CZ305472B6

CZ305472B6 - Substituované furo[3,2-b]pyridiny pro použití jako léčiva

Info

Publication number: CZ305472B6
Application number: CZ2014-295A
Authority: CZ
Inventors: Kamil Paruch; Michaela Petrůjová
Original assignee: Masarykova Univerzita; Fakultní nemocnice u sv. Anny v Brně
Priority date: 2014-04-30
Filing date: 2014-04-30
Publication date: 2015-10-14
Also published as: CZ2014295A3

Abstract

Předkládané řešení poskytuje substituované furo[3,2-b]pyridiny obecného vzorce I nebo jejich farmaceuticky přijatelné soli či solváty, kde R.sup.1.n. je fenyl nebo naftyl, případně substituovaný substituentem vybraným ze skupiny zahrnující methyl, methoxy, methylthio, F, Cl, Br; R.sup.2.n. je vybrán ze skupiny zahrnující -NR.sup.3.n.(CR.sup.4.n..sup.R5.n.)pNR.sup.6.n..sup.R7.n.nebo -NR.sup.3.n.(CR.sup.4.n..sup.R5.n.).sub.p.n.OR.sup.8.n.; R.sup.3.n.je vybrán ze skupiny zahrnující H, methyl, ethyl, propyl, isopropyl; R.sup.4.n. je H; R.sup.5.n. je H; R.sup.6.n. je vybrán ze skupiny zahrnující H, methyl, ethyl, propyl, isopropyl; R.sup.7.n. je vybrán ze skupiny zahrnující H, methyl, ethyl, propyl, isopropyl; R.sup.8.n. je vybrán ze skupiny zahrnující H, methyl, ethyl, propyl, isopropyl; p je v rozmezí 2 až 7. Tyto látky jsou vhodné pro použití jako léčiva, zejména léčiva pro léčbu hematologických maligních onemocnění.

Description

Oblast techniky

Předkládaný vynález se týká substituovaných furo[3,2-Z>]pyridinů a jejich aktivity jako inhibitorů PIM kináz.

Dosavadní stav techniky

PIM kinázy jsou serin/threoninové kinázy patřící do skupiny CAMK. (kalmodulin-dependentní proteinové kinázy) kináz. Jsou známy tři PIM kinázy: PIM-1, PIM-2 a PIM-3 (Int. J. Biochem. Cell Biol. 2005, 37, 726). Mezi PIM kinázami existuje vysoká sekvenční homologie, která může souviset s jejich funkční redundancí. PIM-1 a PIM-2 jsou overexprimovány v mnoha buňkách lidských maligních hematopoietických onemocněních, jako je myeloidní leukémie a lymfomy (Proč. Nati. Acad. Sci. U.S.A. 1989, 86, 8857; Leuk. Lymphoma 2004, 45, 951.). DNA microarray analýzy ukázaly, že PIM-1 je overexprimována v lidské rakovině prostaty a tato nadměrná exprese koreluje s prognózou choroby (J. Exp. Med. 2005, 201, 259). Ve zvířecích modelech bylo prokázáno, že overexprese PIM-1 a PIM-2 v buňkách lidského nádoru prostaty podporuje jejich růst v myších (Mol. Cancer Res. 2005, 3, 443.). Lze tedy docílit, že inhibice PIM-1 a/nebo PIM2 bude účinnou alternativou v léčbě hematologických maligních onemocnění.

Podstata vynálezu

Předmětem předkládaného vynálezu jsou substituované furo[3,2-ů]pyridiny obecného vzorce I

nebo jejich farmaceuticky přijatelné soli či solváty, kde

R¹ je fenyl nebo naftyl, případně substituovaný substituentem vybraným ze skupiny zahrnující methyl, methoxy, methylthio, F, Cl, Br;

R² je vybrán ze skupiny zahrnující -NR³(CR⁴R⁵)PNR⁶R⁷ nebo -NR³(CR⁴R⁵)POR⁸;

R³ je vybrán ze skupiny zahrnující H, methyl, ethyl, propyl, isopropyl;

R⁴ je H;

R⁵ je H;

R⁶ je vybrán ze skupiny zahrnující H, methyl, ethyl, propyl, isopropyl;

R⁷ je vybrán ze skupiny zahrnující H, methyl, ethyl, propyl, isopropyl;

R⁸ je vybrán ze skupiny zahrnující H, methyl, ethyl, propyl, isopropyl;

p je v rozmezí 2 až 7.

