CZ296858B6 - Agonisté receptoru 3 (R3) hypofyzárního peptidu aktivujícího adenylátcyklázu (PACAP) a jejich farmaceutické pouzití - Google Patents

Abstract

Resení poskytuje nové peptidy, které in vivo stimulují uvolnování inzulínu z pankreatických .beta.-bunek glukózo-dependentním zpusobem. Ukázalo se, ze tyto peptidy produkující inzulín stimulují uvolnování inzulínu v ostruvkových bunkách krysy in vitro a in vivo. Peptidy podle vynálezu nabízejí novou moznost lécby pacientum se zvýsenou endogenní sekrecí inzulínu, zejména diabetikum typu 2. Podstatou je konkrétne polypeptid zvolený ze specifické skupiny polypeptidu príbuzných VIP/PACAP nebo jejich funkcních ekvivalentu. Dále se týká zpusobu lécby metabolické poruchy u savce, který zahrnuje podání terapeuticky úcinného mnozství peptidu stimulujících uvolnování inzulínu savci. Do rozsahu rovnezspadají zpusoby výroby peptidu, a to jak rekombinantní, tak syntetické.

Description

Oblast techniky

Vynález se týká nově identifikovaných polypeptidů a použití těchto peptidů jsou terapeutické účely. Zejména polypeptidy podle vynálezu jsou použitelné při stimulaci uvolňování inzulínu z β-buněk Langerhansových ostrůvků slinivky břišní glukózo-dependentním způsobem, čímž poskytují možnost léčby osob postižených poruchami metabolizmu, například osoby postižené diabetem nebo porušenou glykemickou tolerancí, což je prediabetický stav.

Dosavadní stav techniky

Diabetes je charakteristický narušeným metabolizmem glukózy, který se, mimo jiné, jako takový projevuje zvýšenou hladinou glukózy v krvi diabetiků. Níže uvedené zdůrazněné defekty vedly k rozdělení typů diabetů na dvě základní skupiny: diabetes typu 1, neboli „inzulíndependentní“ diabetes mellitus (IDDM), který propukne, jakmile pacienti postrádají β-buňky produkující inzulín v Langerhansových ostrůvcích slinivky břišní; a diabetes typu 2, neboli „non-inzulín dependentní“ diabetes mellitus (NIDDM), který se objevuje u pacientů s nedostatečnou funkcí β-buněk a se změnami inzulínového účinku.

Diabetici typu 1 nejsou v současné době léčeni inzulínem, zatímco většina diabetiků typu 2 se léčí látkami, které stimulují funkci β-buněk, nebo látkami, které zvyšují citlivost cílových tkání pacientů k inzulínu. V průběhu času si téměř jedna polovina diabetiků typu 2 vytváří rezistenci proti těmto látkám a následně je nucena přejít na léčbu inzulínem. Účinné látky, které se v současnosti používají pro léčbu diabetiků typu 2 zahrnují:

Inhibitory α-glukosidázy, kterými jsou například PRECOSE, VOGLIBOSE a MIGLITOL. Inhibitory α-glukosidázy redukují odchýlení postpradiální glukózy opožděním absorpce glukózy ze střev. Tyto látky jsou bezpečné a lze je úspěšně použít pro léčbu lehce nebo středně postižených diabetiků. Nicméně v literatuře jsou zaznamenány vedlejší gastrointestinální účinky.

Inzulínové senzibilizátory jsou účinnými látkami, které zesilují odezvu těla na inzulín. Thiozolidindiony, jako například REZULIN (troglitazon), aktivují PPAR γ-receptor a modulují aktivitu souboru genů, který nebyl doposud dobře popsán. Přesto, že jsou tyto látky účinné, jsou spojovány sjatemí toxicitou. V důsledku hepatotoxicity byl REZULIN stažen z trhu.

Činidla stimulující produkci inzulínu, jakými jsou například sulfonylmočoviny (SFU) a další činidla, která působí prostřednictvím ATP-dependentního K⁺ kanálu. SFU Představují standardní terapii pro diabetiky typu 2 trpící mírnou nebo střední glykémií nalačno. SFU mají určitá omezení, která zahrnují potenciál pro indukci hypoglykemie, přírůstek na hmotnosti a vysoké četnosti primárního a sekundárního selhání. U 10 % až 20 % léčených pacientů se neprojevil významnější léčebný účinek (primární selhání). Sekundární selhání se projevilo u dalších 20 % až 30 % pacientů, u kterých dochází ke ztrátě léčebného účinku po šesti měsících léčby pomocí SFU. Léčba inzulínem je potřebná u 50 % SFU respondentů po 5 až 7 letech léčby (Scheen, A.J. a kol., Diabetes Res. Clin. Pract. 6:533-543 (1989)).

GLUCOPHAGE (metformin HC1) Je biguanid, který snižuje hladinu glukózy v krvi snížením hepatického výdaje glukózy a zvýšením periferní absorpce glukózy a jejího využití. Tato látka je účinná při snižování hladiny glukózy v krvi u mírně nebo středně postižených subjektů a nemá takové vedlejší efekty, jakými jsou zvýšení hmotnosti nebo potenciál indukovat hypoglykémii. Nicméně GLUCOPHAGE vykazuje celou řadu dalších vedlejších účinků, včetně gastrointesti

-1 CZ 296858 B6 nálních poruch a acidózy z nahromaděné kyseliny mléčné. GLUCOPHAGE Je kontraindikován u diabetiků starších 70 let a u diabetiků s poškozením renální nebo jaterní funkce. Na závěr je třeba zmínit, že léčba lékem GLUCOPHAGE má stejné četnosti primárního a sekundárního selhání jako léčba pomocí SFU.

Léčba inzulínem se zahajuje po dietě, cvičení a selhání orálních léků pro odpovídající kontrolu glukózy v krvi. Léčba inzulínem má své nedostatky. Mimo jiné lze zmínit nutnost aplikace pomocí injekce, možnost indukce hypoglykémie a zvýšení hmotnosti.

Vzhledem k problémům spojeným se současnými způsoby léčby stále existuje potřeba vyvinutí nových terapií pro léčbu diabetů typu 2. Zejména jsou zapotřebí nové léčebné metody pro zachování normální (glukózově-dependentní) sekrece inzulínu. Nové účinné látky, použitelné pro tyto účely, by měly mít následující vlastnosti: měly by být dependentní na glukóze ve smyslu podpory sekrece inzulínu, tj. produkovat sekreci inzulínu pouze v přítomnosti zvýšené hladiny glukózy v krvi; měly by mít nižší četnost primárních, resp. sekundárních selhání; a měly by chránit funkci ostrůvkových buněk. Strategie vývoje nové, zde popsané terapie je založena na mechanizmu signalizujícím cyklický adenosinmonofosfát (cAMP) a jeho vlivem na sekreci inzulínu.

Cyklický AMP je základním a hlavním regulátorem procesu sekrece inzulínu. Elevace této signální molekuly podpoří uzavření K⁺ kanálků a následnou aktivaci dráhy protein kinázy A. Uzavření K⁺ kanálků způsobí buněčnou depolarizaci a následné otevření Ca²⁺ kanálků, což zase vede k exocytóze granulí inzulínu. Malý, pokud vůbec nějaký, vliv na sekreci inzulínu se objeví za absence nízkých koncentrací glukózy (Weinhaus A. a kol., Diabetes 47: 1426-1435 (1998)). Činidla stimulující produkci inzulínu, jako například hypofyzámí peptid aktivující adenylátcykláza (PACAP) a GLP-1, využívají k regulaci sekrece inzulínu glukózo-dependentním způsobem cAMP systém (Komatsu M. a kol., Diabetes 46: 1928-1938, (1997)). Činidla stimulují produkci inzulínu využívají zvýšení cAMP, jakým je například GLP-1, a PACAp je schopen kromě uvolňování inzulínu rovněž zesilovat syntézu inzulínu (Skoglund G. a kol. Diabetes 49: 1156— 1164, (2000). Bordoni P. a kol., Endocrinology 140: 5530-5537, (1999)).

PACAP Je potenciálním stimulátorem glukózo-dependentní sekrece inzulínu z pankreatických β-buněk. Byly popsány tři různé typy PACAP receptorů (Rl, R2 a R3) (Harmar A. a kol., Pharmacol. Reviews 50: 265-270 (1998)). PACAP Nevykazuje selektivitu pro žádný receptor a má srovnatelnou aktivitu a potenci na všech třech receptorech. Receptor Rl se převážně nachází v centrální nervové soustavě (CNS), zatímco receptory R2 a R3 jsou distribuovány šíře. Receptor R2 se nachází v CNS, a stejně tak v játrech, plicích a střevech. Receptor R3 se nachází v CNS, slinivce, kosterním svalu, srdci, ledvinách, tukové tkáni, varlatech a žaludku. Nedávná práce uvádí, že receptor R3 je zodpovědný za sekreci inzulínu z β-buněk (Inagaki N. a kol., PNAS 91: 2679-2683, (1994)). Tento inzulínotropní účinek PACAP je mediován GTP vážícím proteinem Gs. Akumulaci intracelulámího cAPM zase aktivuje proteinem Gs Akumulace intracelulámího cAMP zase aktivuje zvýšení neselektivních kationových kanálků v β-buňkách [Ca²⁺] a podporuje exocytózu sekrečních granulí obsahujících inzulín.

PACAP Je nejmladším členem nadrodiny metabolických, neuroendokrinních a neurotransmiterových peptidových hormon, které projevují svůj účinek přes signální transdukční dráhu mediovanou cAMP (Arimura, Regul, Peptides 37:287-303 (1992)). Biologicky účinné peptidy se uvolní z biosyntetického prekurzoru ve dvou molekulových formách, buď jako 38-aminokyselinový peptid (PACAP-38) a/nebo jako 27-aminokyselinový peptid (PACAP-27) s amidem substituovaným karboxylovým koncem (Arimura, viz výše).

Nejvyšší koncentrace obou forem peptidu se nalézají v mozku a ve varlatech (přehled v Arimura, viz výše). Kratší forma peptidu, PACAP-27, vykazuje 68% strukturní homologii s vasoaktivním intestinálním polypeptidem (VIP). Nicméně distribuce PACAp a VIP v centrálním nervovém systému dává tušit, že tyto strukturně příbuzné peptidy mají odlišné neuromediační funkce (Koves a kol., Neuroendocrinology 54:159-169, (1991)).

-2CZ 296858 B6

Nedávné studie demonstrovaly diverzní biologické účinky PACAP-38 od určité role při reprodukci (McArdle, Endocrinology 135:815-817 (1994)) až ke schopnosti stimulovat sekreci inzulínu (Yada a kol., J. Biol. Chem. 269:1290-1293 (1994)).

Vasoaktivní intestinální peptid (VIP) je 28 aminokyselinový peptid, který byl prvně izolován z horní části tenkého střeva (Said a Mutt, Science 169: 1217-1218, 1970; patent US 3 879 371). Tento peptid patří do rodiny strukturně příbuzných kratších polypeptidů, které zahrnují helodermin, sekretin, somatostatiny a glukagon. Biologické účinky VIP jsou mediovány aktivací proteinů receptorů vázaných k membráně, které jsou spojeny s intracelulámím cAMP signálním systéme. Tyto receptory byly původně známy jako VIP-R1 a VIP-R2, nicméně později se ukázalo, že jsou totožné s receptory známými jako PACAP-R2 a PACAp-R3. Peptid VIP vykazuje srovnatelnou účinnost a potenci na PACAP-R2 a PACAP-R3.

Pro zlepšení stability VIP v lidské plicní tekutině (Bolin a kol., Biopolymers 37: 57-66, (1995)) se vyrobila celá řada různých variant VIP navržených pro posílení sklonu tohoto peptidu tvořit spirálu a pro redukci proteolytické degradace. Substituce se soustředily do pozice 8, 12, 17 a 25 až 28, u kterých bylo prokázáno, že nejsou důležité pro navázání receptorů. Navíc sekvence „GGT“ byla zavěšena na C-konec VIP proteinů s nadějí, že účinněji uzavře helix. Pro další stabilizaci helixu bylo syntetizováno několik cyklických variant (patent US 5 677 419). Ačkoliv tyto snahy nebyly cíleně směrovány v selektivitě receptorů, poskytly dva analogy (označené zde jako R3P0 a R3P4), které mají více než lOOx vyšší selektivitu než PACAP-R3 (Gourlet a kol., Peptides 18: 403-408, (1997); Xia a kol., J, Pharmacol. Exp. Ther. 281: 629-633, (1997)).

GLP-1 Se uvolňuje z intestinální L-buňky po jídle a působí jako hormon inkretin (tj. potencuje glukózou indukované uvolňování inzulínu z pankreatické β-buňky). Jedná se o 37-aminokyselinový peptid, který je diferenciálně exprimován genem glukagon, v závislosti na typu tkáně. V souvislosti s GLP-1 byly shromážděny klinické výsledky, které podporují příznivý účinek zvýšení hladiny cAPM v β-buňkách. Infúze GLP-1 u špatně kontrolovaných diabetiků typu 2 normalizovala hladinu glukózy v krvi nalačno (Gutniak M. a kol., New Engl J. Med. 326:7316-1322, (1992)) a při dlouhodobějších infúzích se funkce β-buněk zcela normalizovala na úroveň zdravých jedinců (Rachman J. a kol., Diabetes 45: 1524-1530, (1996)). Nedávná zpráva ukázala, že GLP-1 zlepšuje schopnost β-buněk odpovídat na stav glukózy u subjektů s narušenou glukózovou tolerancí (Byrne M., a kol., Diabetes 47: 1259-1265 (1998)). Nicméně všechny tyto účinky jsou krátkodobě, v důsledku krátkého poločasu života peptidu. Před nedávnou dobou společnost Novo Nordisk přerušil klinické testy s GLP-1. proslýchá se, že toto selhání bylo způsobeno velmi krátkým, pouze několikaminutovým, poločasem peptidu vplazmě.

EXENDIN-4: Amylinová farmaceutka procházejí I. fází testů s EXENDINem-4 (AC2993), 39-aminokyselinovým peptidem, který byl prvně identifikován u komatce. Nedávno byla zahájena II. fáze testů. Amylin si nárokuje podle výsledků předklinických testů 4h zachování účinnosti na zvířecích modelech při subkutánním, orálním a nazálním podání AC2993. Nicméně v dávkách 0,2 pg/kg a 0,3 pg/kg, byl zaznamenán významný výskyt bolestí hlavy, posturální hypotenze, nevolnosti a zvracení.

Z výše uvedeného je zřejmé, že existuje oprávněná potřeba vyvinout vylepšený peptid, který bude mít glukózo-dependentní schopnost peptidů PACAP, GLP-1 nebo EXENDINu-4 stimulovat produkci inzulínu a který bude současně vykazovat méně vedlejších účinků.

Podstata vynálezu

Vynález poskytuje nové polypeptidy, které působí in vivo jako agonisty PACAP R3 receptorů (dále jen R3) a jsou účinné při léčbě chorob a stavů, které lze zmírnit pomocí látek majících aktivitu R3 agonisty. Výhodně jsou polypeptidy podle vynálezu selektivní R3 agonisty mající větší

-3 CZ 296858 B6 potenci a R3 až na R2 a Rl. Tyto polypeptidy například stimulují syntézu inzulínu a jeho uvolnění z pankreatických β-buněk glukózo-dependentním způsobem a následnou redukci glukózy v plazmě. Ukázalo se, že tyto polypeptidy stimulují produkci inzulínu stimulující uvolňování inzulínu v ostrůvkových buňkách u kiys a lidí, a to jak in vitro, tak in vivo. Na rozdíl do PACA27 tyto polypeptidy stimulují produkci hormonu rovněž snižují in vivo hladiny glukózy v krvi více, než kontrola vehikula po expozici glukózy.

Polypeptidy podle vynálezu poskytují novou terapii například pro pacienty trpící metabolickými poruchami, kterými jsou například poruchy způsobené sníženou endogenní sekrecí inzulínu, zejména pro diabetiky typu 2, nebo pro pacienty s porušenou glukózou tolerancí, prediabetickým stavem, u kterých došlo k mírné změně sekrece inzulínu.

Jedním aspektem vynálezu je konkrétně polypeptid zvolený z množiny sestávající z polypeptidů následujících sekvencí: SEQ ID NO: 11 až 14, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 21 až 26, SEQ ID NO: 32 až 36, SEQ ID NO: 40 až 53, SEQ ID NO: 57 až 61, SEQ ID NO: 63 až 99, SEQ ID NO: 102 až 119, SEQ ID NO: 121 až 137, SEQ ID NO: 139 až 177, SEQ ID NO: 179, 180, SEQ ID NO: 183 až 202, 322 až 341 a jejich fragmentů, derivátů a variant, které vykazují alespoň jednu biologickou funkci, která je v podstatě totožná s biologickou funkcí polypeptidů jmenovaných sekvencí (souhrnně budou označovány jako „polypeptidy podle vynálezu“), včetně jejich funkčních ekvivalentů. Výhodné provedení podle vynálezu představuje polypeptid zvolený z množiny sestávající z polypeptidů následujících sekvencí: SEQ ID NO: 12, 18, 21 až 26, 32 až 35, 41, 43 až 53, 63, 66, 70 až 92, 94 až 99, 102 až 104, 107, 109, 112 až 119, 121 až 137, 139, 140, 142 až 153, 156 až 174, 187, 322 až 341 a jejich fragmentů, derivátů a variant, které vykazují alespoň jednu biologickou funkci, která je v podstatě totožná s biologickou funkcí polypeptidů jmenovaných sekvencí. Výhodnější provedení podle vynálezu je polypeptid zvolený z množiny sestávající z polypeptidů následujících sekvencí: SEQ ID NO: 18. 24, 25, 32, 33, 43 až 50, 52, 53, 70 až 87, 92, 98, 99, 104, 107, 112 až 114, 129 až 131, 137, 140, 144, 147 až 151, 156 až 159 a 161 až 173, 323, 324, 326, 327, 335, 338, 341 a jejich fragmentů, derivátů a variant, které vykazují alespoň jednu biologickou funkci polypeptidů jmenovaných sekvencí. Nej výhodnějším provedením podle vynálezu je polypeptid zvolený z množiny sestávající z polypeptidů následujících sekvencí: SEQ ID NO: 18, 32, 43, 45, 47, 50, 52, 71, 72, 83, 86 a 87 a jejich fragmentů, derivátů a variant, které vykazují alespoň jednu biologickou funkci, která je v podstatě totožná s biologickou funkcí polypeptidů jmenovaných sekvencí.

Dalším provedením podle vynálezu je polynukleotid, který kóduje polypeptidy podle vynálezu, a doprovodné vektory a hostitelské buňky nezbytné pro rekombinantní expresi polypeptidů podle vynálezu. Tyto polynukleotidové sekvence zahrnují sekvence identifikované jako SEQ ID NO: 204, 207 až 211, 214 až 230 a 232 až 321. Výhodné polypeptidy zahrnují sekvenci identifikované jako SEQ ID NO: 204, 207 až 209, 215, 217 až 230, 232 až 234, 237, 239, 242 až 268, 270 až 281 a 284 až 321. Ještě výhodnější polynukleotidy zahrnují sekvence identifikované jako SEQ ID NO: 207, 218 až 224, 226 až 230, 234, 237, 242 až 244, 258 až 260, 266, 268, 272, 275 až 279, 284 až 287, 289 až 301 a 303, 304, 306, 307, 318 a 321. Nejvýhodnější polynukleotidy zahrnují sekvence identifikované jako SEQ ID NO: 217, 221 a 226.

