Antimikrobiální peptidy odvozené z lidského proteinu ameloblastinu, účinné na mikrobiologických biofilmech

Oblast techniky

Tato přihláška se týká nových antimikrobiálních peptidů (AMP) odvozených z lidského proteinu ameloblastinu (AMBN), určených k terapeutickému a biotechnologickému využití, zejména k aplikaci na vrstvy, tzv. biofilmy, pro zabránění růstu specifických kmenů bakteriální mikroflóry.

Dosavadní stav techniky

Antimikrobiální peptidy (AMP) lze kategorizovat jako nekonvenční terapeutické molekuly, atraktivní svým potenciálem alternativní léčby vůči narůstajícímu množství infekcí tvořených bakteriemi rezistentními vůči antibiotikům. AMP vynikají svou účinností, širokým spektrem antimikrobiální aktivity, nerozvíjející se rezistencí u mikroorganismů a nízkou akumulací v tkáních. Z těchto důvodů jsou AMP vysoce zajímavé pro farmaceutické společnosti snažící se vyvinout z AMP komerčně dostupné léky. Proto také byly v posledních dvaceti letech provedeny rozsáhlé výzkumy s cílem vyhodnotit potenciál antimikrobiálních peptidů izolovaných z různých přírodních zdrojů, jako jsou obratlovci, rostliny, hmyz a bakterie, k léčbě mikrobiálních infekcí (Wang et al., Nucleic acids research 44(D1): D1087-D1093, 2016; Čeřovský, V.: EP 3570868, US 10,160,785).

AMP byly obecně charakterizovány jako typicky krátké (<100 aminokyselin), kladně nabité, amfifilní peptidy s širokým spektrem antimikrobiální aktivity vůči bakteriím a plísním či kvasinkám, se schopností interagovat s membránami a/nebo pronikat do membrán těchto mikroorganismů (Bahar et al., Pharmaceuticals 6(12): 1543-1575, 2013). Ačkoli tvorba pórů je obecně přijímaným způsobem účinku AMP, nedávný výzkum ukazuje, že některé z těchto peptidů mají další specifické účinky na mikroorganismy, které přispívají k jejich selektivní antimikrobiální aktivitě (Zhang, Song et al., Scientific reports 6(1): 1-13, 2016; Correa, et al. Biomolecules 8(1): 4, 2019). AMP mohou zároveň s antimikrobiálními účinky působit také proti rakovině, či mít antivirové vlastnosti (Felício, et al., Frontiers in chemistry 5: 5, 2017).

V posledních letech bylo věnováno rostoucí úsilí identifikaci nových terapeutických strategií schopných vyrovnat se s infekcemi spojenými s biofilmem. Bakterie organizované v biofilmu vykazují dramaticky sníženou citlivost (až 1000krát) vůči konvenčním antibiotikům, což způsobuje vysokou míru selhání léčby a přetrvávání mnoha typů infekcí (např. plicní infekce u pacientů s cystickou fibrózou, infekce ran, infekce spojené s biomateriály) (Yasir, Willcox et al., Materials 11(12): 2468, 2018).

Vzhledem k časté tvorbě biofilmů na lékařských implantátech, jednou z aktuálně zajímavých aplikací AMP je jejich imobilizace právě na takovýchto zařízeních tak, aby se zabránilo tvorbě bakteriálního biofilmu a rovněž rozvoje (chronických) infekcí spojených s biofilmem. Tato aplikace navíc nabízí řešení k překonání problémů vztahujícím se k systémovému transportu a toxicitě AMP (Hemmati, et al., Molecular Biotechnology: 1-18, 2021). Důležitým přínosem použití AMP jako kovalentních povlaků pro implantovatelné terapeutické materiály je i jejich dlouhodobá stabilita a aktivita po potažení. I když je princip tohoto použití omezený, stále více studií popisuje účinnost proti tvorbě mikrobiálního biofilmu u důležitých druhů plísní a bakterií (např. LL-37 a magainin) a pozoruhodně vysokou dlouhodobou aktivitu potažených peptidů a stabilitu za různých extrémních podmínek (Martins, et al.,Biofouling 37(1): 96-108, 2021).

