CZ303083B6 - Zpusob stanovení alelických variant kappa kaseinu a beta laktoglobulinu u skotu - Google Patents
Zpusob stanovení alelických variant kappa kaseinu a beta laktoglobulinu u skotu Download PDFInfo
- Publication number
- CZ303083B6 CZ303083B6 CZ20100642A CZ2010642A CZ303083B6 CZ 303083 B6 CZ303083 B6 CZ 303083B6 CZ 20100642 A CZ20100642 A CZ 20100642A CZ 2010642 A CZ2010642 A CZ 2010642A CZ 303083 B6 CZ303083 B6 CZ 303083B6
- Authority
- CZ
- Czechia
- Prior art keywords
- beta lactoglobulin
- kappa casein
- ttg
- mer
- dna
- Prior art date
Links
- 108010060630 Lactoglobulins Proteins 0.000 title claims abstract description 38
- 102000008192 Lactoglobulins Human genes 0.000 title claims abstract description 37
- 102000011632 Caseins Human genes 0.000 title claims abstract description 28
- 108010076119 Caseins Proteins 0.000 title claims abstract description 28
- 235000021246 κ-casein Nutrition 0.000 title claims abstract description 27
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 26
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 title claims abstract description 15
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims abstract description 25
- 108091093088 Amplicon Proteins 0.000 claims abstract description 21
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 claims abstract description 17
- 206010071602 Genetic polymorphism Diseases 0.000 claims abstract description 7
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 claims abstract description 7
- 230000003321 amplification Effects 0.000 claims abstract description 6
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 claims abstract description 6
- 101000726002 Homo sapiens COP9 signalosome complex subunit 3 Proteins 0.000 claims abstract 6
- 101000793859 Homo sapiens Kappa-casein Proteins 0.000 claims abstract 6
- 102100029874 Kappa-casein Human genes 0.000 claims abstract 6
- AYTVLULEEPNWAX-UHFFFAOYSA-N cesium;azide Chemical compound [Cs+].[N-]=[N+]=[N-] AYTVLULEEPNWAX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract 6
- 238000002844 melting Methods 0.000 claims description 14
- 230000008018 melting Effects 0.000 claims description 14
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 8
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 abstract description 9
- 230000004927 fusion Effects 0.000 abstract 1
- 239000005018 casein Substances 0.000 description 10
- BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N casein, tech. Chemical compound NCCCCC(C(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CC(C)C)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(C(C)O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(COP(O)(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(N)CC1=CC=CC=C1 BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 235000021240 caseins Nutrition 0.000 description 10
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 8
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 6
- 108010011756 Milk Proteins Proteins 0.000 description 6
- 239000013615 primer Substances 0.000 description 6
- 102000014171 Milk Proteins Human genes 0.000 description 5
- 235000021239 milk protein Nutrition 0.000 description 5
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 5
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 5
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 5
- 238000007894 restriction fragment length polymorphism technique Methods 0.000 description 4
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 3
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 3
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 3
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 3
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 3
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 3
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 3
- 238000003205 genotyping method Methods 0.000 description 3
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 3
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 3
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 3
- 238000007862 touchdown PCR Methods 0.000 description 3
- 230000004544 DNA amplification Effects 0.000 description 2
- 239000003155 DNA primer Substances 0.000 description 2
- 108091027305 Heteroduplex Proteins 0.000 description 2
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N dATP Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N 0.000 description 2
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 2
- 239000000155 melt Substances 0.000 description 2
- 238000011880 melting curve analysis Methods 0.000 description 2
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 description 2
- 239000008267 milk Substances 0.000 description 2