Farmaceuticky přijatelné soli zahrnují soli s anionty farmaceuticky přijatelných anorganických a organických kyselin, jako jsou chloridy, bromidy, sírany, fumaráty, acetáty, formiáty apod. Rov- 1 CZ 305472 B6 něž zahrnují soli bází. Taktéž zahrnují soli s farmaceuticky přijatelnými anorganickými a organickými kyselinami.

Solváty jsou látky, které ve své krystalové struktuře zahrnují molekuly rozpouštědla, například vody.

Dalším předmětem vynálezu jsou látky obecného vzorce I pro použití jako léčiva. Látky obecného vzorce jsou zejména vhodné jako léčiva pro léčbu hematologických maligních onemocnění, obzvláště leukémie a lymfomu, konkrétněji myeloidní leukémie a lymfomu.

Příprava látek obecného vzorce I:

Látky lze připravit běžnými syntetickými postupy.

Výhodným postupem je například Pd-katalyzovaná reakce 6-chlor-2-jodpyridin-3-olu s vinylboronáty za vzniku meziproduktu 1, který se potom za katalýzy mědí podrobí cyklizaci za vzniku furopyridinového systému 2. Ten se pak podrobí aminaci katalyzované Pd za vzniku žádané látky. Postup je schematicky znázorněn v následujícím schématu:

R¹

Příklady uskutečnění vynálezu

Příklad 1

K roztoku (PhO)₃P (2,09 g; 6,75 mmol) v bezvodém CH₂C1₂ (10 mL) byl pod atmosférou argonu přidán Br₂ (0,380 mL; 7,38 mmol) při teplotě -60 °C. Poté byl přidán triethylamin (1,10 mL; 7,89 mmol) a roztok 2-acetylnaftalenu (1,03 g; 6,05 mmol) v suchém CH₂C1₂ (5 mL). Reakční směs byla poté ponechána při teplotě 25 °C, míchána pod argonem po dobu 18 hodin a nakonec refluxována po dobu 2 hodin. CH₂C1₂ a nezreagovaný triethyolamin a Br₂ byly odpařeny a zbytek byl čištěn pomocí kolonové chromatografíe na silikagelu (eluent: hexan/CH₂Cl₂ - 2/1). Produkt byl získán ve formě světle oranžové tuhé látky (0,947 g; 67 %).

-2CZ 305472 B6

HRMS (APCI): teor. pro C₁₂H₁₀Br (M+H)⁺ = 232,9960; exp. (M+H)⁺ = 232,9958 'HNMR (500 MHz, CDC1₃): δ = 8,07 (d, J= 1,55 Hz, 1H); 7,87 až 7,77 (m, 3H); 7,69 až 7,66 (m, 1H); 7,52 až 7,46 (m, 2H); 6,25 (d, J= 2,10 Hz, 1H); 5,87 (d, J= 2,10 Hz, 1H) ppm.

¹³C NMR (500 MHz, CDC1₃): δ = 135,88; 133,67; 133,15; 131,32; 128,77; 128,14; 127,75; 127,09; 126,85; 124,41; 118,23 ppm.

Příklad 2

Směs sloučeniny připravené v příkladu 1 (0,947 g; 4,06 mmol), bis(pinakolato)dibor (1,140 g;

4,49 mmol), PPh₃ (0,066 g; 0,25 mmol), fenolátu draselného (0,809 g; 6,12 mmol) a PdCl₂(PPh₃)₂ (0,089 g; 0,13 mmol) v suchém toluenu (20 mL) byla míchána pod dusíkem při 50 °C po dobu 24 hodin. Poté byla směs ochlazena na 25 °C, nalita do vody (100 mL) a poté extrahována EtOAc (3x 80 mL). Organické extrakty byly promyty solankou (80 mL), vysušeny nad Na₂SO₄, zfiltrovány a rozpouštědlo bylo odpařeno. Takto získaný olej byl čištěn pomocí kolonové chromatografie na silikagelu (eluent: hexan/CH₂Cl₂ - 2/1). Produkt byl získán ve formě světle oranžové tuhé látky (0,460 g; 40 %).