Do rozsahu vynálezu rovněž spadají protilátky a jejich fragmenty, které selektivně váží polypeptidy podle vynálezu. Takové protilátky jsou použitelné při detekci polypeptidů podle vynálezu a lze je identifikovat a připravit v oboru známými způsoby, včetně postupů analogických s postupy popsanými v níže uvedeném příkladu 17.

Vynález se rovněž týká způsobu léčby diabetů a/nebo dalších chorob nebo stavů, které lze ovlivnit polypeptidy podle vynálezu, výhodně R3 agonistickou funkcí polypeptidů podle vynálezu, u savců, přičemž tento způsob zahrnuje podání terapeuticky účinného množství libovolných polypeptidů podle vynálezu nebo libovolného polypeptidu aktivního na R3, například se sekvencí SEQ ID NO: 5 a 9 savci.

-4CZ 296858 B6

Součástí vynálezu jsou rovněž způsoby přípravy polypeptidů podle vynálezu, a to jak rekombinantní, tak syntetické.

Stručný popis obrázků

Obr. 1 znázorňuje polypeptidy s aminokyselinovou sekvencí SEQ ID NO: 11 až 14, SEQ ID NO: 18 SEQ ID NO: 21 až 26, SEQ ID NO: 32 až 36, SEQ ID NO: 40 až 53,

SEQ ID NO: 57 až 61, SEQ ID NO: 63 až 99, SEQ ID NO: 102 až 119, SEQ ID NO: 121 až 137,

SEQ ID NO: 139 až 177, SEQ ID NO: 179, 180, SEQ ID NO: 183 až 202 a SEQ ID NO: 322 až

341, což jsou nárokované polypeptidy.

Obr. 2 znázorňuje srovnání sekvencí VIP mutantů a nativních polypeptidů VIP, PACAP38, GLP-1, EXENDIN-4 a příklady R3 selektivních polypeptidů. Konzervované zbytky jsou znázorněny tučně a vystínovány tmavě šedou, zatímco konzervativní změny jsou vystínované světle šedou.

Obr. 3 je restrikční mapou typického plazmidu obsahujícího GST-peptidovou fúzi.

Obr. 4A a 4B jsou grafy znázorňující vliv GLP-1 nebo R3P3 na uvolňování inzulínu z ostrůvků krys in vitro.

Obr. 5 je grafem znázorňujícím vliv RP3P peptidu na odstranění glukózy.

Obr. 6 je sloupcovým grafem ukazujícím vliv PACAp a příbuzných polypeptidů na obsah intestinální vody u myši Balb/C.

Obr. 7 je sloupcovým grafem ukazujícím, že subkutánně podaná dávka 1 nmol/kg, R3P3, R3P12, R3P13 nebo GLP-1 podporuje odstraňování glukózy u krysy.

Obr. 8 znázorňuje polynukleotidové sekvence SEQ ID NO: 54 až 56 a 203 až 301, kterékódují polypeptidy podle vynálezu.

První 6 nukleotidů reprezentuje Bam HI rozpoznávací místo restrikčního enzymu, následujících 12 nukleotidů kóduje rozpoznávací místo „IEGR“ faktor Xa. Posledních 6 nukleotidů reprezentuje rozpoznávací místo restrikčního enzymu Xho I nebo Eco RI, přičemž těmto 6 nukleotidům předchází 6 nukleotidů, které kódují dva koncové kodony. Nukleotidy mezi místem faktoru Xa a koncovými kodony kódují aminokyselinovou sekvenci odpovídajícího polypeptidů. Nukleotidy mezi dvěma restrikčními místy jsou nakloňovány do odpovídajících restrikčních míst na pGEX6P-1 vektoru (Amersham Pharmacia Biotech). Sekvence SEQ ID NO jsou uvedeny v závorkách.

Obr. 9 ukazuje vliv PACAP-27, VIP a receptorově selektivních agonistů na tepovou frekvenci u psů v bezvědomí (viz příklad 15).

Obr. 10 ukazuje detekci R3P66 polyklonálními protilátkami produkovanými v těle králíků imunizovaných R3P66 C-koncovou sekvencí (Ac-CRKQVAAKKYLQSIKNKRY-COOH) za použití ELISA.

Vynález poskytuje nové polypeptidy a jejich fragmenty, deriváty a varianty, které vykazují alespoň jednu biologickou funkci, která je v podstatě totožná s biologickou funkcí polypeptidů z obr. 1 (souhrnně polypeptidy podle vynálezu). Polypeptidy podle vynálezu působí in vivo jako R3 agonisty nebo jinak při prevenci a/nebo léčbě takových chorob nebo stavů, jakými jsou diabetes, astma, hypertenze, problémy mužského rozmnožování včetně pohyblivosti lidských spermií, kardiovaskulární choroby, vředy a další zde definované stavy, nebo působí jiným níže popsaným

-5CZ 296858 B6 způsobem. Výhodně budou polypeptidy podle vynálezu stimulovat uvolňování inzulínu zpankreatických β-buněk glukózo-dependentním způsobem.

Polypeptidy podle vynálezu jsou R3 agonisty. Výhodně jsou R3 selektivními agonisty alespoň s lOx vyšší selektivitou pro R3 než pro R2 a/nebo Rl. Ještě výhodněji jsou R3 selektivními agonisty alespoň se lOOx vyšší selektivitou pro R3 než pro R2 a/nebo Rl. Nejvýhodněji stimulují uvolňování inzulínu do plazmy glukózo-dependentním způsobem bez indukce stáze nebo zvýšení hladiny glukózy v plazmě, což jsou účinky působící proti léčbě, například proti léčbě diabetů typu 2. V případě polypeptidů podle vynálezu je výhodné, že jsou agonisty selektivními pro R3 receptor, takže způsobují například zvýšené uvolňování inzulínu do plazmy a současně jsou selektivními pro R3 receptor, takže způsobují například zvýšené uvolňování inzulínu do plazmy a současně jsou selektivní proti dalším receptorům, které jsou zodpovědné za takové nepřijatelné nebo nebezpečné vedlejší efekty, jakými jsou například zadržování gastrointestinální vody, a/nebo nežádoucí kardiovaskulární účinky, jakými jsou například zvýšené tepové frekvence. Nyní se zjistilo, že R3-Mediovaná sekrece inzulínu nezpůsobuje hypoglykémii, aktivace R2vede k uvolňování glukózy do plazmy, což je účinek působící proti léčbě diabetů typu 2 a způsobuje zadržování gastrointestinální vody a aktivizace Rl vede ke kardiovaskulárním účinkům, jakým je například zvýšená tepová frekvence.

Polypeptidy podle vynálezu poskytují novou terapii pro pacienty se sníženou endogenní sekrecí inzulínu nebo narušenou glukózovou tolerancí, zejména pro pacienty trpící diabetem typu 2.

A. Diskuse

PACAP, VIP, GLP-1 a EXENDIN-4 Jsou polypeptidy schopní stimulovat uvolňování inzulínu glukózo-dependentním způsobem. Nicméně samotný tento fakt negarantuje redukci glukózy in vivo. Protože je známo, že PACAp se váže na PACAP-R1, PACAP-R2 a PACAp-R3 receptory a rovněž je známo, že se VIP váže na PACAP-R2 a PACAP-R3 receptory, lze se domnívat, že mají podobné konzervované strukturní znaky. Níže uvedené zarovnání nad sebou ukazují primární strukturní vztahy:

SEQ ID NO

VIP 1 HSDAVFTDNY TRLRKQMAVK KYLNSILN-NH₂ 281

PACAP38 1 HSDGIFTDSY SRYRKQMAVK KYLAAVLGKR YKQRVKNK-NH₂ 382

GLP-1 1 HAEGTFTSDV SSYLEGQAAK EFIAWLVKGR-NH₂ 303

Exendin 4 1 HGEGTFTSDL SKQMEEEAVR LFIEWLKNGG PSSGAPPPS-NH₂ 394 (použité zkratky s jedním písmenem pro aminokyseliny lze nalézt v Zubay, Biochemístry 2. ed., 1988, MacMillan Publishing, New York, str. 33), které jsou definovány níže. Polypeptidy podle vynálezu (obr. 1) jsou nejblíže příbuzné VIP, ve smyslu jejich primární struktury, s výjimkou sekvencí SEQ ID NO: 57 až 61, 66 až 69 a 176, 177, 179, 180, 183 a 202, které jsou příbuznější PACAP.

Vynález tedy poskytuje nový polypeptid, který je R3 agonistem, výhodně selektivním R3 agonistem, a/nebo který vykazuje selektivní schopnost stimulovat produkci inzulínu glukózo-dependentním způsobme, přičemž selektivní aktivace PACAP R3 receptoru ve skutečnosti vede ke glukózo-dependentní dráze sekrece inzulínu pankreatickými β-buňkami a ke konkomitující redukci glukózy in vivo. V tomto ohledu byl nejprve studovány struktury PACAP-27 a VIP, ve snaze určit zbytky, které jsou nejpravděpodobněji zodpovědné za selektivitu receptoru. Je známo, že PACAP a VIP neredukují glukózu in vivo, ale spíše naopak stimulují uvolňování glukózy z jater. Ukázalo se, že aktivace R2 zvyšuje hladiny glukózy v plazmě in vivo. Jak PACAP, tak VIP byly v minulosti extenzívně mutagenizovány pro různé účely. Řada deleci v PACAP27

-6CZ 296858 B6 a PACAP38 z obou konců například potvrdily důležitost obou zakončení pro navázání receptoru (Gourlet a kol., Eur. J. Pharm. 287: 7-11, (1995); Gourlet a kol., Regul Peptides 62: 125-130, (1996)). Navázání membrána mozku krysy a adenylátcyklázové aktivity PACAP27/VIP hybridních muteinů prokázaly důležitost N-koncových zbytků PACAp pro rozpoznání PACAP-R1 (Ando a kol., Biomed. Pept. Proteins Nucleic Acids 2:41-46, (1996)). Zvýšení bazicity Leu¹⁷-PACAP27 a Leu¹⁷-VIP vytvořením K15R, K20R, a K21R mutací a prodloužením Ckonce „GKR“ sekvence vedlo k prodloužení trvání tracheální relaxační aktivity morčete, které, jak se předpokládá, bylo způsobeno ochranou zprostředkovanou heparinovou vazbou (Kashimoto a kol., Ann. NY Acad. Sci. 805: 505-510, (1996)). Gourlet a kol., (Biochim. Biophys. Acta 1314: 267-273, (1996)) demonstruje, že Q16R mutein VIP a PACAP vykazuje vyšší afinity pro PACAP-R2, resp. Rl, než jim odpovídající přírodní polypeptidy. Gourlet a kol. (Peptides 18: 1539-1545, (1997)) vyvinul R2-selektivního agonistu s vysokou afinitou tím, že připravil chiméricky substituovaný peptid [K15, R16, L27] VIP(l-7)/GRF(8-27). N-Koncová acylace a DPhe2 substituce tohoto selektivního agonisty vedla k získání účinného R2 selektivního antagonisty (Gourlet a kol., Peptides 18: 1555-1560, (1997). VIP Muteiny Y22L a Y22A, ale nikoliv Y22F, vykazují nižší afinitu pro PACAP-R3, z čehož vyplývá důležitost aromatické skupiny v poloze 22 pro navázání receptoru R3, ale nikoliv pro navázání receptoru R2 (Gourlet, Eur. J. Biochem. 348: 95-99, (1998). Helodermin a helospektin, což jsou VIP podobné peptidy izolované z jedu slinné žlázy ještěrek, vykazují lOOx vyšší selektivitu pro PACAP-R3 (Gourlet, Ann. NY Acad. Sci. 865: 247-252, (1998)). Fotoafinitní značení PACAP27 náhradou F6 a Y22 pBenzoyl-Z-fenylalaninem (pBz) nebo K15, K20 a k21 pBz₂ ukazuje, že K.15 a F22 jsou bližší PACAP-R1 než F6, K20 a K21 (Cao a kol., Eur. J. Biochem. 244: 400-406, (1997); Cao a kol., Ann. NY Acad. Sci. 865: 82-91, (1998)).

Bylo nalezeno několik polypeptidů, které způsobují stimulaci uvolňování inzulínu glukózodependentním způsobem a redukci glukózy in vivo. Tyto polypeptidy nesou několik společných znaků s VIP a PACAP. Zejména zarovnám nad sebou ukazuje následující shody:

SEQ ID NO

VIP	1	HSDAVFTDNY	TRLRKQMAVK	kylnsiln-nh2	28	1
PACAP38	1	HSDGIFTDSY	SRYRKQMAVK	kylaavlgkr ykqrvknk-nh2	38	2
R3P1	Ac	:-HSDAVFTDNY TKLRKQLAAK KYLNDLKKGG T-NH2	31	6
R3P3	1	HSDAVFTDNY	TKLRKQLAAK	KYLNDLKKGG T	31	8
R3P12	1	HSDAVFTDNY	TRLRKQLAAK	KYLNDLKKGG T	31	15
R3P13	1	HSDAVFTDNY	TRLRKQLAAK	KYLNDIKK-NH2	28	16
R3P36	1	HSDAVFTDNY	TRLRKQLAAK	KYLNDIKKKR Y	31	32
R3P66	1	HSDAVFTDNY	TRLRKQVAAK	KYLQSIKNKR Y	31	72

Nicméně žádná zmínka ani ve vědecké ani v patentové literatuře nenasvědčuje tomu, že by volba modifikací na VIP a PACAP sekvencích vedla k získání polypeptidu se schopností stimulovat sekreci inzulínu glukózo-dependentním způsobem a redukovat koncentraci glukózy v plazmě.

Nyní budou definovány některé výrazy použité v celém textu přihlášky vynálezu. Následuje přehled zkratek jednotlivých aminokyselin s jedním písmem, u kterých jsou v závorkách uvedeny i jejich zkratky se třemi písmeny): A, alanin (ala); C, cystein (cys); D, kyselina aspartová (asp); E, kyselina glutamová (glu); F, fenylalanin (phe); G, glycin (gly); H, histidin (his); I, izoleucin (ile); K, lysin (lys); L, leucin (leu); M, methionin (met); N, asparagin (asn); P, prolin (pro); Q, glutamin (gin); R, arginin (arg); S, serin (ser); T, threonin (thr); V, valin (val); W, tryptofan (trp); a Y, tyrosin (tyr).

Výraz „polynukleotid kódující polypeptid“ zahrnuje polynukleotid, který zahrnuje pouze kódovací sekvenci pro polypeptid a stejně tak polynukleotid, který zahrnuje další kódovací a/nebo nekódovací sekvenci: Vynález se dále týká polypeptidů, které hybridizují na výše uvedené sek vence, pokud je mezi sekvencemi alespoň 70%, výhodně alespoň přibližně 90%, a výhodněji alespoň přibližně 95% identita. Vynález se zejména týká polynukleotidů kódujících polypeptidy, které hybridizují za přísných podmínek ve výše popsané polynukleotidy. Výraz „přísné podmínky“, jak je zde použit znamená „přísné hybridizační podmínky“. Výhodně k hybridizaci dojde, pokud bude mezi sekvencemi alespoň přibližně 90% a výhodně přibližně 95% až 97% identita. Polynukleotidy, které hybridizují na výše popsané polynukleotidy, u výhodného provedení kódují polypeptidy, které si zachovávají v podstatě stejnou biologickou funkci nebo aktivitu jako zralý polynukleotid kódovaný cDNA.

Výrazy „funkční ekvivalent“ a „v podstatě stejná biologická funkce nebo aktivita“ se rozumí 30% až 100% nebo vyšší stupeň biologické aktivity, kterou vykazuje polypeptid sjehož aktivitou se srovnává, za předpokladu, že se biologická aktivita všech polypeptidů určuje stejným postupem. Polypeptid který je funkčně ekvivalentní k polypeptidu z obr. 1, je například polypeptid, který při testu scintilační poximity cyklického AMP, který je specificky popsán v příkladu 16, vykazuje akumulaci cAMP v CHO buněčné linii exprimující humánní PACAP/VIP R2 (PACAP R3) receptor.

Polypeptid podle vynálezu, který je R3 agonistou, je polypeptid, který vykazuje 30% až 100% nebo vyšší maximální PACAP-27 R3 agonistickou aktivitu, pokud se testuje podle protokolu z příkladu 16. Výhodnými polypeptidy podle vynálezu, které jsou selektivními agonisty pro R3 a nikoliv pro PACAP R2 a R1 receptory, jsou ty polypeptidy, které vykazují poměr agonistické aktivity R3 ku aktivitě R3 přibližně 10:1 nebo vyšší a výhodněji přibližně 100:1 nebo vyšší, a/nebo ty, které vykazují poměr agonistické aktivity R3 ku aktivitě R1 přibližně 10:1 nebo vyšší a výhodněji přibližně 100:1 nebo vyšší, pokud se polypeptid testuje podle protokolu z příkladu 16 a za použití buněk, které exprimují vhodné receptory.

„Přísné hybridizační podmínky“ označují celonoční inkubaci dvou druhů polynukleotidů určených pro hybridizaci při 42 °C v roztoku, který obsahuje 50% formami, 5x SSC (750 mM NaCl, 75 mM citrátu sodného), 50 mM fosforečnanu sodného (pH 7,6), 5x Denhardtův roztok, 10% dextransulfát a 20 pg/ml DNA denaturovaného, odstřeďovaného spermatu lososa, a následné propláchnutí filtrátů v 0,lx SSC při přibližně 65 °C.

Výrazy „fragment“, „derivát“ a „varianta“ ve spojení s polypeptidy z obr. 1 označují fragmenty, deriváty a varianty polypeptidů, které si, jak bude popsáno níže, zachovávají v podstatě shodnou biologickou funkci nebo aktivitu jako uvedené polypeptidy.

Výraz „analog“ zahrnuje propolypeptid, jehož součástí je aminokyselinová sekvence polypeptidu podle vynálezu. Aktivní polypeptid podle vynálezu lze odštěpit od dalších aminokyselin, které tvoří zbytek propolypeptidové molekuly, přirozenými in vivo procesy nebo dalšími v oboru známými postupy, jakými jsou například enzymatické nebo chemické štěpení. 28-Aminokyselinový nativní peptid VIP se například přirozeně exprimuje jako mnohem větší polypeptid, který se následně zpracuje in vivo tak, že uvolní 28-aminokyselinový aktivní zralý peptid.

Výrazem „fragment“ se rozumí část polypeptidu, která si zachovává v podstatě shodnou funkční aktivitu, jak ukazují zde popsané a níže diskutované in vivo modely.

Výraz „derivát“ zahrnuje veškeré modifikace polypeptidu, který si v podstatě chrání zde popsané funkce a obsahuje další strukturu a doprovodnou funkci, např. PEGylované polypeptidy, které mají delší poločas života, fúzní polypeptid,y které derivátů propůjčují cílovou specifičnost nebo další aktivitu, např. toxicitu pro určený cíl, viz níže.

Polypeptidy podle vynálezu mohou být rekombinantní polypeptidy, přírodní puntíkované polypeptidy nebo syntetické polypeptidy.