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 description 2
- 239000011535 reaction buffer Substances 0.000 description 2
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- 235000011178 triphosphate Nutrition 0.000 description 2
- 239000001226 triphosphate Substances 0.000 description 2
- 241000024188 Andala Species 0.000 description 1
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 1
- 108020001019 DNA Primers Proteins 0.000 description 1
- 239000003298 DNA probe Substances 0.000 description 1
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 1
- AHCYMLUZIRLXAA-SHYZEUOFSA-N Deoxyuridine 5'-triphosphate Chemical compound O1[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)C[C@@H]1N1C(=O)NC(=O)C=C1 AHCYMLUZIRLXAA-SHYZEUOFSA-N 0.000 description 1
- 102000006395 Globulins Human genes 0.000 description 1
- 108010044091 Globulins Proteins 0.000 description 1
- 101150045535 LGB gene Proteins 0.000 description 1
- 240000002129 Malva sylvestris Species 0.000 description 1
- 235000006770 Malva sylvestris Nutrition 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 description 1
- 108010006785 Taq Polymerase Proteins 0.000 description 1
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 1
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 1
- 230000004075 alteration Effects 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 1
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 1
- 238000010804 cDNA synthesis Methods 0.000 description 1
- -1 causative mutations Chemical compound 0.000 description 1
- 235000013351 cheese Nutrition 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 1
- SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N dATP Natural products C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1CC(O)C(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J dCTP(4-) Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@@H]1O[C@H](COP([O-])(=O)OP([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O)[C@@H](O)C1 RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J 0.000 description 1
- HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N dGTP Chemical compound C1=NC=2C(=O)NC(N)=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N 0.000 description 1
- 235000013365 dairy product Nutrition 0.000 description 1
- 230000003111 delayed effect Effects 0.000 description 1
- 239000005549 deoxyribonucleoside Substances 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 238000009830 intercalation Methods 0.000 description 1
- 238000007403 mPCR Methods 0.000 description 1
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 235000016046 other dairy product Nutrition 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 238000009738 saturating Methods 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 125000002264 triphosphate group Chemical class [H]OP(=O)(O[H])OP(=O)(O[H])OP(=O)(O[H])O* 0.000 description 1
- UNXRWKVEANCORM-UHFFFAOYSA-N triphosphoric acid Chemical compound OP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O UNXRWKVEANCORM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Rešení se týká zpusobu stanovení alelických variant kappa kaseinu a beta laktoglobulinu u skotu multiplexní touch down polymerázovou retezovou reakcí (PCR), který je charakterizovaný tím, že amplifikace alelických variant se provádí s primery o složení Kappa kasein CSN3 F: 5´ - CCA TTG CTA GTG GTG AGC CTA C - 3´ (22 mer) CSN3 R: 5´ - CCT GCG TTG TCT TCT TTG ATG TC - 3´ (23 mer) o délce amplikonu DNA 175 bp a Beta laktoglobulin LGB F: 5´ - TTG TGC TGG ACA CCG ACT AC - 3´ (20 mer), LGB R: 5´ - GCA GCG AGG ACC ACA CAG - 3´ (18 mer) o délce amplikonu DNA 142 bp a poté se analýzou krivky tání specifických heteroduplexu DNA s vysokým rozlišením (HRM) v Light Cycler 480 II Real time PCR systému, která je nove aplikovaná a optimalizovaná pro stanovení genetického polymorfismu kappa kaseinu a beta laktoglobulinu u skotu, presne a soucasne urcí genotypy kappa kaseinu, varianty A, B a E a beta laktoglobulinu, varianty A a B.
Description
Způsob stanovení alelických variant kappa kaseinu a beta laktoglobulinu u skotu
Oblast techniky
Vynález se týká způsobu stanovení genetického polymorfismu kappa kaseinového (CSN3) a beta laktoglobullnového (LGB) lokusu u skotu.
io Dosavadní stav techniky
Genetický polymorfismus a skladba alelických variant mléčných proteinů prokazatelně ovlivňují nejen užitkovost, obsah proteinů a dalších biologicky významných složek v mléce, ale i technologické vlastnosti a zpracovatelské charakteristiky mléka, produkci a kvalitu sýrů a dalších mléč15 ných výrobků. Sledování výskytu jednotlivých variant mléčných proteinů v populaci je významným podkladem pro následný šlechtitelský proces, zvyšování užitkovosti dojeného skotu a kvality mléčného proteinu.