HRMS (APCI): teor. pro Ci₈H₂₂BO₂ (M+H)⁺ = 281,1711; exp. (M+H)⁺ = 281,1708 'HNMR (500 MHz, CDC1₃): δ = 7,94 (s, 1H); 7,84 až 7,75 (m, 3H); 7,61 (dd, J= 1,50 Hz, 8,54 Hz, 1H); 7,46 až 7,38 (m, 2H); 6,20 (d, J= 2,29 Hz, 1H); 6,14 (d, J= 2,73 Hz, 1H); 1,35 (s, 12H) ppm.

¹³C NMR (500 MHz, CDC1₃): δ = 139,09; 133,77; 132,91; 131,36; 128,47; 127,82; 127,72; 126,36; 126,02; 125,76; 84,09, 25,06 ppm

Příklad 3

Ck

ΌΗ

Na₂CO₃ (10,3 g, 97,3 mmol) a I₂ (11,8 g, 46,3 mmol) byly přidány k míchanému roztoku 2chlor-5-hydroxypyridinu (6,0 g, 46,3 mmol) ve vodě (80 mL). Vzniklá směs byla míchána při 25 °C po dobu 2 hodin, poté byla neutralizována pomocí 1M HCI (cca 50 mL) na pH = 7 a následně extrahována EtOAc (3x 110 mL). Organické extrakty byly promyty solankou (150 mL), vysušeny nad Na₂SO₄, zfiltrovány a rozpouštědlo bylo odpařeno. Produkt byl získán ve formě světle žluté tuhé látky (11,1 g; 94 %).

HRMS (APCI): teor. pro C₅H₄C1INO (M+H)⁺ = 255,9021; exp. (M+H)⁺ = 255,9018 'HNMR (500 MHz, CDC1₃): δ = 11,10 (s, 1H); 7,30 (d, J= 8,40 Hz, 1H); 7,18 (d, J= 8,40 Hz, 1H) ppm.

¹³C NMR (500 MHz, CDC1₃): δ = 153,88; 138,14; 124,01; 123,89; 107,67 ppm

-3CZ 305472 B6

Příklad 4A

Ke směsi sloučeniny připravené v příkladu 2 (0,460 g; 1,64 mmol), sloučeniny připravené v příkladu 3 (0,349 g; 1,37 mmol), K₃PO₄ (1,196 g; 5,64 mmol) a Pd(dppf)Cl₂, kde dppf značí difenylfosfínoferocen (0,063 g; 0,068 mmol) byly pod dusíkem přidány 1,2-dimethoxyethan (8 mL) a voda (2 mL). Reakční směs byla refluxována po dobu 15 hodin. Poté byla směs ochlazena na 25 °C, nalita do solanky (80 mL) a poté extrahována CH₂C1₂ (3x 60 mL). Organické extrakty byly promyty solankou (150 mL), vysušeny nad Na₂SO₄, zfiltrovány a rozpouštědlo bylo odpařeno. Takto získaný surový produkt byl čištěn pomocí klonové chromatografie na silikagelu (eluent: CH₂C1₂). Produkt byl získán ve formě světle žluté tuhé látky (0,105 g; 27 %).

