CZ296858B6 - Agonisté receptoru 3 (R3) hypofyzárního peptidu aktivujícího adenylátcyklázu (PACAP) a jejich farmaceutické pouzití - Google Patents
Agonisté receptoru 3 (R3) hypofyzárního peptidu aktivujícího adenylátcyklázu (PACAP) a jejich farmaceutické pouzití Download PDFInfo
- Publication number
- CZ296858B6 CZ296858B6 CZ20021085A CZ20021085A CZ296858B6 CZ 296858 B6 CZ296858 B6 CZ 296858B6 CZ 20021085 A CZ20021085 A CZ 20021085A CZ 20021085 A CZ20021085 A CZ 20021085A CZ 296858 B6 CZ296858 B6 CZ 296858B6
- Authority
- CZ
- Czechia
- Prior art keywords
- seq
- polypeptide
- nos
- polypeptides
- represented
- Prior art date
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/575—Hormones
- C07K14/57563—Vasoactive intestinal peptide [VIP]; Related peptides
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
- A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Diabetes (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Obesity (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Hematology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Emergency Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Vascular Medicine (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Zoology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Resení poskytuje nové peptidy, které in vivo stimulují uvolnování inzulínu z pankreatických .beta.-bunek glukózo-dependentním zpusobem. Ukázalo se, ze tyto peptidy produkující inzulín stimulují uvolnování inzulínu v ostruvkových bunkách krysy in vitro a in vivo. Peptidy podle vynálezu nabízejí novou moznost lécby pacientum se zvýsenou endogenní sekrecí inzulínu, zejména diabetikum typu 2. Podstatou je konkrétne polypeptid zvolený ze specifické skupiny polypeptidu príbuzných VIP/PACAP nebo jejich funkcních ekvivalentu. Dále se týká zpusobu lécby metabolické poruchy u savce, který zahrnuje podání terapeuticky úcinného mnozství peptidu stimulujících uvolnování inzulínu savci. Do rozsahu rovnezspadají zpusoby výroby peptidu, a to jak rekombinantní, tak syntetické.
Description
Oblast techniky
Vynález se týká nově identifikovaných polypeptidů a použití těchto peptidů jsou terapeutické účely. Zejména polypeptidy podle vynálezu jsou použitelné při stimulaci uvolňování inzulínu z β-buněk Langerhansových ostrůvků slinivky břišní glukózo-dependentním způsobem, čímž poskytují možnost léčby osob postižených poruchami metabolizmu, například osoby postižené diabetem nebo porušenou glykemickou tolerancí, což je prediabetický stav.
Dosavadní stav techniky
Diabetes je charakteristický narušeným metabolizmem glukózy, který se, mimo jiné, jako takový projevuje zvýšenou hladinou glukózy v krvi diabetiků. Níže uvedené zdůrazněné defekty vedly k rozdělení typů diabetů na dvě základní skupiny: diabetes typu 1, neboli „inzulíndependentní“ diabetes mellitus (IDDM), který propukne, jakmile pacienti postrádají β-buňky produkující inzulín v Langerhansových ostrůvcích slinivky břišní; a diabetes typu 2, neboli „non-inzulín dependentní“ diabetes mellitus (NIDDM), který se objevuje u pacientů s nedostatečnou funkcí β-buněk a se změnami inzulínového účinku.
Diabetici typu 1 nejsou v současné době léčeni inzulínem, zatímco většina diabetiků typu 2 se léčí látkami, které stimulují funkci β-buněk, nebo látkami, které zvyšují citlivost cílových tkání pacientů k inzulínu. V průběhu času si téměř jedna polovina diabetiků typu 2 vytváří rezistenci proti těmto látkám a následně je nucena přejít na léčbu inzulínem. Účinné látky, které se v současnosti používají pro léčbu diabetiků typu 2 zahrnují:
Inhibitory α-glukosidázy, kterými jsou například PRECOSE, VOGLIBOSE a MIGLITOL. Inhibitory α-glukosidázy redukují odchýlení postpradiální glukózy opožděním absorpce glukózy ze střev. Tyto látky jsou bezpečné a lze je úspěšně použít pro léčbu lehce nebo středně postižených diabetiků. Nicméně v literatuře jsou zaznamenány vedlejší gastrointestinální účinky.
Inzulínové senzibilizátory jsou účinnými látkami, které zesilují odezvu těla na inzulín. Thiozolidindiony, jako například REZULIN (troglitazon), aktivují PPAR γ-receptor a modulují aktivitu souboru genů, který nebyl doposud dobře popsán. Přesto, že jsou tyto látky účinné, jsou spojovány sjatemí toxicitou. V důsledku hepatotoxicity byl REZULIN stažen z trhu.