Přirozeně se vyskytující AMP jsou tedy slibnými kandidáty na léčbu infekcí spojených s mikrobiálním biofilmem nebo invazivních infekcí vyvolaných patogeny, rezistentními vůči v současné době používaným antimykotickým či antimikrobiálním látkám. Syntetické peptidy a

- 1 CZ 309667 B6 peptidomimetika založená na přírodních AMP či jejich derivátech mají potenciál stát se novými (systémovými) terapeutiky, protože překonávají hlavní omezení standardních antibiotik používaných v dnešní době. Některé AMP mohou zabíjet bakterie prostřednictvím disrupce membrány a/nebo tvorby pórů či inhibice dělení bakteriálních buněk. Další potenciál AMP zahrnuje schopnost působit v různých fázích tvorby biofilmu a s různými mechanismy účinku, AMP často vykazují multirezistentní aktivitu proti bakteriálním kmenům (Raheem and Straus 2019, Frontiers in microbiology 10: 2866, 2019). AMP mohou být dále účinné vůči bakteriím mechanismem, kterým zabraňují přilnutí bakteriálních buněk k povrchu substrátu, čímž snižují intercelulární komunikaci tzv. quorum sensing (QS), anebo odstraňují předem vytvořený biofilm; jedná se o tzv. antivirulentní mechanismy působení (Raško et al., Sperandio, Nature Reviews Drug Discovery 9(2): 117-128, 2010). Antibiofilmová aktivita AMP může být také zprostředkována downregulací genů zapojených do motility a inhibice řady buněčných biologických postupů, jako je syntéza buněčných stěn, DNA, RNA a proteinů (Di Somma, et al., Biomolecules 10(4): 6520, 2020). Antibiofilmové aktivity AMP na biofilmech byly dosud studovány méně než účinek AMP na suspenzní populace mikroorganismů. K hodnocení specifické schopnosti AMP narušovat tvorbu biofilmu se používají identifikátory tzv. minimální koncentrace inhibitoru biofilmu (MBIC) minimální inhibiční koncentrace (MIC) a minimální koncentrace eradikace biofilmu (MBEC).

Další velkou výhodou AMP působících na biofilmy je jejich specifický způsob aktivity vykazující nízkou toxicitu pro eukaryotické buňky, což poskytuje příležitost k širokému terapeutickému využití (Cruz et al., BMC microbiology 18(1): 1-9, 2018). Navíc AMP často vykazují synergii s klasickými antibiotiky, neutralizují endotoxiny a jsou velmi aktivní na zvířecích modelech. Rezistence k AMP je relativně vzácná vzhledem k jejich afinitě k záporně nabité části dvouvrstvé lipidové struktury bakteriálních membrán. Kinetika inhibice růstu bakterií účinkem AMP je pak rychlejší ve srovnání s většinou konvenčních antibiotik (de Breij, et al., Science translational medicine 10(423), 2018). Výhody AMP mohou dokonce přesahovat jejich antimikrobiální účinky, neboť dokážou posílit imunitní odpověď k dalšímu boji s patogenní infekcí. Imunitní regulace vyplývá z interakce AMP s receptory hostitelské buňky (Di Somma, et al., Biomolecules 10(4): 6520, 2020).

Vzhledem k tomu, že v oboru dentálních náhrad jsou využívány mnohé anorganické matrice (titan, keramika) nabízí se možnost tyto materiály pokrýt vrstvou funkčních peptidů se specifickou aktivitou působení vůči bakteriálním kmenům v dutině ústní, způsobujícím typické infekce. Logické řešení nabízí analýza proteinů přirozeně se vyskytujících v ústní dutině, které vykazují možnou antimikrobiální aktivitu, a to především vůči biofilmu. Proteiny matrice zubní skloviny jsou dobře známé jako prekurzory jejího vzniku (Bartlett, International Scholarly Research Notices, 2013) a byly již dříve popsány v literatuře pro indukci tvorby skloviny. Proteiny matrice zubní skloviny a její deriváty jsou rovněž známé svou podporou hojení ran v měkkých tkáních, jako jsou kůže a sliznice (WO 9943344 A2, Gestrelius). Popsání podpory hojení tkaní za pomoci těchto proteinů indikovalo možnou širší antimikrobiální aktivitu proteinů matrice zubní skloviny či jejích štěpů (peptidů). Peptidy vznikající jako štěpy těchto proteinů jsou produktem enzymatického působení proteáz, z nichž nejvýznamnější jsou kalikrein-4 (KLK4) a enalysin (MMP20) (Bartlett, International Scholarly Research Notices, 2013). Jedním ze signifikantních proteinů matrice zubní skloviny je ameloblastin (AMBN). Jedná se o fosfoprotein, klasifikovaný výpočetními a biofyzikálními metodami jako vnitřně neuspořádaný (IDP) (Stakkestad, Lyngstadaas et al., Frontiers in physiology 8: 531, 2017) a tím pádem dobře přístupný pro štěpení proteázami. Na základě teoretických a experimentálních analýz AMBN a jeho derivátů byly identifikovány peptidy se specifickou antimikrobiální aktivitou vůči bakteriálním biofilmům, které jsou prezentovány v tomto vynálezu.