'HNMR (500 MHz, CDC1₃): δ = 7,85 až 7,75 (m, 3H); 7,72 (d, J= 1,33 Hz, 1H); 7,52 (dd, 7 = 1,86 Hz, 8,57 Hz, 1H); 7,50 až 7,45 (m, 2H); 7,26 až 7,22 (m, 2H); 6,06 (s, 1H); 5,79 (s, 1H); 5,07 (s, 1H) ppm ¹³C NMR (500 MHz, CDC1₃): δ = 149,57; 145,61; 143,82; 142,27; 134,90; 133,71; 133,59; 129,13; 128,65; 127,91; 127,37; 127,01; 126,88; 126,78; 125,04; 124,53; 120,55 ppm

Příklad 4B

Pomocí v podstatě stejné procedury, jaká byla uvedena v příkladu 4A, přičemž byl použit pinakol ester fenylvinylborité kyseliny místo boronátu z příkladu 2, byla připravena tato sloučenina:

'HNMR (500 MHz, CDC1₃): δ = 7,39 až 7,31 (m, 5H); 7,23 až 7,18 (m, 2H); 5,94 (d, 7 = 0,73 Hz, 1H); 5,71 (d, J= 0,68 Hz, 1H); 5,00 (brs, 1H) ppm.

¹³C NMR (500 MHz, CDC1₃): δ = 149,48; 145,54; 143,82; 142,18; 137,57; 129,33; 129,29; 127,32; 127,24; 124,95; 120,11 ppm.

Příklad 5A

-4CZ 305472 B6

Směs sloučeniny připravené v příkladu 4A (0,105 g; 0,37 mmol), octanu měďnatého (0,029 g; 0,24 mmol), 8-hydroxychinolinu (0,037 g; 0,25 mmol) a K₂CO₃ (0,067 g; 0,48 mmol) v bezvodém Λζ/V-dimethylacetamidu (1,5 mL) byla míchána při 140 °C po dobu 18 hodin pod atmosférou O₂. Rozpouštědlo bylo poté odpařeno ve vakuu a zbytek byl nalit do vody (50 mL) a extrahován EtOAc (3x 30 mL). Organické extrakty byly promyty solankou (40 mL), vysušeny nad MgSO₄, zfiltrovány a rozpouštědlo bylo odpařeno. Takto získaný surový produkt byl čištěn pomocí kolonové chromatografie na silikagelu (eluent: hexan/CH₂Cl₂ - 1/1). Produkt byl získán ve formě světle žluté tuhé látky (0,037 g; 36 %).

‘HNMR (500 MHz, CDC1₃): δ = 8,67 (s, 1H); 8,23 (s, 1H); 8,01 až 7,93 (m, 2H); 7,90 (d J = 8,53 Hz, 1H); 7,85 až 7,82 (m, 1H); 7,75 (d, J= 8,60 Hz, 1H); 7,53 až 7,45 (m, 2H); 7,29 (d, J = 8,59 Hz, 1H) ppm.

^I3C NMR (500 MHz, CDC1₃): δ = 148,02; 147,34; 146,37; 146,00; 133,88; 133,20; 128,71; 128,66; 127,90; 127,28; 126,53; 126,42; 126,37; 124,87; 121,73; 121,29; 119,88 ppm.

Příklad 5B

Pomocí v podstatě stejné procedury, jaká byla uvedena v příkladu 5A, přičemž byl použit produkt uvedený v příkladu 4B, byla připravena tato sloučenina:

HRMS (APCI): teor. pro Cj₃H₉C1NO (M+H)⁺ = 230,0367; exp. (M+H)⁺ = 230,0365 ‘HNMR (500 MHz, CDC1₃): δ = 8,12 (s, 1H); 8,04 až 7,99 (m, 2H); 7,73 (d, J= 8,61 Hz, 1H);

7,49 až 7,43 (m, 2H); 7,37 až 7,32 (m, 1H); 7,27 (d, J= 8,60 Hz, 1H) ppm.

¹³C NMR (500 MHz, CDC1₃): δ = 147,93; 147,28; 146,06; 145,92; 129,89; 129,11; 128,23; 127,27; 121,81; 121,26; 119,78 ppm.