Činidla stimulující produkci inzulínu, jakými jsou například sulfonylmočoviny (SFU) a další činidla, která působí prostřednictvím ATP-dependentního K+ kanálu. SFU Představují standardní terapii pro diabetiky typu 2 trpící mírnou nebo střední glykémií nalačno. SFU mají určitá omezení, která zahrnují potenciál pro indukci hypoglykemie, přírůstek na hmotnosti a vysoké četnosti primárního a sekundárního selhání. U 10 % až 20 % léčených pacientů se neprojevil významnější léčebný účinek (primární selhání). Sekundární selhání se projevilo u dalších 20 % až 30 % pacientů, u kterých dochází ke ztrátě léčebného účinku po šesti měsících léčby pomocí SFU. Léčba inzulínem je potřebná u 50 % SFU respondentů po 5 až 7 letech léčby (Scheen, A.J. a kol., Diabetes Res. Clin. Pract. 6:533-543 (1989)).
GLUCOPHAGE (metformin HC1) Je biguanid, který snižuje hladinu glukózy v krvi snížením hepatického výdaje glukózy a zvýšením periferní absorpce glukózy a jejího využití. Tato látka je účinná při snižování hladiny glukózy v krvi u mírně nebo středně postižených subjektů a nemá takové vedlejší efekty, jakými jsou zvýšení hmotnosti nebo potenciál indukovat hypoglykémii. Nicméně GLUCOPHAGE vykazuje celou řadu dalších vedlejších účinků, včetně gastrointesti
-1 CZ 296858 B6 nálních poruch a acidózy z nahromaděné kyseliny mléčné. GLUCOPHAGE Je kontraindikován u diabetiků starších 70 let a u diabetiků s poškozením renální nebo jaterní funkce. Na závěr je třeba zmínit, že léčba lékem GLUCOPHAGE má stejné četnosti primárního a sekundárního selhání jako léčba pomocí SFU.
Léčba inzulínem se zahajuje po dietě, cvičení a selhání orálních léků pro odpovídající kontrolu glukózy v krvi. Léčba inzulínem má své nedostatky. Mimo jiné lze zmínit nutnost aplikace pomocí injekce, možnost indukce hypoglykémie a zvýšení hmotnosti.
Vzhledem k problémům spojeným se současnými způsoby léčby stále existuje potřeba vyvinutí nových terapií pro léčbu diabetů typu 2. Zejména jsou zapotřebí nové léčebné metody pro zachování normální (glukózově-dependentní) sekrece inzulínu. Nové účinné látky, použitelné pro tyto účely, by měly mít následující vlastnosti: měly by být dependentní na glukóze ve smyslu podpory sekrece inzulínu, tj. produkovat sekreci inzulínu pouze v přítomnosti zvýšené hladiny glukózy v krvi; měly by mít nižší četnost primárních, resp. sekundárních selhání; a měly by chránit funkci ostrůvkových buněk. Strategie vývoje nové, zde popsané terapie je založena na mechanizmu signalizujícím cyklický adenosinmonofosfát (cAMP) a jeho vlivem na sekreci inzulínu.
Cyklický AMP je základním a hlavním regulátorem procesu sekrece inzulínu. Elevace této signální molekuly podpoří uzavření K+ kanálků a následnou aktivaci dráhy protein kinázy A. Uzavření K+ kanálků způsobí buněčnou depolarizaci a následné otevření Ca2+ kanálků, což zase vede k exocytóze granulí inzulínu. Malý, pokud vůbec nějaký, vliv na sekreci inzulínu se objeví za absence nízkých koncentrací glukózy (Weinhaus A. a kol., Diabetes 47: 1426-1435 (1998)). Činidla stimulující produkci inzulínu, jako například hypofyzámí peptid aktivující adenylátcykláza (PACAP) a GLP-1, využívají k regulaci sekrece inzulínu glukózo-dependentním způsobem cAMP systém (Komatsu M. a kol., Diabetes 46: 1928-1938, (1997)). Činidla stimulují produkci inzulínu využívají zvýšení cAMP, jakým je například GLP-1, a PACAp je schopen kromě uvolňování inzulínu rovněž zesilovat syntézu inzulínu (Skoglund G. a kol. Diabetes 49: 1156— 1164, (2000). Bordoni P. a kol., Endocrinology 140: 5530-5537, (1999)).