Podstata vynálezu

Předkládaný vynález poskytuje nové antimikrobiální látky, odvozené z lidského proteinu ameloblastinu (AMBN), které byly cíleně upraveny za využití bioinformatických analýz a

- 2 CZ 309667 B6 molekulárního modelování a poté připraveny ve formě syntetických analogů.

Předmětem vynálezu jsou antimikrobiální peptidy o vzorcích:

AP 4.9. QGSTIFQIARLISHGPMG (A, SEKV. ID. Č.:1),

AP 4.9.1. QGHTIFQIARLISHGPM (B, SEKV. ID. Č.:2),

AP 5.10. STIFQIARLISHGPMPQNKQSPG (c, SEKV. ID. Č.:3), a

AP 5.10.1 STIFQIARLISHGAMAQNKQSP (D, SEKV. ID. Č.:4).

Předkládaný vynález rovněž zahrnuje uvedené antimikrobiální peptidy A, B, C a D pro použití jako léčiva v medicíně, zejména jako doplněk léčby onkologických onemocnění.

Onkologická onemocnění zahrnují tvorbu karcinomů zejména v oblasti dutiny ústní, jako jsou například mezenchymové benigní karcinomy fibrom, lipom, hemangiom a podobně, maligní karcinomy fibrosarkom, myelom a kostní nádory, či karcinomy neuroektodermové.

Předkládaný vynález také zahrnuje uvedené antimikrobiální peptidy A, B, C a D pro použití v biotechnologických aplikacích k prevenci růstu bakteriální kontaminace, zvláště pak k prevenci či k odstranění infekčních agens z povrchu kloubních, zubních či kostních náhrad používaných v medicíně (titanových, keramických apod.).

Předkládaný vynález dále zahrnuje uvedené antimikrobiální peptidy A, B, C a D pro výrobu prostředku k prevenci či odstranění infekčního agens z povrchu kloubních, zubních a kostních náhrad a k prevenci infikace ortopedických implantátů.

Primární role AMBN je proteinová matrice pro výstavbu zubní skloviny. Studie naznačující, že proteiny a deriváty matrice zubní skloviny podporují hojení ran v měkkých tkáních, ukázaly na možnou přítomnost proteinů či peptidů s antimikrobiální aktivitou.

Z lidského proteinu ameloblastinu (AMBN, UniProtKB - Q9NP70, AMBN_HUMAN) byly pomocí bioinformatických analýz identifikovány a poté analyzovány sekvence krátkých úseků, peptidů a jejich mutovaných analog, které byly označeny jako (A): AP4.9, (B): AP 4.9.1., (C): AP 5.10. a (D): AP 5.10.1. Peptid vzorce (B), AP4.9.1, představuje analog peptidů (A), Ap4.9, s obměnou jedné aminokyseliny, a peptid vzorce (D), AP5.10.1, představuje analog peptidů (C), AP5.10., s obměnou dvou aminokyselin. Peptidy A, B, C a D vykazují antimikrobiální účinek na mikrobiální biofilmy specifických kmenů bakterií vyskytujících se v ústní dutině.

Objasnění výkresů

Obrázek 1 předkládá ECD spektra peptidů A, SEKV. ID. Č.: 1; B, SEKV. ID. Č.: 2; C, SEKV. ID. Č.: 3; D, SEKV. ID. Č.: 4 v přítomnosti 0 %, 10 %, 30 % a 50 % (obj./obj.) TFE ve vodě MQ. CD spektra byla vyjádřena jako molární elipticita Q (deg cm²dmol^-1) na jedno reziduum.

Příklady uskutečnění vynálezu

Seznam uvedených zkratek:

ACPs

AMP

APD

CD

ECD spektrum

HBTU peptidy s účinkem proti rakovině (z angl. Anti Cancer Peptides) antimikrobiální peptidy (z angl. Antimicrobial Peptides) databáze antimikrobiálních peptidů (z angl. Antimicrobial Peptides Database) cirkulární dichroismus elektronický cirkulární dichroismus

O-(Benzotriazol-1 -yl)-N,N,N',N'-tetramethyluronium hexafluorofosfát

- 3 CZ 309667 B6 hc₅₀

IC_5O IDP MBIC50 MBEC50 MIC₅₀ MMP N-Fmoc PBS PMSF SDS SDS-PAGE TEV RP-HPLC RT

EDTA MQ voda koncentrace, při níž je lyžována polovina červených krvinek (hernolýza) inhibiční koncentrace při 50% cytotoxicitě vnitřně neuspořádaný protein (z angl. Intrinsically Disordered Protein) minimální koncentrace pro 50% inhibici biofilmu minimální koncentrace pro 50% eradikaci biofilmu minimální inhibiční koncentrace k 50% snížení nárůstu suspenzních buněk metaloproteázy fluorenylmethyloxykarbonyl (chránící skupina pro organické syntézy) fosfátový pufr fenylmethylsulfonylfluorid dodecylsíran sodný elektroforéza v polyakrylamidovém gelu virus tabákové mozaiky vysoceúčinná kapalinová chromatografie na nepolárním sorbentu při teplotě místnosti (z angl. room tempearture) ethylendiamin tereftalová kyselina ultrafiltrovaná voda od firmy Merck