Příklad 6A

Λζ/V-dimethylethylendiamin (0,015 mL; 0,14 mmol) byl přidán k roztoku sloučeniny připravené v příkladu 5A (0,038 g; 0,13 mmol), (Á)-BINAPu (0,009 g; 0,015 mmol), Pd(dba)₂, kde dba značí dibenzylidenaceton (0,011 g; 0,019 mmol) a Z-BuOK (0,025 g; 0,22 mmol) v bezvodém toluenu (2 mL) a takto vzniklá směs byla míchána pod dusíkem při 80 °C po dobu 16 hodin. Poté byl přidán EtOAc (5 mL), směs byla nalita do vody (5 mL) a extrahována EtOAc (3x 10 mL). Organické extrakty byly promyty solankou (15 mL), vysušeny nad MgSO₄, zfiltrovány a rozpouštědlo bylo odpařeno. Surový produkt byl purifikován pomocí preparativní TLC na silikagelu (eluent: CH₂C1₂/7N NH₃ v MeOH - 17:1). Produkt byl získán jako žlutá tuhá látka (0,016 g; 35 %).

-5CZ 305472 B6

HRMS (APCI): teor. pro C₂₁H₂₂N₃O (M+H)⁺ = 332,1757; exp. (M+H)⁺ = 332,1759 ‘HNMR (500 MHz, CDC1₃): δ = 8,84 (s, 1H); 8,08 (s, 1H); 8,05 (d, 7= 1,64 Hz, 8,52 Hz); 7,94 až 7,72 (m, 3H); 7,54 (d, J= 8,92 Hz, 1H), 7,50 až 7,42 (m, 2H); 6,42 (d, J= 8,92 Hz, 1H); 5,03 (t, J= 4,47 Hz, 1H); 3,56 (dd, J= 5,63 Hz, 11,47 Hz, 2H); 2,62 (t, J= 6,02 Hz, 2H); 2,30 (s, 6H) ppm.

¹³C NMR (500 MHz, CDC1₃): δ = 157,00; 144,20; 143,92; 143,60; 134,01; 132,86; 129,15; 128,50; 128,26; 127,89; 126,25; 125,92; 125,84; 125,04; 120,96; 120,79; 105,55; 58,61; 45,60; 40,17 ppm.

Příklad 6B

Pomocí v podstatě stejné procedury, jaká byla uvedena v příkladu 6A, přičemž byl použit produkt uvedený v příkladu 5B, byla připravena tato sloučenina:

HRMS (APCI): teor. pro C₁₇H₂₀N₃O (M+H)⁺ = 282,1601; exp. (M+H)⁺ = 282,1600 ‘HNMR (500 MHz, CDC1₃): δ = 8,13 až 8,08 (m, 2H); 7,96 (s, 1H); 7,51 (d, J= 8,93 Hz, 1H); 7,45 až 7,39 (m, 2H); 7,32 až 7,26 (m, 1H); 6,39 (d, J= 8,93 Hz, 1H), 5,04 až 4,95 (m, NH, 1H);

3,50 (dd, J= 5,71 Hz, 11,41 Hz, 2H); 2,60 (t, 7= 6,06 Hz, 2H); 2,29 (s, 6H) ppm.

’³C NMR (500 MHz, CDC1₃): δ = 156,93; 143,86; 143,84; 143,50; 131,73; 128,78; 127,32; 127,00; 121,05; 120,73; 105,43; 58,36; 45,55; 40,10 ppm.

Příklad 7

H₂N

Sloučenina připravená v příkladu 5A (0,056 g; 0,20 mmol), Z-BuOK (0,028 g; 0,29 mmol) a ethylendiamin (0,016 mL; 0,24 mmol) byly přidány k čerstvě připravenému roztoku (5)-l-[(/?p)2—(dicyklohexylfosfino)ferrocenyl]ethyldi—/er/-butylfosfinu (0,006 g; 0,011 mmol) a Pd(OAc)₂(0,006 g; 0,026 mmol) v bezvodém 1,2-dimethoxyethanu (2 mL) a takto vzniklá směs byla míchána pod dusíkem při 100 °C po dobu 14 hodin. Poté byl přidán EtOAc (30 mL), směs byla nalita do solanky (30 mL) a extrahována EtOAc (3x 20 mL). Organické extrakty byly promyty solankou (15 mL), vysušeny nad MgSO₄, zfiltrovány a rozpouštědlo bylo odpařeno. Surový produkt byl purifikován pomocí preparativní TLC na silikagelu (eluent: CH₂C1₂/7N NH₃ v MeOH 15/1). Produkt byl získán jako světle oranžová voskovitá látka (0,019 g; 31 %).