-8CZ 296858 B6

Fragmentem, derivátem nebo variantou polypeptidů podle vynálezu mohou být (i) takové, u kterých je jeden nebo více aminokyselinových zbytků nahrazeno konzervovaným nebo nekonzervovaným aminokyselinovým zbytkem (výhodně konzervovaným aminokyselinovým zbytkem) a takový substituovaný aminokyselinový zbytek může nebo nemusí být kódován genetickým kódem, nebo (ii) takové, u kterých zahrnuje jeden nebo více aminokyselinových zbytků substituční skupinu, nebo (iii) takové, u kterých je zralý polypeptid navázán na další sloučeninu, například na sloučeninu, která prodlužuje poločas života polypeptidů (například na polyethylenglykol), nebo (iv) takové, u kterých je na zralý polypeptid navázána další aminokyselina, například vedoucí nebo sekreční sekvence nebo sekvence, která se využívá při purifikaci zralé polypeptidové nebo propolypeptidové sekvence, nebo (v) takové, u kterých je polypeptidová sekvence navázána na větší polypeptid, tj. lidský albumin, protilátku nebo Fc, s cílem prodloužit dobu trvání účinku. Odborníkům v daném oboru jsou obsah i rozsah takto chápaných významů „fragment“, „derivát“, „varianta“ a „analog“ známy.

Deriváty podle vynálezu budou výhodně obsahovat konzervativní aminokyselinové substituce (definované níže) provedení na jednom nebo několika předem určených, výhodně neesenciálních aminokyselinových zbytcích. „Neesenciální“ aminokyselinový zbytek je zbytek, který lze změnit ve standardní sekvenci proteinu bez změny biologické aktivity, zatímco „esenciální“ aminokyselinový zbytek je pro biologickou aktivitu potřebný. Výrazem „konzervativní aminokyselinová substituce“ se rozumí substituce, při které je aminokyselinový zbytek nahrazen aminokyselinovým zbytkem majícím podobný boční řetězec. Rodiny aminokyselinových zbytků mající podobné boční řetězce již byly v dané oblasti definovány. Tyto rodiny zahrnuji aminokyseliny s bazickými bočními řetězci (např. lysin, arginin, histidin), s kyselinovými bočními řetězci (např. kyselina aspartová, kyselina glutamová), s polárními vedlejšími řetězci bez náboje (např. glycin, asparagin, glutamin, serin, threonin, tyrosin, cystein), s nepolárními vedlejšími řetězci (např. alanin, valin, leucin, izoleucin, prolin, fenylalanin, methionin, tryptofan), s β-větvenými bočními řetězci (např. threonin, valin, izoleucin) a s aromatickými bočními řetězci (např. tyrosin, fenylalanin, tryptofan, histidin). Nekonzervativní substituce se neprováděly u konzervovaných aminokyselinových zbytků nebo u aminokyselinových zbytků nacházejících se v konzervované proteinové doméně, například zbytků 19 a 27, pokud jsou esenciální pro aktivitu proteinu, například R3 aktivitu a/nebo R3 selektivitu. Fragmenty nebo biologicky účinné části zahrnují polypeptidové fragmenty vhodné pro použití jako léčivo, pro výrobu protilátky, jako analytické činidlo apod. Fragmenty zahrnují peptidy obsahující aminokyselinovou sekvenci dostatečně podobnou nebo odvozenou od aminokyselinové sekvence polypeptidů podle vynálezu a vykazují alespoň jednu aktivitu tohoto polypeptidů, ale zahrnují méně aminokyseliny než zde popsané celodélkové polypeptidy. Biologicky účinné části zpravidla obsahují doménu nebo motiv s alespoň jednou aktivitou polypeptidů. Biologicky účinnou částí polypeptidů může být například peptid o délce 5 nebo více aminokyselin. Takové biologicky účinné části lze připravit synteticky nebo pomocí rekombinantních technik a pomocí zde popsaných nebo v oboru známých technik lze u nich hodnotit jednu nebo více funkčních aktivit polypeptidů podle vynálezu.

Nicméně výhodné deriváty podle vynálezu zahrnují zralé polypeptidy, které jsou navázány na další sloučeninu, například na sloučeninu, která prodlužuje poločas života polypeptidů a/nebo redukuje potenciální imunogenicitu polypeptidů (například na polyethylenglykol „PEG“). V případě PEGylace lze navázání polypeptidů na PEG realizovat jakýmkoliv vdaném oboru známým způsobem. PEGylaci lze například provádět tak, že se nejprve zavede do polypeptidů cysteinová mutace a následně se provede místně specifická derivatizace pomocí PEG-maleinimidu. Na C-konec peptidů lze přidat cystein. (Viz například Tsutsumi a kol., Proč Nati. Acad Sci USA, 18. červenec 2000; 97(15):8548-53).

Varianty polypeptidů podle vynálezu zahrnují polypeptidy mající aminokyselinovou sekvenci dostatečně podobnou aminokyselinovým sekvencím SEQ ID NO: z obr. 1 nebo jejich doménám. Výraz „dostatečně podobný“ znamená, že první aminokyselinová sekvence obsahuje dostatečný nebo minimální počet aminokyselinových zbytků identických nebo ekvivalentních ke druhé aminokyselinové sekvenci, takže první a druhá aminokyselinová sekvence mají společnou struk-9CZ 296858 B6 turní doménu a/nebo společnou funkční aktivitu. Aminokyselinové sekvence, které obsahují společnou strukturní doménu, tj. jsou přibližně z alespoň 45 %, výhodně přibližně 75 % až 98 % identické, jsou zde například definovány jako dostatečně podobné. Výhodně budou varianty dostatečně podobné aminokyselinové sekvenci výhodných polypeptidů podle vynálezu. Varianty zahrnují varianty polypeptidů kódované polynukleotidem, kteiý hybridizuje na polynukleotid podle vynálezu nebo na jeho komplement za přísných podmínek. Tyto varianty si zpravidla zachovávají funkční aktivitu polypeptidů podle vynálezu. Pro vytvoření rozmanité populace fragmentů pro screening a následnou selekci lze využít knihovny fragmentů těchto polynukleotidů. Knihovnu fragmentů lze například připravit působením nukleázy na dvouřetězcový PCR fragment polynukleotidu za podmínek kde se v každé jednotlivé molekule vytvoří pouze jedno rozštěpení, denaturaci dvoušroubovice DNA, renaturací DNA za vzniku dvoušroubovice DNA, která může obsahovat smyslové/protismyslné páry různých štěpných produktů, odstraněním jednořetězcových částí z reformovaných duplexů působením S1 nukleázy a ligací výsledné knihovny fragmentů do expresního vektoru. Tímto způsobem lze odvodit expresní knihovnu, která kóduje N-koncové a vnitřní fragmenty různě dlouhého polypeptidů podle vynálezu.

Varianty zahrnují polypeptidy, jejichž aminokyselinová sekvence se odlišuje v důsledku mutageneze. Varianty, které působí jako R3 agonisty, lze identifikovat screeningem na R3 agonistickou aktivitu kombinatorických knihoven mutantů, například mutantů získaných sestřihem, polypeptidů podle vynálezu.

U jednoho provedení se široká knihovna analogů generuje kombinatorickou mutagenezí na úrovni nukleové kyseliny a je kódovaná širokospektrou genovou knihovnou. Širokospektrou knihovnu variant lze například produkovat enzymatickou ligací směsi syntetických oligonukleotidů do genových sekvencí, takže lze degenerovanou sadu potenciálních různých aminokyselinových sekvencí exprimovat jako individuální polypeptidy nebo, alternativně, jako sadu větších kondenzovaných proteinů (například pro zobrazení fágu) obsahujících sadu sekvencí. Existuje celá řada způsobů, které lze použít pro přípravu knihoven potenciálních variant z degenerované oligonukleotidové sekvence. Chemickou syntézu degenerované genové sekvence lze provádět v automatickém DNA syntetizéru a syntetický gen se následně liguje do vhodného expresního vektoru. Použití degenerované sady genů umožňuje vjediné směsi poskytnutí všech sekvencí kódujících požadovanou sadu sekvencí potenciálních variant. Způsoby syntetizace degenerovaných oligonukleptidů jsou v daném oboru známy (viz například Nurang (1983) Tetrahedron 39:3; Itakura a kol. (1984) Annu. Rev. Biochem. 53:323; Itakura a kol. (1984); Science 198:1056; Ike a kol. (1983) Nucleic acid Res. 11:477).

Pro screening genových produktů kombinatorických knihoven vyrobených bodovými mutacemi nebo sestřihem a pro screening cDNA knihoven na genové produkty vykazující zvolenou vlastnost je v daném oboru známo několik technik. Tyto techniky jsou přizpůsobitelné rychlému screeningu genových knihoven generovaných kombinatorickou mutagenezí R-agonistických polypeptidů. Nejběžněji používané metody, které lze přizpůsobit vysokovýkonné analýze pro screening velkých genových knihoven, zpravidla zahrnují klonování genové knihovny do replikovatelných expresních vektorů, transformaci vhodných buněk výslednou vektorovou knihovnou a expresi kombinatorických genů za podmínek, při kterých detekce požadované aktivity usnadní izolaci vektor kódujícího genu, jehož produkt byl detekován. Rekurzívní komplexní mutageneze „Recursive ensemble mutagenesis“ (REM), tj. technika, která zvyšuje frekvenci funkčních mutantů v knihovně, může být v kombinaci se screeningovou analýzou použita k identifikaci požadovaných variant.

Vynález rovněž poskytuje chimérické nebo fúzní polypeptidy. Příklady těchto polypeptidů podle vynálezu jsou sekvence SEQ ID NO: 18 a 172, které jsou fúzemi pankreatické targeting sekvence „SWCEPGWCR” [Rajotte D. a kol. (1998) J Clin Invest 102:430-437) se SEQ ID NO: 8, resp. 32: Targeting sekvence je navržena pro lokalizační dopravu polypeptidů do slinivky s minimalizací potenciálních vedlejších účinků. Polypeptidy podle vynálezu mohou být tvořeny aminokyselinami, které jsou vzájemně navázány pomocí peptidových vazeb nebo modifikova

-10CZ 296858 B6 ných peptidových vazeb, tj. peptidových izoesterů, a mohou obsahovat i další aminokyseliny, kromě 20 genem kódovaných aminokyselin. Polypeptidy lze modifikovat buď přirozenými způsoby, jakým je například posttranslační zpracování, nebo chemickými modifikačními technikami, které jsou vdaném oboru známy. Tyto modifikace jsou dobře popsány v základních textech a podrobných monografiích a rovněž v rozsáhlé odborné literatuře. Modifikace se mohou vyskytovat kdekoliv v polypeptidu, včetně hlavního peptidového řetězce, aminokyselinových bočních řetězců a aminového nebo karboxylového konce. Lze předpokládat, že stejný typ modifikace může být přítomen ve stejné nebo jiné míře na několika místech v daném polypeptidu. Daný polypeptid může rovněž obsahovat několik typů modifikací. Polypeptidy mohou být větvené, například v důsledku ubiquitinace, a stejně tak mohou být cyklické, a to s větvením nebo bez větvení. Cyklické, větvené a větvené cyklické polypeptidy mohou být připraveny syntetickými metodami. Modifikace zahrnují acetylaci, acylaci, ADP-ribosylaci, amidaci, kovalentní navázání flavinu, kovalentní navázání heme zbytku, kovalentní navázání nukleotidu nebo nukleotidového derivátu, kovalentní navázání lipidu nebo lipidového derivátu, kovalentní navázání fosfotidylinositolu, zesíťování, cyklizaci, tvorbu disulfidových vazeb, demethylaci, tvorbu kovalentních příčných vazeb, tvorbu cysteinu, tvorbu pyroglutamátu, formulaci, γ-karboxylaci, glykosylaci, tvorbu GPI ukotvení, hydroxylaci, jodizaci, methylaci, myristoylaci, oxidaci, pegylaci, proteolytické zpracování, fosforylaci, prenylaci, racemizaci, selenoylaci, sulfaci, t-RNA mediovanou adici aminokyselin do proteinů, například arginylaci, a ubiquitinaci. (Viz například, Proteines. Structure and Molecular Properties, B. C. Johnson, ed., Academie Press, New York, str. 1-12 (1983); Seifter a kol., Meth. Enzymol 182:626-646 (1990); Rettan a kol., Ann N.Y. Acad. Sci. 663:48-62 (1992)).

Polypeptidy podle vynálezu zahrnují polypeptidy z obr. 1, to jsou SEQ ID NO: 11 až 14, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 21 až 26, SEQ ID NO: 32 až 36, SEQ ID NO: 40 až 53, SEQ ID NO: 57 až 61, SEQ ID NO: 63 až 99, SEQ ID NO: 102 až 119, SEQ ID NO: 121 až 137, SEQ ID NO: 139 až 177, SEQ ID NO: 179, 180, SEQ ID NO: 183 až 202, 322 až 341 a rovněž ty sekvence, které mají nepodstatné změny v sekvenci oproti jmenovaným sekvencím. Výraz „nepodstatná změna“ zahrnuje libovolnou sekvenci, substituci, nebo deleci variant, při kterých zůstane v podstatě zachována alespoň jedna biologická funkce polypeptidů podle vynálezu, výhodně R3 agonistická aktivita, výhodněji selektivní R3 agonistická aktivita a nejvýhodněji zde demonstrovaná schopnost podporující sekreci inzulínu. Tyto funkční ekvivalenty mohou výhodně zahrnovat polypeptidy, které mají alespoň přibližně 90% identitu s polypeptidy z obr. 1 a výhodněji alespoň 95% identitu s polypeptidy z obr. 1 a ještě výhodněji alespoň 97% identitu s polypeptidy z obr. 1, a stejně tak zahrnují části těchto polypeptidů, které mají v podstatě stejnou biologickou aktivitu. Nicméně do rozsahu vynálezu spadá i jakýkoliv polypeptid, který má ve své aminokyselinové sekvenci nepodstatnou změnu oproti sekvencím polypeptidů z obr. 1 a který vykazuje funkční ekvivalenci, která bude dále popsána v popisu přihlášky vynálezu.

Jak je vdaném oboru známo, „podobnost“ mezi dvěma polypeptidy se určí porovnáním aminokyselinové sekvence a jejích konzervovaných aminokyselinových substitucí jednoho polypeptidu se sekvencí druhého polypeptidu. Tyto konzervativní substituce zahrnují výše popsané substituce a rovněž substituce, které popsal Dayhoff a Atlas of Protein Sequence and Structure 5 (1978) a Argos a EMBO J., 8:779-785 (1989). Například aminokyseliny patřící do jedné z následujících skupin reprezentují konzervativní změny:

- ala, pro, gly, gin, asn, ser, thr;

- cys, ser, tyr, thr;

- val, ile, leu, met, ala, phe;

- lys, arg, his;

phe, tyr, trp, his; a

- asp, glu.

Vynález se rovněž týká vektorů, které obsahují polynukleotidy podle vynálezu, hostitelských buněk, které byly geneticky upraveny vektory podle vynálezu, a produkce polypeptidů podle

-11 CZ 296858 B6 vynálezu rekombinantními technikami. Hostitelské buňky lze geneticky upravit (transdukovat nebo transformovat nebo transfektovat) pomocí vektorů podle vynálezu, kterými mohou být například klonovací vektory nebo expresní vektory. Vektor může mít například formu plazmidu, virové částice, fágu atd. Genovým inženýrstvím zpracované hostitelské buňky lze kultivovat v běžném živném médiu modifikovaném tak, aby bylo vhodné pro aktivaci promotorů nebo selekci transformantů. Kultivační podmínky, jakými jsou například teplota, pH apod., budou stejné jako podmínky dříve používané u hostitelské buňky zvolené pro expresi, což jsou podmínky odborníkům v daném oboru známé. Polynukleotid podle vynálezu lze použít pro výrobu polypeptidu rekombinantními technikami. Polynukleotidovou sekvenci lze například zabudovat do libovolného expresního vehikula, zejména do vektorů nebo plazmidů určených pro expresi polypeptidu. Tyto vektory zahrnují chromozomální, non-chromozomální a syntetické DNA sekvence, například derivát SV40; bakteriální plazmidy; fágovou DNA; kvasnicové plazmidy; vektory odvozené z kombinací plazmidů a fágové DNA, virové DNA, například vakcínie, adenovirus, virus způsobující neštovice u drůbeže a pseudovzteklina. Nicméně lze použít další vektory nebo plazmidy, pokud jsou replikovatelné a mají schopnost přežívat v hostiteli.

Vhodnou DNA sekvenci lze do vektoru zabudovat různými postupy. Zpravidla se DNA sekvence zabuduje do vhodného místa restrikční endonukleázy postupy, které jsou v daném oboru známy. O těchto postupech se předpokládá, že budou odborníkům v daném oboru známy. DNA Sekvence v expresním vektoru se operativně naváže na vhodné expresi řídicí sekvence (promotor) potřebné pro přímou mRNA syntézu. Jako reprezentativní příklady těchto promotorů lze zmínit LTR nebo SV40 promotor, E. coli. lac nebo trp, fágový lambda P_L promotor a další promotory, o kterých je známo, že řídí expresi genů v prokaryotických nebo eukaryotických buňkách nebo jejich virech. Expresní vektor rovněž obsahuje místo pro navázání ribozómu, kteréje důležité pro iniciaci translace, a transkripční terminátor. Vektor může dále zahrnovat vhodné sekvence pro zesílení exprese. Expresní vektory navíc výhodně obsahují gen, který jim poskytuje fenotypový znak pro selekci transformovaných hostitelských buněk, jakým je například dihydrofolátreduktázová nebo neomycinová rezistence pro eukaryotickou buněčnou kulturu nebo tetracyklinová nebo ampicillinová rezistence v E. coli. Vektor obsahující vhodnou výše popsanou DNA sekvenci, a stejně tak vhodný promotor nebo řídicí sekvenci, lze použít pro transformaci vhodného hostitele, která umožní hostiteli exprimovat protein. Jako reprezentativní příklady vhodných hostitelů lze zmínit bakteriální buňky, například buňky E. coli, Salmonella typhimurium, Streptomyces; fungální buňky, například buňky kvasinek; buňky hmyzu, například buňky Drosophila S2 a Spodoptera Sf9; zvířecí buňky, například CHO, COS nebo buňky Bowesova melanomu; adenoviry; rostlinné buňky atd. Předpokládá se, že volba vhodného hostitele je zcela v kompetenci odborníkům v daném oboru.

Vynález rovněž zahrnuje rekombinantní konstrukty obsahující jednu nebo několik sekvencí, které byly podrobně popsány výše. Konstrukty obsahují vektor, například plazmid nebo virový vektor, do kterého se začlení sekvence podle vynálezu, a to v přímé nebo reverzní orientaci. U výhodného provedení konstrukt dále obsahuje regulační sekvence, například včetně promotoru operativně navázaného na sekvenci. Odborníkům v daném oboru je znám velký počet vhodných vektorů, které jsou navíc komerčně dostupné. Mezi vhodné vektory lze zařadit například bakteriální vektory: pQE70, pQE60, pQE-9 (Qiagen), pBS, phagescript, psiX174, pBluescript SK, pBsKS, pNH8a, pNHlóa, pNH18a, pNH46a (Stratagene); pTRC99A, pKK223-3, pKK233-3, pDR540, PRIT5 (Pharmacia); a eukaryotické vektory, pWLneo, pSV2cat, pOQ44, pXTl, pSG (Stratagene) pSVK3, pBPV, pMSG, PSVL (Pharmacia). Nicméně lze použít i jakýkoliv další plazmid nebo vektor, pokud bude replikovatelný a pokud bude schopen přežít v hostiteli. Oblasti promotoru lze zvolit z libovolných požadovaný gen používajících CAT (chloramphenicol transferase) vektorů nebo dalších vektorů s volitelnými markéry. Dvěma vhodnými vektory jsou pKK232-8 a pMC7. Za zmínku stojí zejména bakteriální promotory zahrnující láci, lacZ, T3, T7, gpt, lambda P_R, P_L a trp. Eukaryotické promotory zahrnují raný (immediate early) CMV, HSV thymidinkinázu, raný a pozdní SV40, LTR z retroviru a myší metallothioneinI. Volba vhodného vektoru a promotoru spadá do kompetence odborníků v daném oboru.