Studie probíhaly na bakteriálních kmenech: Enterococcus faecalis DBM 3075, CNCTC 5530, CNCTC 5483, M-1; Staphylococcus aureus CNCTC 5670 (ATCC 12600), CNCTC 6271 (ATCC 43300), 3178 (ATCC 29213); a Escherichia coli DBM 3125 (ATCC 10536), DBM 3138, B (tabulka č 1 až 3). Antimikrobiální efekt identifikovaných AMP je doprovázený velmi mírnou cytotoxickou aktivitou a téměř nulovou hemolytickou aktivitou (tabulka č. 4 a 5). Peptidy A, B, C a D vykazují antimikrobiální vlastnosti pouze na biofilmech specifických bakteriálních kmenů, antimikrobiální aktivita AMP v roztoku nebyla prokázána jako signifikantní. Tento fakt naznačuje na možné přirozené působení peptidových štěpů AMBN proti mikrobiálním filmům přítomným například na zubní sklovině. Sekundární struktura AMPs je ve vodném prostředí neuspořádaná, ale snadno přechází na α-helikální strukturu v přítomnosti sloučenin indukujících a-helix, jako je trifluorethanol (obrázek č. 1, tabulka č. 6). Potenciál tvořit indukovanou helikální strukturu AMPs ukazuje na možnost antimikrobiální aktivity mechanismem tvorby helikálních pórů v membráně buňky a jejího narušení. Avšak silnějším faktorem je zřejmě specifické působení peptidů na tvorbu konkrétních bakteriálních kmenů tvořících biofilmy. Předkládané peptidy vykázaly významnou antimikrobiální aktivitu vůči biofilmu, testovanou pomocí eradikace a adheze.

Tabulka 1: Vliv studovaných antimikrobiálních peptidů A, B, C a D na suspenzní růst zástupců druhu Enterococcus faecalis, Staphylococcus aureus a Escherichia coli. (MIC50 - minimální koncentrace pro 50% inhibici)

	MIC50 (pmol.r1)
A	B	c	D
E. faecalis DBM 3075	★	*	*	ik
CNCTC 5530	*	Λ	fc	*
CNCTC 5483	*		*	*
M-1	*	*		·*
S. aureus CNCTC 5670	*	*	200	200
DBM 3138	*	i	*	*
CNCTC 6271	★	*		A
M-1	*	*	-k	*
E. goIí DBM 3125	★	-λ	300	150
DBM 3138	A	★	*	*
CCM 4787	*	λ	*	300
B	*	*·	*	*

*nebylo stanoveno ve studovaném koncentračním rozmezí (50 až 300 pmol.l¹)

-4 CZ 309667 B6

Tabulka 2: Vliv peptidů A a B na tvorbu biofilmu a eradikaci zralého biofilmu Enterococcus faecalis, Staphylococcus aureus a Escherichia coli.

	MBICsd	A (μπιοΙ.Ι'1)	MBECso	B (pmol.l-1)
MBICbo	MBECso	MBICso	MBICeo	MBECso	MBECso
E. faecalis	DBM 3075	200	300	50		150	200	150	ft
	CNCTC 5530	300	*	ft	*	300	ft	ft	ft
	CNCTC 5483	300	*	ft	ft	300	ft	ft	ft
	M-1	300	*	ft	ft	300	ft	ft	*
S. aureus	CNCTC 5670	150	*	300	ft	200	ft	50	ft
	DBM 3138	300	*	ft	ft	150	ft	ft	ft
	CNCTC 6271	200	*	ft	ft	200	ft	300	ft
	M-1	*		ft	ft	ft	ft	ft	ft
E. coli	DBM 3125	*		100	ft	150	★	100	ft
	DBM 3138	150	150	150	ft	150	ft	160	ft
	CCM 4787	300	*	ft	ft	ft	ft	ft	ft
	B	50	100	200	ft	150	150	150	ft

*nebylo stanoveno ve studovaném koncentračním rozmezí (50 až 300 pmol.l¹)

Tabulka 3: Vliv peptidů C a D na tvorbu biofilmu a eradikaci zralého biofilmu Enterococcus ίο faecalis, Staphylococcus aureus a Escherichia coli.

