po 12 hodinách byla k buňkám přidána testovaná cytostatika (3,3 mikromolámí finální koncentrace) nebo DMSO vehikulum. Všechny látky byly dávkovány systémem ECHO, DMSO roztoky byly 1000-krát koncentrované. Po 72 hodinovém působení byl přidán lOOOx koncentrovaný roztok resazurinu v DMSO do konečné koncentrace 0,0125 mg/ml. Fluorescence byla měřena po 3 hodinové inkubaci. Výsledky jsou zobrazeny na obrázku 7.
Bylo ukázáno, že aplikace V'-(turan-2-ylmcthyl)-7H-purin-6-amin před přidáním cytostatik zvyšuje jejich účinnost. Stejného cytotoxického efektu je pak možné dosáhnout aplikací nižší koncentrace cytostatika.
Příklad 8: V'-(furan-2-ylmcthyl)-7//-piirin-6-amin je netoxický pro lidské nenádorové linie v resazurinovém testu
Resazurin je modrá slabě fluorescentní látka, která je mitochondriemi ireverzibilně redukována na červený vysoce fluorescentní resofůrin. Používá se proto k hodnocení viability eukaryotických buněk. V testu byl sledován vliv 72-hodinového působení několika koncentrací látek (trojnásobná ředící řada, maximální koncentrace = 100 mikroM) na viabilitu lidských buněk - kožních fibroblastů BJ a buněk sítnice ARPE-19. Buňky byly pěstovány ve standardním médiu DMEM s 10% fetálním telecím sérem. 5000 buněk bylo vyseto do jednotlivých jamek 96-jamkové mikrotitrační destičky 24 hodin před přidáním testovaných látek. Jako negativní kontrola bylo použito DMSO vehiculum. Po 72-hodinovém působení byl přidán roztok lOOOx koncentrovaný roztok resazurin v DMSO do konečné koncentrace 0,0125 mg/ml. Fluorescence byla měřena po 1-hodinové (ARPE-19) případně 3-hodinové (BJ) inkubaci. Hodnoty IC10 byly vypočteny z dávkových křivek pomocí programu v jazyce R využívajícího knihovnu drc.
Byly obdrženy následující výsledky: Resazurinový test po 3 dnech inkubace - ARPE19 ICw >100 pM, BJ ICio>lOO pM.
A-(furan-2-ylmcthyl)-7//-piirin-6-amin má příznivý profil toxicity pro lidské nenádorové buňky.To je významný rozdíl oproti řadě jiných M -substlinovaných purinů a jejich biosterů z nichž mnohé jsou toxické, některé z nich kvůli tomu, že jsou to inhibitory cyklin dependentních kinas (Voliér et al. 2010 [doi: 10.1016/j.phytochem.2010.04.018], Jorda et al. 2012 [doi: 10,2174/1381612128006728041).
Příklad 9: /V-(furan-2-ylmethyl)-7H-purin-6-amin je netoxický pro normální lidské buňky během dlouhodobé kultivace
Lidské fibroblasty BJ byly pěstovány ve standardním DMEM s 10% fetálním telecím sérem.
Vlastní experiment byl proveden ve 24-jamkových kultivačních destičkách. Do jednotlivých jamek bylo vyseto přibližně 10 000 buněk v médiu DMEM s 10% telecím sérem. Testovaná sloučenina byla přidána po 24 hodinách do finální koncentrace pohybující se mezi 12,5 a 100 pM. Každá koncentrace byla testována ve 4 opakováních. DMSO vehikulum bylo testováno jako netoxická kontrola. Pro získání lepší představy o variabilitě bylo kontrolních jamek 8 (sloupce desky A a D). Kultivační médium s testovanou látkou nebo DMSO bylo vyměňováno dvakrát týdně. 12. den byly buňky ztrypsinizovány a spočteny na přístroji Coulter Z2. Testované sloučeniny v daném koncentračním rozmezí a době kultivace neovlivňují negativně růst buněk. Výsledky jsou znázorněny na obr. 8.
A-(furan-2-ylmcthyl)-7//-piirin-6-amin má příznivý profil toxicity pro lidské nenádorové buňky. To je významný rozdíl oproti řadě jiných V -siibstitiiováných purinů a jejich biosterů z nichž mnohé jsou toxické, některé z nich kvůli tomu, že jsou to inhibitory cyklin dependentních kinas
-10 CZ 310035 B6 (Voliér et al. 2010 [doi: 10.1016/j.phytochem.2010.04.018], Jorda et al. 2012 [doi: 10,2174/1381612128006728041).
Příklad 10: A-(fiiran-2-ylmethyl)-7H-purin-6-amin má příznivé farmakokinetické parametry
Analytická chemie
Kvantifikace /V-(fiiran-2-ylmethyl)-7H-purin-6-aminu ve vzorcích byla provedena pomocí systému RapidFire RF300 (Agilent Technologies) ve spojení s hmotnostním spektrometrem QTRAP 5500 (AB Sciex, Concord, Canada) s ionizačním zdrojem typu electrosprej v MRM módu. Tento systém je dále označován jako RF-MS. Příprava lyofilizovaných vzorků pro analýzu je popsána níže v sekcích věnovaných jednotlivým metodám. Lyofilizované vzorky byly rozpuštěny v mobilní fázi (95 % voda, 5 % acetonitril, 0,1 % kyselina mravenčí) obsahující příslušný vnitřní standard. Rozpuštěné vzorky byly aspirovány přímo z 96-jamkové desky do 10 μΐ kapiláry a z ní putovaly do C4 kartridže (Agilent Technologies) se solventem A (95% voda, 0,01% k mravenčí, 5% acetonitril) rychlostí of 1,5 mL/minuta po 3 vteřiny. Po odsolení byl analyt z kartridže eluován solventem B (95% acetonitril, 5%voda, 0,01% k mravenčí) do hmotnostního spekrometru rychlostí 0,4 ml/minuta po 7 s. Následovala hmotnostní spektrometrie s ionizací elektrosprejem v negativním módu. Dceřinné ionty byly identifikovány pomocí MRM protokolu.
Hodnocení stability v lidské plazmě
Testováná látka (finální koncentrace 2 μΜ) byla inkubována s lidskou plazmou 0, 15, 30, 60 a 120 min při 37 °C. Reakce byla zastavena přidáním směsi acetonitril-methanol (2:1). Vzorky byly umístěny přes noc do -80 °C a zcentrifůgovány (2811x g, 6 min, 4 °C). Supematanty byly lyofilizovány.
Hodnocení mikrosomální stability