- 12 CZ 296858 B6

Vynález se rovněž týká hostitelských buněk obsahujících výše popsaný konstrukt. Hostitelskou buňkou může být vyšší eukaryotická buňka, jakou je například savčí buňka, nebo nižší eukaryotická buňka, jakou je například kvasinková buňka, případně může být hostitelskou buňkou prokaryotická buňka, například bakteriální buňka, zavedení konstruktu do hostitelské buňky lze realizovat kalcium fosfátovou transfekcí, DEAE-dextranem mediovanou transfekcí nebo elektroporací (Davis L., Dibner, M., Battey, I., Basic Methods in Molecular Biology, (1986)). Konstrukty v hostitelských buňkách lze použít běžným způsobem k výrobě genového produktu kódovaného rekombinantní sekvencí. Alternativně lze polypeptidy podle vynálezu syntetizovat pomocí běžných peptidových syntetizátorů.

Zralé proteiny lze exprimovat v savčích buňkách, kvasnicích, bakteriích nebo dalších buňkách za řízení vhodnými promotory. Buněk prosté translační systémy lze rovněž použít k výrobě těchto proteinů, přičemž v tomto případě se používají RNA odvozené z DNA konstruktů podle vynálezu. Vhodné klonovací a expresní vektory použitelné v kombinaci s prokaryotickými a eukaryotickými hostiteli popsal Sambrook a kol., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. vydání, (Cold Spring Harbor, N.Y., 1989), zde uveden formou odkazů.

Transkripce DNA kódující polypeptidy podle vynálezu pomocí vyšších eukaryontů se zvýší zavedením sekvence zesilovače do vektoru. Zesilovačem jsou cis-působící prvky DNA, jejichž velikost zpravidla dosahuje přibližně 10 bp až 300 bp, které působí na promotor a zvyšují jeho transkripci. Příklady zahrnují SV40 zesilovač na pozdní straně replikačního původu (100 bp až 270 bp), zesilovač raného promotoru cytomegaloviru, zesilovač polyomu na pozdní straně replikačního původu a zesilovač adenovirů. Rekombinantní expresní vektory budou zpravidla zahrnovat počátky replikace a volitelné markéry umožňující transformaci hostitelské buňky, například gen ampicillinové rezistence n E. coli a S. cerevisiae TRPÍ gen a promotor odvozený z vysoce exprimovaného genu pro přímou transkripci downstream strukturní sekvence. Tyto promotory lze odvodit z operonů kódujících glykolytické enzymy, jakým je například 3-fosfoglycerátkináza (PGK), a faktor, kyselinofosfatáza nebo proteiny tepelného šoku. Heterologická strukturní sekvence se asembluje ve vhodné fázi s translační, iniciační a terminační sekvencí a výhodně je vedoucí sekvence schopna řídit sekreci translatovaného proteinu do periplazmického prostoru nebo extracelulámího média. Heterologická sekvence může případně kódovat fúzní protein zahrnující N-koncový identifikační peptid udílející požadované vlastnosti, například stabilizaci nebo zjednodušenou purifikaci exprimovaného rekombinantního produktu.

Použitelné expresní vektory pro bakteriální použití se konstruují zavedení strukturní DNA sekvence kódující požadovaný protein společně s vhodnými translačními, iniciačními a terminačními signály v řiditelné čtecí fázi s funkčním promotorem. Vektor bude obsahovat jeden nebo více fenotypových volitelných markérů a počátek replikace pro zajištění zachování vektoru a, pokud je to žádoucí, pro poskytnutí amplifikace uvnitř hostitele. Vhodnými prokaryotickými hostiteli pro transformaci jsou například E. coli, Bacillus subtilis, Salmonella typhimurium a různé druhy obsažené v rodech Pseudomonas, Streptomyces a Staphylococcus, nicméně lze použít i další druhy. Použitelné expresní vektory pro bakteriální použití mohou obsahovat volitelný markér a bakteriální počátek replikace odvoditelný z komerčně dostupných plazmidů obsahujících genetické prvky známého klonovacího vektoru pBR322 (ATCC 37017). Tyto komerční vektory zahrnují například pKK223-3 (Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Švédsko) a GEM1 (Promega Biotec, Medison, Wis., USA). Tyto pBR322 „backbone“ sekce jsou zkombinovány s vhodným promotorem a strukturní sekvencí, která má být exprimována.

Po transformaci vhodného hostitelského kmene a růstu hostitelského kmene až do dosažení vhodné buněčné hustoty je zvolený promotor opět potlačen pomocí vhodného prostředku (například teplotního posunu nebo chemické indukce) a buňky se kultivují pro další periodu. Buňky se zpravidla sklízí odstřeďováním, rozrušením pomocí fyzických nebo chemických prostředků a výsledný surový extrakt se uchová pro další purifikaci. Mikrobiální buňky použité při expresi proteinu lze rozrušit pomocí libovolné běžné metody zahrnující cyklické mražení a rozmrazování, sonikaci, mechanické rozrušení nebo použití činidel způsobujících buněčnou lyži.

-13 CZ 296858 B6

Pro expresi rekombinantního proteinu lze použít různé savčí buněčné kultury. Příklady savčích expresních systémů zahrnují COS-7 linie fibroblastů ledvin opice, které opsal Gluzman, Cell 23:175 (1981), a další buněčné linie, které jsou schopny exprimovat kompatibilní vektor, například Cl27, 3T3, CHO, HeL a BHK buněčné linie. Savčí expresní vektory budou obsahovat počátek replikace, vhodný promotor a zesilovač, a rovněž všechna nezbytná místa pro navázání ribozému, polyadenylační místo, místa spoje donoru a akceptoru, transkripční terminační sekvence a 5' lemovou nepřepsanou sekvenci. DNA Sekvence odvozená z SV40 virového genomu, například původ SV40, raný promotor, zesilovač, spoj a polyadenylační místa mohou být použita pro poskytnutí požadovaných nepřepsaných genetických prvků.

Polypeptidy podle vynálezu lze izolovat a purifikovat z rekombinatních buněčných kultur zde použitými metodami zahrnujícími vysrážení síranem amonným nebo ethanolem, kyselinovou extrakci, anionto- nebo kationtoměničovou chromatografií, fosfocelulózovou chromatografií, hydrofobní interakční chromatografií, afínitní chromatografií, hydroxyapatitovou chromatografií a lektinovou chromatografií. Pokud je to nezbytné, lze pro kompletaci konfigurace zralého proteinu použít kroky proteinového refoldingu. Pro finální purifikaci lze na závěr použít vysokovýkonnou kapalnou chromatografií (HPLC).

Polypeptidy podle vynálezu mohou být produktem chemických syntetických postupů nebo je lze připravit rekombinantními technikami z prokaryotického nebo eukaryotického hostitele (například z buněk bakterií, kvasinek, vyšších rostlin, hmyzu a savců v kultuře). V závislosti na hostiteli použité v procesu rekombinantní produkce mohou být polypeptidy podle vynálezu glykosylované cukry savce nebo jiného eukaryotického hostitele nebo mohou být neglykosylované. Polypeptidy podle vynálezu mohou rovněž obsahovat počáteční methioninový aminokyselinový zbytek. Izolovaný nebo purifikovaný polypeptid podle vynálezu nebo jeho biologicky aktivní část, pokud se produkují rekombinantními technikami, je v podstatě prostá biologického materiálu nebo kultivačního média, nebo, pokud se syntetizují chemicky, potom jsou v podstatě prosté chemických prekurzorů nebo jiných chemikálií. Výhodně je izolovaný polypeptid podle vynálezu v podstatě prostý buněčného materiálu a má méně než přibližně 30 % (hmotnosti sušiny) nepolypeptidu neboli kontaminujícího materiálu. Pokud se polypeptid podle vynálezu nebo jeho biologicky účinná část produkuje rekombinantním způsobem, potom kultivační médium výhodně reprezentuje méně než přibližně 30 % obj. připravovaného polypeptidu. Pokud se polypeptid podle vynálezu produkuje chemickou syntézou, potom obsahují přípravky výhodně méně než přibližně 30 % hmotn. sušiny chemických prekurzorů nebo jiných vedlejších produktů a příměsí.

Polypeptidy podle vynálezu lze běžně izolovat způsoby popsanými v níže uvedených příkladech. Přípravek purifikovaného polypeptidu má alespoň přibližně 70% čistotu; výhodně mají tyto přípravky 85% až 99% čistotu. Čistotu přípravků lze stanovit libovolným v daném oboru známým způsobem, například SDS-polyakrylamidovou gelovou elektroforézo a hmotovou spektroskopií/kapalinovou chromatografií.

Polynukleotidová sekvence kódující polypeptid podle vynálezu lze syntetizovat celý nebo jeho část, za použití v daném oboru známých chemických metod (viz například, Caruthers a kol., Nucl. Acids Res. Symp. Ser. 215-223, 1980; Hom a kol., Nucl. Acids Res. Symp. Ser 225-232, 1980). Polynukleotid, který kóduje polypeptid, lze následně klonovat do expresního vektoru pro expresi polypeptidu.

Jak bude odborníkům v daném oboru zřejmé, může být výhodné produkovat polypeptid kódující nukleotidové sekvence vykazující kodony, které se nevyskytují přirozeně. Například kodony preferované konkrétním prokaryotickým nebo eukaryotickým hostitelem lze zvolit tak, aby zvyšovaly hodnotu exprese polypeptidu nebo produkci RNA transkriptu majícího požadované vlastnosti, například poločas života, který je delší než poločas života transkriptu generovaného z přirozeně se vyskytující sekvence.

- 14CZ 296858 B6

Zde popsanou nukleotidovou sekvenci lze geneticky zpracovat za použití v daném oboru obecně známých metod tak, že se změní polypeptid kódující sekvence, a to z celé řady různých důvodů, přičemž tyto změny zahrnují změny, které modifikují uzavírání, zpracování a/nebo expresi polypeptidového nebo mRNA produktu. Pro genetické zpracování nukleotidové sekvence lze použít DNA tvořenou nahodilou fragmentací a PCR přeskupením genových fragmentů a syntetických oligonukleptidů. Například místně směrovaný mutagenezi lze použít pro zavedení nových restrikčních míst, změnu glykosylačních vzorů, změnu kodonové preference, produkci sestřihových variant, zavedení mutací atd.

Alternativně lze polypeptidy podle vynálezu produkovat za použití chemických metod syntetizujících jejich aminokyselinovou sekvenci, například přímou peptidovou syntézou za použití technik v pevné fázi (viz například Merrifield, J. Am. Chem. Soc. 85, 2149-2154, 1963; Roberge a kol, Science, 269, 202-204, 1995). Syntézu polypeptidů lze provádět manuálními technikami nebo automatizovanými technikami. K automatizovaným syntézám lze použít například Applied Biosystems 431A peptidový syntetizátor (Perkin Elmer). Fragmenty polypeptidů lze případně syntetizovat samostatně a následně kombinovat za použití chemických metod produkujících celodélkovou molekulu.

Nově syntetizovaný polypeptid lze v podstatě purifikovat preparativní vysoce výkonovou kapalinovou chromatografíí (viz například Creighton, PROTEINS: STRUCTURES AND MOLECULAR PRINCIPLES, WH Freeman and. Co., New York, N.Y., 1983). Kompozice syntetického polypeptidů podle vynálezu lze potvrdit aminokyselinovou analýzou nebo sekvencováním, například Edmanovým degradačním postupem (viz Creighton, viz výše). Kromě toho lze za použití chemických metod libovolné části aminokyselinové sekvence polypeptidů během přímé syntézy střídat a/nebo kombinovat se sekvencí z dalších proteinů za vzniku varianty polypeptidů nebo fúzního polypeptidů.

Polypeptidy podle vynálezu, které mají schopnost stimulovat sekreci inzulínu z pankreatických ostrůvkových buněk in vitro a způsobovat snížení glukózy v krvi in vivo, lze použít pro léčení diabetů typu 2 (non-inzulínově dependentní diabetes mellitus). Tyto polypeptidy podle vynálezu lze u subjektů s narušenou glukózovou tolerancí rovněž použít jako prevenci proti rozvoji diabetů typu 2. Kromě toho lze polypeptidy podle vynálezu léčit astma (Bolin a kol., Biopolymer 37:57-66 (1995); patent US 5 677 419) (ukazuje, že polypeptid R3P0 je aktivní při uvolnění tracheálního hladkého svalstva u morčat); indukci hypotenze (VIP indukuje hypotenzi, tachykardii, a faciální zarudnutí u astmatických pacientů (Marice A.H. a Sever P.S., Peptides 7:279-280 (1986); Morice A. a kol., The Lancet Π, 1225-1227 (1983)), při problémech s mužskou neplodností (Siow Y. a kol., Effects of vasoactive intestinal peptide on human sperm motility, Arch, Androl., červenec až srpen 1999; 43(1): 67-71); jako antiapoptózní/neuroprotekční činidla (Brenneman D.E. a kol., VIP neurotrophism in centrál nervous systém: multiple effectors and identifícation of a femtomolar-acting neuroprotective peptide, Ann. N.Y. Acad. Sci., 11 .prosince 1998; 865: 207-12); při kardioprotekci během ischemických příhod (Kalfin R. a kol., Protective role of intracoronary vasoactive intestinal peptide in ischemic and reperfused myocardium, J, Pharmacol. Exp. Ther., únor 1994; 268(2):952-8; Das D.K. a kol., Coordinated role of vasoactive intestinal peptide and nitric oxide in cardioprotection, Ann. N.Y. Acad. Sci., 11. prosinec 1998; 865:297-308) a konečně jako protivředové činidlo (Tuncel a kol., The protective effect of vasoactive intestinal peptide (VIP) on stress-induced gastric ulceration in rats, Ann. N.Y. Acad. Sci., prosinec 1998; 865:309-22),

Polypeptidy podle vynálezu lze použít v kombinaci s vhodným farmaceutickým nosičem pro přípravu farmaceutické kompozice pro parenterální podání. Tyto kompozice obsahují terapeuticky účinné množství polypeptidů a farmaceuticky přijatelný nosič nebo excipient. Takový nosič zahrnuje neomezujícím způsobem solný roztok, pufrovaný solný roztok, dextrózu, vodu, glycerol, ethanol a jejich kombinace. Formulace by měly vyhovovat způsobu podání. Vynález rovněž poskytuje farmaceutický balíček nebo kit obsahují jednu nebo více nádobek naplněných jednou nebo více ingrediencemi farmaceutických kompozic podle vynálezu. Součástí této nádobky

- 15CZ 296858 B6 (těchto nádobek) může být příbalový leták ve formě předepsané státním Úřadem regulujícím výrobu, použití nebo prodej farmaceutik nebo biologických produktů, přičemž tento leták odráží souhlas Úřadu s výrobou, použitím nebo prodejem pro humánní medicínu. Kromě toho mohou být polypeptidy podle vynálezu použity ve spojení s dalšími terapeutickými sloučeninami.

Farmaceutické kompozice lze podávat libovolným vhodným způsobem, například orálně, topicky, intravenózně, intraperitoneálně, intramuskulámě, subkutánně, intranazálně nebo intradermálně. Farmaceutické kompozice se podávají v množství, které je účinné při léčbě a/nebo profylaxi specifické indikace. Obecně se podávají v množství alespoň přibližně 350 ng (0,1 nmol)/kg tělesné hmotnosti a ve většině případ budou podávány v množství nepřesahujícím přibližně 35 pg (10 nmol)/kg tělesné hmotnosti na den. Ve většině případů dávku tvoří přibližně 0,1 pg/kg až přibližně 100 mg/kg tělesné hmotnosti denně, vezme-li se v úvahu způsob podání, příznaky atd. Tato čísla nezahrnují biologickou dostupnost peptidu in vivo. V případě, že by se tato biologická dostupnost brala v úvahu, bylo by toto číslo o něco vyšší, případně nižší. Odborník v daném oboru je schopen stanovit pomocí dávkových experimentů nebo dalších běžných prostředků hrubý odhad množství, které je třeba použít pro přípravu účinné dávky.

Polypeptid podle vynálezu lze v rámci vynálezu rovněž použít tak, že se exprimuje in vivo, přičemž toto využití se zpravidla označuje jako „genová terapie“. Buňky lze tedy například zmanipulovat polynukleotidem (DNA nebo RNA) kódujícím polypeptidy ex vivo a zmanipulované buňky se následně darují pacientovi, který má být léčen polypeptidem. Tyto metody jsou v daném oboru známy. Buňky lze například zpracovat v daném oboru známými postupy, které využívají retrovirové částice obsahující RNA kódující polypeptid podle vynálezu.

Lokální doprava činidla stimulujícího produkci inzulínu při použití genové terapie může dopravit terapeutické činidlo do cílové oblasti, tj. do slinivky. Pro vytvoření myšího modelu β-buněčného pankreatického tumoru se například použije pankreaticky specifický promotor (Hanahan D., Heritable formation of pancreatic beta-cell tumors in transgenic mice expressing recombinant insulin/simian virus 40 oncogenes, Nátuře 315 (6015):115-22 (1985)).

V úvahu se berou jak in vitro, tak in vivo genové terapeutické metodologie. Několik metod přenosu potenciálně terapeutických genů do definovaných buněčných populací jsou známy. Viz například Mulligan, „The Basic Science Of Gene Therapy“, Science, 260:926-31 (1993). Tyto metody zahrnují:

1) Přímý přenos genu, viz například Wolff a kol., „Direct Gene transfer Into Mouše Muscle In Vivo“, Scince, 247:1465-68 (1990);

2) Lipozomy mediovaný přenos DNA, viz například Caplen a kol., „Liposome-mediate CFTR Gene Transfer To the Nasal Epithellium of Patients With Cystic Fibrosis“, Nátuře Med., 3.39-46 (1995); Cryslatal, „The Gene As A Drug“, Nátuře Med. 1:15-17 (1995); Gao a Huang, „A Novel Cationic Liposome Reagent For Effícient Transfection Of Mammalian Cells“, Biochem. Biophys. Res. Comm., 179:280-85 (1991);

3) Retrovirem mediovaný přenos DNA, viz například Kay a kol., „In Vivo Gene Therapy OfHemophilia B: Sustained Partial Correction In Factor IX-Defícient Dogs“, Science, 262:117-19 (1993); Anderson, „Human Gene Therapy“, Science“, 256:808-13 (1992).

4) DNA Virem mediovaný přenos DNA. Takové DNA viry zahrnují adenoviry (výhodně vektory na bázi Ad-2 nebo Ad-5), herpesviry (výhodně vektory na bázi herpes simplex viru) a parvoviry (výhodně vektory na bázi „defektních“ nebo non-autonomních parvovirů, výhodněji vektory na bázi adeno-asociovaného viru, nejvýhodněji vektory na bázi AAV-2). Viz například Ali a kol., „The Use Of DNA Viruses As Vectors For Gene Therapy“, Gene Therapy, 1:367-84 (1994); patent US 4 797 368, zabudovaný zde formou odkazu, a patent US 5 139 941, zabudovaný zde formou odkazu.

- 16CZ 296858 B6

Volba konkrétního vektorového systému pro přenos požadovaného genu bude záviset na celé řadě různých faktorů. Jedním důležitým faktorem je povaha cílové buněčné populace. Přesto, že retrovirové vektory byly poměrně extenzivně studovány a použity v určitém počtu genovým terapeutickým aplikací, nejsou tyto vektory zpravidla vhodné pro infikaci nedělených buněk. Kromě toho mají retroviry potenciál pro onkogenicitu. Nicméně nedávný vývoj na poli lentivirových vektorů může obejít některá z těchto omezení. Viz Naldini a kol., In vivo gene delivery and stable transduction of nondividing cells by a lentiviral vector, Science 272:263-7 (1996).