-5 CZ 309667 B6

C (jjmot.l·¹) D fpmol l·¹)

	MBICao	MBICsa	MBECso	MBECa:	MBICw	MBlCeo	MBEC^c	MBECeo
E. DBM	200	300	•	*	200	300	300	*
faecalis 3075 CNCTC		*	a	•	A	A	*	A
5530 CNCTC	A	*	*		*	*	*	t
5483 M-1	*	*	200	*	300	*	300	A-
S. CMCTC	200	*	*	*	300	*		*
aureus 5670 DBM	*	Ir	A	★	*	*	A	Sr
3138 CNCTC	300	300	300	*	300	300	300	*
6271 M-1	300	*		λ	300	*	A	*
E. coli DBM	A	*	*	*	300	A	*	*
3125 DBM	200	*	*	*	150	A	A	*
3138 CCM	A	*	300	*	300	*	200	a-
4787 B	150	150		Λ	50	200	*	*

*nebylo stanoveno ve studovaném koncentračním rozmezí (50 až 300 pmol.l¹)

Příklad 1

Identifikace peptidů

Antimikrobiální peptidy byly identifikovány ze sekvence AMBN (AMBN, UniProtKB - Q9NP70, AMBN HUMAN) kombinací různých přístupů bioinformatických nástrojů, sloužících k predikci antimikrobiální aktivity krátkých proteinových sekvencí. Analýzou bylo predikováno celkem šest krátkých úseků, z nichž následně vykázaly signifikantní antimikrobiální aktivitu na biofilmech dva peptidy A a C. Z těchto peptidů byly poté navrženy dva jejich analogy označené jako B a D pomocí racionálního designu metodami molekulového modelování. Navržené analogy C a D vykazují vyšší antimikrobiální aktivitu na biofilmech než peptidy A a B.

Příklad 2

Syntéza peptidů

Všechny peptidy v této studii byly chemicky syntetizovány a purifikovány na >97% čistotu. Peptidy byly solubilizovány v destilované vodě a jejich koncentrace byly stanoveny pomocí aminokyselinové analýzy.

Peptidy odvozené z AMBN (AMBN, UniProtKB - Q9NP70, AMBN HUMAN), označené jako A, B, C a D, byly syntetizovány technikou syntézy peptidů na pevné fázi podle standardního protokolu V-Fmoc. Byly připraveny na pryskyřici TentaGel S RAM (431 mg s 0,24 mmol/g substitucí) na automatickém syntetizátoru peptidů PS3 (Protein Technologies, Tucson, AZ). Aminokyseliny chráněné V-Fmoc (10 ekv.) byly spojeny za použití 0,4 mol.1¹ V-methylmorfolinu v ΛζΑ-dimethylformamidu (DMF, 20 ekv.) a HBTU (10 ekv.) v V-methyl-2-pyrrolidonu. Deprotekce α-aminoskupiny byly provedeny pomocí 20% (obj./obj.) piperidinu v DMF. Peptidy byly zcela zbaveny ochrany a odštěpeny z pryskyřice směsí TFA/H20//triisopropylsilan (92,5:5:2,5) po dobu 2 hodin a poté vysráženy fórc-butylmethyletherem. Všechny peptidy byly purifikovány pomocí RP-HPLC (Jasco lne.) na (5 pm, 250 x 20 mm) YMC-Pack ODS-AM koloně. Identita a čistota syntetických peptidů byly potvrzeny pomocí Agilent 1260 HPLC (Agilent Technologies) spojené s ESI-TOF Agilent 6530 (Agilent Technologies) s technologií Agilent Jet Stream. Čistota všech

-6CZ 309667 B6 peptidů byla >97 %.

Příklad 3

Použité mikroorganismy a podmínky kultivace

Byly studovány tři druhy mikroorganismů, které se vyskytují v ústní dutině nebo způsobují zubní kaz:

Enterococcus faecalis DBM 3075 je klinický izolát z Fakultní nemocnice Bulovka v Praze a byl poskytnut z Ústavu biochemie a mikrobiologie, VŠCHT Praha. Kontrolní kmeny E. faecalis pro testování antimikrobiálních léčiv CNCTC 5530 (ATCC 51299) a CNCTC 5483 (ATCC 29212) byly získány z České národní sbírky typových kultur. E. faecalis M-1 představuje klinický izolát z Fakultní nemocnice Motol v Praze.

Staphylococcus aureus CNCTC 5670 (ATCC 12600) představuje typový kmen získaný z České národní sbírky typových kultur v Praze. Ze stejné sbírky byl rovněž získán methicillin-rezistentní kmen S. aureus CNCTC 6271 (ATCC 43300). Dále byl studován k methicillinu citlivý kmen S. aureus DBM 3178 (ATCC 29213) poskytnutý Ústavem biochemie a mikrobiologie, VŠCHT Praha a S. aureus M-1 izolovaný z infikované kloubní náhrady ve Fakultní nemocnici Motol v Praze.