Reakční směs byla tvořena testovanou látkou (2 μΜ), lidskými jatemími mikrosomy (ThermoFisher Scientific, 0.5 mg/ml) a systémem generujícím NADPH (NADP+, isocitrate dehydrogenasa, kyselina izocitronová a MgSCfi v 0,1 mol/1 K3PO4 pufiru). Po 0, 15, 30 a 60minutové inkubaci byla reakce zastavena přidáním směsi acetonitril-methanol (2:1). Vzorky byly umístěny přes noc do -80 °C a zcentrifůgovány (2811x g, 6 min, 4 °C). Supematanty byly lyophilizovány.
Výpočty: Vnitřní clearence byla vypočtena podle vztahu CLint = V*(0,693/tl/2), kde V je objem směsi v μΐ vztažený na hmotnost mikrosomálních proteinů v mg na danou reakci. Poločas (tl/2) byl vypočten podle vztahu tl/2 = 0.693/k, kde k je směrnice regresní přímky vztahu mezi přirozeným logaritmem procenta zbývajícího substrátu a času inkubace.
Hodnocení permeability pasivní difúzí - PAMPA
PAMPA (parallel artificial membrane permeability assay) byla provedena pomocí desek MultiScreen® Filter Plates for PAMPA (Merck Millipore) podle protokolu výrobce (PC040EN00). Před přidáním do donorových jamek byla testovaná látka byla naředěna PBS (pH 7,4) na finální koncentraci 20 μΜ. Membrána byla potažena 10% lecithinem (Sigma Aldrich) v dodekanu a akceptorové jamky byly naplněny PBS (pH 7,4). Akceptorová deska byla opatrně přenesena na donorovou desku. Inkubace probíhala 18 hodin při pokojové teplotě. Poté byly odebrány alikvoty roztoků z donorového a akceptorového roztoku a lyofilizovány.
Výpočty: Relativní permeabilita logPe byla vypočtena podle vztahu: log Pe = log{Cx-ln(l-drugA/drugE)}; kde C = (FA x FD)/{(FD+FA) x A χ T}. FD a FA jsou objemy donorového a akceptorového roztoku, A je velikost aktivního povchu v cm2, T je doba inkubace
-11 CZ 310035 B6 ve vteřinách, drugA a drugE je množství látky v akceptorovém roztoku a v roztoku v teoretické rovnováze.
Hodnocení vazby na plazmatické proteiny
Hodnocení je založeno na rychlé rovnovážné dialýze (rapid equilibrium dialysis, RED). Inzerty do destiček (Thermo Scientific™, Rockford, USA) pro RED se skládají ze dvou komůrek (červená a bílá) oddělených semipermeabilní membránou. Roztok testované látky (10 μΜ) v 10% lidské plazmě byl přenesen do červených komůrek a bílé komůrky byly naplněny PBS pufrem, pH 7,4. Po 4-hodinové inkubaci za třepání při 250 rpm byly aliquoty z obou komůrek přeneseny do mikrozkumavek. Aby aliquoty z obou komůrek měly stěnou matrici, byla přidána 10% plasma nebo PBS pufr (pH 7,4). Reakce byla zastavena přidáním směsi acetonitril-methanol (2:1). Vzorky byly zcentrifůgovány (2811x g, 6 min, 4 °C) a supematanty lyofilizovány.
Hodnocení transportu přes Caco-2 and MDR-MDCK bariéry
Caco-2 (American Tissue Type Collection) a MDR1 -MCDK (Netherlands Cancer Institute) byly pěstovány v DMEM medium s 10% fetálním telecím séru. Pro přípravu monovrstvy pro studie transportu byly buňky ztrypsinizovány a vysety na polyesterové membrány (velikost filtru 0,4 pm pro Caco-2 a 1 μιη pro MDR1-MCDK) v 96-jamkových destičkách Transwell® (Coming, NY, USA). Kultivační médium bylo přidáno do donorového i akceptorového kompartmentu. Buňky byly nechány růst, aby vytvořily monovrstvu. Kultivační médium bylo měněno každý druhý den.
Diferencované Caco-2 a MDR1-MCDK monovrstvy byly použity k testům jen pokud byly intaktní, což bylo otestováno pomocí hodnocení exkluze barviva Lucifer Yellow. Před vlastním testem permeability byly monovrstvy opláchnuty Hanksovým pufrem balanced buffer solution (Hanks balanced buffer solution - HBBS) (Gibco, Waltham, USA) a ekvilibrovány 1 h HBSS o pH 7,4. Následně byla k buňkám přidána testovaná látka (10 μΜ v HBSS pH 7,4) na Ih (MDR1MDCK) nebo 2 h (Caco-2). Po ukončení inkubace byly odebrány aliqoty z donorového i akceptorového kompartmentu a lyofilizovány.
Výpočty: Koeficient permeability byl vypočten podle vztahu Papp= (dQ/dt)/(Co x A), kde dQ/dt je rychlost permeace látky přes monovrstvu, Co je koncentrace v donorovém kompartmentu v čase t=0 a A je plocha monovrstvy. Efůxový poměr je definován jako poměr Pba/Pab, kde Pba a Pab jsou zdánlivé permeability testované látky v apikálně-bazálním a bazálně-apikálním směru. Látky s efluxovým poměrem >2 jsou považovány za látky podléhající efluxu.
Tabulka 1. Výsledky panelu farmakokinetický testů in vitro. Hodnoty Papp >20 xlO-6 pro Caco-2 a Papp >10x10-6 pro MDR-MDCK indikují dobrou orální, respektive CNS, dostupnost.
MDR1-MDCK permeabilíta (PaOT xlO-6)/ Caco-2 permeabilíta (PaopXlO'6) PAMPA permeabilíta (log Pe) Mikrosomální stabilita (60min) [% intaktní] Stabilita v plasmě (120 min) [% intaktní]
315,31 76 -5,3 90 91
jV-(fůran-2-ylmethyl)-7H-purin-6-amin je vysoce stabilní v lidské plasmě a při vystavení lidské mikrosomální frakci. Data z Caco-2 modelu střevní stěny predikují, že se bude orálně vstřebávat. Výjimečně vysoké hodnoty permeability v MDR1-MDCK modelu hematoencefalické bariéry predikují výbornou permeabilitu do CNS pravděpodobně pomocí transportéru. Penetrace do CNS je klíčová pro ovlivnění centrálního pacemakeru.
Příklad 11: Suché tobolky s A-(fůran-2-ylmethyl)-7H-purin-6-aminem a melatoninem
-12 CZ 310035 B6 tobolek, každá obsahující jako aktivní složku 500 mg jV-(furan-2-ylmethyl)-7H-purin-6-aminu a 5 mg melatoninu, se připraví následujícím postupem:
Složení jV-(furan-2-ylmethyl)-7H-purin-6-amin 25 g
Melatonin 250 mg ίο Talek 100 mg
Magnesium stearát 100 mg
Postup přípravy: Homogenizované látky jsou protlačeny přes síto s velikostí ok 0,6 mm. Dávka 0,51 g směsi je přeneseno do želatinové tobolky.