Retroviry, ze kterých lze výše uvedené retrovirové plazmidové vektory odvodit, zahrnují neomezujícím způsobem virus Moloneyho myší leukémie, virus nekrózy, sleziny, retrovirus, jakým je například virus Rousova sarkomu, virus Harveyova sarkomu, virus ptačí leukózy, virus leukémie gibbona, HIV, adenoviru, virus myeloproliferačního sarkomu a virus tumoru prsní žlázy. U jednoho provedení je retro virovým plazmidovým vektorem vir odvozený od viru Moloneyoho myší leukémie.

Adenoviry mají výhodu vtom, že mají široké hostitelské možnosti, mohou infikovat inaktivní buňky nebo buňky v závěrečném stádiu diferenciace, například neurony nebo hepatocyty, a zdají se být v podstatě neonkogenní. Viz například Ali a kol., viz výše, str. 367. Nezdá se, že by se adenoviry integrovaly do genomu hostitele. Protože existují extrachromozomálně,riziko vkládací mutageneze je značně zredukované. Ali a kol., viz výše, str. 373.

Adeno-asociované viry vykazují podobné výhody jako vektory na bázi adenovirů. Nicméně AAV vykazují místně specifickou integraci na lidském chromozómu 19 (Ali a kol., viz výše, str. 377).

U výhodného provedení se DNA kódující polypeptid stimulující produkci inzulínu podle vynálezu použije v rámci genové terapie při léčbě takových poruch, jakou je například diabetes.

Podle tohoto provedení se genová terapie využívající DNA kódující polypeptid stimulující produkci inzulínu nebo muteiny podle vynálezu aplikuje u pacienta, který tuto terapii potřebuje, souběžně nebo bezprostředně po určení diagnózy.

Odborník v daném oboru si je vědom, že v rámci vynálezu lze použít libovolný vhodný genově terapeutický vektor obsahující polypeptid stimulující produkci inzulínu, DNA nebo DNA fragmentu, derivátu nebo varianty polypeptidu stimulujícího produkci inzulínu. Techniky konstrukce takového vektoru jsou známy. Viz například Anderson W.F., „Human Gene Therapyů, Nátuře, 392:25-30 (1998); Verma I.M. a Somia N„ „Gene Therapy - Promises, Problems, and Prospects“, Nátuře, 389:239-242 (1998). Zavedení vektoru obsahujícího DNA polypeptidu stimulujícího produkci inzulínu do cílového místa lze realizovat za použití běžných technik.

Vektor zahrnuje jeden nebo více promotorů. Vhodné promotory, které lze použít, zahrnují neomezujícím způsobem retrovirový LTR; SV40 promotor; a promotor lidského cytomegaloviru (CMV); popsaný vMiller a kol., Biotechniques, 7(9):980-990 (1989), nebo libovolný další promotor (například celulámí promotory, jako například eukaryotické celulární promotory zahrnující neomezujícím způsobem histon, pol III a β-aktinový promotor). Další virové promotory, které lze použít, zahrnují neomezujícím způsobem promotory adenoviru, promotory thymidinkinázy (TK) a promotory B19 parvoviru. Volba vhodného promotoru bude odborníkům v daném oboru zřejmá po prostudování zde popsaných technik.

Nukleokyselinová sekvence kódující polypeptid podle vynálezu je řízena vhodným promotorem. Vhodné promotory, které lze použít, zahrnují neomezujícím způsobem adenovirové promotory, například adenovirový hlavní pozdní promotor; nebo heterologické promotory, například promotor cytomegaloviru (CMV); promotor viru respiračního syncytia (RSV); indukovatelné promotory, například MMT promotor, promotor metallothioneinu; promotory tepelného šoku; pro

- 17CZ 296858 B6 motor albuminu; promotor ApoAI; promotory lidského globinu; promotory virové thymidinkinázy, například herpes simplex promotor thymidinkinázy; retrovirová LTR (včetně modifikovaných výše popsaných retrovirových LTR); promotor β-aktinu; a promotory lidského růstového hormonu. Promotorem může být rovněž nativní promotor, který řídí gen kódující polypeptid.

Retrovirový plazmidový vektor se použije pro transdukční balení buněčných linií za vzniku produkčních buněčných linií. Příklady balení buňky, kterou lze transfektovat, zahrnují neomezujícím způsobem PE501, PA317, ψ-2, ψ-ΑΜ, PA12, T19-14X, VT-19-17-H2, qCRE, igCRIP, GP+4-86, GP+envAml2 a DAN buněčnou linii, které popsal Miller vHuman Gene Therapy, 1:5-14 (1990), zde zabudováno formou odkazu. Vektor může transdukovat balení buňky přes libovolný v daném oboru známý prostředek. Tento prostředek zahrnuje neomezujícím způsobem elektroporaci, použití lipozomů a CaPO₄ precipitaci. U jedné alternativy lze retrovirový plazmidový vektor zapouzdřit do lipozomů nebo navázat do kapaliny a následně aplikovat do hostitele. Produkční buněčná linie generuje infekční částici retrovirového vektoru, která obsahuje nukleokyselinovou sekvenci(e) kódující polypeptidy. Tyto částice retrovirového vektoru lze následně použít pro transdukci eukaryotických buněk buď in vitro, nebo in vivo. Tyto transdukované eukaryotické buňky budou exprimovat nukleokyselinovou sekvenci(e) kódující polypeptid. Eukaryotické buňky, které lze transdukovat, zahrnují neomezujícím způsobem embryonální karcinomové buňky, a stejně tak hematopoietické kmenové buňky, hepatocyty, fibroblasty, myoblasty, karatinodyty, endoteliální buňky a bronchiální epiteliální buňky.

Odlišným přístupem genové terapie je „transkaryotická terapie“, při které jsou buňky pacienta ošetřeny ex vivo s cílem indukovat latentní chromozómové geny a produkovat požadovaný protein po znovuzavedení do těla pacienta. Transkaryotická terapie předpokládá, že jednotlivec má normální komplement genů nezbytných pro aktivaci. Transkaryotická terapie zahrnuje zavedení promotoru nebo jiné exogenní regulační sekvence schopné aktivovat vznikající geny do chromozomální DNA buňky pacienta ex vivo, kultivaci a selekci na aktivní protein produkující buňky a následné zpětné zavedení aktivované buňky do těla pacienta s předpokladem, že budou následně zcela přijaty tělem pacienta. „Genem aktivované“ buňky budou následně po určitou významnější dobu, pravděpodobně po dobu života pacienta, produkovat požadovaný protein. Tento koncept podrobně popisují patenty US 5 641 670 a US 5 733 761, zde zabudovaný formou odkazů.

Vynález bude lépe pochopen po prostudování následujících příkladů provedení vynálezu, které mají pouze ilustrativní charakter a nikterak neomezují rozsah vynálezu, jenž je jednoznačně vymezen přiloženými patentovými nároky.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

Protokol pro izolaci ostrůvků z těla krys

Krysy Sprague Dawley (275 g až 320 g) se použily jako zdroj donorových ostrůvků. Stručně řečeno, slinivka se naplnila 10 ml studeného rekonstituovaného enzymu Liberase Rl (Boehringer Manheim), ostrůvky se sklidily a 30 min inkubovaly dalšími 5 ml enzymatického roztoku ve vodní lázni. Tkáňová suspenze se 2x propláchla studeným 10% FBS/Hanksovým pufrem (Gibco), resuspendovala v 8 ml 25% ficoll (Sigma) a následně rozvrstvila 5 ml 23%, 20% a 11% ficoll. Ostrůvky ve 20% vrstvě se po odstředění izolovaly, 2x propláchly 10% FBS/Hankovým pufrem a resuspendovaly v 10% FBS/RPMI 1640 médiu (Sigma).

-18CZ 296858 B6

Příklad 2

Protokol pro analýzy peptidem indukovaného zvýšení hladiny inzulínu u krys

Krysy Wistar se nechaly přes noc vyhladovět (17 h) a následně se provedla anestézie pentobarbitálem (0,1 ml/100 g BW). Glukóza (0,4 g/kg rozpuštěná v 1% roztoku lidského albuminu v solném roztoku) +/- peptid (rozpuštěný v 1% roztoku lidského albuminu v solném roztoku) se vstříkl intravenózně do ocasní žíly.

Krysám se 1 min po injekci z oka odebralo 50 μΐ až 100 μΐ plazmy, která se analyzovala na hladinu inzulínu pomocí Lineo RIA kitu (Lineo Research, lne., St. Charles, MO).

Příklad 3

Protokol pro určení vlivu peptidů na intraperitoneální tolerance glukózy u krys

Krysy Wistar se nechaly přes noc hladovět a následně se znecitlivěly pentobarbitálem. Krysám se odebrala krev z oka (čas nula) a do ocasní žíly se pomocí injekce aplikoval peptid (v 1% roztoku lidského albuminu). O 5 min později se pomocí intraperitoneální injekce aplikoval 1 g/kg glukózy (v solném roztoku) a po 15 min, 30 min a 60 min se provedl odběr krve z oka. Hladina glukózy v plazmě se určila za použití autoanalyzéru Technicon Axon, od divize Bayer Diagnostics společnosti Bayer Corporation, Tyrrytown NY, a za použití metody č. SM4-2143F90 „Glucose“.

Příklad 4

Protokol pro určení vlivů peptidů na zadržování intestinální vody u krys

Samečci krys se nechali 24 h hladovět a 2 h až 3 h před zahájením experimentu se jim odebraly jejich lahve s vodou. Peptid nebo solný roztok se indikoval subkutánně do těla krys s provedenou anestézií. Krysy se usmrtily CO₂ 10 min po podání dávky peptidu a tenké střevo se vyřízlo a zvážilo (1). Střevo se otevřelo řezem, voda v průsvitu se absorbovala filtračním papírem a střevo se opět zvážilo (2). Množství intestinální vody (g) = hmotnost (1)- hmotnost (2).

Příklad 5

Metodologie syntézy peptidu

Pro syntézu některých polypeptidů podle vynálezu se použil následný obecný postup. Pro syntézu peptidu se použije FMOC/t-butylová strategie (Peptide Synthesis Protokols (1994), svazek 35 od Michaela W. panningtona & Bena M. Dunna), podmínky kontinuálního tečení a Rapp-Polymere PEG-polystyrenové pryskyřice (Rapp-Polymere, Tubingen, Německo). Po ukončení syntézy se peptidy odštěpí od pryskyřice a zbaví ochranných skupin pomocí TFA/DTT/H₂O triizopropylsilanu (88/5/5/2). Peptidy se vysráží z koktejlu získaného štěpení pomocí studeného diethyletheru. Sraženina se třikrát propláchne studeným etherem a následně se rozpustí v 5% roztoku kyseliny octové a lyofilizuje. Peptidy se analyzují chromatografií s reverzní fází na koloně YMC-Pack ODS-AQ (YMC, lne., Wilmington, NC) na systému Waters ALLIANCE (Waters Corporation, Milford, MA) za použití eluční soustavy tvořené vodou a acetonitrilem s 3% TFA jako gradientem od 0 % do 100 % acetonitrilu a MALDI hmotovou spektrometrií na VOYAGER DE MALDI hmotovém spektrometru, (model 5-2386-00, PerSeptive BioSystems, Framingham, MA). Kmatrix pufru 1/1 se přidá (50/50 dH₂O/acetonitril s 3% roztokem TFA) vzorek matrix pufrovaného peptidu. Tyto peptidy nesplňují kritéria kladená na čistotu, která má být vyšší než

-19CZ 296858 B6

95%, se purifikují chromatografíí s reverzní fází na HPLC systému Waters Delta Prep 4000 (Waters Corporation, Milford, MA).

Příklad 6

Klonování peptidů

Pokusy o rekombinantní expresi VIP měly doposud smíšené výsledky. Simoncsits a kol. (Eur. J. Biochem. 178: 343-350, (1988)) exprimoval Leu¹⁷, Gly²⁹-VIP nebo Leu¹⁷Gly²⁹Lys³⁰-VIP jako C-terminační fúzi na N-koncovou část E. coli β-galaktosidázový gen v£. coli. Odstranění methioninu v poloze 17 eliminuje CNBR štěpné místo. C-Koncová adice Gly nebo Gly-Lys-Arg byla navržena pro potenciál in vivo C-koncovou amidaci savčí PAMázy. Po CNBR štěpení fúzních proteinů na methioninu se zavedl N-konec na VIP mutanty, volné VIP mutanty se purifikovaly a ukázalo se, že vykazují podobné aktivity jako nativní VIP, nicméně aktivity se měřily pouze za nasycených koncentrací peptidů. Raingeaud a kol. (Biochemie 78:14—25 (1996)) exprimoval VIP jako polymerní C-koncové fúze na glutathion S-transferáze (GST) v E. coli. Volné polymerní nebo monomemí VIP peptidy se uvolnily po sekvenčních štěpeních pomocí faktoru Xa a hydroxylaminu. Požadavek na dvoustupňové štěpení vedl k neúčinnosti a získání směsi produktů. Polymerní nebo monomemí VIP peptidy produkované tímto postupem byly méně aktivní než nativní VIP. Vylepšená verze konstruktu využívá pouze štěpení pomocí faktoru Xa, které poskytlo VIP mutant s prodloužením C-konce sedmi zbytky, přičemž tento VIP mutant je rovněž méně aktivní než nativní VIP (Ottavi a kol., Biochemie 80:289-293 (1998)). Žádná exprese PACAP nebyla doposud zaznamenána. Po určení masivního způsobu exprese PACAP, VIP a jejich mutantů se jejich genetické kódy nakloňují na C-konec GST pomocí jediné separace monomerního peptidů s GST za použití rozpoznávacího místa faktoru Xa. Gen kódující rozpoznávací místo pro faktor Xa navázaný na DNA sekvenci peptidů, který se má připravit, se syntetizuje hybridizaci dvou překrývajících se jednořetězcových DNA fragmentů (70-90mery) obsahujících Bam Hl nebo Xho I restrikční enzymové místo bezprostředně za 5' na DNA sekvenci genu, který má být klonován, načež následuje DNA syntéza protilehlých řetězců přes velký fragment DNA polymerázy I (Life Technologies, lne., Gaithersburg, MD). Sekvence DNA, zvolená pro každý gen, je založena na reverzní translaci navržené aminokyselinové sekvence každého peptidů. V některých případech se gen kódující peptid generuje PCR mutagenezí (Picard V. a kol, Nucleic Acids Res 22:2587-91 (1994); Sambrook J., Fritsch, E.F. & Maniatis T. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. vydání, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York) genu již vyrobeného výše popsanou metodou. Dvoušroubovice produktu se následně digeruje Bam Hl a Xho I a liguje do pGEX-6P-l (Amersham Pharmacia Biotech), který by rovněž štěpen jako Bam Hl a Xho I. Seznam sekvencí DNA klonovaných peptidových genů je na obr. 8.

Pokud se například DNA sekvence SEQ ID NO: 54, 55, a 56 nakloňují do pGEX-6P-l, potom se polypeptidové sekvence exprimují jako fúze z glutathion S-transferázy (GST):

PACAP38: IEGRHSDGIFTCSYSRYRKQMAVKKYLAAVLGKRYKQRVKNK (SEQ ID NO: 2)

VIP: IEGRHSDAVFTDNYTRLRKQMAVKKYLNSILN (SEQ ID NO: 1)

R3P3: IEGPBSDAVFTENYTKLRKQLAAKKYLNDLKKGGT (SEQ ID NO: 8)

Příklad 7

Rekombinantní exprese a purifíkace peptidů

Buňky BL21 (Stratagene) transformované GST-peptidovou fúzí obsahující plazmidy se pěstovaly při teplotě 37 °C, dokud OD₆₀₀ nedosáhlo 0,6 až 1,0 a 2 h se při teplotě 37 °C indukovaly 1

-20CZ 296858 B6 mM IPTG (Life Technologies). 2 Litry buněk se 15 min odstřeďovaly při 7700 g, zvážily, a alespoň 3 h se skladovaly při teplotě -20 °C. Zmrazené buněčné pelety se resuspendovaly ve 100 ml ledové studené PBS s 250 μΐ proteázového inhibičního koktejlu (Kat. č. P-8465, Sigma Chemical) na 1 g buněk a 3x 1 min sonikovaly s 15s přestávkami. Buněčné úlomky se odstřeďovaly 20 min při 10 000 g. Supernatant se při 4 °C přes noc mísil na protřepávačce se 2 ml 50% roztoku pryskyřice Glutathione Sepharose 4B (Pharmacia). Pryskyřice se 15 min odstřeďovaly při 1500 G, zavedly do prázdných Poly-Prep chromatografíckých kolon (Bio-Rad), propláchly 30 ml PBS a následně 10 ml pufru faktoru Xa (1 mM CaCl₂, 100 mM NaCl, a 50 mM Tris-HCl, pH 8,0). Peptidy se přes noc při 4 °C štěpily z kolony 60ti jednotkami faktoru Xa (Pharmacia) v 1 ml pufrového faktoru Xa na C¹⁸ HPLC (Backham Systém Gold) za použití 2 ml smyčky a rychlosti proudění 2 ml/min s následujícím programem: 10 min pufr A (0,1% TFA/H₂O), 30 min gradient ku pufru B (0,1% TFA/ACN), 10 min pufr A, 10 min gradient a 10 min pufr A. Píkové frakce (1 ml každý) se jímaly a screenovaly 10% až 20% Tricin-SDS gelovou elektroforézou. Frakce obsahující peptidy, jejichž seznam uvádí tabulka 1, se jímaly a sušily. Za typické výtěžky se považuje několik set mikrogramů volných peptidů na 1 litr kultury E. coli. Ukázalo se, že rekombinantní peptidy mají stejné aktivity jako jejich syntetické verze.

Následující tabulka obsahuje některé zvolené polypeptidy vyrobené za použití výše diskutovaného protokolu pro syntézu peptidu (příklad 5) nebo vyrobené rekombinantním způsobem, viz příklad 7. Peptidy vyrobené rekombinantním způsobem jsou označeny malým písmem „r“ před označením peptidu. Peptidy produkované jak rekombinantním tak syntetickým způsobem jsou označeny hvězdičkami (*) vedle čísla peptidu. Peptidy R3P0 a P3P4 popsal Bolin a kol. (Biopolymers 37:57-66 (1995); patent US 5 677 419).