Genetický polymorfismus kappa kaseinu a beta laktoglobulinu je nejčastěji charakterizován jed20 nou nebo několika nukleotidovými substitucemi uvnitř kódující DNA, které vedou k výskytu různých alelických variant. Tyto mutace jsou spojeny s aminokyselinovými záměnami u zralého proteinu a změně jeho výsledné struktury a fyzikálně chemických vlastností. Za technologicky nej významnější a současně u evropských populací skotu nej frekventovanější jsou považovány alelické varianty A, B a E u kappa kaseinu a A a B u beta laktoglobulinu. Kappa kasein B se liší od A varianty substitucí aminokyseliny Ile za Thr v pozici 136 a Ala za Asp v pozici 148. Na úrovni DNA dochází k substituci C 5309 -T, respektive A 5345 C (GenBank X14908) v exonu 4. Varianta E se liší od varianty A substitucí Gly 155 za Ser 155, charakterizovanou také jako záměna G 5365 A ve stejném exonu (GenBank XI4908). Beta Iaktoglobulin B se odlišuje od varianty A na 64. pozici substitucí Asp za Gly a na 118. pozici substituci Val za Ala, které na nukleotidové úrovni korespondují se záměnami A 3984 G v exonu 3 a T 5263 C v exonu 4 genu LGB (GenBank X14710). Mutace v popsaných oblastech genů způsobují alteraci restrikčních míst - míst štěpení molekuly DNA, které jsou rozeznávány restrikčními endonukleázami HindlII a BsuRI a vznik délkového polymorfismu generovaných restrikčních fragmentů DNA.
Nejpoužívanější analytickou technikou pro stanovení alelických variant na úrovni DNA je dosud metoda PCR-RFLP. DNA je nejprve amplifikována in vitro metodou polymerázové řetězové reakce se specifickými oligonukleotidovými primery v DNA termocykleru a poté je specificky štěpena restrikčními endonukleázami. Vzniklé fragmenty studovaného amplikonu jsou elektroforeticky rozděleny podle své velikosti. Každému genotypu odpovídá jiný elektroforetický vzor, který vede kjeho identifikaci. Tato časově poměrně náročná metoda zatím nebyla optimalizována pro současné stanovení genetického polymorfismu u více genů mléčných proteinů, její spolehlivost je do značné míry ovlivněna lidským faktorem a zkušeností experimentátora a vyžaduje práci se zdraví škodlivými chemickými látkami karcinogenního charakteru, což je velmi nežádoucí.
Podstata vynálezu
Uvedené nedostatky odstraňuje způsob stanovení alelických variant kappa kaseinu a beta lakto50 globulinu u skotu multiplexní touch down polymerázovou řetězovou reakcí (PCR) podle vynálezu, jehož podstata spočívá v tom, že amplifikace alelických variant se provádí s primery o složení
- 1 CZ 303083 B6
Kappa kasein
CSN3 F: 5 - CCA TTG CTA GTG GTG AGC CTA C- 3'(22 mer)
CSN3 R: 5' - CCT GCG TTG TCT TCT TTG ATG TC - 3' (23 mer) o délce amplikonu DNA 175 bp a
Beta laktoglobulin
LGB F: 5' - TTG TGC TGG ACA CCG ACT AC - 3' (20 mer)
LGB R: 5' - GCA GCG AGG ACC ACA CAG -3(18 mer) o délce amplikonu DNA 142 bp a poté se analýzou křivky tání specifických heteroduplexů DNA s vysokým rozlišením (HRM) v Light Cycler 480 II Reál time PCR systému, která je použitá a optimalizovaná právě pro stanovení genetického polymorfismu kappa kaseinu a beta laktoglobulinu u skotu, přesně a současně určí genotypy kappa kaseinu, varianty A, B a E a beta laktoglobulinu, varianty A a B.
Podstatou vynálezu jsou také nové primery pro stanovení alelických variant kappa kaseinu a beta laktoglobulinu u skotu o složení Kappa kasein
CSN3 F: 5' - CCA TTG CTA GTG GTG AGC CTA C - 3' (22 mer)
CSN3 R: 5' - CCT GCG TTG TCT TCT TTG ATG TC - 3' (23 mer) o délce amplikonu DNA 175 bp a
Beta laktoglobulin
LGB F: 5' - TTG TGC TGG ACA CCG ACT AC - 3' (20 mer)
LGB R: 5' - GCA GCG AGG ACC ACA CAG - 3' (18 mer) o délce amplikonu DNA 142 bp.
