CZ308154B6 - Nanočástice pro magnetické a fluorescenční značení buněk, způsob přípravy a použití - Google Patents
Nanočástice pro magnetické a fluorescenční značení buněk, způsob přípravy a použití Download PDFInfo
- Publication number
- CZ308154B6 CZ308154B6 CZ2015-606A CZ2015606A CZ308154B6 CZ 308154 B6 CZ308154 B6 CZ 308154B6 CZ 2015606 A CZ2015606 A CZ 2015606A CZ 308154 B6 CZ308154 B6 CZ 308154B6
- Authority
- CZ
- Czechia
- Prior art keywords
- cells
- nanoparticles
- magnetic
- mixture
- cell
- Prior art date
Links
- 239000002105 nanoparticle Substances 0.000 title claims abstract description 106
- 238000002372 labelling Methods 0.000 title claims abstract description 36
- 230000005291 magnetic effect Effects 0.000 title claims description 23
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title claims description 10
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims abstract description 173
- 238000002595 magnetic resonance imaging Methods 0.000 claims abstract description 33
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 29
- 229910000859 α-Fe Inorganic materials 0.000 claims abstract description 23
- LRCFXGAMWKDGLA-UHFFFAOYSA-N dioxosilane;hydrate Chemical compound O.O=[Si]=O LRCFXGAMWKDGLA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 21
- 229960004029 silicic acid Drugs 0.000 claims abstract description 21
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 claims abstract description 18
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 claims abstract description 17
- MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N fluorescein-5-isothiocyanate Chemical compound O1C(=O)C2=CC(N=C=S)=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 12
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims abstract description 6
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 28
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 24
- ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N N,N-Dimethylformamide Chemical compound CN(C)C=O ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 19
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 16
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims description 13
- 239000002609 medium Substances 0.000 claims description 13
- 239000000725 suspension Substances 0.000 claims description 13
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 claims description 13
- QWXYZCJEXYQNEI-OSZHWHEXSA-N intermediate I Chemical compound COC(=O)[C@@]1(C=O)[C@H]2CC=[N+](C\C2=C\C)CCc2c1[nH]c1ccccc21 QWXYZCJEXYQNEI-OSZHWHEXSA-N 0.000 claims description 12
- 238000002156 mixing Methods 0.000 claims description 12
- AHYFYQKMYMKPKD-UHFFFAOYSA-N 3-ethoxysilylpropan-1-amine Chemical compound CCO[SiH2]CCCN AHYFYQKMYMKPKD-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 9
- 238000000926 separation method Methods 0.000 claims description 9
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims description 9
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 9
- 238000001215 fluorescent labelling Methods 0.000 claims description 8
- 239000011521 glass Substances 0.000 claims description 8
- 239000002245 particle Substances 0.000 claims description 8
- 239000000377 silicon dioxide Substances 0.000 claims description 8
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 claims description 7
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 claims description 7
- 239000006185 dispersion Substances 0.000 claims description 7
- 208000015122 neurodegenerative disease Diseases 0.000 claims description 7
- 239000002904 solvent Substances 0.000 claims description 7
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- BOTDANWDWHJENH-UHFFFAOYSA-N Tetraethyl orthosilicate Chemical compound CCO[Si](OCC)(OCC)OCC BOTDANWDWHJENH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 claims description 6
- 239000002159 nanocrystal Substances 0.000 claims description 6
- 238000003756 stirring Methods 0.000 claims description 6
- NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N Ammonium chloride Substances [NH4+].[Cl-] NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N Ammonium hydroxide Chemical compound [NH4+].[OH-] VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 235000011114 ammonium hydroxide Nutrition 0.000 claims description 5
- 238000002659 cell therapy Methods 0.000 claims description 5
- GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N fluorescein Chemical compound O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 230000003902 lesion Effects 0.000 claims description 5
- WYTZZXDRDKSJID-UHFFFAOYSA-N (3-aminopropyl)triethoxysilane Chemical compound CCO[Si](OCC)(OCC)CCCN WYTZZXDRDKSJID-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 210000000577 adipose tissue Anatomy 0.000 claims description 4
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 claims description 4
- 208000030159 metabolic disease Diseases 0.000 claims description 4
- 210000005155 neural progenitor cell Anatomy 0.000 claims description 4
- 210000004498 neuroglial cell Anatomy 0.000 claims description 4
- 230000000472 traumatic effect Effects 0.000 claims description 4
- 210000003954 umbilical cord Anatomy 0.000 claims description 4
- 230000001464 adherent effect Effects 0.000 claims description 3
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 3
- 230000003412 degenerative effect Effects 0.000 claims description 3
- 210000001178 neural stem cell Anatomy 0.000 claims description 3
- 238000001890 transfection Methods 0.000 claims description 3
- 239000006143 cell culture medium Substances 0.000 claims description 2
- 230000004770 neurodegeneration Effects 0.000 claims description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 2
- 238000010992 reflux Methods 0.000 claims description 2
- 210000002536 stromal cell Anatomy 0.000 claims description 2
- 238000010361 transduction Methods 0.000 claims description 2
- 230000026683 transduction Effects 0.000 claims description 2
- 230000006698 induction Effects 0.000 claims 2
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 claims 2
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 claims 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 claims 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 claims 1
- 210000004443 dendritic cell Anatomy 0.000 claims 1
- 210000002919 epithelial cell Anatomy 0.000 claims 1
- 230000007654 ischemic lesion Effects 0.000 claims 1
- 210000001539 phagocyte Anatomy 0.000 claims 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 claims 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 abstract description 13
- 210000002901 mesenchymal stem cell Anatomy 0.000 abstract description 7
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 abstract description 7
- 239000007900 aqueous suspension Substances 0.000 abstract description 4
- 230000006378 damage Effects 0.000 abstract description 4
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 abstract description 4
- 239000000463 material Substances 0.000 abstract description 4
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 abstract description 4
- 230000008901 benefit Effects 0.000 abstract description 3
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 abstract description 3
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 abstract description 3
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 abstract description 3
- 229910052596 spinel Inorganic materials 0.000 abstract description 3
- 239000011029 spinel Substances 0.000 abstract description 3
- 230000035899 viability Effects 0.000 abstract description 3
- 229910001308 Zinc ferrite Inorganic materials 0.000 abstract description 2
- HSSJULAPNNGXFW-UHFFFAOYSA-N [Co].[Zn] Chemical compound [Co].[Zn] HSSJULAPNNGXFW-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract description 2
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 16
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 15
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 9
- XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N iron Substances [Fe] XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 8
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 8
- 238000001574 biopsy Methods 0.000 description 7
- 238000000799 fluorescence microscopy Methods 0.000 description 7
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 7
- 238000012634 optical imaging Methods 0.000 description 7
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 6
- 239000002872 contrast media Substances 0.000 description 6
- 239000010410 layer Substances 0.000 description 6
- 238000013508 migration Methods 0.000 description 6
- 230000005012 migration Effects 0.000 description 6
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 6
- 239000011701 zinc Substances 0.000 description 6
- 230000005778 DNA damage Effects 0.000 description 5
- 231100000277 DNA damage Toxicity 0.000 description 5
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 5
- 230000012202 endocytosis Effects 0.000 description 5
- 239000007943 implant Substances 0.000 description 5
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 5
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 4
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 4
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 4
- 210000005013 brain tissue Anatomy 0.000 description 4
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 4
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 4
- 230000001738 genotoxic effect Effects 0.000 description 4
- 238000001095 inductively coupled plasma mass spectrometry Methods 0.000 description 4
- 239000000543 intermediate Substances 0.000 description 4
- UQSXHKLRYXJYBZ-UHFFFAOYSA-N iron oxide Inorganic materials [Fe]=O UQSXHKLRYXJYBZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 4
- 239000000047 product Substances 0.000 description 4
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 4
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 description 4
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 3
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 3
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 3
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- GRYLNZFGIOXLOG-UHFFFAOYSA-N Nitric acid Chemical compound O[N+]([O-])=O GRYLNZFGIOXLOG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000399119 Spio Species 0.000 description 3
- 125000005376 alkyl siloxane group Chemical group 0.000 description 3
- 230000002902 bimodal effect Effects 0.000 description 3
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 3
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 3
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 3
- 210000001671 embryonic stem cell Anatomy 0.000 description 3
- 210000002889 endothelial cell Anatomy 0.000 description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 3
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 3
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 3
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 3
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 3
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 3
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 3
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 3
- 238000002513 implantation Methods 0.000 description 3
- 230000000302 ischemic effect Effects 0.000 description 3
- 210000004153 islets of langerhan Anatomy 0.000 description 3
- 230000033001 locomotion Effects 0.000 description 3
- 229910017604 nitric acid Inorganic materials 0.000 description 3
- 210000004940 nucleus Anatomy 0.000 description 3
- 210000001706 olfactory mucosa Anatomy 0.000 description 3
- 210000002826 placenta Anatomy 0.000 description 3
- 238000006068 polycondensation reaction Methods 0.000 description 3
- 238000011160 research Methods 0.000 description 3
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 3
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- 229930040373 Paraformaldehyde Natural products 0.000 description 2
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N Phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 2
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 2
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 2
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 2
- 238000000354 decomposition reaction Methods 0.000 description 2
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 2