-21 CZ 296858 B6

Tabulka 1

Peptid č.	Sekvence	SEQ ID NO
R3P0	Ac-HSDAVFTENYTKLRKQNIeAAKKYLNDLKKGGT-NH2	5
R3P1	Ac-HSDAVFTENYTKLRKQLAAKKYLNDLKKGGT-NH2	6
R3P2	Ac-HSDAVFTENYTKLRKQLAAKKYLNDLKKGGT	7
rR3P3*	HSDAVFTENYTKLRKQLAAKKYLNDLKKGGT	8
R3P4	Ac-HSDAVFTEN (CH3O-Y) TKLRKQNIeAAKKYLNDLKK-NH2	9
R3P5	HSDAVFTENYTKLRKQLAAKKYLNDLKK	10
R3P8	HSDAVFTDNYTRLRKQMAVKKYLNSIKK-NHn	11
rR3P9*	HSDAVFTDNYTRLRKQMAVKKYLNSIKKGGT	12
R3P1 0	HSDAVFTENYTKLRKQLAAKKYLNDLLNGGT	13
R3P11	HSDAVFTDNYTKLRKQLAAKKYLNDILNGGT	14
R3P12*	HSDAVFTDNYTRLRKQLAAKKYLNDIKKGGT	15
R3P13	HSDAVFTDNYTRLRKQLAAKKYLNDIKK-NH2	16
R3P14	H S DAVFT DN YT RLRKQMAVKKYLN DLKKGGT	17
R3P19	SDAVFTENYTKLRKQLAAKKYLNDLKKGGTSWCEPGWCR	18
R3P20	HSDAVFTDNYTRLRKQMAAKKYLNDIKKGGT	19
R3P21	HSDAVFTDNYTRLRKQLAVKKYLNDIKKGGT	20
R3P22	HSDAVFTDNYTRLRKQLAAKKYLNSIKKGGT	21
R3P24	HSDAVFTDNYTRLRKQLAAKKYLNDIKNGGT	22
R3P25	HSDAVFTDNYTRLRKQLAVKKYLNSIKKGGT	23
R3P26	H S DAVFT DN YT RLRKQMAAKKYLN SIKKGGT	24
R3P29	HSDAVFTDNYTRLRKQLAVKKYLNDIKNGGT	25
R3P30	HSDAVFTDNYTRLRKQLAAKKYLNSIKNGGT	26
R3P31	HSDAVFTDNYTRLRKQLAAKKYLNDIKKGG	27
R3P32	HSDAVFTDNYTRLRKQLAAKKYLNDIKKG	28
rR3P33*	HSDAVFTDNYTRLRKQLAAKKYLNDIKK	29
R3P34	HSDAVFTDNYTRLRKQLAAKKYLNDIKKQ	30
R3P35	H S DAV FT DN YT RLRKQLAAKKYLN DlKKNQ	31
R3P36	HSDAVFTDNYTRLRKQLAAKKYLNDIKKKRY	32
rR3P41	HSDAVFTDNYTRLRKQMAVKKYLNSIKK	33
rR3P42	HS DAVFT DNYTRLRKQMAVKKYLNSIKN	34
rR3P43	HSDAVFTDNYTRLRKQMAVKKYLNSILK	35
rR3P44	HSDAVFTDNYTELRKQMAVKKYLNSILN	36
rR3P45	HSDAVFTDNYTRLREQMAVKKYLNSILN	37
rR3P46	HSDAVFTDNYTRLRKQLAVKKYLNSILN	38
rR3P47	HSDAVFTDNYTRLRKQMAAKKYLNSILN	39
rR3P48	HSDAVFTDNYTRLRKQMAVKKYLNDILN	40
rR3P49	HSDAVFTDNYTRLRKQMAAKKYLNSIKN	41
rR3P50	HSDAVFTDNYTRLRKQMAAKKYLNSILK	42
rR3P51*	H S DAVFT DNYTRLRKQMAAKKYLNSIKK	43
rR3P52	HSDAVFTDNYTRLRKQMAAKKYLNSIKKKRY	44
rR3P53*	HSDAVFTDNYTRLRKQMAAKKYLNSIKKKR	45

-22CZ 296858 B6

Tabulka 1 - pokračování

rR3P54	HSDAVFTDNYTRLRKQMAAKKYLNSIKKK	46
rR3P55·*·	HSDAVFTDNYTRLRKQMAAKKYLNSIKNKRY	47
rR3P56	H S DAVFTDN YTRLRKQMAVKKYLNSIKKKRY	48
Γ.Η3Ρ57	HSDAVFTDNYTRLRKQMAVKKYLNSIKKKR	49
rR3P58	HSDAVFTDNYTRLRKQMAVKKYLNSIKKK	50
rR3P59	HSDAVFTDNYTRLRKQMAVKKYLNSIKNKRY	51
rR3P60	HSDAVFTDNYTRLRKQVAAKKYLQSIKK	52
rR3P61	HSDAVFTDNYTRLRKQIAAKKYLQTIKK	53
R3P6	HSDGIFTESYSRYRKQMAVKKYLAALKKKRYKQRVKNK	57
R3P7	HSDAVFTENYTRLRKQMAVKKYLNSLKK-NH2	58
R3P15	hsdgiftdsysryrkqmavkkylsavrhgqt-nh2	59
R3P16	hsdgiftdsysryrkqmavkkylaavkqggt-nh2	60
R3P17	HSDGIFTDSYSRYRKQMAVKKYLAAVKKYLAAVRHG-NH2	61
R3P18	WCEPGWCRHSDAVFTENYTKLRKQLAAKKYLNDLKKGGT	62
R3P23	HSDAVFTDNYTRLRKQLAAKKYLNDILKGGT	63
R3P27	HSDAVFTDNYTRLRKQLAAKKYLNDILNGGT	64
R3P28	HSDAVFTDNYTRLRKQLAVKKYLNDILKGGT	65
R3P37	HSDGIFTDSYSRYRKQLAAKKYLADVKKGGT	66
R3P38	HSDGIFTDSYSRYRKQLAAKKYLADVKK	67
R3P3 9	HSDGIFTDSYSRYRKQLAVKKYLAAVKK	68
R3P40	HSDGIFTDSYS RYRKQMAVKKY LAAVKK	69
R3P62	HS DAV FT DNYT RLRKQVAAKKYLNSIKK	70
R3P65	HSDAVFTDNYTRLRKQMAAKKYLNSIKNKR	71
R3P66	HSDAVFTDNYTRLRKQVAAKKYLQSIKNKRY	72
R3P67	HSDAVFTDNYTRLRKQLAAKKYLNTIKNKRY	73
R3P69	HSDAVFTDNYTRLRKQVAAKKYLNSIKNKRY	74
R3P69	HSDAVFTDNYTRLRKQMAAKKYLQSIKNKRY	75
R3P70	HSDAVFTDNYTRLRKQMAAKKYLNTIKNKRY	76
R3P71	HSDAVFTDQYTRLRKQMAAKKYLNSIKNKRY	77
R3P72	HSDAVFTDQYTRLRKQLAAKKYLNTIKNKRY	78
R3P73	HSDAVFTDNY7RLRKQMAAHKYLNSIKNKRY	79
R3P7 4	HSDAVFTDNYTRLRKQMAAKHYLNSIKNKRY	80
R3P75	HSDAVFTDQYTRLRKQLAAHKYLNTIKNKRY	81
R3P76	HSDAVFTDQYTRLRKQLAAKHYLNTIKNKRY	82
R3P7 7	HSDAVFTDNYTRLRKQVAAKKYLQSIKKKR	83
R3P78	HSDAVFTDNYTRLRKQVAAKKYLNSIKKKR	84
R3P79	HS DAVFTDN YTRLRKQVAAKKYLNSIKN KRY	85
R3P80	HSDAVFTDNYTRLRKQVAVKKYLQSIKKKR	86
R3P81	HSDAVFTDNYTRLRKQVAVKKYLQSIKKK	87
R3P82	HS DAVFTDNYTRLRKQVAVKKYLQSIKNKRY	88
R3P8 3	HSDAVFTDNYTRLRKQVAAKKYLQSILKKRY	89
R3P84	HS DAVFT DNYTRLRKQVAAKKYLQSILKKR	90
R3P85	HSDAVFTDNYTRLRKQVAAKKYLQSILKK	91
R3P86	HSDAVFTDNYTRLRKQVAAKKYLQSIKNK	92
R3P87	HSDAVFTDNYTRLRKQVAVKKYLQSILKKRY	93

-23CZ 296858 B6

Tabulka 1 - pokračování

R3P88	HSDAVFTDNYTRLRKQVAVKKYLQSILKKR	94
R3P89	HSDAVFTDNYTRLRKQVAVKKYLQSILKK	95
R3P92	HS DAVFT DNYTRLRKQVAAKKYLQSILNKRY	97
R3P93	HSDAVFTDNYTRLRKQVAAKKYLQSILNKR	98
R3P94	H S DAV FTON YTRLRKQVAAKKYLQSILNK	99
rR3P97	H S DAV FT DN YT RLRKQMACKKYLN SIKNKR	100
rR3P98	HS DAV FT DN YTRLRKQMADKKYLN SIKNKR	101
rR3P99	HS DAVFT DNYT RLRKQMAEKKYLNSIKNKR	102
rR3P100	HS DAVFT DNYT RLRKQMAFKKYLNSIKN KR	103
rR3P101	HSDAVFTDNYTRLRKQMAGKKYLNSIKNKR	104
rR3Pl02	HSDAVFTDNYTRLRKQMAHKKYLNSIKNKR	105
I-R3P103	H S DAV FT DN YT RLRKQMAIKKYLN SIKNKR	106
rR3Pl04	HS DAV FT DNYTRLRKQMAKKKYLNSIKNKR	107
rR3P105	H S DAV FT DN Y TRLRKQMALKKYLN SIKNKR	108
rR3P106	HSDAVFTDNYTRLRKQMAMKKYLNSIKNKR	109
rR3P107	HSDAVFTDNYTRLRKQMANKKYLNSIKNKR	110
rR3P108	HSDAVFTDNYTRLRKQMAPKKYLNSIKNKR	111
rR3P109	HSDAVFTDNYTRLRKQMAGKKYLNSIKNKR	112
rR3P110	HSDAVFTDNYTRLRKQMARKKYLNSIKNKR	113
rR3Plll	HSDAVFTDNYTRLRKQMASKKYLNSIKNKR	114
rR3P112	HSDAVFTDNYTRLRKQMATKKYLNSIKNKR	115
rR3P113	HSDAVFTDNYTRLRKQMAVKKYLNSIKNKR	116
rR3P114	HSDAVFTDNYTRLRKQMAWKKYLNSIKNKR	117
rR3P115	HSDAVFTDNYTRLRKQMAYKKYLNSIKNKR	118
rR3P116	HSDAVFTDNYTRLRKQMAAKKYLNSIANKR	119
rR3P117	HSDAVFTDNYTRLRKQMAAKKYLNSICNKR	120
TR3P118	HSDAVFT DN YT RLRKQMAAKKYLNSIDNKR	121
I-R3P119	HSDAVFTDNYTRLRKQMAAKKYLNSIENKR	122
rR3P120	HSDAVFTDNYTRLRKQMAAKKYLNSIFNKR	123
rR3P121	HSDAVFTDNYTRLRKQMAAKKYLNSIGNKR	124
rR3P122	HSDAVFTDNYTRLRKQMAAKKYLNSIHNKR	125
rR3P123	HSDAVFTDNYTRLRKQMAAKKYLNSIINKR	126
rR3P124	HSDAVFTDNYTRLRKQMAAKKYLNSIMNKR	127
rR3P12b	HSDAVFTDNYTRLRKQMAAKKYLNSINNKR	128
rR3P126	HSDAVFTDNYTRLRKQMAAKKYLNSIPNKR	129
rR3P127	HSDAVFTDNYTRLRKQMAAKKYLNSIQNKR	130
rR3P128	HSDAVFTDNYTRLRKQMAAKKYLNSIRNKR	131
rR3P129	HSDAVFTDNYTRLRKQMAAKKYLNSISNKR	132
rR3P130	HSDAVFTDNYTRLRKQMAAKKYLNSITNKR	133
rR3P131	HSDAVFTDNYTRLRKQMAAKKYLNSIVNKR	134
1-R3P132	HSDAVFTDNYTRLRKQMAAKKYLNSIWNKR	135
rR3P133	H S DAVFT DNYT RLRKQMAAKKYLN SIYN KR	136
rR3P134	HSDAVFTDNYTRLRKQMAAKKYLNSIKNAR	137
rR3P135	H S DAV FT DN YT RLRKQMAAKKYLNSIKNC R	138
rR3P136	HSDAVFTDNYTRLRKQMAAKKYLNSIKNDR	139

-24CZ 296858 B6

Tabulka 1 - pokračování

rR3P137	HSDAVFTDNYTRLRKQMAAKKYLNSIKNER	140
rR3P138	HSDAVFTDNYTRLRKQMAAKKYLNS1KNFR	141
rR3Pl39	HSDAVFTDNYTRLRKQMAAKKYLNSIKNGR	142
rR3P140	H S DAV FT DNYT RLRKQMAAKKYLNSIKNHR	143
rR3P141	H S DAV FT DNY T RLRKQMAAKKYLN SIKNIR	144
rR3P142	HSDAVFTDNYTRLRKQMAAKKYLNSIKNLR	145
rR3P143	HSDAVFTDNYTRLRKQMAAKKYLNSIKNMR	146
rR3P144	HSDAVFTDNYTRLRKQMAAKKYLNSIKNNR	147
rR3P145	HS DAV FT DN YT RLRKQMAAKKY LN SIKN P R	148
rR3Pl46	HSDAVFTDNYTRLRKQMAAKKYLNSIKNQR	149
rR3P147	HSDAVFTDNYTRLRKQMAAKKYLNSIKNRR	150
rR3P148	HS DAV FT DM Y T RLRKQMAAKKYLN SIKN S R	151
rR3P149	HSDAVFTDNYTRLRKQMAAKKYLNSIKNTR	152
rR3P150	HSDAVFTDNYTRLRKQMAAKKYLNSIKNVR	153
rR3P151	HS DAV FT DN YT RLRKQMAAKKYLNSIKNWR	154
TR3P152	HSDAVFTDNYTRLRKQMAAKKYLNSIKNYR	155
rR3P153	HS DAV FT DN YT RLRKQMAAKKYLNSIKNKA	156
rR3P155	HSDAVFTDNYTRLRKQMAAKKYLNSIKNKD	157
rR3P156	HSDAVFTDNYTRLRKQMAAKKYLNSIKNKE	158
TR3PI57	H SDAV FT DN YTRLRKQMAAKKYLN SIKN KF	159
rR3P158	H S DAV FT DNY T RLRKQMAAKKYLNSIKN KG	160
rR3P159	HSDAVFTDNYTRLRKQMAAKKYLNSIKNKH	161
rR3P.l 60	HSDAVFTDNYTRLRKQMAAKKYLNSIKNKI	162
rR3P161	HSDAVFTDNYTRLRKQMAAKKYLNSIKNKK	163
rR3P162	HSDAVFTDNYTRLRKQMAAKKYLNSIKNKL	164
TR3P163	HSDAVFTDNYTRLRKQMAAKKYLNSIKNKM	165
rR3P164	H S DAV FT DN YTRLRKQMAAKKYLN SIKN KN	166
1-R3PL65	H S DAV FT DN Y TR l, RKQMAAKKYLN SIKN KP	167
rR3P165	HSDAVFTDNYTRT.RKQMAAKKYLNSIKNKQ	168
rR3P167	HSDAVFTDNYTRLRKQMAAKKYLNSIKNKS	169
TR3P168	HSDAVFTDNYTRLRKQMAAKKYLNSIKNKT	170
rR3P169	H S DAV FT DN YT RLRKQMAAKKYLN SIKN KV	171
rR3P170	H S DAV FT D N YT RLRKQMAAKKYLN SIKNKW	172
rR3P171	H S DAV FT DN Y TRL RKQMAAKKYLNSIKN KY	173
R3P172	HSDAVFTDNYTRLRKQVAAKKYLQSIKNKRYSWCEPGWCR	174
R3P173	HSDAVFTDDYTRLRKEVAAKKYLESIKDKRY	175
PAC1	ESDGIFTDSYSRYRKQMAVKKYLAAVL-NHí	176
PAC2	HKDGIFTDSYSRYRKQMAVKKYLAAVL-NH2	177
PAC3	HSKGIFTDSYSRYRKQMAVKKYLAAVL-NH2	178
PAC4	HSDKIFTDSYSRYRKQMAVKKYLAAVL-NH2	179
PAC5	HSDGKFTDSYSRYRKQMAVKKYLAAVL-NH2	180
PAC6	HS DGIKT DS Y S R Y RKQMAVKK YLAAVL - NH?	181
PAC7	HSDGIFKDSYSRYRKQMAVKKYLAAVL-NH2	182
PAC8	HS DG IFTKSY S R Y R KQM A VK K Y LAAVL - N H 2	183
PAC9	HSDGIFTDKYSRYRKQMAVKKYLAAVL-NH2	184

-25 CZ 296858 B6

Tabulka 1 - pokračování

PAC10	HSDGIFTDSKSRYRKQMAVKKYLAAVL-NH2	185
PACH	HSDGIFTDSYKRYRKQMAVKKYLAAVL-NH2	186
PAC12	HSDGIFTDSYSEYRKQMAVKKYLAAVL-NH2	187
PAC13	HSDGIFTDSYSRKRKQMAVKKYLAAVL-NH2	188
PAC14	HSDGIFTDSYSRYEKQMAVKKYLAAVL-NH2	189
PAC15	HSDGIFTDSYSRYREQMAVKKYLAAVL-NH?	190
PAC16	hsdgiftdsysryrkkmavkkylaavl-nh2	191
PAC17	HSDGIFTDSYSRYRKQKAVKKYLAAVL-NH2	192
PA.C18	HSDGIFTDSYSRYRKQMKVKKYLAAVL-NHj	193
PAC19	HSDGIFTDSYSRYRKQMAKKKYLAAVL-NHj	194
PAC20	HSDGIFTDSYSRYRKQMAVEKYLAAVL-NH2	195
PAC21	HSDGIFTDSYSRYRKQMAVKEYLAAVL-NH2	196
PAC22	HSDGIFTDSYSRYRKQMAVKKKLAAVL-NHs	197
PAC23	HSDGIFTDSYSRYRKQMAVKKY KAAVL-N H2	198
PAC24	HSDGIFTDSYSRYRKQMAVKKYLKAVL-NHz	199
PAC25	HSDGIFTDSYSRYRKQMAVKKYLAKVL-NH2	200
PAC2 6	HSDGIFTDSYSRYRKQMAVKKYLAAKL-NH2	201
PAC27	HSDGIFTDSYSRYRKQMAVKKYLAAVK-NH2	202
rR3P174	HSDAVFTDNYTRLRKQMAAKKYLNSIKNRI	322
rR3P175	HSDAVFTDNYTRLRKQMAGKKYLNSIKNRI	323
rR3P17 6	H S DAV FT DNYTRLRKQMAKKKYLNSIKN RI	324
rR3P177	HSDAVFTDNYTRLRKQMARKKYLNSIKNRI	325
rR3P178	HSDAVFTDNYTRLRKQMASKKYLNSIKNRI	326
rR3P179	HSDAVFTDNYTRLRKQMAAKKYLNSIPNRI	327
rR3P180	HSDAVFTDNYTRLRKQMAGKKYLNSIPNRI	328
rR3P181	HSDAVFTDNYTRLRKQMAKKKYLNSIPNRI	329
rR3P182	HSDAVFTDNYTRLRKQMARKKYLNSIPNRI	330
rR3P183	HSDAVFTDNYTRLRKQMASKKYLNSIPNRI	331
rR3P184	HSDAVFTDNYTRLRKQMAAKKYLNSIQNRI	332
rR3P185	HSDAVFTDNYTRLRKQMAGKKYLNSIQNRI	333
rR3P186	HSDAVFTDNYTRLRKQMAKKKYLNSIQNRI	334
rR3P187	HSDAVFTDNYTRLRKQMARKKYLNSIQNRI	335
rR3P188	HSDAVFTDNYTRLRKQMASKKYLNSIQNRI	336
rR3P189	HSDAVFTDNYTRLRKQMAAKKYLNSIRNRI	337
rR3P190	HSDAVFTDNYTRLRKQMAGKKYLNSIRNRI	338
rR3P191	HSDAVFTDNYTRLRKQMAKKKYLNSIRNRI	339
TR3P192	HSDAVFTDNYTRLRKQMARKKYLNSIRNRI	340
rR3P193	HSDAVFTDNYIRLRKQMASKKYLNSIRNRI	341

Příklad 8

Sekrece inzulínu ostrůvky u krys ío Peptid R3P3 (0,1 nM až 100 mM) stimuluje glukózo-dependentní sekreci inzulínu z izolovaných ostrůvků u krys. Tyto studie porovnávají účiny R3P3 peptidu a GLP-1 na buňkách ostrůvků.