Claims (8)

1. N-(furan-2-ylmethyl)-7H-purin-6-amin pro použití pro prevenci a/nebo léčbu onemocnění cirkadiánního rytmu vybraných ze skupiny zahrnující syndrom předběhnuté spánkové fáze - ASPD a jeho dědičné formy - FASPD a FASPS.
2. N-(fUran-2-ylmethyl)-7H-purin-6-amin pro použití podle nároku 1 pro prevenci a/nebo léčbu onemocnění cirkadiánního rytmu, vybraných ze skupiny zahrnující syndrom předběhnuté spánkové fáze - ASPD, a jeho dědičné formy - FASPD a FASPS, kde N-(furan-2-ylmethyl)-7H-purin-6-amin je podáván po dobu více než 5 dnů.
3. N-(furan-2-ylmethyl)-7H-purin-6-amin pro použití pro prevenci a/nebo léčbu dysfunkcí cirkadiánního rytmu vybraných ze skupiny zahrnující pásmovou nemoc, sociální jet lag, a cirkadiánní dysfunkci spojenou s prací na směny.
4. N-(furan-2-ylmethyl)-7H-purin-6-aminu pro použití podle nároku 3 pro prevenci a/nebo léčbu dysfunkcí cirkadiánního rytmu, vybraných ze skupiny zahrnující pásmovou nemoc, sociální jet lag, poruchu cirkadiánního rytmu spojenou s prací na směny, kde N-(furan-2-ylmethyl)-7H-purin-6amin je podáván jednorázově nebo po dobu méně než 5 dnů nebo po dobu nejvýše 5 dnů.
5. Kombinace N-(furan-2-ylmethyl)-7H-purin-6-aminu a chronoterapeutika pro použití pro modulaci cirkadiánního rytmu, zejména při prevenci a/nebo léčbě onemocnění cirkadiánního rytmu vybraných ze skupiny zahrnující syndrom předběhnuté spánkové fáze - ASPD, a jeho dědičné formy - FASPD a FASPS.
6. Kombinace pro použití podle nároku 5, kde chronoterapeutikum je vybrané ze skupiny zahrnující melatonin, ramelteon, tasimelteon, agomelatin, harmin, resveratrol.
7. Kombinace N-(furan-2-ylmethyl)-7H-purin-6-aminu a chronoterapeutika pro použití pro prevenci a/nebo léčbu dysfunkcí cirkadiánního rytmu vybraných ze skupiny zahrnující pásmovou nemoc, sociální jet lag, a cirkadiánní dysfunkci spojenou s prací na směny.
8. Kombinace pro použití podle nároku 7, kde chronoterapeutikum je vybrané ze skupiny zahrnující melatonin, ramelteon, tasimelteon, agomelatin, harmin, resveratrol.
CZ2019-757A 2019-12-09 2019-12-09 N-(furan-2-ylmethyl)-7H-purin-6-amin pro modulaci cirkadiánních rytmů CZ310035B6 (cs)