Principem způsobu podle vynálezu, tedy současného (simultánního) stanovení alelických variant A, B a E kappa kaseinu a A a B beta laktoglobulinu, je analýza křivky tání DNA s vysokým rozlišením, která detekuje přítomnost vzájemně odlišných sekvencí v PCR amplikonech (PCRHRM). Amplifikace analyzovaných sekvencí a následná genotypizační analýza probíhají v LightCycler 480 II Real-Time PCR systému. Cílové sekvence jsou amplifikovány v přítomnosti saturujícího interkalačního fluorescenčního barviva, které se váže pouze k dsDNA, intenzita snímané fluorescence je úměrná narůstající koncentraci amplifikované DNA v reálném čase. Bezprostředně po ukončení PCR amplifikace jsou amplikony krátce denaturovány a pak rychle reanelovány. V průběhu procesu velice pomalého opětného narůstání teploty, který je monitorován, dochází k postupnému tání duplexu DNA. Přítomnost nukleotidové mutace se projeví změnou fluorescenčního signálu při dosažení specifické teploty tání (Tm) a změnou průběhu výsledné křivky tání molekuly DNA, která je analyzována softwarovým modulem přístroje.
Podstata vynálezu spočívá v tom, že stanovení variant A, B a E kaseinu a A a B beta laktoglobulinu se provádí současně v jedné reakci s novými primery, které byly designovány s ohledem na aplikaci technik multiplexní touch down PCR a HRM. Způsob podle vynálezu nevyžaduje použití žádných specifických značených DNA sond pro detekci mutací. Sled operací probíhá kontinuálně bez přerušení od vložení PCR reakční směsi do přístroje Light Cycler po stanovení jednotlivých genotypů bez nutnosti zásahu obsluhy, čímž se významně snižuje čas nezbytný pro analýzu genotypů. Metoda PCR-HRM pro genotypizaci mléčných proteinů skotu je celkově robustnější, přesnější, rychlejší i ekonomicky výhodnější než starší metoda PCR-RFLP.
_ i .
Způsob podle vynálezu se provádí na principu dvou bezprostředně navazujících technik. Techniku multiplex touch down polymerázové řetězové reakce (PCR) přepracovali původci vynálezu s využitím publikovaných anotovaných sekvencí genů CSN3 a LGB (GenBank XI4908 a XI4710). Specifíta primerů DNA byla ověřena programem BLAST (NCBI, USA) a délka a s nukleotidová sekvence amplikonů obou genů byla potvrzena nezávislými metodami: elektroforézou (3 % agarózový gel) a resekvenováním v automatickém DNA kapilárním sekvenátoru
3130 Genetic Analyzer (Live Technologies, USA). Podmínky techniky analýzy křivky tání DNA amplikonů s vysokým rozlišením (HRM) byly pro účely vynálezu optimalizovány původci.
io Způsob podle vynálezu na určování genetických variant kappa-kaseinu A, B a E a beta-laktoglobulinu A a B je jednoznačný, velmi rychlý, jednoduchý, za přiměřenou cenu a bez používání škodlivých chemikálií. Reakční směs, používaná při PCR-HRM u způsobu podle vynálezu, obsahuje následující složky: genomickou DNA, polymerázu Taq DNA, 2 páry primerů, chlorid horečnatý, reakční pufr, dNTP mix a HRM barvivo. Po ukončení amplifikace DNA je získaný produkt bezprostředně podroben analýze HRM, při kterém dochází k tání dsDNA a vzniku jednořetězcové DNA, která není schopna dále vázat barvivo a generovat fluorescenci. Výsledkem změny fluorescenčního signálu v závislosti na teplotě je graf křivek tání analyzovaných amplikonů DNA s odlišnými vrcholy (píky) u jednotlivých vzorků (genotypů).