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 2
- 238000005538 encapsulation Methods 0.000 description 2
- 231100000025 genetic toxicology Toxicity 0.000 description 2
- 231100000024 genotoxic Toxicity 0.000 description 2
- 238000003306 harvesting Methods 0.000 description 2
- 229910052742 iron Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000013980 iron oxide Nutrition 0.000 description 2
- WTFXARWRTYJXII-UHFFFAOYSA-N iron(2+);iron(3+);oxygen(2-) Chemical compound [O-2].[O-2].[O-2].[O-2].[Fe+2].[Fe+3].[Fe+3] WTFXARWRTYJXII-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- VBMVTYDPPZVILR-UHFFFAOYSA-N iron(2+);oxygen(2-) Chemical class [O-2].[Fe+2] VBMVTYDPPZVILR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 2
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 2
- 238000000386 microscopy Methods 0.000 description 2
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 2
- 229920002866 paraformaldehyde Polymers 0.000 description 2
- 238000002600 positron emission tomography Methods 0.000 description 2
- 230000003007 single stranded DNA break Effects 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 2
- 238000004627 transmission electron microscopy Methods 0.000 description 2
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 2
- 229910052725 zinc Inorganic materials 0.000 description 2
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FWBHETKCLVMNFS-UHFFFAOYSA-N 4',6-Diamino-2-phenylindol Chemical compound C1=CC(C(=N)N)=CC=C1C1=CC2=CC=C(C(N)=N)C=C2N1 FWBHETKCLVMNFS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 201000001320 Atherosclerosis Diseases 0.000 description 1
- 238000000685 Carr-Purcell-Meiboom-Gill pulse sequence Methods 0.000 description 1
- 101710081048 Endonuclease III Proteins 0.000 description 1
- 238000012413 Fluorescence activated cell sorting analysis Methods 0.000 description 1
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 1
- 101000699762 Homo sapiens RNA 3'-terminal phosphate cyclase Proteins 0.000 description 1
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 1
- PIWKPBJCKXDKJR-UHFFFAOYSA-N Isoflurane Chemical compound FC(F)OC(Cl)C(F)(F)F PIWKPBJCKXDKJR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101710149951 Protein Tat Proteins 0.000 description 1
- 102100029143 RNA 3'-terminal phosphate cyclase Human genes 0.000 description 1
- 241000700157 Rattus norvegicus Species 0.000 description 1
- IWUCXVSUMQZMFG-AFCXAGJDSA-N Ribavirin Chemical compound N1=C(C(=O)N)N=CN1[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 IWUCXVSUMQZMFG-AFCXAGJDSA-N 0.000 description 1
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 208000006011 Stroke Diseases 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- 239000004809 Teflon Substances 0.000 description 1
- 229920006362 Teflon® Polymers 0.000 description 1
- 102000007238 Transferrin Receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010033576 Transferrin Receptors Proteins 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 description 1
- HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N Zinc Chemical compound [Zn] HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000007259 addition reaction Methods 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 238000012382 advanced drug delivery Methods 0.000 description 1
- 229910000147 aluminium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 1
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N ammonia Natural products N QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012736 aqueous medium Substances 0.000 description 1
- SCJNCDSAIRBRIA-DOFZRALJSA-N arachidonyl-2'-chloroethylamide Chemical compound CCCCC\C=C/C\C=C/C\C=C/C\C=C/CCCC(=O)NCCCl SCJNCDSAIRBRIA-DOFZRALJSA-N 0.000 description 1
- 238000011888 autopsy Methods 0.000 description 1
- 230000006736 behavioral deficit Effects 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 210000004204 blood vessel Anatomy 0.000 description 1
- 210000000988 bone and bone Anatomy 0.000 description 1
- 239000012482 calibration solution Substances 0.000 description 1
- 239000012830 cancer therapeutic Substances 0.000 description 1
- 210000000845 cartilage Anatomy 0.000 description 1
- 210000003855 cell nucleus Anatomy 0.000 description 1
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 1
- 230000003833 cell viability Effects 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 230000007541 cellular toxicity Effects 0.000 description 1
- CRQQGFGUEAVUIL-UHFFFAOYSA-N chlorothalonil Chemical compound ClC1=C(Cl)C(C#N)=C(Cl)C(C#N)=C1Cl CRQQGFGUEAVUIL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000005352 clarification Methods 0.000 description 1
- 238000000975 co-precipitation Methods 0.000 description 1
- 229910017052 cobalt Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010941 cobalt Substances 0.000 description 1
- GUTLYIVDDKVIGB-UHFFFAOYSA-N cobalt atom Chemical compound [Co] GUTLYIVDDKVIGB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000003927 comet assay Methods 0.000 description 1
- 229940039231 contrast media Drugs 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 1
- 231100000433 cytotoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 description 1
- 230000008021 deposition Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- 206010012601 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 1
- 208000016097 disease of metabolism Diseases 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 1
- 230000002900 effect on cell Effects 0.000 description 1
- 238000001493 electron microscopy Methods 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 210000002615 epidermis Anatomy 0.000 description 1
- ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N ethidium bromide Chemical compound [Br-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CC)=C1C1=CC=CC=C1 ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960005542 ethidium bromide Drugs 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 230000005294 ferromagnetic effect Effects 0.000 description 1
- 229940079405 ferumoxides Drugs 0.000 description 1
- 229960000324 ferumoxsil Drugs 0.000 description 1
- 239000012467 final product Substances 0.000 description 1
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 1
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 1
- 229940016219 gastromark Drugs 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 238000002695 general anesthesia Methods 0.000 description 1
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 238000011532 immunohistochemical staining Methods 0.000 description 1
- 238000012623 in vivo measurement Methods 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 229960002725 isoflurane Drugs 0.000 description 1
- 230000000155 isotopic effect Effects 0.000 description 1
- 210000005240 left ventricle Anatomy 0.000 description 1
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 1
- 230000004807 localization Effects 0.000 description 1
- 230000002934 lysing effect Effects 0.000 description 1
- 239000002122 magnetic nanoparticle Substances 0.000 description 1
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 1
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000003595 mist Substances 0.000 description 1
- 210000002894 multi-fate stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 208000031225 myocardial ischemia Diseases 0.000 description 1
- 239000006199 nebulizer Substances 0.000 description 1
- 210000000944 nerve tissue Anatomy 0.000 description 1
- 230000000626 neurodegenerative effect Effects 0.000 description 1
- 210000002569 neuron Anatomy 0.000 description 1
- 238000006386 neutralization reaction Methods 0.000 description 1
- 239000002405 nuclear magnetic resonance imaging agent Substances 0.000 description 1
- 201000008482 osteoarthritis Diseases 0.000 description 1
- 230000004792 oxidative damage Effects 0.000 description 1
- 230000005298 paramagnetic effect Effects 0.000 description 1
- 230000001936 parietal effect Effects 0.000 description 1
- 230000035515 penetration Effects 0.000 description 1
- 230000010412 perfusion Effects 0.000 description 1
- 230000002572 peristaltic effect Effects 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 230000035790 physiological processes and functions Effects 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 230000001172 regenerating effect Effects 0.000 description 1
- 238000000679 relaxometry Methods 0.000 description 1
- 238000012827 research and development Methods 0.000 description 1
- 230000029058 respiratory gaseous exchange Effects 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- 210000003625 skull Anatomy 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 210000004872 soft tissue Anatomy 0.000 description 1
- 238000009331 sowing Methods 0.000 description 1
- 208000020431 spinal cord injury Diseases 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 239000002344 surface layer Substances 0.000 description 1
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 1
- 238000007669 thermal treatment Methods 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- 231100000027 toxicology Toxicity 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 1
- 238000012800 visualization Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B82—NANOTECHNOLOGY
- B82B—NANOSTRUCTURES FORMED BY MANIPULATION OF INDIVIDUAL ATOMS, MOLECULES, OR LIMITED COLLECTIONS OF ATOMS OR MOLECULES AS DISCRETE UNITS; MANUFACTURE OR TREATMENT THEREOF
- B82B1/00—Nanostructures formed by manipulation of individual atoms or molecules, or limited collections of atoms or molecules as discrete units
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B82—NANOTECHNOLOGY
- B82B—NANOSTRUCTURES FORMED BY MANIPULATION OF INDIVIDUAL ATOMS, MOLECULES, OR LIMITED COLLECTIONS OF ATOMS OR MOLECULES AS DISCRETE UNITS; MANUFACTURE OR TREATMENT THEREOF
- B82B3/00—Manufacture or treatment of nanostructures by manipulation of individual atoms or molecules, or limited collections of atoms or molecules as discrete units
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B82—NANOTECHNOLOGY
- B82Y—SPECIFIC USES OR APPLICATIONS OF NANOSTRUCTURES; MEASUREMENT OR ANALYSIS OF NANOSTRUCTURES; MANUFACTURE OR TREATMENT OF NANOSTRUCTURES
- B82Y5/00—Nanobiotechnology or nanomedicine, e.g. protein engineering or drug delivery
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C01—INORGANIC CHEMISTRY
- C01G—COMPOUNDS CONTAINING METALS NOT COVERED BY SUBCLASSES C01D OR C01F
- C01G49/00—Compounds of iron
- C01G49/02—Oxides; Hydroxides
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C01—INORGANIC CHEMISTRY
- C01G—COMPOUNDS CONTAINING METALS NOT COVERED BY SUBCLASSES C01D OR C01F
- C01G51/00—Compounds of cobalt
- C01G51/04—Oxides
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C01—INORGANIC CHEMISTRY
- C01G—COMPOUNDS CONTAINING METALS NOT COVERED BY SUBCLASSES C01D OR C01F
- C01G9/00—Compounds of zinc
- C01G9/02—Oxides; Hydroxides
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Nanotechnology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
- Inorganic Chemistry (AREA)
- Medical Informatics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Manufacturing & Machinery (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Předkládané řešení poskytuje způsob značení buněk a zobrazování pomocí multifunkční vodné suspenze kobaltnatozinečnatých feritových nanočástic. Hybridní nanočástice spinelové, feritové fáze obecného vzorce CoZnFeO, kde x je 0,2 až 0,8, opatřených souvislou vrstvou hydratovaného oxidu křemičitého s navázanou fluorescenční značkou, s výhodou fluoresceinisothiokyanátu (FITC), který jednak zajišťuje stabilitu jejich vodných suspenzí a neškodnost v organismu svým biokompatibilním povrchem a jednak umožňuje zobrazování značených buněk fluorescenčním mikroskopem. Ve srovnání se stávajícími materiály vykazují výrazně zvýšenou transversální relaxivitu a tím i vyšší kontrast při zobrazení magnetickou rezonancí. Jsou proto využitelné v biologii a v medicíně pro značení transplantovaných buněk, zejména mezenchymových kmenových buněk, neboť značení neovlivňuje ani jejich viabilitu ani diferenciační potenciál. Další výhodou je, že přítomnost nanočástic nezpůsobuje v buňce poškození DNA, lipidů a proteinů. Jsou proto vhodné k in vivo sledování transplantovaných buněk pomocí zobrazování magnetickou rezonancí a optickými metodami.