Ostrůvky krys se podle příkladu 1 izolovaly a ošetřily GLP-1 nebo R3P3 buď při 3 mM, nebo 8 mM glukózy v médiu. Jak ukazují obr. 4A a 4B, peptid R3P3 významně zesiluje uvolnění

-26CZ 296858 B6 inzulínu z ostrůvků způsobem dependentním na koncentraci a tento účinek je podobný účinku GLP-1, což je známé činidlo stimulující produkci inzulínu.

Příklad 9

In vivo inzulínová a glukózová odezva

Jak ukazují níže uvedené tabulky 2 a 3, polypeptidy, které aktivují R3 receptor, rovněž vyvolávají glukózou indukované zvýšení hladiny inzulínu v plazmě, v porovnání se samotnou glukózou. Toto zvýšení inzulínu způsobí současné snížení glukózy v plazmě.

V souladu s protokolem zvýše uvedeného příkladu 2 se krysy Wistar, které se nechaly přes noc o hladu, znecitlivěly pentobaritálem; načež se jim i.v. injikovala glukóza ± peptid a po 1 min se odebrala krev z oka. N=12 krys/supina. Graf na obr. 5 ukazuje, že polypeptid R3P3 způsobuje vyšší odstranění glukózy, které je dopravováno zvýšením sekrece inzulínu. Peptid nebo vehikulum se podaly i.v. a následně se i.p., v souladu s příkladem 3, zvýšila hladina glukózy. Hladina glukózy v plazmě se sledovala po naznačenou časovou periodu. Jak ukazuje graf, R3P3 výrazně urychluje odstranění glukózy z krve.

Příklad 10

Průjmové vedlejší účinky

Jak uvádí protokol ve výše uvedeném příkladu 4, krysy, které se nechaly hladovět, se injikovaly s.c. naznačeným peptidem (5 nmol/kg nebo 22 nmol/kg až 24 nmol/kg). Pět minut po injekci, se p.o. aplikovalo 0,3 ml vody. Pět minut po aplikaci vody se zvířata znecitlivěla a určil se obsah vody v tenkém střevě. Jak znázorňuje obr. 6, VIP injekce aplikované ve dvou dávkách způsobily významné zvýšení obsahu vody v tenkém střevu oproti kontrolnímu vehikulu (solný roztok). Při nej vyšší dávce způsobily R3 peptidy pouze velmi malé zvýšení obsahu vody (tj. zhruba 10%) v porovnání s VIP. Při dávce 5 nmol/kg peptidy nezpůsobily žádnou změnu, pokud jde o obsah vody v tenkém střevu. Stupeň zadržení vody se použil jako index R2 aktivity zn vivo.

Příklad 11

Vliv peptidů na intraperitoneální glukózovou toleranci u krys

Krysy Wistar se nechaly přes noc hladovět a následně znecitlivěly pentobartibálem. Krysám se odebrala krev z oka (čas nula) a subkutánně se injikoval peptid (v 1% roztoku lidského albuminu). O 5 min později se intraperitoneálně injikoval 1 g/kg glukózy (v solném roztoku) a po 30 min se krysám odebral vzorek krve z oka. Hladina glukózy v plazmě se určila za použití autoanalyzéru Axon a výsledky jsou shrnuty v obr. 7.

Obr. 7 ukazuje, že 30 min po IPGTT (testu IP glukózové tolerance) se hladina glukózy v plazmě zvýšila na 160 mg/dl, zatímco krysy otevřené vehikuly dosahovaly bazální hodnoty lOOmg/dl. U krys, kterým se injikovaly peptidy R3P3, R3P12 a R3P13, bylo toto zvýšení plazmové glukózy značně zredukováno, čímž se ověřila jejich schopnost produkovat inzulín. Při s.c. dávce 1 nmol/kg byl vliv každého peptidu, ve smyslu snižování obsahu glukózy, podobný jako v případě ekvivalentní dávce GLP-1.

-27CZ 296858 B6

Příklad 12

Polypeptidy vylučující inzulín glukózo-dependentním způsobem

Tabulka 2 obsahuje seznam peptidů, které stimulují uvolňování inzulínu in vivo vIPGTT testu nebo in vitro při testu ostrůvků krys. Jak ukazují výsledky, peptidy zvyšují glukózou mediované uvolnění inzulínu in vivo i in vitro.

Plazmový inzulín: výsledky jsou vyjádřeny jako % plazmového inzulínu 1 min o IVGTT (0,4 g/kg glukózy) buď se solným roztokem, nebo 0,1 nmol/kg P51, P55, P60, P66 nebo 1 nmol/kg dalších peptidů v těle krys Wistar. Krev se odebrala z oka a hodnoty inzulínu se měřily pomocí „rat insulinu RIA“ kitu (Lineo Research, lne., St. Charles, MO).

Plazmová glukóza: výsledky jsou vyjádřeny jako % vehikula plochy plazmové glukózy pod křivkou po IPGTT (1 g/kg glukózy) po ošetření 1 nmol/kg peptidů. V minulosti bylo zaznamenáno, že PACAP27 indukuje sekreci inzulínu, ale neovlivňuje hladinu glukózy v plazmě (Filipsson K. a kol., J. Clin. Endocrin. & Metabolism 82:3093-3098 (1997)). Nyní se poprvé ukázalo, že tato skutečnost je způsobena vzájemně se rušícím vlivem R2 a R3 na glukózu. R2-Selektivní agonista [K15, R16, L27]VIP(l-7)/GRF(8-27) (Gourlet P. a kol. Peptides 18:1539-45 (1997)), definovaný jako R2P1, zvyšuje hladinu plazmové glukózy o 14 %, zatímco R3-selektivní agonisty snižují hladinu plazmové glukózy přibližně o 20 %. Zdá se tedy, že objevení R3-selektivity je významným atributem pro léčiva určená pro dosažení redukce glukózy v krvi a současně pro léčbu diabetů typu 2.

Uvolnění inzulínu z ostrůvků: ostrůvky se izolovaly z těla krys Sprague-Dawley způsobem popsaným v příkladu 1 a po dobu 2 h se ošetřovaly vehikulem nebo specifikovaným peptidem (10 nM). Koncentrace inzulínu v médiu se měřila pomocí kitu „Lineo rat insulin RIA“. Koncentrace glukózy v médiu dosahovala 8 mM. Výsledky jsou vyjádřeny jako % [inzulínu] v 8 mM samotné glukóze. Při 3mM koncentraci glukózy nebylo pozorováno žádné polypeptidem indukované zvýšení koncentrace inzulínu, takže je patrné, že schopnost těchto polypeptidů uvolňovat inzulín je glukózo-dependentní.

-28CZ 296858 B6

Tabulka 2

Peptid	Plazmový	Plazmová	Uvolnění inzulínu z
inzulín		glukóza	ostrůvků
	(% bazální)		; bazální)	(% bazální)
PACAP 27	320			186
R2P1	216	114
R3P0		77		264
R3P1	480	73		250
R3P3	361	77	72	275
R3P9				221
R3P10				174
R3P12	302		76	324
R3P13	465		77	170
R3P19	285
R3P36	255	73	78
P51	259
P55	208
P60	283
R3P66	388		82	184

R3P77 388

R3P80 360

R3P81 302

Příklad 13

Farmaceutická kom pozice - IV. Formulace

Sterilní injekční formulace se vyrobila ze 4 mg polypeptidů SEQ ID NO: 72 a 1 litru sterilního solného roztoku za použití v daném oboru známého výrobního způsobu.

Příklad 14

Farmaceutická kompozice - TV. Formulace

Sterilní injekční formulace se vyrobila ze 400 mg polypeptidů SEQ ID NO: 174 a 1 litru sterilního solného roztoku za použití v daném oboru známého výrobního způsobu.

Příklad 15

Vliv PACAP27, VIP a PACAP receptorově selektivních peptidových agonistů na tepovou frekvenci u psů u bezvědomí

Protokol:

Psi plemene bígl se uvázali na řemen a trénovali na 3 h stání. Okolo ocasů psů se umístila manžeta monitoru tepové frekvence.

Do cefalické žíly se injikoval solný roztok a tepová frekvence se monitorovala každé 2 min, ve snaze stanovit základní linii. Po 10 min se injikoval peptid a následujících 20 min se každé 2 min

-29CZ 296858 B6 monitorovala tepová frekvence. Pokud byla po tuto dobu tepová frekvence normální, potom se aplikovala vyšší dávka a tepová frekvence se monitorovala dalších 20 min. Plocha po křivkou (AUC) prvních 10 min změny tepové frekvence indukované polypeptidem byla vynesena do grafu v %, vztaženo k AUC vehikula, proti koncentraci polypeptidů. PACAP27 a Rl-Selektivní agonista maxadilan (moro O., J. Biol. Chem. 272:966-970 (1997)) vykazují podobnou potenci, ve smyslu zvyšování tepové frekvence. Peptid VIP, který aktivuje R2 i R3, ale nikoliv Rl, R2-selektivní agonista R2P1 a R3-selektivní agonisté R3PI, R3P3, R3P19, R3P36, R3P51 aR3P53 mají alespoň lOx nižší účinnost než PACAP27 nebo maxidilan. Kardiovaskulární účinky PACAP27 může tedy významně přispívat kPACAP-Rl aktivaci. Všechny peptidy jsou úplnými agonisty na svých příslušných receptorech se srovnatelnou afinitou. R3PO Odpovídá Roche analogu RO 25-1553, který, jak se ukázalo, vykazuje alespoň lOOx vyšší selektivitu pro PACAP-R3 než pro Rl a R2 (Gourlet a kol., Peptides 18:4030408 (1997)).

Příklad 16

Cyklické AMP SPA

CHO Buňky exprimují PACAP R3 se umístily do 96jamkových ploten (Costar) v koncentraci 8x 10⁴ buněk/jamka a nechaly růst 24 h při 37 °C v α MEM+nukleosidy+glutamin (Gibco BRL), 10% FBS, 100 pg/ml Pen/Strep, 0,3 mg/ml glutaminu, 1 mM HEPES, 0,5 mg/ml Geneticinu (Gibco BRL). Médium se odstranilo a plotny se propláchly PBS. Buňky se inkubovaly 15 min při 37 °C peptidem v Hepes-PBS-BSA s 0,4 mg/ml trypsinového inhibitoru ze sójových bobů, 0,5 mg/ml Bacitracinu, 100 μΜ IBMX. Cyklický AMP v buněčných extraktech se kvantifikoval za použití cAMP SPA přímého screeningového analytického systému (Amersham Pharmacia Biotech lne., Piscataway, NJ). Peptidy uvedené v tabulce 3 byly testovány na cAMP aktivitu.

Tabulka 3 uvádí in vitro cAMP SPA výsledky na CHO buňkách transfektovaných pomocí PACAP-R2 nebo PACAP-R3. EC50 Je definováno jako koncentrace polypeptidů, při které se dosáhne 50 % maximální PACAP27 aktivity. „NA“ označuje nedetekovatelné aktivity. „R3 Selektivita“ je odvozena poměru EC50 na R2 ku EC50 na R3. Většina následujících polypeptidů je navržena na bázi VIP, který vykazoval nedostatečnou aktivitu na Rl (Vaudry D. a kol., 2000, Pharmacological Reviews, 52:269-324). Dá se tedy předpokládat, že tyto polypeptidy nebudou vykazovat výraznější aktivitu na Rl. Peptidy navržené na bázi VIP zahrnují SEQ ID NO: 6 až 53, 62 až 65 a 70 až 175.

-30CZ 296858 B6

Tabulka 3

Peptid	SEQ ID NO	R2 EC50, nM	R3 EC50, nM	R3 Selektivita
VIP	1	0,1	0,08	1,3
R3P0	5	>100	0,4	>250
R3P1	6	>100	2	>50
R3P2	7	>1000	3	>300
R3P3	8	100	0,75	130
R3P5	10	200	7	30
R3P8	11	2	1,4	1,5
R3P9	12	40	2	20
R3P10	13	3	11	0,3
R3P11	14	10	3	3
R3P12	15	>100	0,5	>200
R3P13	16	163	5	33
R3P14	17	50	17	3
R3P19	18	42	1,4	30
R3P20	19	330	1,4	230
R3P21	20	17	0, 3	60
R3P22	21	38	1,6	24
R3P24	22	45	1,3	34
R3P25	23	15	0,7	20
R3P26	24	>100	0,55	>180
R3P29	25	>100	0, 5	>200
R3P30	26	20	0,4	50
R3P31	27	>100	0,3	>300
R3P32	28	84	0,4	200
R3P33	29	>100	0, 5	>200
R3P34	30	>100	1,4	>70
R3P35	31	>100	2,6	>40
R3P36	32	>90	0,4	>200
R3P41	33	8	0, 08	100
R3P42	34	0,3	0,03	10
R3P43	35	0, 8	0, 08	10
R3P44	36	8	1,3	6
R3P45	37	NA	NA
R3P46	38	0,4	0,06	7
R3P47	39	0,7	0,12	6
R3P48	40	1	0,13	8
R3P49	41	8	0,27	30
R3P50	42	0,7	0,13	6
R3P51	43	23	0,26	90
R3P52	44	>100	0,4	>250
R3P53	45	500	0,2	2500
R3P54	46	>100	0,5	>200
R3P55	47	50	0,17	280
R3P56	48	40	0,4	100
R3P57	49	42	0,23	190
R3P58	50	55	0,32	170

-31 CZ 296858 B6

Tabulka 3 - pokračování

R3P59	51	10	0,15	70
R3P60	52	120	1	120
R3P61	53	110	0,8	140
R3P6	57	220	80	3
R3P7	58	2	4	0,5
R3P15	59	12	5	2
R3P16	60	14	10	1,4
R3P17	61	9	4	2
R3P18	62	NA	NA
R3P23	63	10	0,43	23
R3P27	64	6,4	0,8	8
R3P28	65	8	7	1
R3P37	66	71	4	18
R3P38	67	17	2,3	7
R3P39	68	1	0,5	2
R3P40	69	1,4	0,7	2
R3P62	70	180	1,8	100
R3P65	71	80	0, 6	130
R3P66	72	100	0,4	250
R3P67	73	100	0,3	330
R3P68	74	130	0, 5	260
R3P69	75	90	0,5	190
R3P70	76	>100	0,4	>250
R3P71	77	56	0,09	660
R3P72	78	>100	0,16	>600
R3P73	79	50	0, 3	170
R3P74	80	90	0, 6	150
R3P75	81	>150	0, 3	>500
R3P76	82	>150	0,1	>1500
R3P77	83	200	0,4	500
R3P78	84	250	1,1	230
R3P79	85	100	0, 5	200
R3P80	86	88	0, 44	200
R3P81	87	50	0, 5	100
R3P82	88	10	0,4	23
R3P83	89	5	0, 08	60
R3P84	90	2,5	0,06	40
R3P85	91	5	0, 18	30
R3P86	92	90	0,8	110
R3P87	93	0,6	0,2	3
R3P88	94	0,9	0,08	12
R3P89	95	0,9	0,06	15
R3P92	98	2	0,02	100
R3P93	98	6	0,14	40
R3P94	99	9	0, 09	100
R3P98	101	NA	NA
R3P99	102	40	1,0	40
R3P100	103	10	0,3	30
R3P101	104	400	1,0	400

-32CZ 296858 B6

Tabulka 3 - pokračování

R3P102	105	300	60, 0	5
R3P103	106	0,4	0,05	8
R3P104	107	100	0,2	500
R3P105	108	1	0,3	3
R3P106	109	2	0,1	20
R3P107	110	1000	200,0	5
R3P108	111	1000	300, 0	3
R3P109	112	1000	10,0	100
R3P110	113	100	0,5	200
R3P111	114	1000	3,0	300
R3P112	115	4	0,1	40
R3P113	116	3	0, 3	10
R3P114	117	20	2,0	10
R3P115	118	300	6,0	50
R3P116	119	20	1,0	20
R3P118	121	15	0,5	30
R3P119	122	15	0, 5	30
R3P120	123	10	0,2	50
R3P121	124	50	1,0	50
R3P122	125	10	0,2	50
R3P123	126	5	0,1	50
R3P124	127	3	0,2	15
R3P125	128	60	2,0	30
R3P126	129	200	1,0	200
R3P127	130	300	0,5	600
R3P128	131	60	0,3	200
R3P129	132	50	1,0	50
R3P130	133	40	1,0	40
R3P131	134	20	0, 3	70
R3P132	135	10	0,2	50
R3P133	136	8	0,1	80
R3P134	137	40	0,4	100
R3P136	139	20	0,3	70
R3P137	140	30	0, 3	100
R3P139	142	20	0,4	50
R3P140	143	15	0,3	50
R3P141	144	20	0,2	100
R3P142	145	6	0,2	30
R3P143	146	6	0,2	30
R3P144	147	300	3,0	100
R3P145	148	50	0, 5	100
R3P146	149	30	0, 3	100
R3P147	150	100	0,2	500
R3P148	151	30	0,3	100
R3P149	152	40	0, 5	80
R3P150	153	40	0, 8	50
R3P153	156	40	0,2	200
R3P155	157	40	0,4	100
R3P156	158	100	1,0	100

-33CZ 296858 B6

Tabulka 3 - pokračování

R3P157	159	50	0, 3	170
R3P158	160	6	0, 07	90
R3P159	161	200	0, 5	400
R3P160	162	100	0,2	500
R3P161	163	60	0,2	300
R3P162	164	20	0,1	200
R3P163	165	40	0,2	200
R3P164	166	100	0, 3	300
R3P165	167	150	0,5	300
R3P166	168	50	0,1	500
R3P167	169	300	1,0	300
R3P168	170	60	0, 2	300
R3P169	171	60	0, 2	300
R3P170	172	20	0,1	200
R3P171	173	80	0,4	200
R3P172	174	77	2,6	29
R3P173	175	NA	200
PAC1	176	970	10	97
PAC2	177	NA	34
PAC 3	178	NA	NA
PAC4	179	45	7	6
PAC 5	180	1,8	0,7	2
PAC 6	181	NA	NA
PAC 7	182	NA	NA
PAC 8	183	43	47	1
PAC 9	184	0,9	0,7	1
PAC 10	185	110	27	4
PACH	186	10	140	0,1
PAC12	187	150	3	50
PAC 13	188	3	0, 5	6
PAC 14	189	110	1,6	70
PAC 15	190	2,4	0, 2	12
PAC 16	191	0,2	0,2	1
PAC 17	192	0,25	0,15	1,5
PAC 18	193	0,7	1, 1	0,7
PAC 1 9	194	8	0,4	20
PAC 2 0	195	20	0,7	30
PAC 21	196	2,5	0,24	10
PAC 2 2	197	2	15	0,1
PAC2 3	198	170	13	13
PAC2 4	199	0, 3	0,2	1,5
PAC 2 5	200	0,13	0,04	3
PAC 2 6	201	0,25	0,3	1
PAC2 7	202	1,5	1,1	1,4
rR3P174	322	18	0,20	90
rR3P175	323	400	2,2	180
rR3P176	324	300	2,0	150
rR3P177	325	110	1,6	70
rR3P178	326	80	0,75	110

-34CZ 296858 B6

Tabulka 3 - pokračování

rR3P179	327	230	1,5	150
rR3P180	328	>100	6,7	>20
rR3P181	329	280	5,1	50
rR3P182	330	280	3,2	90
rR3P183	331	>150	5,4	>30
rR3P184	332	10	0, 37	30
rR3P185	333	180	4,5	40
rR3P186	334	70	1,6	44
rR3P187	335	>130	1,6	>80
rR3P188	336	150	2,2	70
rR3P189	337	1,3	0,04	30
rR3P190	338	220	2,2	100
rR3P191	339	>200	2,7	>80
rR3P192	340	40	0,60	60
rR3P193	341	200	1,9	110

Příklad 17

Výroba polyklonální látky

Syntéza peptidu Ac-CRKQVAAKKYLQSIKNKRY COOH se provedla na peptidovém syntetizátoru Applied Biosystems 430A z použití fmoc chemie s HBTU aktivací aminokyselin, peptid se štěpil za použití štěpného koktejlu tvořeného 84,6 % TFA, 4,4% fenolu, 4,4 % vody, 4,4 % thioanizolu a 2,2 %> ethandithiolu. Surový peptid se purifíkoval na Cl8 koloně s reverzní fází a jako eluent se použil 0,1% TFA/CH₂CN gradient. Hodnocení čistoty se provádělo na hmotovém spektrometru PerSeptive V Biosystems Voyager DE Pro MALDI. Cysteinový zbytek se navázal na KLH za použití kitu „Pierce Imject Maleimide Activated mcKLH“ a přiloženého produktu (Pierce, Rockford, IL). Králíci se imunizovali za použití následujícího schématu imunizace polyklonálním antisérem:

den 0 - odběr 10 ml krve pro stanovení základní hodnoty séra, 250 pg každého peptidu v 1 ml emulze kompletního Freundsova adjuvansu, 0,1 ml/místo x 10 míst subkutánně;

den 14 - zesílení 250 pg každého peptidu v místo x 10 míst subkutánně;

ml emulze nekompletního Freundova adjuvansu den 21 - odběr 35 m krve;

den 35 - zesílení 250 pg každého peptidu v místo x 10 míst subkutánně;

ml emulze nekompletního Freundsova adjuvansu den 42 - odběr 35 ml krve;

den 56 - zesílení 250 pg každého peptidu v místo x 10 míst subkutánně;

ml emulze nekompletního Freundsova adjuvansu den 63 - odběr 35 ml krve;

den 77 - zesílení 250 pg každého peptidu v místo x 10 míst subkutánně;

ml emulze nekompletního Freundsova adjuvansu

-35CZ 296858 B6 den 84 - konečný odběr.