Na přiložených obrázcích je na Obr. 1 znázorněn graf normalizovaných teplotních profilů křivek tání amplikonů DNA kappa kaseinu (CSN3) v módu závislosti relativních rozdílů fluorescenčního signálu (osa y) různých genotypů na teplotě tání (osa x); Light Cycler 480 II Reál time PCR systém. Na Obr. 2 je znázorněn graf normalizovaných teplotních profilů křivek tání amplikonů DNA beta laktoglobulinu (LGB) v módu závislosti relativních rozdílů fluorescenčního signálu (osa y) různých genotypů na teplotě tání (osa x); Light Cycler 480 II Reál time PCR systém.
Následující příklad provedení způsob podle vynálezu pouze dokládá, aniž by ho jakkoliv omezoval.
Příklad provedení
Příklad 1
Polymerázová řetězová reakce (PCR) pro amplifikaci specifických úseků CSN3 a LGB, zahrnujících příčinné mutace byla, připravována původci vynálezu podle následujících podmínek:
μΙ PCR směsi obsahovalo 16 až 24 ng genomické DNA, dále 0,2 μΜ každého primerů, 1 x koncentrovanou reakční směs High Resolution Melting Master (obsahuje FastStart DNA polymerázu, dNTP mix, reakční pufr a HRM barvivo, firma Roche, Francie) a 2,5 mM chloridu hořečnatého (MgCl2).
Amplifikace metodou PCR a HRM analýza DNA probíhala v Light Cycler 480 II Reál time PCR systému (Roche, Francie) podle následujícího programu PCR: úvodní denaturace 95 °C po dobu 10 min; pak následuje 45 cyklů touch down PCR: l. krok denaturační pri 95 °C 10 sec. 2. krok anelační při 60 °C 15 sec. 3. krok elongační při 72 °C 15 sec. V pořadí od 5. cyklu se teplota anelačního kroku snižuje o 0,4 °C každý cyklus na výslednou teplotu 50 °C od 25. cyklu.
Získané PCR produkty jsou dále podrobeny HRM analýze za následujících podmínek: 1. Denaturace 95 °C po dobu 1 sec. 2. Reanelace a tvorba heteroduplexu 40 °C dobu 1 min, 3. Tání amplikonu v nastaveném rozsahu 70 až 99 °C kontinuálně, ramp rate 0,02 °C. Během tání amplikonů je zaznamenávána intenzita fluorescence, která prudce klesá při oddálení komplementárních
-3CZ 303083 B6 řetězců DNA v závislosti na charakteru nukleotidové substituce. Každý z analyzovaných genotypů má jiný, charakteristický tvar křivky tání heteroduplexu DNA (viz Obr. 1 a 2), který vede k jejich diskriminaci. Přitom simultánní HRM analýza CSN3 a LGB je umožněna odlišnou hodnotou Tm jejich amplikonů.
Způsob podle vynálezu byl původci s úspěchem ověřen v laboratořích Výzkumného ústavu živočišné výroby, v.v.i., Praha - Uhříněves, CZ.
Průmyslová využitelnost
Řešení se týká přesného, rychlého a levného stanovení genetických variant A, B a E kappa kaseinu a A a B beta laktoglobulinu u skotu, které ovlivňují produkci, strukturu a fyzikálně chemické vlastnosti obou mléčných bílkovin a jsou tudíž relevantní pro technologické charakteristiky a výtěžnost mléčných produktů ve zpracovatelském mlékárenském průmyslu.