Description
Nanočástice pro magnetické a fluorescenční značení buněk, způsob přípravy a použití
Oblast techniky
Vynález se týká využití biokompatibilních ferimagnetických kobaltnatozinečnatých feritových nanočástic krystalujících ve strukturním typu spinelu pro vybrané medicinální aplikace (značení buněk před transplantaci do živého organismu, neinvazivní sledování implantátu v těle příjemce pomocí magnetické rezonance a optického zobrazování in vivo, sledování buněk in vitro a ex vivo pomocí fluorescenční mikroskopie), především tam, kde je vyžadováno dlouhodobé monitorování distribuce značených transplantovaných buněk v těle příjemce, jako je transplantace buněk do ischemických a traumatických lézí, použití kmenových buněk v degenerativních a metabolických onemocněních a to jak v experimentálních modelech, tak ve veterinární i humánní medicíně.
Nanočástice pro magnetické a fluorescenční značení buněk jsou připravovány kovalentním navázáním fluorescenční značky do obalu hydratovaného oxidu křemičitého částic složených z jader feritů a souvislé vrstvy z hydratovaného oxidu křemičitého. Feritová jádra jsou připravována koprecipitací s následným mechanickým a tepelným zpracováním. Jádra jsou enkapsulována do hydratovaného oxidu křemičitého modifikovaným postupem bazické polykondenzace alkylsiloxanů. Postup přípravy jader a jejich enkapsulace do hydratovaného oxidu křemičitého byl popsán v patentu CZ 307623. Na feritová jádra obalená hydratovaným oxidem křemičitým je pomocí adiční reakce navázáno fluorescenční činidlo. Následná enkapsulace do hydratovaného oxidu křemičitého pomoci polykondenzační reakce alkylsiloxanů zajišťuje stabilitu navázání fluorescenčního činidla.
Takto připravené nanočástice jsou přidány do media s buněčnými kulturami buď samotné nebo v kombinaci s transfekčními činidly, které zkracují dobu inkubace potřebnou pro značení buněk. Nanočástice lze kombinovat i s mikroporačními technikami. Označené buňky jsou podány příjemci a díky získanému magnetickému a fluorescenčnímu značení mohou být in vitro sortovány průtokovou cytometrií, po podání do živého organismu sledovány v těle příjemce magnetickou rezonancí nebo optickým zobrazováním a ex vivo detekovány fluorescenční mikroskopií.
Dosavadní stav techniky
Neinvazivní sledování transplantovaných buněk
Pokroky v buněčné terapii, vedoucí k rozvoji klinických studií, vyžadují zásadní použití neinvazivní techniky pro monitorování účinnosti buněčné terapie a přežití štěpu v hostitelském organismu, s cílem odhalit nebezpečné vedlejší účinky, jako například hyperproliferaci nebo migraci do nežádoucích struktur. V případě experimentálních zvířecích modelů je vždy po skončení experimentu provedena histologická analýza transplantované tkáně, což není v klinické praxi myslitelné. V posledních letech se proto rozvinuly různé zobrazovací metody, jako například pozitronová emisní tomografie (PET), optické zobrazování nebo magnetická rezonance (Modo, M.: Current opinion in organ transplantation, 13 (2008) 654). Pro klinickou praxi se nejlépe hodí posledně jmenovaná, neboť PET má horší prostorové rozlišení (Luker, GD. a Piwnica-Worms D.: Academie radiology, 8 (2001) 4) a pracuje s izotopickými sondami, které mají relativně krátký poločas rozpadu, zatímco optické zobrazování je velmi citlivou metodou ve studiích využívajících malá laboratorní zvířata, ale díky omezené penetraci vlnových délek emitovaných fluorochromy do tkáně je použitelné pouze v povrchových vrstvách (Mahmood, U. a Weissleder, R: Molecular cancer therapeutics, 2 (2003) 489). Magnetická rezonance (MR) má několik výhod: výborné rozlišení (až 100 pm), není limitována velikostí pacienta a nevyžaduje použití izotopicky značených sond. Kontrastní látky v mikromolámích koncentracích mění
- 1 CZ 308154 B6 relaxační časy sousedních protonů vody a zvyšují tak kontrast. Mohou měnit kontrast Ti i T2 vážených obrazů. Paramagnetické látky zkracují zejména Ti relaxaci vody, zatímco superpara-, ferro- a ferri- magnetické látky mají dominantní vliv na T2 relaxaci.
Značení buněk nanočásticemi
Nej častěji používané superparamagnetické kontrastní látky pro magnetickou rezonanci jsou na bázi oxidů železa (SPIO). Seznam komerčních kontrastních látek zahrnuje ferumoxidy obalené dextranem (Endorem®, Feridex®), ferucarbotran (Resovist®), ferumoxan (Sinerem®, Combidex®), ferumoxsil (Lumírem®, Gastromark®). Všechny tyto kontrastní látky byly vyvinuty k zobrazování orgánů pro rutinní klinická vyšetření, ale začaly se používat i ke značení buněk (Corot, C. et al.: Advanced drug delivery reviews, 58 (2006) 1471). Liší se hlavně svojí velikostí a povrchem, což ovlivňuje zejména jejich endocytózu. Většina komerčních látek nemá ideální vlastnosti z hlediska značení buněk, většinou se jedná o malou účinnost značení, případně má jejich přítomnost v buňce negativní efekt na buněčnou diferenciaci nebo růst.
Obecně platí, že pro maximální kontrast intracelulámě značených buněk je důležitým parametrem počet částic absorbovaných buňkami. Endocytózu komerčních kontrastních látek lze zlepšit transfekčními činidly (Arbab, AS. et al.: Radiology, 229 (2003) 838), která zvyšují účinnost značení zkracují dobu nezbytnou pro příjem nanočástic do buněk. Endocytóza nanočástic přes buněčnou membránu může být rovněž usnadněna použitím elektroporace (Gilad, AA. et al.: Magn Reson Med, 60 (2008) 1), specifickým cílením a endocytózou nanočástic přes receptory transferinu (Bulte, JW. et al.: Proc. Nat. Acad. Sci. 96, (1999) 15256), magnetodendrimery (Bulte, JW. et al.: Academie radiology, 9 Suppl 2 (2002) S332) nebo transdukčními činidly, jako je např. TAT protein odvozený od HIV (Kircher, MF. et al.: Cancer research, 63 (2003) 6838). Pro klinické aplikace jsou s výhodou používány takové kontrastní látky, které neobsahují jiné přísady k usnadnění endocytózy, čímž odpadá nutnost schvalování dalšího přípravku pro lékařské použití.
Dalším aspektem značení buněk kontrastními látkami je jejich vliv na regenerační potenciál kmenových buněk po transplantaci. Bylo pozorováno, že značení lidských neurálních kmenových buněk magnetickými nanočásticemi neovlivnilo jejich přežití, migraci nebo dělení a nedošlo ke změně elektrofyziologické vlastnosti neuronů (Guzman, R. et al.: Proc. Nat. Acad. Sci. 104, (2007) 10211). Nedávná studie na neurálních kmenových buňkách naproti tomu ukázala, že buňky značené komplexem gadolinium-rhodamin-dextran transplantované po iktu do kontralaterální hemisféry nemigrovaly do oblasti penumbry a ani nijak významně nezlepšily deficit chování ve srovnání s buňkami značenými pouze fluorescenčním barvivém. Naopak, 1 rok po transplantaci došlo k mírnému nárůstu velikosti léze. Tato práce zdůraznila nezbytnost dlouhodobých studií, protože většina používaných kontrastních látek nebyla původně určená pro zobrazování buněk (Modo, M. et al.: Neurolmage, 47 Suppl 2, (2009) TI33).
Tento vynález řeší problematiku značení buněk nanočásticemi pro neinvazivní sledování buněk pomocí magnetické rezonance a optického zobrazování a současně detekci buněk in vitro fluorescenčním mikroskopem. Nanočástice nevykazují vedlejší cytotoxické a genotoxické účinky, a přitom je citlivost detekce díky jejich vysoké relaxivitě vyšší. Bimodální látky pro značení buněk s navázanou fluorescenční značkou mohou sloužit k detekci transplantovaných buněk v těle příjemce magnetickou rezonancí in vivo a současně k detekci buněk ve tkáni pomocí histologie fluorescenčním mikroskopem.