Protilátky se charakterizovaly pomocí následujícího protokolu:

Plotna Immulon III (DYNATECH Laboratories, INC, Chantilly, Virginia) se 3 h při pokojové teplotě (dále jen RT) potáhla PE66 peptidem (rozmezí 0,3 ng až 100 ng) ve 100 μΐ EIA potahového pufru (1,6 1 0,lM NaHCO₃ + 0,4 1 0,lM Na₂CO₃, pH 9,5). Plotna se 1 h blotovala 100 μΐ 5% mléčného TBS Tween 20 (lOmM tris pH 8,0, 150mM NaCl, 0,05% Tween-20 (SIGMA P1379)) při RT a 3x propláchla TBS Tween. Protilátka P3P66 se na 2 h při RT přidala do jamky v 100 μΐ 5% bloto (TBS-Tween 20 + 5% mléko) a následně propláchla TBS Tween (průplach se 5x zopakoval). Druhá protilátka (BioRad kozí anti králičí alkalických fosfatázový konjugát) se přidala do jamky při naředění 1:1000 ve 100 μΐ 5% bláto a zde ponechala 1 h. Plotna se 5x propláchla TBS Tween, μ-nitrofenylfosfátem (SIGMA 104-105), 0,5 mg/ml substrátového pufřu (1 M diethanolaminu, 0,5 μΜ MgCl₂.6H₂O, pH 9,8 voda/HCl) ve 100 μΐ a inkubovala 1 h při RT na O/N. Odečet plotny se provedl při OD 405 v SPECTRAmax 250 (Molecular Devices Corporation, Sunnyvale, CA).

Ve snaze určit, zda protilátky produkované v těle králíků proti peptidu Ac-CRKQVAAKKYLQSIKNKRY COOH podle příkladu 17 rozpoznají peptid R3P66 (SEQ ID NO: 72), se provedl test ELISA (enzyme-linked immunoadsorbent assay). V případě, že protilátky rozpoznávají peptid, dojde při OD405 k detekci signálu. Obr. 10 ukazuje, že tyto protilátky rozpoznají R3P66, ale nereagují s homologickými peptidy PACAP-27 nebo VIP až do koncentrace peptidu 30 pg.

Příklad 18

Přecitlivělost dýchacích cest u modelu akutního astmatu primáta

Pro tuto studii se použili samečci opic rodu cynomolgus (Macaca foscicularis), jejichž prostředí se ponechalo v podmínkách konstantní teploty a vlhkosti a při 12h světelném cyklu. Strava jim byla podávána 2x denně s výjimkou dne experimentu, kdy jim noc před experimentem byla strava pozastavena. Po celou dobu měli k dispozici vodu dle potřeby.

Základní hodnota přecitlivělosti dýchacích cest (AHR) se měřila 1 týden před kontrolní (žádné ošetření) antigenovou provokací a znovu 24 h po antigenové provokaci. Přecitlivělost dýchacích cest indukovaná antigenem se měřila jako pokles PCioo (koncentrace methacholinu potřebná pro 100% zvýšení rezistence plic) po 24 h, v porovnání se základní hodnotou. Po 2 týdnech odpočinku se provedlo další stanovení základní hodnoty AHR. O 1 týden později se 10 min před antigenovou provokací podaly opicím peptidy podle vynálezu ve formě aerosolu. Po 24 h se opět změřila hodnota AHR a pokles PCioo byl v tomto případě srovnatelný s předchozím případem, kdy nebylo provedeno žádné ošetření.

Experimentální postup: každý den, kdy probíhal experiment, se zvířata ve svých klecích znecitlivěla směsí ketaminu a cylazinu (70:12 mg.kg¹ při 0,1 ml.kg'¹). V bezvědomí se zvířata přenesla do laboratoře pro primáty, kde se umístila do polohy v leže na zádech na vyhřívané vodní podušky na vozíčku. Do každého oka se vetřela oční mast a do hrdla a zadní části hrdla se vstříklo 0,2 ml lidocainu (2%). Čelisti se udržovaly od sebe pomocí čelistní rozpěrky a pomocí laringoskopu se do hrdla zvířat zavedla 5,0 měřící endotracheální trubice (jejíž konec byl dostatečně obalen xylocainem gelem, 2%). Zvíře se následně umístilo do speciálně navrženého zádržného křesla, takže bylo mírně nakloněno, ale ve vzpřímené sedící poloze a přidržováno pouze límcem kolem krku. Vodou vyhřívaná podložka obklopovala zvíře.

-36CZ 296858 B6

Endotracheální trubice se připojila k ventilátoru Harvard nastaveném na dopravu 30 až 35 vdechů za minutu. Průtok vzduchu se měřil pomocí pneumotachografu Fleisch a hrudní tlak se měřil pomocí validynového tlakového transduceru (jako rozdíl mezi tlakem na vzdáleném konci endotracheální trubice a okolním tlakem).

Pneumotachograf a validyn se připojily k předzesilovaěi a následně MI² respiraěnímu analyzátoru. na základě primárních signálů průtoku a tlaku analyzátor vypočetl rezistenci a komplienci dýchacích cest (a stejně tak celou řadu dalších respiračních parametrů). Účelem počátečního 5min až 6min měření bylo zajištění stability signálů a toho, že hodnoty rezistence a komplience budou ležet mezi rozpoznanými limitami.

Antigenová provokace: jednalo se o inhalační provokaci pomocí Ascaris suum. Dodaný extrakt Ascaris suum se lOx naředil PBS a poskytl 1000 pg/ml roztoku. Aerosil byl dopravován pomocí tlakově hnaného nebulizéru Rainbow drop (Puritan-Bennett) připojeného k respirátoru Bird mark 7A, který byl nastaven na dopravu 15 vdechů za minutu. Do těla zvíře se vpravilo 30 vdechů antigenu, načež se 15 min monitorovala akutní bronchokostrikce.

Po ukončení provokace se zvířata odpojila od ventilátoru a, pokud dýchala sama, potom se uvolnila za záchytného křesla a položila v poloze na zádech na vozík. Jakmile se navrátily normální reflexy (mrkání očí, polykání) společně se svalovým napětím v končetinách, vrátila se zvířata zpět do svých klecí.

Podání peptidů: hodnocené peptidy se podávaly do těla zvířat výše popsaným inhalačním způsobem. Zásobní roztoky peptidů se naředily sterilní vodou do dosažení koncentrace 0,5 pg/4 μΐ. Při předchozích měřeních se ukázalo, že nebulizér dopraví 4 μΐ/vdech a počet vdechů dodaných každému zvířeti se nastavil tak, že nebulizér dodal zvířeti správnou finální koncentraci. Jednotlivé peptidy měly následující finální koncentrace:

R3P0 (SEQ ID NO:5) - 0,6 pg/kg

R3P76 (SEQ ID NO:82) - 3 pg/kg

R3P82 (SEQ ID NO:88) - 1,8 pg/kg

Methacholinová provokace: pro stanovení přecitlivělosti dýchacích cest se zjistily křivky závislosti odezvy na methacholinové dávce. Měření na akutním modelu se provedla po 24 h a porovnala s citlivostí 7 dní před ošetřením. Aerosol fosfátem pufrovaného solného roztoku (PBS) se dopravoval pomocí nebulizéru výše popsaným způsobem. Po aplikaci 15 vdechů aerosolu se 10 min monitorovala plicní rezistence. Methacholin (Sigma) byl vyroben v koncentraci 100 mg/ml v PBS a tento zásobní roztok se ředil PBS do finálního rozmezí koncentrací 0,1 mg/ml až 100 mg/ml. Po podání methacholinu (0,1 mg/ml, 15 vdechů) se provedlo další lOmin monitorování. Následné dávky methacholinu se vždy o půl logaritmu dávky zvýšily v každém kroku až do okamžiku zdvojnásobení plicní rezistence nebo do okamžiku, kdy maximální podaná dávka methacholinu dosáhla 100 mg/ml. Za základní hodnotu (0%) rezistence se vzala rezistence dosažená po podání PBS. Zvýšení plicní rezistence (%) a methacholinové dávky se vynesly do grafu, ze kterého se následně vypočetla hodnota PCioo (dávka methacholinu způsobující 100% zvýšení rezistence). Tyto hodnoty se převedly na hodnoty log_l0. Delta PCioo (hodnota po 24 h základní hodnota) v případě testu se porovnala s kontrolním případem.

Tabulka 4 ukazuje PC_IOo hodnoty pro tři peptidy. Jak vyplývá z těchto hodnot, tyto peptidy jsou účinné proti přecitlivělosti dýchacích cest indukované antigenem, a jsou tedy pravděpodobně účinné při léčbě astmatu.

-37CZ 296858 B6

Tabulka 4: PCioo hodnoty pro všechny tři peptidové studie

Peptid (dávka)

R3P0 (0,6 Rg/mg) R3P76 (3,0 pg/kq) R3P82(1,8 pg/kq)

Kontrola Ošetření Kontrola Ošetřeni

Kontrola Ošetření

Delta log10PCioo
N	4 4
Průměr*	-0,325 -0,150
SD	0,177 0,152
P (ošetřeni vs kontrola)	0,240
% Inhibice indukované AHR**	54

5	5	4	4
-0,468	+0,047	-0,567	-0,067
0,128	0,253	0,361	0,329
0,031	0,087
100	88

* čím zápornější hodnota, tím přecitlivějším se zvíře stává ** AHR = přecitlivělost dýchacích cest

Claims (35)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Polypeptid zvolený z množiny sestávající z polypeptidů se sekvencí SEQ ID NO: 11 až 14, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 21 až 26, SEQ ID NO: 32 až 36, SEQ ID NO: 40 až 53, SEQ ID NO: 57 až 61, SEQ ID NO: 63 až 99, SEQ ID NO: 102 až 119, SEQ ID NO: 121 až 137, SEQ ID NO: 139 až 177, SEQ ID NO: 179, 180, SEQ ID NO: 183 až 202, 322 až 341, přičemž polypeptid se zvolí ze selektivního agonisty PACAP R3, kdy má polypeptid selektivitu pro R3 a selektivita polypeptidů pro R3 je větší než R3 selektivita SEQ ID NO: 5 nebo SEQ ID NO: 9.
2. 2. Polypeptid podle nároku 1, který je reprezentován SEQ ID NO: 18.
3. 3. Polypeptid podle nároku 1, který je reprezentován SEQ ED NO: 32.
4. 4. Polypeptid podle nároku 1, který je reprezentován SEQ ID NO: 43.
5. 5. Polypeptid podle nároku 1, který je reprezentován SEQ ID NO: 45.
6. 6. Polypeptid podle nároku 1, který je reprezentován SEQ ED NO: 47.
7. 7. Polypeptid podle nároku 1, který je reprezentován SEQ ID NO: 50.
8. 8. Polypeptid podle nároku 1, který je reprezentován SEQ ID NO: 52.
9. 9. Polypeptid podle nároku 1, který je reprezentován SEQ ID NO: 71.

   -38CZ 296858 B6
10. 10. Polypeptid podle nároku 1, který je reprezentován SEQ ID NO:72.
11. 11. Polypeptid podle nároku 1, který je reprezentován SEQ ID NO:83.
12. 12. Polypeptid podle nároku 1, který je reprezentován SEQ ID NO:86.
13. 13. Polypeptid podle nároku 1, který je reprezentován SEQ ID NO:87.
14. 14. Polypeptid podle nároku 1, který se zvolí z množiny sestávající ze SEQ ID NO: 328, SEQ ID NO: 331, SEQ ID NO: 335 a SEQ ID NO: 339.
15. 15. Polypeptid podle nároku 1, který se zvolí z množiny sestávající ze SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 32 a SEQ ID NO: 46.
16. 16. Polypeptid podle nároku 1, který se zvolí z množiny sestávající ze SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 72, SEQ ID NO: 74 a SEQ ID NO: 76.
17. 17. Polypeptid podle nároku 1, který se zvolí z množiny sestávající ze SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 104, SEQ ID NO: 114, SEQ ID NO: 161, SEQ ID NO: 163, SEQ ID NO: 166, SEQ ID NO: 167 a SEQ ID NOs: 169 až 171.
18. 18. Polypeptid podle nároku 1, který se zvolí z množiny sestávající ze SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 83, SEQ ID NO: 107, SEQ ID NO: 130, SEQ ID NO: 150, SEQ ID NO: 162 a SEQ ID NO: 168.
19. 19. Polypeptid podle nároku 1, který je reprezentován SEQ ED NO: 82.
20. 20. Polypeptid kódující polypeptidovou sekvenci podle kteréhokoliv z nároků 1 až 19 nebo jeho degenerační varianta.
21. 21. Vektor obsahuj icí polynukleotid podle nároku 20.
22. 22. Kultura obsahující hostitelskou buňku, která obsahuje vektor podle nároku 21.
23. 23. Způsob přípravy polypeptidu, vyznačující se tím, že zahrnuje:

    a) kultivaci kultury podle nároku 22 za podmínek vhodných pro expresi uvedeného polypeptidu; a

    b) izolaci polypeptidu z kultury.
24. 24. Farmaceutický přípravek pro léčbu choroby nebo stavu, které mohou být zmírněny pomocí selektivního agonisty PACAP R3, vyznačující se tím, že obsahuje polypeptid podle kteréhokoliv z nároků 1 až 19 v kombinaci s farmaceuticky přijatelným nosičem.
25. 25. Přípravek pro genovou terapii pro léčbu choroby nebo stavu, které mohou být zmírněny pomocí selektivního agonisty PACAP R3, vyznačující se tím, že obsahuje polypeptid podle nároku 20 v kombinaci s terapeuticky účinným genovým vektorem.
26. 26. Purifikovaná protilátka, která se specificky váže na polypeptid podle kteréhokoliv z nároků 1 až 19.
27. 27. Použití polypeptidu pro přípravu léčiva pro léčení metabolické poruchy u savce, které zahrnuje podání terapeuticky účinného množství polypeptidu podle nároku 1, který se zvolí z množiny sestávající ze SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 45,

    -39CZ 296858 B6

    SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 71, SEQ ID NO: 72, SEQ ID NO: 83, SEQ ID NO: 86 a SEQ ID NO: 87.
28. 28. Varianta vasoaktivního intestinálního peptidů, kterou je polypeptid podle nároku 1, zvolený z množiny sestávající ze SEQ ID NOs: 11 až 14, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NOs: 21 až 26, SEQ ID NOs: 32 až 36, SEQ ID NOs: 40 až 53, SEQ ID NOs: 57 až 61, SEQ ID NOs: 63 až 99, SEQ ID NOs: 102 až 119, SEQ ID NOs: 121 až 137, SEQ ID NOs: 139 až 177, SEQ ID NO: 179, SEQ ID NO: 180 a SEQ ID NOs: 183 až 202.
29. 29. Použití polypeptidu pro výrobu léčiva pro stimulaci uvolňování insulinu glukózodependentním způsobem u savce, u něhož je tato stimulace potřebná, podáním polypeptidu podle nároku 1, přičemž tento polypeptid je zvolen z množiny sestávající ze SEQ ID NOs: 11 až 14, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NOs: 21 až 26, SEQ ID NOs: 32 až 36, SEQ ID NOs: 40 až 53, SEQ ID NOs: 57 až 61, SEQ ID NOs: 63 až 99, SEQ ID NOs: 102 až 119, SEQ ID NOs: 121 až 137, SEQ ID NOs: 139 až 177, SEQ ID NO: 179, SEQ ID NO: 180, a SEQ TD NOs: 183 až 202, savci.
30. 30. Použití polypeptidu pro výrobu léčiva pro léčbu respiračního onemocnění u savce, kdy se savci podává terapeuticky účinné množství polypeptidu podle kteréhokoliv z nároku 1 až 19.
31. 31. Použití polypeptidu pro výrobu léčiva pro léčbu astmatu u savce zahrnující podání terapeuticky účinného množství polypeptidu podle kteréhokoliv z nároků 1 až 19 savci.
32. 32. Použití polypeptidu pro výrobu léčiva pro léčbu přecitlivělosti dýchacích cest u savce zahrnující podání terapeuticky účinného množství polypeptidu podle kteréhokoliv z nároků 1 až 19 savci.
33. 33. Použití polypeptidu pro výrobu léčiva pro léčbu astmatu u savce zahrnující podání terapeuticky účinného množství polypeptidu podle nároku 1, který je reprezentován SEQ ID NO: 82 nebo SEQ ID NO: 88, savci.
34. 34. Použití polypeptidu pro výrobu léčiva léčbu přecitlivělosti dýchacích cest u savce zahrnující podání terapeuticky účinného množství polypeptidu podle nároku 1, který je reprezentován SEQ ID NO: 82 nebo SEQ ID NO: 88, savci.
35. 35. Použití polypeptidu pro výrobu léčiva pro léčbu respiračního onemocnění u savce zahrnující podání terapeuticky účinného množství polypeptidu podle nároku 1, který je reprezentován SEQ ID NO: 82 nebo SEQ ID NO: 88, savci.