Kontrolní kmeny pro testování antibiotik Escherichia coli DBM 3125 (ATCC 10536) a DBM 3138 (ATCC 8739) byly poskytnuty Ústavem biochemie a mikrobiologie, VŠCHT Praha. Dále byly studovány kmen E. coli CCM 4787 (sérovar 0157:H7) a E.coli CCM 7372 (kmen B) získané z České sbírky mikroorganismů Masarykovy university v Brně.

Před provedením experimentů studujících antimikrobiální a antibiofilmový účinek studovaných peptidů na mikrobiální buňky byl každý mikroorganismus zaočkován do tekutého média, v případě E. faecalis a S. aureus do trypton-sojového bujónu a v případě E. coli do Luria-Bertanni média, a kultivován při 37 °C a 150 rpm (otáček za minutu) po dobu 24 h.

Příklad 4

Studium účinku AMP na suspenzní růst mikroorganismů

Vliv AMP na suspenzní růst mikroorganismů byl posouzen pomocí kultivace v mikrokultivačním zařízení Bioscreen C (LabSystems, Finsko), jak popsala Maťátková a spol (Matatkova et al., Int J Anal Chem, 8195329, 2017). Ve zkratce, připravené inokulum (viz příklad 3) bylo upraveno na optickou denzitu OD600nm = 0,1 (CFU/ml = 2,5x10⁷) a následně bylo v objemu 30 pl smícháno s 290 pl příslušného média a roztoku testovaného peptidu v polystyrenové mikrotitrační destičce Honeycomb 2 (Growth Curves, USA). Kultivace buněk probíhala v mikrokultivačním zařízení po dobu 24 h při 37 °C a 150 rpm. Každých 30 min byla proměřena optická denzita obsahu jamek a z výsledných dat byly sestaveny růstové křivky odrážející suspenzní růst buněk v každé jamce mikrotitrační destičky. Každý experiment obsahoval kontrolní vzorky bez přídavku antimikrobiálních látek a všechny experimenty byly provedeny v technických triplikátech. Z naměřených dat byla následně stanovena minimální inhibiční koncentrace (MIC50), tedy taková nejnižší koncentrace studované látky, která již způsobila alespoň 50% pokles nárůstu suspenzních buněk po 24 h kultivaci.

Příklad 5

Studium účinku AMP na tvorbu biofilmu a eradikaci již zralého biofilmu mikroorganismů

Vliv AMP na tvorbu biofilmu byl studován v polystyrenových mikrotitračních destičkách dle postupu popsaného ve Vaňková a spol (Vaňkova et al., World J Microbiol Biotechnol, 36(7):101,

- 7 CZ 309667 B6

2020). Ve zkratce, připravené inokulum (viz příklad 3) bylo upraveno na OD600nm = 0,8 (CFU/ml = 2x10⁸) a následně bylo v objemu 210 pl smícháno s 70 pl příslušného růstového média a roztoku studovaného peptidu v polystyrénové mikrotitrační destičce TPP96 (TPP, Švýcarsko). Biofilm byl tvořen staticky při 37 °C po dobu 24 h.

Vliv AMP na eradikaci již zralého biofilmu byl studován analogicky uvedenému postupu. Nejprve byl kultivován samotný biofilm bez přidané antimikrobiální látky. Inokulum bylo v tomto případě upraveno na OD600nm = 0,6 (CFU/ml = 1,5x10⁸) a pipetováno do jamek mikrotitrační destičky v objemu 200 pl. Kultivace probíhala 24 h při 37 °C staticky. Vytvořený biofilm byl promyt fyziologickým roztokem a byly k němu pipetovány příslušné roztoky studovaných peptidů a růstové médium do finálního objemu 200 pl. Kultivace probíhala, jak popsáno výše. Všechny experimenty obsahovaly kontrolní vzorky bez přídavku antimikrobiální látky a blank (vzorky bez suspenze buněk). Všechny experimenty byly provedeny v technickém triplikátu.

Příklad 6

Stanovení metabolické aktivity buněk biofilmu

Metabolická aktivita buněk biofilmu byla stanovena pomocí resazurinu. K promytému biofilmu bylo pipetováno 25 pl roztoku D-glukosy (180 g/l ve fyziologickém roztoku), 25 pl roztoku resazurinu (0,15 g/l ve fyziologickém roztoku) a 100 pl fyziologického roztoku. Biofilm byl fluorimetricky změřen hned, nebo v případě E. coli inkubován 30 min při 37 °C a následně změřen. Intensita fluorescence byla stanovena při 545/575 nm v destičkovém spektrofotometru Infinite M200 Pro Reader (Tecan, Švýcarsko). Z výsledných dat bylo odečteno průměrné pozadí (intensita fluorescence blanku) a vypočítán průměr a směrodatná odchylka, které byly pro lepší srovnání kmenů i peptidů převedeny na relativní procenta. Experimenty byly provedeny v technických triplikátech.