Podstata vynálezu
Podstatou vynálezu jsou bimodální nanočástice CZF-F, připravené modifikací feritových jader enkapsulovaných do hydratovaného oxidu křemičitého pomocí fluorescenčního činidla, a způsob jejich použití pro značení a sledování buněk in vivo pomocí magnetické rezonance a optického
-2CZ 308154 B6 zobrazování, a in vitro pomocí fluorescenční mikroskopie. Vynález využívá feritová jádra obecného vzorce COi-xZmFciCLv (CZF) , kde x je 0,2 až 0,8, s výhodou 0,4 až 0,6 opatřených souvislou vrstvou hydratovaného oxidu křemičitého v tloušťce v rozmezí 1 až 100 nanometrů (viz dokument CZ 307623).
Nanočástice pro magnetické a fluorescenční značení buněk se skládají z jader opatřených hydrofílním obalem zajišťujícím biokompatibilitu materiálu s možností navázání fluorescenčního činidla. Obal jader zajišťuje fluorescenční signál a stabilitu vodných suspenzí nanočástic v rozsahu hodnot pH 5 až pH 9, v souladu s biologickým prostředím.
Připravené nanočástice CZF-F v koncentraci 0,02 až 0,3 mmol.dm“3(czF) nesnižují životaschopnost buněk, neovlivňují fyziologické funkce (například diferenciační potenciál u multipotentních kmenových buněk) a nejsou genotoxické (nezpůsobují poškození DNA, lipidů ani proteinů). Připravené nanočástice jsou určeny pro značení živých buněk, vhodných pro buněčnou terapii ve zvířecích experimentálních modelech i ve veterinární a klinické medicíně, jako je transplantace buněk do ischemických a traumatických lézí (například iktus, srdeční ischemie, míšní poranění), degenerativních onemocnění (například, artróza kloubů), neurodegenerativních onemocnění (ALS), metabolických chorob (diabetes, ateroskleróza). Živý příjemce je experimentální model (laboratorní zvíře) nebo pacient veterinární nebo humánní medicíny. Post mortem nebo ex vivo (biopsie) lze buňky označené CZF-F detekovat ve tkáni příjemce pomocí fluorescenční mikroskopie.
Po podání buněk s obsahem nanočástic v cytoplazmě je možné neinvazivní metodou, pomocí magnetické rezonance a optického zobrazování, sledovat pohyb značených buněk v těle příjemce a následně je detekovat pomocí fluorescenčního mikroskopu ex vivo v biopsiích a histologických vzorcích.
Připravené nanočástice CZF-F představují vhodný materiál ke sledování distribuce a průběhu cesty buněk transplantovaných do organizmu, včetně jejich in vivo migrace s možností ověření účinnosti značení před transplantací pomocí průtokového cytometru nebo fluorescenčního mikroskopu a následně post mortem nebo z biopsie histologicky pomocí fluorescenčního mikroskopu. Připravené nanočástice CZF-F jsou vhodné pro neinvazivní sledování značených buněk v těle příjemce a slouží a) ke značení adherentních buněk ex vivo (mezenchymových kmenových buněk z kostní dřeně, placenty, pupečníkové tkáně, tukové tkáně, buněk olfaktorické glie z čichového epitelu, neurálních progenitorových buněk, indukovaných pluripotentních buněk a jejich derivátů, embryonálních kmenových buněk a jejich derivátů, endotheliálních buněk, Langerhansových ostrůvků, fíbroblastů a nádorových linií); b) k ověření účinnosti značení pomocí průtokové cytometric a případného výběru pouze značených buněk (mezenchymových kmenových buněk z kostní dřeně, placenty, pupečníkové tkáně, tukové tkáně, buněk olfaktorické glie z čichového epitelu, neurálních progenitorových buněk, indukovaných pluripotentních buněk a jejich derivátů, embryonálních kmenových buněk a jejich derivátů, endoteliálních buněk, Langerhansových ostrůvků, fíbroblastů a nádorových linií); c) k podání značených buněk (mezenchymových kmenových buněk z kostní dřeně, placenty, pupečníkové tkáně, tukové tkáně, buněk olfaktorické glie z čichového epitelu, neurálních progenitorových buněk, indukovaných pluripotentních buněk a jejich derivátů, embryonálních kmenových buněk a jejich derivátů, endoteliálních buněk, Langerhansových ostrůvků, fíbroblastů a nádorových linií) živému příjemci (zvířeti nebo člověku s ischemickou nebo traumatickou lézí, s degenerativním, neurodegenerativním, nádorovým nebo metabolickým onemocněním), kdy nanočástice umožňují sledovat pohyb, umístění a přežití exogenních buněk prostřednictvím MRI nebo optického zobrazení. Z následné post mortem histologie nebo biopsie lze ověřit přežití, migraci a cestu transplantovaných buněk ve tkáni (například v nervové tkáni, cévách, játrech, chrupavce, epidermis, nádorové tkáni).
Nanočástice pro magnetické a fluorescenční značení buněk se připraví kovalentním navázáním fluorescenční značky, s výhodou fluoresceinu, na vrstvu hydratovaného oxidu křemičitého částic
-3 CZ 308154 B6 tvořených jádry feritů, s výhodou nanokrystalů feritů obecného vzorce Coi_xZnxFe2O4^ (CZF), kde x je 0,2 až 0,8, s výhodou 0,4 až 0,6, enkapsulovaných do hydratovaného oxidu křemičitého. Fluorescenční značka je navázána pomocí adiční reakce mezi aminoalkylalkoxysilanem, s výhodou aminopropyltriethoxysilanem, a činidlem obsahujícím skupinu s násobnou vazbu, s výhodou fluorescein-isothiokyanátem obsahující skupinu C=N. Pro omezení hydrolýzy navázaných molekul fluorescenčního činidla je následně uskutečněna reakce bazické polykondenzace alkylsiloxanů, s výhodou tetraethoxysilanu nebo jeho derivátů, s nastavením vhodných podmínek přípravy. Jsou tak získány suspenze vysoce stabilní ve vodném prostředí při pH > 4. Hydrofilní obal z vrstvy hydratovaného oxidu křemičitého zároveň zamezuje expozici magnetických jader buněčnému prostředí, což zajišťuje dostatečnou biokompatibilitu a použitelnost pro medicínské aplikace.
Vynález je blíže objasněn v následujících příkladech provedení. Tyto příklady, které představují přípravu nanokrystalů feritové fáze pro magnetické značení buněk podle vynálezu, mají výhradně ilustrativní charakter a rozsah vynálezu v žádném ohledu neomezují.
Nové znaky předmětu vynálezu
Novým znakem je navázání fluorescenční látky. Příprava CZF-F nanočástic pro magnetické a fluorescenční značení buněk je provedena tak, že na jádra feritů obecného vzorce Coi-xZnJtyCfl+Y, kde x je 0,2 až 0,8, o velikosti nanokrystalů v rozmezí 1 až 90 nanometrů, která jsou enkapsulovaná do hydratovaného oxidu křemičitého v tloušťce v rozmezí 1 až 100 nanometrů, jsou postupnými reakcemi kovalentně navázány aminoalkylalkoxysilan, s výhodou aminopropyltriethoxysilan, v bazickém prostředí při teplotě v rozmezí 20 °C až 50 °C po dobu v rozmezí 1 až 24 hod., činidlo tvořící fluorescenční značku, s výhodou fluorescein-isothiokyanát, v bezvodém prostředí při teplotě v rozmezí 20 až 90 °C po dobu 1 až 24 hod. a alkoxysilan, s výhodou tetraethoxysilan, v bazickém prostředí při teplotě v rozmezí 20 až 80 °C po dobu 1 až 24 hod. Novými znaky použití nanočástic jsou nízká buněčná toxicita. Buňky označené CZF-F nanočásticemi v koncentraci 0,03 až 0,2 mM proliferují stejně jako kontrolní neznačené buňky, což znamená, že značení buněk CZF-F nanočásticemi neovlivňuje proliferaci a expanzi buněk (viz příklad 2). Buňky lze pozorovat fluorescenčním mikroskopem (viz příklad 3).
Novým znakem je fluorescenčně označená buňka, kterou lze analyzovat a oddělit z buněčné suspenze pomocí průtokové cytometric a následného sorto vání na základě jejího fluorescenčního značení. Lze tak snadno změřit procentuální poměr označených buněk (viz příklad 6) a následně oddělit označené a neoznačené buňky.
Novým znakem je to, že buňky značené nanočásticemi vykazují vysoký relaxační poměr R2 při nižším obsahu potenciálně toxického magnetického kovu v buňkách, než je dosaženo u běžně užívaných magnetických značek (viz příklad 7).
Vysoký relaxační poměr buněk značených nanočásticemi zajišťuje jejich snadnou detekci pomocí magnetické rezonance in vitro i in vivo v nízkých koncentracích. Detekovat lze pomocí MR zobrazování i jednotlivé buňky (viz příklad 9). Po podání označených buněk příjemci (zvířeti nebo člověku) lze z odebrané tkáně obsahující transplantované buňky (autopsie, biopsie) detekovat transplantované buňky (viz příklad 12) ve tkáni a pomocí dalšího imunohistochemického barvení na různé markéry analyzovat stav buněk (například stupeň jejich diferenciace) nebo jejich interakci s tkání příjemce (kontakt buněk, zánětlivá reakce v přímém okolí transplantovaných buněk).