Vysvětlení zkratek použitých v textu
LGB - beta laktoglobulín
CSN3 - kappa kasein
DNA - deoxyribonukleová kyselina dNTP - směs 4 deoxyribonukleosid trifosfátů (mix tvořený dATP deoxyadenosintrifosfát, dCTP deoxyeytidintrifosfát, dUTP - deoxy urid i ntr i fosfát, dGTP - deoxyguanosintrifosfát v poměru 1:1:1:1) ds DNA - dvouřetězcová DNA
HRM - analýza křivky tání DNA s vysokým rozlišením multiplexní PCR - amplifíkace minimálně 2 různých DNA úseků v jedné reakci
PCR - polymerázová řetězová reakce primer - oligonukleotidový úsek specificky se vážící ke komplementární DNA ramp rate - velikost změny teploty v čase
RFLP - polymorfismus délky restrikčních fragmentů DNA touch down PCR - amplifíkace DNA s postupným kontrolovaným poklesem teploty anelace primerů, omezuje výskyt nespecifických produktů amplifíkace
Claims (2)
- PATENTOVÉ NÁROKY1. Způsob stanovení alelických variant kappa kaseinu a beta laktoglobulinu u skotu multiplexní touch down polymerázovou řetězovou reakcí (PCR), vyznačující se tím, že amplifíkace alelických variant se provádí s příměry o složeníKappa kaseinCSN3 F: 5' - CCA TTG CTA GTG GTG AGC CTA C - 3' (22 mer)CSN3 R: 5 - CCT GCG TTG TCT TCT TTG ATG TC - 3' (23 mer) o délce amplikonů DNA 175 bp aBeta laktoglobulínLGB F: 5' - TTG TGC TGG ACA CCG ACT AC - 3' (20 mer)-4CZ 303083 B6LGB R: 5' - GCA GCG AGG ACC ACA CAG - 3' (18 mer) o délce amplikonu DNA 142 bp, a poté se analýzou křivky tání specifických heteroduplexů DNA s vysokým rozlišením (HRM) i Light Cycler 480 II Reál time PCR systému, která je nově aplikovaná a optimalizovaná pro sta5 novení genetického polymorfísmu kappa kaseinu a beta laktoglobulinu u skotu, přesně a součas ně určí genotypy kappa kaseinu, varianty A, B a E a beta laktoglobulinu, varianty A a B.
- 2. Primery pro stanovení alelických variant kappa kaseinu a beta laktoglobulinu u skotu o slo žení io Kappa kaseinCSN3 F: 5' - CCA TTG CTA GTG GTG AGC CTA C - 3' (22 mer)CSN3 R: 5' - CCT GCG TTG TCT TCT TTG ATG TC - 3' (23 mer) o délce amplikonu DNA 175 bp a15 Beta laktoglobulinLGB F: 5' - TTG TGC TGG ACA CCG ACT AC - 3' (20 mer)LGB R: 5' - GCA GCG AGG ACC ACA CAG -3 (18 mer) o délce amplikonu DNA 142 bp.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CZ20100642A CZ303083B6 (cs) | 2010-08-26 | 2010-08-26 | Zpusob stanovení alelických variant kappa kaseinu a beta laktoglobulinu u skotu |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CZ20100642A CZ303083B6 (cs) | 2010-08-26 | 2010-08-26 | Zpusob stanovení alelických variant kappa kaseinu a beta laktoglobulinu u skotu |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CZ2010642A3 CZ2010642A3 (cs) | 2012-03-21 |
| CZ303083B6 true CZ303083B6 (cs) | 2012-03-21 |
Family
ID=45816260
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CZ20100642A CZ303083B6 (cs) | 2010-08-26 | 2010-08-26 | Zpusob stanovení alelických variant kappa kaseinu a beta laktoglobulinu u skotu |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CZ (1) | CZ303083B6 (cs) |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CZ2006786A3 (cs) * | 2006-12-08 | 2008-01-23 | Výzkumný ústav živočišné výroby, v.v.i. | Způsob detekce genetických variant A a B alel ukozího kapa-kaseinu |
| CZ2007198A3 (cs) * | 2007-03-14 | 2008-05-21 | Výzkumný ústav živocišné výroby, v. v. i. | Zpusob detekce genetického polymorfizmu u ovcího kappa-kaseinu |
-
2010
- 2010-08-26 CZ CZ20100642A patent/CZ303083B6/cs not_active IP Right Cessation