Na základě stanovené metabolické aktivity byly určeny parametry vyjadřující antibiofilmovou účinnost studovaných látek. Minimální koncentrace inhibující biofilm (MBIC50, resp. MBICsc) představuje nejnižší studovanou koncentraci dané látky, která již způsobí 50%, resp. 80% pokles metabolické aktivity buněk biofilmu tvořeného v přítomnosti dané látky. Analogicky, minimální koncentrace eradikující biofilm (MBIC50, resp. MBEC80) představuje nejnižší studovanou koncentraci dané látky, která již způsobí 50% resp. 80% pokles metabolické aktivity buněk zralého biofilmu eradikovaného danou látkou.

Příklad 7

Hemolytická esej

Hemolytická aktivita studovaných antimikrobiálních peptidů byla hodnocena in vitro za použití lidské krve. Pro testování hemolýzy byla použita čerstvá krev odebraná do zkumavky s citrátem sodným jako antikoagulans. Melitin, amfipatický peptid z jedu včely medonosné, byl použit jako pozitivní kontrola, protože vykazuje lytickou aktivitu proti různým buňkám (včetně červených krvinek) v submikromolárních koncentracích. Hemolytická aktivita testovaných látek pak byla vztažena k hemolýze, vyvolané 0,5% Tritonem X-100, který při této koncentraci způsobil 100% hemolýzu. Koncentrace, při níž je lyzována polovina červených krvinek (hodnota hemolytické aktivity HC50), představuje ukazatel toxicity testovaných peptidů.

Plná krev (1 ml) zředěná v PBS (9 ml) byla odstředěna (800 x g, 15 min., RT) a následně byla peleta červených krvinek pětkrát promyta 10 ml PBS (800 x g, 15 min., RT). Po odstranění supernatantu byla promytá peleta červených krvinek naředěna PBS na koncentraci 0,5 % (obj./obj.) a 50 pl vzniklé suspenze bylo přeneseno do 96 jamkové mikrotitrační destičky. Poté bylo přidáno 50 pl dvakrát koncentrovaných roztoků peptidů (testované antimikrobiální peptidy v koncentracích 12,5 až 300 pmol.l^-1, Melitin 0,024 až 50 pmol.l^-1 výsledně, dvojkové ředění), samotný PBS a 0,5%

- 8 CZ 309667 B6

Triton X-100. Mikrotitrační destička se vzorky byla inkubována 60 minut při 37 °C a odstředěna (1000 x g, 15 min., RT). 40 μΐ supernatantu z každé jamky bylo následně přeneseno do transparentní 384 jamkové destičky. Absorbance supernatantu byla změřena při 415 nm pomocí čtečky mikrotitračních destiček (Cytation 3, BioTek, USA).

Tabulka 4: Hemolytická aktivita AMP A, B, C a D, měřená v oblasti 12,5 až 100 (300) pmol.l^-1 na vzorku lidské krve a vyjádřená jako HC50.

Peptid

A

B

C

D Melitin

Hemolytická aktivita HC50 (pmol.l^-1) »> 300 » 300 »> 300 - 300 0,79

Příklad 8

Testy cytotoxicity s použitím lidských endoteliálních buněk HUVEC a HCT 116

Buněčné kultury:

Primární lidská buněčná kultura HUVEC (endoteliální buňky lidské pupečníkové žíly, Lonza) byla udržována v růstovém médiu pro endoteliální buňky EGM™-2 (Lonza) doplněném 10% (obj./obj.) tepelně inaktivovaným fetálním bovinním sérem (FBS) při 37 °C ve zvlhčené atmosféře s 5 % CO2. Dvakrát týdně, když buňky dosáhly 80 až 90% konfluence, byly subkultivovány pomocí roztoku 0,25% trypsinu/0,53 mmol.l^-1 EDTA pro další pasáž.

Lidská buněčná linie rakoviny tlustého střeva HCT 116 (ATCC) byla udržovaná v růstovém médiu McCoy's 5A (Sigma Aldrich) doplněném 10% (obj./obj.) tepelně inaktivovaným fetálním bovinním sérem (FBS) ve zvlhčené atmosféře s 5 % CO2. Dvakrát týdně, když buňky dosáhly 80 až 90% konfluence, byly subkultivovány pomoci 0,25% roztoku trypsinu/0,53 mmol.l^-1 EDTA pro další pasáž.