Objasnění výkresů
Obr. 1 znázorňuje snímky A, B a C, kde snímek A zachycuje buňky značené nanočásticemi při koncentraci 0,11 mmol.drrrýczi-i) v optickém mikroskopu, snímek B zachycuje totéž jako
-4CZ 308154 B6 snímek A, avšak ve fluorescenčním mikroskopu, a C zachycuje překrytí snímků A a B a ukazuje na přítomnost fluorescenčních částic v buňkách;
Obr. 2 znázorňuje graf obsahující růstové křivky buněk rMSC značených nanočásticemi o koncentracích 0,055; 0,11 a 0,55 mmol.dm_3(czF-F);
Obr. 3 znázorňuje snímek detailu rMSC buněk s přítomností nanočástic jako menších tmavých míst;
Obr. 4 znázorňuje grafý z FACS analýzy vykazující hodnoty fluorescence a procento nanočásticemi značených (0,11 mmol. dm“3(czF-F)) různých typů buněk;
Obr. 5 znázorňuje MR obrazy vzorků buněčných suspenzí změřených pomocí MR spektrometru Bruker pracujícím s polem 4,7 T získané pomocí standardní T2-vážené turbospinové sekvence;
Obr. 6a znázorňuje MR obraz implantátu v mozku potkana in vivo změřený 24 hod. po implantaci pomocí standardní T2-vážené turbospinové sekvence;
Obr. 6b znázorňuje MR obraz získaný T2*-váženou sekvencí gradientového echa;
Obr. 7 znázorňuje snímek detekce zeleně svíticích transplantovaných buněk v mozkové tkáni příjemce, kde modře jsou dobarvena jádra buněk (DAPI).
Příklady uskutečnění vynálezu
Příklad 1
Příprava suspenze nanočástic sestává z následujících kroků:
1. smíchání 250 pl aminopropylethoxysilanu a 1 ml chloroformu, čímž vznikne roztok aminopropylethoxysilanu;
2. smíchání 10 ml suspenze v ethanolu obsahující přibližně 40 mg jader feritu enkapsulovaných do hydratovaného oxidu křemičitého, 100 μΐ koncentrovaného roztoku amoniaku a roztoku aminopropylethoxysilanu, čímž vznikne směs I;
3. dispergace směsi I v ultrazvukové lázni po dobu 5 min.;
4. míchání směsi I ve skleněné baňce při nastavené teplotě v rozsahu 10 až 75 °C , s výhodou při 20 °C, po dobu 12 hod.;
5. oddělení meziproduktu I, kde meziprodukt I představuje jádra feritu enkapsulovaných do hydratovaného oxidu křemičitého s navázaným aminopropylethoxysilanem, od zreagované směsi I odstředěním při 10 000 ot./min. po dobu 10 min.
6. dispergace meziproduktu I v bezvodém ethanolu v ultrazvukové lázni po dobu 5 min.;
7. opakování oddělení meziproduktu I a následné dispergace v trojnásobném provedení;
8. oddělení rozpouštědla pomocí vakuové odparky;
9. dispergace suchého meziproduktu I v ultrazvukové lázni v 6 ml dimethylformamidu;
-5 CZ 308154 B6
10. smíchání 1,5 mg fluorescein-isothiokyanátu a 1 ml dimethylformamidu, čímž vznikne roztok fluorescein-isothiokyanátu;
11. smíchání suspenze meziproduktu I v dimethylformamidu a roztoku fluoresceinisothiokyanátu, čímž vznikne směs II;
12. dispergace směsi II v ultrazvukové lázni po dobu 5 min.
13. míchání směsi II ve skleněné baňce se zpětným chladičem uložené v olejové lázni, při nastavené teplotě v rozsahu 10 až 90 °C, s výhodou při 80 °C, po dobu 12 hod.;
14. oddělení meziproduktu II, kde meziprodukt II představuje jádra feritu enkapsulovaných do hydratovaného oxidu křemičitého s navázaným fluoresceinem, odstředěním při 10 000 ot./min. po dobu 10 min.
15. smíchání 15 ml ethanolu, 3 ml demineralizované vody a 1 ml koncentrovaného roztoku amoniaku, čímž vznikne silanizační roztok;
16. smíchání meziproduktu II a silanizačního roztoku, čímž vznikne směs III;
17. dispergace směsi III v ultrazvukové lázni, po dobu 5 min.;
18. smíchání směsi III a 5 μΐ tetraethoxysilanu, čímž vznikne směs IV;
19. míchání směsi IV při nastavené teplotě v rozsahu 10 až 90 °C, s výhodou při 57 °C, po dobu v rozmezí 0,5 až 24 hod., s výhodou 4 hod.;
20. oddělení produktu nanočástic odstředěním při 10 000 ot./min. po dobu 10 min.;
21. dispergace produktu nanočástic v ethanolu v ultrazvukové lázni po dobu 5 min.;
22. opakování oddělení produktu nanočástic a následné dispergace v ethanolu v dvojnásobném provedení;
23. opakování oddělení produktu nanočástic a následné dispergace v demineralizované vodě v trojnásobném provedení.
Meziprodukty:
I = jádra feritu enkapsulovaných do hydratovaného oxidu křemičitého s navázaným aminopropylethoxysilanem II
II = jádra feritu enkapsulovaných do hydratovaného oxidu křemičitého s navázaným fluoresceinem
Vstupní látky:
aminopropyltriethoxysilan (silanizační činidlo s aminovou skupinou, p.a.) demineralizované voda (rozpouštědlo, vodivost < 0,01 mS.m“1) chloroform (rozpouštědlo, p.a.) ethanol (bezvodé rozpouštědlo, p.a.) ethanol (rozpouštědlo, 96 %, p.a.) fluorescein-isothiokyanát (fluorescenční činidlo, p.a.) koncentrovaný vodný roztok amoniaku (25 %, p.a.) Ν,Ν-dimethylformamid (bezvodé rozpouštědlo, p.a.)
-6CZ 308154 B6 suspenze v ethanolu rozptýlených jader feritu (CZF) enkapsulovaných do hydratovaného oxidu křemičitého (viz dokument CZ/307623) tetraethoxysilan (silanizační činidlo, p.a.)
Výsledný produkt: nanočástice obsahující jádra feritu enkapsulovaných do hydratovaného oxidu křemičitého a modifikovaných fluoresceinem.
Příklad 2
Značení buněk nanočásticemi
Vstupní látky: buněčná suspenze, suspenze nanočástic CZF-F, kultivační medium DMEM +10 % FBS + primocin
Postup značení buněk nanočásticemi zahrnuje následující kroky:
1. Vysetí mesenchymálních kmenových buněk do kultivačních lahví;
2. Přidání vodné suspenze nanočástic připravených podle příkladu 1 po 2 hodinách do media (DMEM +10% FBS + primocin) tak, aby výsledná koncentrace CZF-F v mediu byla 0,055, 0,11 a 0,55 mmol.dm“3(czF-F);
3. Kultivace mesenchymálních kmenových buněk v kultivačním médiu DMEM +10% FBS + primocin s koncentracemi 0,055, 0,11 a 0,55 mmol. dnrýczF-F) po dobu 6 až 72 hod, s výhodou 48 hod.;
4. Po 48 h výměna média za čisté, bez nanočástic.
Příklad 3
Mikroskopie značených buněk
Postup mikroskopie značených buněk zahrnuje:
1. Pozorování mezenchymových stromálních buněk potkana (rMSC) značených nanočásticemi CZF-F podle příkladu 2 v optickém mikroskopu a fluorescenčním mikroskopu (obr. 1).
Buňky v kontaktu s nanočásticemi připravenými podle příkladu 1 adherují a proliferují a endocytují nanočástice CZF-F (viz obr. 1). Účinnost značení lze ověřit pomocí průtokové cytometric.
Příklad 4
Měření viability a proliferace
Způsob měření viability a proliferace zahrnuje následující kroky:
1. Proliferace v reálném čase se měří metodou RTCA xCELLigence (ACEA);
2. Vysetí buněk rMSC do E-Plate destiček v počtu 20 000 buněk na jamku;
3. Po 2 hod přidání vodné suspenze nanočástic CZF-F připravených podle příkladu 1 s výslednými koncentracemi v jamkách 0,055; 0,011 a 0,55 mmol. dnrýczF-Fj;
4. Měření proliferace pro dobu 48 hodin.
-7CZ 308154 B6
Průběh růstových křivek buněk s přítomností nanočástic o koncentraci 0,055 a 0,11 mmol.dm-3 je téměř shodný s tvarem růstové křivky neznačených buněk (viz obr. 2). Nejvyšší koncentrace nanočástic zpomaluje růst buněk oproti neznačeným buňkám i buňkám značených nižšími koncentracemi nanočástic.
Příklad 5
Transmisní elektronová mikroskopie buněk značených nanočásticemi
Způsob transmisní elektronové mikroskopie buněk značených nanočásticemi zahrnuje následující kroky:
1. Označení rMSC buněk podle příkladu 2;
2. Fixace a zpracování buněk pro potřeby elektronové mikroskopie;
3. Pozorování buněk v elektronovém mikroskopu
Na obr. 3. jsou patrné četné shluky nanočástic uvnitř značených buněk. Shluky nanočástic jsou rovnoměrně rozmístěny v buněčné cytoplazmě a není viditelné, že se hromadí na buněčné membráně.
Příklad 6
Stanovení účinnosti značení pomocí průtokové cytometric
Způsob semikvantitativního stanovení účinnosti značení různých typů buněk fluorescenčními nanočásticemi zahrnuje následující kroky:
1. Označení buněk (lidských a potkaních mezenchymových kmenových buněk, potkaní a lidské nádorové linie) podle příkladu 2
2. Po 48 h vymytí přebytečných nanočástic kultivačním médiem a oplach PBS;
3. Sklizení označených buněk pomocí trypsinu/EDTA a příprava buněčné suspenze v PBS pro potřeby průtokové cytometric.
4. Analýza průtokovým cytometrem.
Z měření jsou vyhodnoceny následující parametry: procenta značených buněk a střední intenzita fluorescence (MFI), viz obr. 4.