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CZ2006786A3 (cs) * | 2006-12-08 | 2008-01-23 | Výzkumný ústav živočišné výroby, v.v.i. | Způsob detekce genetických variant A a B alel ukozího kapa-kaseinu |
| CZ2007198A3 (cs) * | 2007-03-14 | 2008-05-21 | Výzkumný ústav živocišné výroby, v. v. i. | Zpusob detekce genetického polymorfizmu u ovcího kappa-kaseinu |
Non-Patent Citations (4)
| Title |
|---|
| Alexander et al.: "Isolation and characterization of the bovine beta-lactoglobulin gene", GenBank X14710, 1992 * |
| HallÚn E. et al.: "Effect of genetic polymorphism of milk proteins on rheology of chymosin-induced milk gels", Int. Dairy J., Vol. 17, 791-799, 2007 * |
| Medrano J.F. et al.: " Genotyping of bovine kappa-casein loci following DNA sequence amplification. Bio/Technology, Vol. 8, 144-146, 1990 * |
| Mercier J.C., Vilotte J.L.: " Structure and function of milk protein genes", J.Dairy Sci., Vol. 76(10), 3079-98, 1993 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CZ2010642A3 (cs) | 2012-03-21 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN105339508B (zh) | Hla基因的多重dna分型方法和试剂盒 | |
| Amills et al. | Isolation of genomic DNA from milk samples by using Chelex resin | |
| WO2008056325B1 (en) | Process for animal species identification in samples with genetic material based on mitochondrial dna size variation | |
| Sharma et al. | High resolution melt curve analysis for the detection of A1, A2 β-casein variants in Indian cows | |
| CN103320518B (zh) | 突触核蛋白内含子1甲基化水平检测方法 | |
| CZ303083B6 (cs) | Zpusob stanovení alelických variant kappa kaseinu a beta laktoglobulinu u skotu | |
| Kyseľová et al. | Simultaneous identification of CSN3 and LGB genotypes in cattle by high-resolution melting curve analysis | |
| Minarovič et al. | Animal species identification by PCR–RFLP of cytochrome b | |
| Ilie et al. | High-resolution melting assay as a tool for identification of CSN3 genotypes in cattle population | |
| CZ21362U1 (cs) | Primery pro stanovení alelických variant kappa kaseinu a beta laktoglobulinu u skotu | |
| Soejima et al. | Rapid detection of haptoglobin gene deletion in alkaline-denatured blood by loop-mediated isothermal amplification reaction | |
| CZ34779U1 (cs) | Sada pro detekci polymorfismu (SNPs) v exonu 7 a 9 genu beta kaseinu (CSN2) u koz | |
| Karl et al. | Cost-effective sequence-based nonhuman primate MHC class I genotyping from RNA | |
| CZ298679B6 (cs) | Zpusob detekce genetických variant A a C alel u kozího beta-kaseinu | |
| RU2851233C1 (ru) | Набор синтетических олигонуклеотидов для выявления аллельного состояния гена устойчивости к вирусу бронзовости томата Sw-5 | |
| KR101628047B1 (ko) | 직접 핵산 증폭용 조성물 및 이를 이용한 직접 핵산의 증폭방법 | |
| JP5530185B2 (ja) | 核酸検出方法及び核酸検出用キット | |
| Zaqeer et al. | Genetic polymorphism of-Lg gene in Iraqi buffalo using Polymerase Chain Reaction–Restriction Fragment Length Polymorphism | |
| CZ300952B6 (cs) | Zpusob detekce genetického polymorfizmu (A/G) ovcího beta kaseinu | |
| CA2753235A1 (en) | Method of cell-line identification | |
| CZ35854U1 (cs) | Sada pro určení alelických variant v genu Toll-like receptoru 4 u skotu | |
| Balteanu et al. | Genetic polymorphisms of αS1-casein (CSN1s1) and β-casein (CSN2) genes in Carpathian goat breed. | |
| Ilie et al. | Rapid and sensitive detection of BLAD in cattle population | |
| Yusuf et al. | Biotica Research Today | |
| Nejad et al. | Allelic polymorphism of exon 2 in BMP15 gene in F1 crossbred sheep from crossing Romanov rams with Kermani ewes |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | Patent lapsed due to non-payment of fee |
Effective date: 20160826 |