Priority Applications (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CZ2019-757A CZ310035B6 (cs) 2019-12-09 2019-12-09 N-(furan-2-ylmethyl)-7H-purin-6-amin pro modulaci cirkadiánních rytmů
PCT/CZ2020/050094 WO2021115502A1 (en) 2019-12-09 2020-12-08 N-(furan-2-ylmethyl)-7h-purin-6-amine for treatment of circadian rhythm diseases, disorders and dysfunctions
EP20828753.2A EP4072555B1 (en) 2019-12-09 2020-12-08 N-(furan-2-ylmethyl)-7h-purin-6-amine for treatment of circadian rhythm diseases, disorders and dysfunctions
US17/781,629 US20230039704A1 (en) 2019-12-09 2020-12-08 N-(furan-2-ylmethyl)-7h-purin-6-amine for treatment of circadian rhythm diseases, disorders and dysfunctions

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CZ2019-757A CZ310035B6 (cs) 2019-12-09 2019-12-09 N-(furan-2-ylmethyl)-7H-purin-6-amin pro modulaci cirkadiánních rytmů

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CZ2019757A3 CZ2019757A3 (cs) 2021-06-16
CZ310035B6 true CZ310035B6 (cs) 2024-05-29

Family

ID=73870154

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CZ2019-757A CZ310035B6 (cs) 2019-12-09 2019-12-09 N-(furan-2-ylmethyl)-7H-purin-6-amin pro modulaci cirkadiánních rytmů

Country Status (4)

Country Link
US (1) US20230039704A1 (cs)
EP (1) EP4072555B1 (cs)
CZ (1) CZ310035B6 (cs)
WO (1) WO2021115502A1 (cs)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CZ2022227A3 (cs) * 2022-05-30 2023-12-13 Univerzita PalackĂ©ho v Olomouci Heterocyklické sloučeniny pro prevenci a terapii poruch cirkadiánního rytmu