Testy cytotoxicity:

Ke zjištění cytotoxicity testovaných antimikrobiálních peptidů byl použit kit CellTiter-Glo® Luminiscent Cell Viability Assay (Promega). Buňky byly kultivovány podle výše uvedeného popisu a experiment byl proveden podle návodu výrobce. 10 000 buněk HUVEC (50 pl) bylo přeneseno do každé z jamek bílé 96 jamkové destičky (BD Biosciences™). Buňky pak byly kultivovány po dobu 24 hodin před přidáním 50 pl dvakrát koncentrovaných roztoků testovaných peptidů nebo samotného EGM™-2 média (kontrolní vehikulum) do každé jamky. Po dalších 72 hodinách bylo do každé jamky přidáno 100 μΐ činidla CellTiter-Glo® (Promega) a 96 jamková destička byla míchána 2 minuty při 400 otáčkách za minutu na orbitální třepačce ve tmě. Následně byl luminiscenční signál ponechán 10 min stabilizovat při teplotě místnosti. Luminiscence byla zaznamenána pomocí mikrotitračního luminometru (Cytation 3, BioTek, USA). V tomto testu intenzita luminiscence přímo koreluje s počtem živých buněk. Získané údaje byly normalizovány a hodnoty IC50 byly vypočteny nelineární regresní analýzou za předpokladu sigmoidální křivky odezvy na koncentraci s proměnlivým Hillovým sklonem (software GraphPadPRISM® 7).

Tabulka 5: Cytotoxická aktivita AMP A, B, C a D, měřená v oblasti 12,5 až 100 (300) pmol.l^-1 na HCT116 a HUVEC buněčných liniích, vyjádřená jako IC50.

-9CZ 309667 B6

Cytotoxická aktivita ICso (μιτοΙ.I'¹)

Peptid /buněčná linie	HCT116	HUVEC
A	»> 100	»> 300
B	>» 100	>300
C	>» 100	»> 300

D »> 1 DO ~ 300

Příklad 9

Měření cirkulárního dichroismu (CD)

Spektra elektronického cirkulárního diochroismu (ECD) všech AMP byla naměřena pomocí spektrometru Jasco J-815 CD (Jasco Corporation, Tokio, Japonsko) ve spektrálním rozsahu 200 až 300 nm s použitím křemenné cely o délce 0,1 cm při RT. Experimentální uspořádání bylo následující: rozlišení kroku 0,5 nm, rychlost 10 nm/min, doba odezvy 16 s a šířka pásma 1 nm. Koncentrace vzorku byla udržována konstantní 0,1 mg/ml v MQ vodě (pH = 7,5). Vzorky byly také měřeny se směsí trifluorethanolu (TFE) (0 %, 25 % a 50 % obj./obj. TFE). Po korekci základní linie byla konečná spektra vyjádřena jako molární elipticita 0 (degcm²dmol^-1) na jedno aminokyselinové residuum. Obsah sekundární struktury byl stanoven pomocí online programu pro analýzu cirkulárního dichroismu Dichroweb software (Lee Whitmore a B. A. Wallace, Nucleic Acids Res., 32: W668 - W673, 2004). Obsah sekundární struktury všech analyzovaných AMP prokázal jejich nestrukturovaný charakter s potenciálem tvořit helikální strukturu se zvyšující se koncentrací TFE. Výsledky měření CD jsou uvedené na obr. č. 1 a v tab. č. 6.

Tabulka 6: Vypočítaná incidence (%) sekundárního strukturálního obsahu. Peptidy A, B, C a D byly studovány CD spektroskopií v přítomnosti 0 %, 10 %, 30 % a 50 % (obj./obj.) TFE v MQ vodě.

	Sekundární struktura, %
AMP	TFE, %	alfa-helix	beta-list	smyčka	nestrukturovaná
A	0	6%	32%	24%	38%
A	25	9%	31%	24%	36%
A	50	25%	23%	23%	30%
B	0	6%	35%	23%	0%
B	25	7%	35%	23%	35%
B	50	34%	14%	23%	28%
C	0	6%	37%	23%	35%
C	25	8%	36%	23%	34%
C	50	34%	13%	24%	30%
D	0	5%	38%	22%	35%
D	25	6%	40%	22%	32%
D	50	25%	26%	19%	29%

- 10CZ 309667 B6

Průmyslová využitelnost

Nové antimikrobiální peptidy jsou uvažovány pro selektivní využití na mikrobiálních biofilmech, 5 k prevenci růstu bakteriální a fungální kontaminace, například kloubních náhrad či jiných implantátů. Aplikace antimikrobiálních peptidů je použitelná v oblasti medicíny a biotechnologií.