Příklad 7
Relaxivita buněk značených nanočásticemi
Přítomnost nanočástic v rMSC buňkách připravených a označených podle příkladu 2 je ověřena pomocí relaxometrie. Stanovený relaxační poměr buněčné suspenze R2 odpovídá kontrastu v MR obrazu.
Způsob stanovení a ověření relaxivity buněk značených nanočásticemi zahrnuje následující kroky:
1. Buněčná suspenze se rozptýlí ve 4% želatině, která zabrání usazování buněk během měření;
- 8 CZ 308154 B6
2. Pomocí relaxometru se měřicí sekvencí CPMG stanoví relaxační čas T2 vzorku;
3. Relaxační čas se přepočítá na relaxační poměr vztažením převrácené hodnotu relaxačního času na koncentraci buněk v daném objemu po odečtení příspěvku čisté želatiny.
Relaxační poměr R2 vzorků rMSC buněk zjištěné pomocí relaxometru Bruker Minispec při magnetickém poli 0,5 T jsou uvedeny v tabulce:
Koncentrace CZF-F Relaxační poměr R2 (0,5 T) v médiu [mmol.dnr3] [s*x/136 buněk/ml j
0,/O550,85
I» , ,11 jl , 5 b
Příklad 8
Stanovení obsahu prvků metodou ICP-MS
Metodou ICP-MS je stanoven obsah prvků (Co, Zn a Fe) ve značených buňkách podle příkladu 2. Měření metodou ICP-MS jsou prováděna na spektrometru Elan DRC-e (Perkin Elmer, Concord, Kanada) vybaveném koncentrickým zmlžovačem s cyklonickou mlžnou komorou a reakční/kolizní celou (DRC) pro eliminaci interferencí, a peristaltickým čerpadlem Gilson 212. Pro stanovení kobaltu, železa a zinku jsou monitorovány isotopy 59Co, 57Fe a 66Zn.
Způsob stanovení obsahu prvků metodou ICP-MS zahrnuje následující kroky:
1. Příprava kalibračních roztoků stanovovaných prvků i roztoku vnitřního standardu (Rh) ředěním roztoků o koncentraci 1,000 ± 0,002 g/1 (Merck, Darmstadt, SRN);
2. Úprava pH měřených roztoků pomocí koncentrovaného roztoku kyseliny dusičné (Suprapur, Merck), (5ml/100ml);
3. Doplnění vzorků připravených podle příkladu 2 demineralizovanou vodou (Mílii-Q, Millipore, USA) na 50 ml;
4. Kvantitativní převedení vzorků pomocí koncentrované kyseliny dusičné do teflonových nádobek pro mikrovlnný rozklad;
5. Rozklad v mikrovlnném zařízení (Uniclever BMI-Z, Plazmatronika, Polsko) ve směsi 3 ml koncentrované kyseliny dusičné a 1 ml koncentrované kyseliny fosforečné;
6. Převod vzorků po rozkladu do 50 ml odměmých baněk;
7. Ředění vzorků lOx pro vlastní analýzu.
Hodnoty obsahu analyzovaných prvků jsou uvedeny v následující tabulce:
-9CZ 308154 B6
| Kone. CZF | Obsah prvku [pg v buňce] |
| [mol. dnrJ] | Co Zn Fe |
| -----.......... | 10.19 |
| 0,11 | 6,346 6,01 27,97 |
Příklad 9
In vitro MR zobrazení buněk značených nanočásticemi
Zobrazování vzorků značených buněk in vitro je výhodné k prokázání citlivosti MRI a současně k napodobení průběhu signálu v mozkové tkáni.
Způsob in vitro MR zobrazení buněk značených nanočásticemi zahrnuje následující kroky:
1) Suspenze buněk značených podle příkladu 2 se rozptýlí ve 4% roztoku želatiny podle příkladu 9. Pro posouzení citlivosti je nezbytné připravit suspenze s různým počtem značených a neznačených buněk sloužících jako kontrolní vzorek;
2) Vzorky se vloží do tomografu a MR obrazy se změří standardními T2- nebo T2*-váženými zobrazovacími sekvencemi.
MR obrazy vzorků buněčných suspenzí změřených pomocí MR spektrometru Bruker pracujícím s polem 4,7 T získané pomocí standardní T2-vážené turbospinové sekvence (parametry sekvence: repetiční čas TR = 2 000 ms, efektivní echočas TE = 72 ms, turbofaktor = 8, počet akvizic AC = 8, zobrazené pole FOV = 45 x 45 mm, matrice MTX = 512 x 512, tloušťka vrstvy 0,5 mm, nastavená geometrie poskytuje srovnatelnou velikost voxelu jako u běžných in vivo měření) jsou v obr. 5.
Při použití obou sekvencí poskytují buňky značené nanočásticemi vynikající kontrast (hypointenzní signál, vzorky C-E resp. G-I) ve srovnání s neznačenými buňkami (vzorky B, F). Viditelný kontrast v MR obrazu je pozorován i u vzorku, jehož každý obrazový voxel obsahuje průměrně pouhé 0,6 buňky.
Obrázek 5:
A - vzorek obsahující čistý gel bez buněk
B - vzorek obsahující 19500 neznačených buněk v 0,5 ml, tj . průměrně 0,6 buňky na obrazový voxel
C - vzorek obsahující 19500 značených buněk v 0,5 ml tj. průměrně 0,6 buňky na obrazový voxel; buňky byly značeny nanočásticemi o koncentraci 0,055 mmol.dm 'lf /i ) v médiu.
D - vzorek obsahující 19500 značených buněk v 0,5 ml tj. průměrně 0,6 buňky na obrazový voxel; buňky byly značeny nanočásticemi o koncentraci 0,11 mmol .dm 'lf /i ) v médiu.
E - vzorek obsahující 19500 značených buněk v 0,5 ml tj. průměrně 0,6 buňky na obrazový voxel; buňky byly značeny nanočásticemi o koncentraci 0,55 mmol.dm 'lf /i ) v médiu.
F - vzorek obsahující 625000 neznačených buněk v 0,5 ml, tj . průměrně 19 buněk na obrazový voxel
G - vzorek obsahující 625000 značených buněk v 0,5 ml tj . průměrně 19 buněk na obrazový voxel; buňky byly značeny nanočásticemi o koncentraci 0, 055 mmol.dm 'lf /i ) v médiu.
H - vzorek obsahující 625000 značených buněk v 0,5 ml tj . průměrně 19 buněk na obrazový voxel; buňky byly značeny nanočásticemi o koncentraci 0,11 mmol .dm 'lf /i ) v médiu.
- 10 CZ 308154 B6
I - vzorek obsahující 625000 značených buněk v 0,5 ml tj . průměrně 19 buněk na obrazový voxel; buňky byly značeny nanočásticemi o koncentraci 0,55 mmol.dm 'lf /i ) v médiu.
Příklad 10
In vivo MR zobrazení buněk značených nanočásticemi
Značené buňky podle příkladu 2 se transplantují do mozku potkanů kmene Wistar a provede se standardní vyšetření na MR tomografů.
Způsob in vivo MR zobrazení buněk značených nanočásticemi zahrnuje následující kroky: Implantace buněk:
1) Buňky se označí nanočásticemi ve výsledné koncentraci 0,11 mol.dmýczF) po dobu 48 hod., poté se opláchnou čistým médiem a sklidí pomocí trypsinu/EDTA;
2) Suspenze se upraví na výsledný obsah 25 000 buněk rMSC v 10 μΐ;
3) Experimentální potkan se anestezuje pasivní inhalací 2 % isofluranu ve vzduchu;
4) Po návrtu lebky se implantují 2 μΐ buněčné suspenze do parietální mozkové kůry (koordináty 3 mm front., 3 mm dx. od bregmatu, 2 mm do hloubky od povrchu tvrdé pleny);
5) Po implantaci se návrt uzavře kostním voskem a měkké tkáně se sešijí;
In vivo MR vyšetřeni
6) Potkan se anestezuje pasivní inhalací 1,5 až 2 % isofloranu ve vzduchu;
7) Potkan se umístí do speciálního vyhřívaného držáku, se kterým se zvíře vloží do MR tomografů;
8) Pro základní lokalizaci se změří jednoduché sagitální, koronální a příčné snímky např. rychlou gradientovou echo sekvencí;
9) Značené buňky se detekují pomocí standardní T2-vážené zobrazovací sekvence (např. turbospinové echo) nebo T2*-vážené sekvence (gradientově echo);
10) V průběhu experimentu se monitoruje dýchání experimentálního zvířete.
MR obraz implantátu v mozku potkana in vivo změřený 24 hod. po implantaci pomocí standardní T2-vážené turbospinové sekvence (TR = 2 000 ms, TE = 42,5 ms, turbofaktor = 4, AC =16, FOV = 30 x 30 mm, matrice MTX 256 x 256, tloušťka vrstvy 0,75 mm) na MR spektrometru Bruker 4,7 T je na obr. 6a. MR obraz získaný T2*-váženou sekvencí gradientového echa (TR = 180 ms, TE = 12 ms, stejná geometrie zobrazení) je na obr. 6b.