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
IE20150193A1 (en) * 2015-07-01 2017-01-11 Leo Shanahan-Prendergast Kinetin (N6-Furfuryadenine) for preventing and treating mucositis and proctitis and erythemia
CN109833338A (zh) * 2017-11-25 2019-06-04 田亚婷 一种防衰老的中药制剂

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20050107411A1 (en) * 2001-12-17 2005-05-19 Macneil Douglas J. Method for treating circadian rhythm disruptions
PE20081229A1 (es) * 2006-12-01 2008-08-28 Merck & Co Inc Antagonistas de receptor de orexina de diazepam sustituido
CN101797280B (zh) * 2010-03-24 2011-11-30 西北农林科技大学 一种防衰老的中药制剂
AU2015217152A1 (en) * 2014-02-11 2016-08-11 Mitokinin, Inc. Compositions and methods using the same for treatment of neurodegenerative and mitochondrial disease

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
IE20150193A1 (en) * 2015-07-01 2017-01-11 Leo Shanahan-Prendergast Kinetin (N6-Furfuryadenine) for preventing and treating mucositis and proctitis and erythemia
CN109833338A (zh) * 2017-11-25 2019-06-04 田亚婷 一种防衰老的中药制剂

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
KADLECOVA, Alena, et al. The plant hormone kinetin in disease therapy and healthy aging. Ageing research reviews, 2019, 100958; ISSN 1568-1637 *

Also Published As

Publication number Publication date
WO2021115502A1 (en) 2021-06-17
EP4072555C0 (en) 2025-01-22
US20230039704A1 (en) 2023-02-09
EP4072555B1 (en) 2025-01-22
CZ2019757A3 (cs) 2021-06-16
EP4072555A1 (en) 2022-10-19

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Furmaga et al. Vagal nerve stimulation rapidly activates brain-derived neurotrophic factor receptor TrkB in rat brain
Ding et al. Role of blood flow in carotid body chemoreflex function in heart failure
US11180521B2 (en) Nicotinamide riboside analogs, pharmaceutical compositions, and uses thereof
US20160082015A1 (en) Methods, compositions and kits for promoting motor neuron survival and treating and diagnosing neurodegenerative disorders
Taxini et al. Control of the central chemoreflex by A5 noradrenergic neurons in rats
WO2008011071A2 (en) Interactions of hedgehog and liver x receptor signaling pathways
Yang et al. Inhibition of pyruvate dehydrogenase kinase 1 enhances the anti-cancer effect of EGFR tyrosine kinase inhibitors in non-small cell lung cancer
WO2016100385A2 (en) Compounds, compositions and methods for treating or preventing neurodegenerative disorders
US20160271157A1 (en) Beta-catenin
Koltai et al. An innovative approach to understanding and treating cancer: targeting ph: from etiopathogenesis to new therapeutic avenues
Beaumont et al. Evidence for an enhancement of excitatory transmission in adult CNS by Wnt signaling pathway modulation
Laura et al. Analysis of connexin expression during seizures induced by 4-aminopyridine in the rat hippocampus
CA2649844C (en) Pharmacological modulation of positive ampa receptor modulator effects on neurotrophin expression
Barlow et al. Conditioned media from contracting skeletal muscle potentiates insulin secretion and enhances mitochondrial energy metabolism of pancreatic beta-cells
Sciancalepore et al. A preliminary study on the role of Piezo1 channels in myokine release from cultured mouse myotubes
Singh et al. Treatment-resistant epilepsy and tuberous sclerosis complex: treatment, maintenance, and future directions
CZ310035B6 (cs) N-(furan-2-ylmethyl)-7H-purin-6-amin pro modulaci cirkadiánních rytmů
JP2013538206A (ja) オレキシン受容体拮抗薬としてのプロリンスルフォンアミド誘導体
Liu et al. Decreased hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated channels are involved in bladder dysfunction associated with spinal cord injury
Alcaraz-Iborra et al. Do Orexins contribute to impulsivity-driven binge consumption of rewarding stimulus and transition to drug/food dependence?
Olea et al. The carotid body does not mediate the acute ventilatory effects of leptin
AU2023398902A1 (en) Treatment of psychological factors affecting other medical conditions (pfaomc)
Ko et al. Bumetanide blocks the acquisition of conditioned fear in adult rats
AU2018316536A1 (en) Enhancement of cancer treatment efficiency via the sphingosine-1-phosphate pathway
Iring et al. Blood oxygen regulation via P2Y12R expressed in the carotid body