HRMS (APCI): teor. pro Ci₉H₁₈N₃O (M+H)⁺ = 304,1444; exp. (M+H)⁺ = 304,1443

-6CZ 305472 B6 ‘HNMR (500 MHz, CDC1₃): δ = 8,81 (s, 1H); 8,08 (s, 1H); 8,01 (dd, J= 1,60 Hz, 8,50 Hz, 1H); 7,93 až 7,79 (m, 3H); 7,55 (d, 7 = 8,91 Hz, 1H), 7,51 až 7,41 (m, 2H); 6,41 (d, 7 = 8,92 Hz, 1H); 4,92 až 4,82 (m, 1H); 3,53 (dd, J= 5,60 Hz, 11,31 Hz, 2H); 3,05 (t, 7 = 5,85 Hz, 2H); 1,44 (brs, 2H) ppm.

^I3C NMR (500 MHz, CDC1₃): δ = 157,03; 144,34; 144,01; 143,63; 133,98; 132,85; 129,03; 128,47; 128,28; 127,88; 126,30; 125,96; 125,89; 124,98; 120,93; 120,88; 105,25; 45,77; 41,77 ppm.

Příklad 8

Sloučenina připravená v příkladu 5A (0,055 g; 0,20 mmol), ř-BuOK (0,028 g; 0,29 mmol) a 2methoxyethylamin (0,021 mL; 0,24 mmol) byly přidány k čerstvě připravenému roztoku (<S)-1[(Áp)-2-(dicyklohexylfosfino)ferrocenyl]ethyldi-Zerř-butylfosfinu (0,004 g; 0,0079 mmol) a Pd(OAc)₂ (0,002 g; 0,0079 mmol) vbezvodém 1,2-dimethoxyethanu (2 mL) a takto vzniklá směs byla míchána pod dusíkem při 100 °C po dobu 14 hodin. Poté byl přidán EtOAc (30 mL), směs byla nalita do solanky (30 mL) a extrahována EtOAc (3x 20 mL). Organické extrakty byly promyty solankou (15 mL), vysušeny nad MgSO₄, zfiltrovány a rozpouštědlo bylo odpařeno. Surový produkt byl purifikován pomocí kolonové chromatografie na silikagelu (eluent: hexan/EtOAc - 1/1). Produkt byl získán ve formě světle červené tuhé látky (0,050 g; 87 %).

HRMS (APCI): teor. pro C₂₀H₁₉N₂O₂ (M+H)⁺ = 319,1441; exp. (M+H)⁺ = 319,1439.

'HNMR (500 MHz, CDC1₃): δ = 8,82 (s, 1H); 8,08 (s, 1H); 8,02 (dd, 7= 1,54 Hz, 8,52 Hz, 1H); 7,93 až 7,80 (m, 3H); 7,57 (d, 7= 8,93 Hz, 1H), 7,51 až 7,42 (m, 2H); 6,44 (d, 7= 8,90 Hz, 1H); 4,99 (brs, 1H); 3,70 (s, 4H); 3,41 (s, 3H) ppm.

C NMR (500 MHz, CDC1₃): δ = 156,66; 144,38; 144,00; 134,00; 132,90; 128,91; 128,52; 128,32; 127,89; 126,32; 126,02; 125,93; 124,98; 121,15; 120,92; 105,68; 71,71; 59,05; 42,46 ppm.

Testování biologické aktivity:

In vitro testy (eseje) byly provedeny komerční firmou Merck Millipore ve formátu jejich radiometrické eseje KinaseProfiler. Takto byly určeny IC50 hodnoty pro jednotlivé sloučeniny vůči jednotlivým kinázám PIM-1, PIM-2 a PIM-3. Zdát o inhibiční aktivitě, která byla měřena ve dvou opakováních z 10 sériových ředění inhibitorů, byly vytvořeny křivky závislosti inhibiční aktivity na koncentraci. Koncentrace testované sloučeniny byla vynášena proti % kinázové aktivity. Pro stanovení hodnot IC₅₀ byly křivky závislosti inhibiční aktivity na koncentraci proloženy standardní sigmoidní křivkou a hodnoty IC₅₀ byly stanoveny standardní nelineární regresní analýzou.