Obr. 6a a obr. 6b prokazují, že buňky značené nanočásticemi podle příkladu 2 jsou velmi dobře rozeznatelné ve tkáni in vivo. Buněčné implantáty značené nanočásticemi jsou zřetelné jako hypointenzní signál v pravé hemisféře při počtu 5000 transplantovaných buněk v 2 μΐ média. Neznačené buněčné implantáty v levé hemisféře jsou viditelné na MR T2-vážených snímcích jako tkáňová nehomogenita bez hypointenzního signálu (obr. 6a).
Příklad 11
Genotoxicita
- 11 CZ 308154 B6
Poškození DNA je studováno pomocí jednobuněčné gelové elektroforézy (kometový test). Pro pokus se používá alkalická verze testu, která umožňuje detekci jedno- a dvouřetězcových zlomů DNA.
Způsob stanovení a ověření genotoxicity nanočástic zahrnuje následující kroky:
1. Sklizeň buněk značených nanočásticemi podle příkladu 2;
2. Umístění buněk na testovací skla (čtyři skla pro každý vzorek)/
3. Lyzace buněk v lyzačním roztoku při pH 10;
4. Oplach PBS a inkubace dvou skel s FPG a endonukleázou III po dobu 1 hod. při 37 °C;
5. Inkubace dalších 2 skel v pufru použitém pro ředění enzymů (0,1 mol KC1, 4 mmol EDTA, 2,5 mmol HEPES, 2 % BSA);
6. Vložení vzorků lyžovaných buněk do alkalického pufru na dobu 40 min., aby došlo k uvolnění DNA;
7. Provedení elektroforézy v čerstvém alkalickém pufru po dobu 20 min.;
8. Neutralizace vzorků v roztoku 0,4 mol Tris obsahujícím 0,005 % ethidiumbromidu;
9. Oplach destilovanou vodou;
10. Fixace methanolem a sušení při pokojové teplotě;
11. Analýza vzorků pomocí VANOX BHS fluorescenčního mikroskopu a hodnocení množství uvolněné DNA softwarem Lucia G 4.81.
Výsledky se uvádí jako procento DNA vyexportované do ocasu komety (Tail DNA %).
Celkové poškození DNA (total DNA damage, enzymatické) a zlomy (DNA-SB, bez enzymů) se počítají na 2 x 50 nespecificky (náhodně) vybraných buňkách. Stupeň oxidativního poškození se vyjadřuje jako rozdíl mezi mediánem celkového poškození DNA a mediánem zlomů. Pro oba typy poškození DNA se získají čtyři hodnoty pro jeden vzorek. K oběma typům poškození dochází pouze při nejvyšší koncentraci 0,55 mmol.dmýczi-i) ve vzorku, zatímco u vzorků s nižšími koncentracemi CZF poškození DNA nenastane podobně jako u neznačených kontrol.
Příklad 12
Histologická detekce označených buněk
Způsob histologické detekce označených buněk zahrnuje následující kroky:
1. Uvedení potkanů do celkové anestézie a perfundace přes levou srdeční komoru solnofosfátovým pufirem a 4% paraformaldehydem (pH 7,4);
2. Vynětí mozku a fixace přes noc v 4% paraformaldehydu;
3. Zamražení v 30 % roztoku sukrózy;
4. Nařezání mozkové tkáně na řezy o tloušťce 40 pm;
- 12 CZ 308154 B6
5. Zamontování na sklíčko.
Transplantované buňky jsou detekovány pod fluorescenčním mikroskopem v mozkové tkáni (Obr.7).
Průmyslová využitelnost
Hybridní nanočástice spinelové feritové fáze obecného vzorce Coi-xZnxFe2C>4^ opatřených souvislou vrstvou hydratovaného oxidu křemičitého se zabudovanou fluorescenční značkou podle tohoto vynálezu mohou být použity jako bimodální činidlo pro značení buněk a jejich následnou vizualizaci pomocí magnetické rezonance a fluorescenčního mikroskopu. Značení a zobrazování buněk je velice dobře využitelné v různých výzkumných oblastech, včetně biologického a lékařského výzkumu, kde je prováděn výzkum a vývoj v oboru buněčné terapie a její převod do klinické praxe.
Bylo zjištěno, že značení buněk připravenými nanočásticemi je výhodnější než značení částicemi oxidů železa díky vyšším hodnotám T2 relaxivity (např. v poli 0,5 T dosahuje T2 hodnot kolem 500 s_1.mmol_1.dm1 * 3(Fe) pro nanočástice s krystalickými jádry o velikosti 15 nm až 50 nm oproti hodnotě 200 s_1.mmol_1.dm3(Fe) pro nanočástice y-FezCb s dextranovým potahem).
Další výhodou předkládaného řešení s použitím takto modifikovaných nanočástic je podstatně menší zátěž sledovaného živého organizmu než v případě použití SPIO částic, neboť SPIO nanočástice mohou poškozovat DNA, lipidy a proteiny (Novotna, B. et al: Toxicology Letters, 210(2012) 53).
Připravené nanočástice představují vhodný materiál ke sledování distribuce a průběhu cesty buněk transplantovaných do organizmu, včetně jejich in vivo migrace s možností ověření účinnosti značení před transplantací pomocí průtokového cytometru nebo fluorescenčního mikroskopu a následně post mortem nebo z biopsie histologicky pomocí fluorescenčního mikroskopu. Připravené nanočástice jsou vhodné pro neinvazivní sledování značených buněk v těle příjemce a slouží a) ke značení kmenových buněk ex vivo; b) k ověření účinnosti značení pomocí průtokové cytometric a případného výběru pouze značených buněk; c) k podání značených kmenových buněk výše živému příjemci, kdy nanočástice umožňují sledovat pohyb, umístění a přežití exogenních buněk prostřednictvím MRI zobrazení. Z následné post mortem histologie nebo biopsie lze ověřit přežití, migraci a cestu transplantovaných buněk ve tkáni.
PATENTOVÉ NÁROKY
Claims (10)
1. Způsob přípravy nanočástic pro magnetické a fluorescenční značení buněk, vyznačující se tím, že v obalu hydratovaného oxidu křemičitého částic složených z jader feritů obecného vzorce
Coi-xZnxFe2O4+Y, kde x je 0,2 až 0,8, o velikosti nanokrystalů v rozmezí 1 až 90 nanometrů a souvislé vrstvy z hydratovaného oxidu křemičitého v tloušťce v rozmezí 1 až 100 nanometrů, je kovalentně navázána fluorescenční značka, přičemž na jádra feritů obecného vzorce Coi-xZnJ^CL+y, kde x je 0,2 až 0,8, s výhodou 0,4 až 0,6, o velikosti nanokrystalů v rozmezí 1 až 90 nanometrů, enkapsulovaných do hydratovaného oxidu křemičitého v tloušťce v rozmezí 1 až 100 nanometrů, jsou postupnými reakcemi kovalentně navázány aminoalkylalkoxysilan, s výhodou aminopropyltriethoxysilan, v bazickém prostředí při teplotě v rozmezí 20 až 50 °C po dobu v rozmezí 1 až 24 hod., činidlo tvořící fluorescenční značku, s výhodou fluorescein-isothiokyanát, v bezvodém prostředí při teplotě v rozmezí 20 až 90 °C po dobu 1 až 12. hod. a alkoxysilan, s výhodou tetraethoxysilan, v bazickém prostředí při teplotě v rozmezí 20 až 80 °C po dobu 1 až 24 hod.
- 13 CZ 308154 B6
2. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že příprava suspenze nanočástic sestává z následujících kroků:
- smíchání 250 μΐ aminopropylethoxysilanu a 1 ml chloroformu, čímž vznikne roztok aminopropylethoxysilanu;
- smíchání 10 ml suspenze v ethanolu obsahující přibližně 40 mg jader feritu enkapsulovaných do hydratovaného oxidu křemičitého, 100 μΐ koncentrovaného roztoku amoniaku a roztoku aminopropylethoxysilanu, čímž vznikne směs I;
- dispergace směsi I v ultrazvukové lázni po dobu 5 min.;
- míchání směsi I ve skleněné baňce při nastavené teplotě v rozsahu 10 až 75 °C, s výhodou při 20 °C, po dobu 12 hod.;
- oddělení meziproduktu I, kde meziprodukt I představuje jádra feritu enkapsulovaných do hydratovaného oxidu křemičitého s navázaným aminopropylethoxysilanem, od zreagované směsi I odstředěním při 10 000 ot./min. po dobu 10 min.
- dispergace meziproduktu I v bezvodém ethanolu v ultrazvukové lázni po dobu 5 min.;
- opakování oddělení meziproduktu I a následné dispergace v trojnásobném provedení;
- oddělení rozpouštědla pomocí vakuové odparky;
- dispergace suchého meziproduktu I v ultrazvukové lázni v 6 ml dimethylformamidu;
- smíchání 1,5 mg fluorescein-isothiokyanátu a 1 ml dimethylformamidu, čímž vznikne roztok fluorescein-isothiokyanátu;
- smíchání suspenze meziproduktu I v dimethylformamidu a roztoku fluorescein-isothiokyanátu, čímž vznikne směs II;
- dispergace směsi II v ultrazvukové lázni po dobu 5 min.;
- míchání směsi II ve skleněné baňce se zpětným chladičem uložené v olejové lázni, při nastavené teplotě v rozsahu 10 až 90 °C, s výhodou při 80 °C, po dobu 12 hod.;
- oddělení meziproduktu II, kde meziprodukt II představuje jádra feritu enkapsulovaných do hydratovaného oxidu křemičitého s navázaným fluoresceinem, odstředěním při 10 000 ot./min. po dobu 10 min.;
- smíchání 15 ml ethanolu, 3 ml demineralizované vody a 1 ml koncentrovaného roztoku amoniaku, čímž vznikne silanizační roztok;
- smíchání meziproduktu II a silanizačního roztoku, čímž vznikne směs III;
- dispergace směsi III v ultrazvukové lázni, po dobu 5 min.;
- smíchání směsi III a 5 μΐ tetraethoxysilanu, čímž vznikne směs IV;
- míchání směsi IV při nastavené teplotě v rozsahu 10 až 90 °C, s výhodou při 57 °C, po dobu v rozmezí 0,5 až 24 hod., s výhodou 4 hod.;
- oddělení produktu nanočástic odstředěním při 10 000 ot./min. po dobu 10 min.;
- dispergace produktu nanočástic v ethanolu v ultrazvukové lázni po dobu 5 min.;
- opakování oddělení produktu nanočástic a následné dispergace v ethanolu v dvojnásobném provedení;
- opakování oddělení produktu nanočástic a následné dispergace v demineralizované vodě v trojnásobném provedení.