Všechny testované sloučeniny byly rozpuštěny ve 100% DMSO na koncentraci 0,5mM (pro koncentrační řadu A, viz níže) nebo 0,05mM (pro koncentrační řadu B). Tento zásobní roztok sloučeniny byl vnesen do jamky jako první složka reakce, následně byly přidány další složky. Zásobní roztok byl přidáván do jednotlivých jamek v takových množstvích, aby konečné koncentrace testované sloučeniny odpovídaly koncentrační řadě A (0,00 ΙμΜ, 0,003 μΜ, 0,0 ΙμΜ, 0,03 μΜ, 0,0ΙμΜ, 0,3μΜ, Ι,ΟμΜ, 3,0μΜ, a ΙΟ,ΟμΜ) nebo koncentrační řadě Β (0,0001 μΜ, 0,0003μΜ,

-7CZ 305472 B6

0,00ΙμΜ, 0,003μΜ, 0,0ΙμΜ, 0,03μΜ, 0,1 μΜ, Ο,μΜ, a Ι,ΟμΜ). Před započetím reakce nebyla testovaná sloučenina s kinázou preinkubována.

Pozitivní kontroly obsahovaly všechny složky reakce kromě testované sloučeniny; obsahovaly však DMSO o koncentraci 2 % pro zahrnutí účinku rozpouštědla. Kontroly (blank) obsahovaly všechny složky reakce a staurosporin jako referenční inhibitor namísto testovaných sloučenin. Tento referenční inhibitor odstranil kinázovou aktivitu a pomocí něj byla ustavena referenční nula (baseline, 0% zbytková kinázová aktivita).

Testování inhibiční aktivity vůči PIM-1:

Byl připraven roztok PIM-l(h) v pufru (20 mM MOPS, lmM EDTA, 0,01% Brij—35, 5% Glycerol, 0,1% β-merkaptoethanol, 1 mg/mL BSAs) o koncentraci 1,01 mg/mL. Tento zásobní roztok byl pak přidán k reakční směsi.

Výše popsaný zásobní roztok PIM-l(h) byl přidán ke směsi obsahující 8mM MOPS pH 7.0, 0,2mM EDTA a 100μΜ KKRNRTLTV v takovém množství, že výsledná koncentrace PIM-l(h) byla l,9nM. Tato směs byla přidána k roztoku testované sloučeniny. Reakce byla iniciována přidáním Mg acetátu a ATP v takovém množství, že výsledná koncentrace Mg acetátu v reakční směsi byla lOmM a [γ-³³Ρ-ΑΤΡ] (specifická aktivita cca. 500 cpm/pmol) byla 90μΜ. Po 40 minutové inkubaci při 25 °C byla reakce zastavena přidáním 3% kyseliny fosforečné. 10 pL reakční směsi bylo pak přeneseno na P30 filtermat a tento filtr byl pak třikrát promyt 75mM kyselinou fosforečnou po dobu 5 minut. Poté byl filtr vysušen a byla měřena reziduální aktivita (pomocí scintilace).

Testování inhibiční aktivity vůči PIM-2:

Byl připraven roztok PIM-2(h) v pufru (20 mM MOPS, lmM EDTA, 0,01% Brij—35, 5% Glycerol, 0,1% β-merkaptoethanol, 1 mg/mL BSAs) o koncentraci 1,01 mg/mL. Tento zásobní roztok byl pak přidán k reakční směsi.

Výše popsaný zásobní roztok PIM-2(h) byl přidán ke směsi obsahující 8mM MOPS pH 7.0, 0,2mM EDTA a 300μΜ RSRHSSYPAGT, v takovém množství, že výsledná koncentrace PIM2(h) byla 16,4nM. Tato směs byla přidána k roztoku testované sloučeniny. Reakce byla iniciována přidáním Mg acetátu a ATP v takovém množství, že výsledná koncentrace Mg acetátu v reakční směsi byla lOmM a [γ-³³Ρ-ΑΤΡ] (specifická aktivita cca. 500 cpm/pmol) byla 15μΜ. Po 40 minutové inkubaci při 25 °C byla reakce zastavena přidáním 3% kyseliny fosforečné. 10 pL reakční směsi bylo pak přeneseno na P30 filtermat a tento filtr byl pak třikrát promyt 75mM kyselinou fosforečnou po dobu 5 minut. Poté byl filtr vysušen a byla měřena reziduální aktivita (pomocí scintilace).

Testování inhibiční aktivity vůči PIM-3:

Byl připraven roztok PIM-3(h) v pufru (20 mM MOPS, lmM EDTA, 0,01% Brij-35, 5% Glycerol, 0,1% β-merkaptoethanol, 1 mg/mL BSAs) o koncentraci 1,01 mg/mL. Tento zásobní roztok byl pak přidán k reakční směsi.

Výše popsaný zásobní roztok PIM-3(h) byl přidán ke směsi obsahující 8mM MOPS pH 7.0, 0,2mM EDTA, 0,1% Triton X-100, a 100μΜ KKRNRTLTV, v takovém množství, že výsledná koncentrace PIM-3(h) byla 2,7nM. Tato směs byla přidána k roztoku testované sloučeniny. Reakce byla iniciována přidáním Mg acetátu a ATP v takovém množství, že výsledná koncentrace Mg acetátu v reakční směsi byla lOmM a [γ-³³Ρ-ΑΤΡ] (specifická aktivita cca. 500 cpm/pmol) byla 155μΜ. Po 40 minutové inkubaci při 25 °C byla reakce zastavena přidáním 3% kyseliny fosforečné. 10 pL reakční směsi bylo pak přeneseno na P30 filtermat a tento filtr byl pak třikrát

-8CZ 305472 B6 promyt 75mM kyselinou fosforečnou po dobu 5 minut. Poté byl filtr vysušen a byla měřena reziduální aktivita (pomocí scintilace).

Výsledky:

A: IC₅₀ < 0.50μΜ

B: IC₅₀<3.00pM

C: IC₅₀ < 5.00μΜ

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Substituované furo[3,2-Z>]pyridiny obecného vzorce I nebo jejich farmaceuticky přijatelné soli či solváty, kde

R¹ je fenyl nebo naftyl, případně substituovaný substituentem vybraným ze skupiny zahrnující methyl, methoxy, methylthio, F, Cl, Br;

R² je vybrán ze skupiny zahrnující -NR³(CR⁴R⁵)PNR⁶R⁷ nebo -NR³(CR⁴R⁵)POR⁸;

R³ je vybrán ze skupiny zahrnující H, methyl, ethyl, propyl, isopropyl;

R⁴ je H;

R⁵ je H;

R⁶ je vybrán ze skupiny zahrnující H, methyl, ethyl, propyl, isopropyl;

R⁷ je vybrán ze skupiny zahrnující H, methyl, ethyl, propyl, isopropyl;

R⁸ je vybrán ze skupiny zahrnující H, methyl, ethyl propyl, isopropyl;

p je v rozmezí 2 až 7.
2. Substituované furo[3,2-ň]pyridiny obecného vzorce I podle nároku 1 pro použití jako léčiva.
3. Použití substituovaných furo[3,2-ů]pyridinů obecného vzorce I podle nároku 1 pro přípravu léčiva pro léčení hematologických maligních onemocnění, zejména leukémií nebo lymfomů.
4. Způsob přípravy substituovaných furo[3,2-ů]pyridinů obecného vzorce I podle nároku 1, vyznačený tím, že 6-chlor-2-jodpyridin-3-ol se za katalýzy Pd ponechá reagovat s vinylboronáty za vzniku meziproduktu, kteiý se potom za katalýzy mědí uzavře za vzniku furopyridinového systému, který se následně podrobí Pd katalyzované aminaci sekundárním aminem za vzniku žádané látky.