3. Nanočástice pro magnetické a fluorescenční značení buněk, vyznačující se tím, že v obalu hydratovaného oxidu křemičitého částic složených z jader feritů obecného vzorce Coi-xZnxFe2O4+Y, kde x je 0,2 až 0,8, o velikosti nanokrystalů v rozmezí 1 až 90 nanometrů a souvislé vrstvy z hydratovaného oxidu křemičitého v tloušťce v rozmezí 1 až 100 nanometrů, je kovalentně navázána fluorescenční značka.
4. Použití nanočástice pro magnetické a fluorescenční značení buněk podle nároku 3 a/nebo nanočástice připravené způsobem podle kteréhokoliv z nároků 1 až 2 k medicínským aplikacím, využívajících buněčnou terapii ve zvířecích experimentálních modelech, veterinární medicíně a humánní medicíně: degenerativní a neurodegenerativní onemocnění, ischemické léze, traumatické léze, metabolické poruchy a nádorová onemocnění.
- 14 CZ 308154 B6
5. Použití nanočástice pro magnetické a fluorescenční značení buněk podle nároku 3 a/nebo nanočástice připravené způsobem podle kteréhokoliv z nároků 1 až 2 jako látky pro zobrazování značených buněk magnetickou rezonancí.
6. Použití nanočástice pro magnetické a fluorescenční značení buněk podle nároku 3 a/nebo nanočástice připravené způsobem podle kteréhokoliv z nároků 1 až 2 jako látky pro zobrazování značených buněk fluorescenčním mikroskopem.
7. Použití nanočástice pro magnetické a fluorescenční značení buněk podle nároku 3 a/nebo nanočástice připravené způsobem podle kteréhokoliv z nároků 1 až 2 jako látky pro analýzu a sorto vání značených buněk průtokovým cytometrem.
8. Použití nanočástic pro magnetické a fluorescenční značení buněk podle nároku 3 a/nebo nanočástice připravené způsobem podle kteréhokoliv z nároků 1 až 2 v koncentracích 0,001 mmol.dm“3 až 0,5 mmol.dm“3 po dobu 2 až 72 hodin při inkubaci adherentních buněk.
9. Použití podle nároku 8, vyznačené tím, že adherentní buňky zahrnují fagocytující buňky, buňky nádorové, buňky nádorových linií, epitheliální buňky a jejich prekurzory, mezenchymové stromální buňky izolované z kostní dřeně, tukové tkáně, pupečníkové tkáně a krve, dále buňky olfaktorické glie, neurální kmenové buňky a neurální progenitorové buňky a dendritické buňky.
10. Použití nanočástic pro magnetické a fluorescenční značení buněk podle nároku 3 a/nebo nanočástice pňpravené způsobem podle kteréhokoliv z nároků 1 až 2 v médiu s buněčnými kulturami samostatně a/nebo samostatně nebo v kombinaci s chemickou indukcí nebo transdukcí nebo v kombinaci s mechanickou indukcí nebo transfekcí.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CZ2015-606A CZ308154B6 (cs) | 2015-09-04 | 2015-09-04 | Nanočástice pro magnetické a fluorescenční značení buněk, způsob přípravy a použití |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CZ2015-606A CZ308154B6 (cs) | 2015-09-04 | 2015-09-04 | Nanočástice pro magnetické a fluorescenční značení buněk, způsob přípravy a použití |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CZ2015606A3 CZ2015606A3 (cs) | 2017-06-14 |
| CZ308154B6 true CZ308154B6 (cs) | 2020-01-29 |
Family
ID=59021177
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CZ2015-606A CZ308154B6 (cs) | 2015-09-04 | 2015-09-04 | Nanočástice pro magnetické a fluorescenční značení buněk, způsob přípravy a použití |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CZ (1) | CZ308154B6 (cs) |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101256863A (zh) * | 2008-01-07 | 2008-09-03 | 北京化工大学 | 一种表面修饰的磁性载体及其制备方法 |
| CZ2011763A3 (cs) * | 2011-11-23 | 2013-06-05 | Technická univerzita v Liberci | Hydrofilní polymerní membrána, textilní kompozit obsahující takovou hydrofilní polymerní membránu, a zpusob její výroby |
| CZ2012813A3 (cs) * | 2012-11-21 | 2014-10-01 | Fyzikální ústav AV ČR, v.v.i. | Vodné suspenze kobaltnatozinečnatých feritových nanočástic, kontrastní látky pro zobrazovací magnetickou rezonanci |
-
2015
- 2015-09-04 CZ CZ2015-606A patent/CZ308154B6/cs not_active IP Right Cessation
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101256863A (zh) * | 2008-01-07 | 2008-09-03 | 北京化工大学 | 一种表面修饰的磁性载体及其制备方法 |
| CZ2011763A3 (cs) * | 2011-11-23 | 2013-06-05 | Technická univerzita v Liberci | Hydrofilní polymerní membrána, textilní kompozit obsahující takovou hydrofilní polymerní membránu, a zpusob její výroby |
| CZ2012813A3 (cs) * | 2012-11-21 | 2014-10-01 | Fyzikální ústav AV ČR, v.v.i. | Vodné suspenze kobaltnatozinečnatých feritových nanočástic, kontrastní látky pro zobrazovací magnetickou rezonanci |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CZ2015606A3 (cs) | 2017-06-14 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Taylor et al. | Long-term tracking of cells using inorganic nanoparticles as contrast agents: are we there yet? | |
| Harrington et al. | Determining the fate of seeded cells in venous tissue-engineered vascular grafts using serial MRI | |
| TWI392509B (zh) | 以紅血球微囊作為奈米藥物遞送系統 | |
| ES2657051T3 (es) | Eritrocitos que contienen medios de contraste para imagen por resonancia magnética | |
| Skopalik et al. | Mesenchymal stromal cell labeling by new uncoated superparamagnetic maghemite nanoparticles in comparison with commercial Resovist–an initial in vitro study | |
| Chen et al. | Simple SPION incubation as an efficient intracellular labeling method for tracking neural progenitor cells using MRI | |
| Shen et al. | Gadolinium3+-doped mesoporous silica nanoparticles as a potential magnetic resonance tracer for monitoring the migration of stem cells in vivo | |
| US11731098B2 (en) | Method for extracting nerve tissue-derived exosomes | |
| Santelli et al. | Multimodal gadolinium oxysulfide nanoparticles: a versatile contrast agent for mesenchymal stem cell labeling | |
| Soenen et al. | MRI assessment of blood outgrowth endothelial cell homing using cationic magnetoliposomes | |
| Namestnikova et al. | Methodological aspects of MRI of transplanted superparamagnetic iron oxide-labeled mesenchymal stem cells in live rat brain | |
| Zeng et al. | Gadolinium hybrid iron oxide nanocomposites for dual T 1-and T 2-weighted MR imaging of cell labeling | |
| Liu et al. | Magnetic resonance imaging probes for labeling of chondrocyte cells | |
| Murphy et al. | Use of trimetasphere metallofullerene MRI contrast agent for the non-invasive longitudinal tracking of stem cells in the lung | |
| De Vocht et al. | Labeling of Luciferase/eGFP-expressing bone marrow-derived stromal cells with fluorescent micron-sized iron oxide particles improves quantitative and qualitative multimodal imaging of cellular grafts in vivo | |
| Yang et al. | Ambidextrous magnetic nanovectors for synchronous gene transfection and labeling of human MSCs | |
| Syková et al. | Magnetic resonance imaging of stem cell migration | |
| Syková et al. | MR tracking of stem cells in living recipients | |
| Anna et al. | nCP: Fe—A Biomineral Magnetic Nanocontrast Agent for Tracking Implanted Stem Cells in Brain Using MRI | |
| CZ308154B6 (cs) | Nanočástice pro magnetické a fluorescenční značení buněk, způsob přípravy a použití | |
| JP7328654B2 (ja) | 候補物質が生体の活性に与える影響を評価する方法、生分解性粒子、キット、および候補物質が生体の活性に与える影響を評価するシステム | |
| CN113786496A (zh) | 一种靶向药物纳米体系及其制备方法和应用 | |
| US20200268912A1 (en) | Composite particles for imaging, method for producing composite particles, cells, cell structure, and mixed dispersion | |
| Berman et al. | MRI of transplanted neural stem cells | |
| Skopalík et al. | Formation of cell-to-cell connection between bone marrow cells and isolated rat cardiomyocytes in a cocultivation model |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | Patent lapsed due to non-payment of fee |
Effective date: 20200904 |