PACAP Je potenciálním stimulátorem glukózo-dependentní sekrece inzulínu z pankreatických β-buněk. Byly popsány tři různé typy PACAP receptorů (Rl, R2 a R3) (Harmar A. a kol., Pharmacol. Reviews 50: 265-270 (1998)). PACAP Nevykazuje selektivitu pro žádný receptor a má srovnatelnou aktivitu a potenci na všech třech receptorech. Receptor Rl se převážně nachází v centrální nervové soustavě (CNS), zatímco receptory R2 a R3 jsou distribuovány šíře. Receptor R2 se nachází v CNS, a stejně tak v játrech, plicích a střevech. Receptor R3 se nachází v CNS, slinivce, kosterním svalu, srdci, ledvinách, tukové tkáni, varlatech a žaludku. Nedávná práce uvádí, že receptor R3 je zodpovědný za sekreci inzulínu z β-buněk (Inagaki N. a kol., PNAS 91: 2679-2683, (1994)). Tento inzulínotropní účinek PACAP je mediován GTP vážícím proteinem Gs. Akumulaci intracelulámího cAPM zase aktivuje proteinem Gs Akumulace intracelulámího cAMP zase aktivuje zvýšení neselektivních kationových kanálků v β-buňkách [Ca2+] a podporuje exocytózu sekrečních granulí obsahujících inzulín.
PACAP Je nejmladším členem nadrodiny metabolických, neuroendokrinních a neurotransmiterových peptidových hormon, které projevují svůj účinek přes signální transdukční dráhu mediovanou cAMP (Arimura, Regul, Peptides 37:287-303 (1992)). Biologicky účinné peptidy se uvolní z biosyntetického prekurzoru ve dvou molekulových formách, buď jako 38-aminokyselinový peptid (PACAP-38) a/nebo jako 27-aminokyselinový peptid (PACAP-27) s amidem substituovaným karboxylovým koncem (Arimura, viz výše).
Nejvyšší koncentrace obou forem peptidu se nalézají v mozku a ve varlatech (přehled v Arimura, viz výše). Kratší forma peptidu, PACAP-27, vykazuje 68% strukturní homologii s vasoaktivním intestinálním polypeptidem (VIP). Nicméně distribuce PACAp a VIP v centrálním nervovém systému dává tušit, že tyto strukturně příbuzné peptidy mají odlišné neuromediační funkce (Koves a kol., Neuroendocrinology 54:159-169, (1991)).
-2CZ 296858 B6
Nedávné studie demonstrovaly diverzní biologické účinky PACAP-38 od určité role při reprodukci (McArdle, Endocrinology 135:815-817 (1994)) až ke schopnosti stimulovat sekreci inzulínu (Yada a kol., J. Biol. Chem. 269:1290-1293 (1994)).
Vasoaktivní intestinální peptid (VIP) je 28 aminokyselinový peptid, který byl prvně izolován z horní části tenkého střeva (Said a Mutt, Science 169: 1217-1218, 1970; patent US 3 879 371). Tento peptid patří do rodiny strukturně příbuzných kratších polypeptidů, které zahrnují helodermin, sekretin, somatostatiny a glukagon. Biologické účinky VIP jsou mediovány aktivací proteinů receptorů vázaných k membráně, které jsou spojeny s intracelulámím cAMP signálním systéme. Tyto receptory byly původně známy jako VIP-R1 a VIP-R2, nicméně později se ukázalo, že jsou totožné s receptory známými jako PACAP-R2 a PACAp-R3. Peptid VIP vykazuje srovnatelnou účinnost a potenci na PACAP-R2 a PACAP-R3.
Pro zlepšení stability VIP v lidské plicní tekutině (Bolin a kol., Biopolymers 37: 57-66, (1995)) se vyrobila celá řada různých variant VIP navržených pro posílení sklonu tohoto peptidu tvořit spirálu a pro redukci proteolytické degradace. Substituce se soustředily do pozice 8, 12, 17 a 25 až 28, u kterých bylo prokázáno, že nejsou důležité pro navázání receptorů. Navíc sekvence „GGT“ byla zavěšena na C-konec VIP proteinů s nadějí, že účinněji uzavře helix. Pro další stabilizaci helixu bylo syntetizováno několik cyklických variant (patent US 5 677 419). Ačkoliv tyto snahy nebyly cíleně směrovány v selektivitě receptorů, poskytly dva analogy (označené zde jako R3P0 a R3P4), které mají více než lOOx vyšší selektivitu než PACAP-R3 (Gourlet a kol., Peptides 18: 403-408, (1997); Xia a kol., J, Pharmacol. Exp. Ther. 281: 629-633, (1997)).
GLP-1 Se uvolňuje z intestinální L-buňky po jídle a působí jako hormon inkretin (tj. potencuje glukózou indukované uvolňování inzulínu z pankreatické β-buňky). Jedná se o 37-aminokyselinový peptid, který je diferenciálně exprimován genem glukagon, v závislosti na typu tkáně. V souvislosti s GLP-1 byly shromážděny klinické výsledky, které podporují příznivý účinek zvýšení hladiny cAPM v β-buňkách. Infúze GLP-1 u špatně kontrolovaných diabetiků typu 2 normalizovala hladinu glukózy v krvi nalačno (Gutniak M. a kol., New Engl J. Med. 326:7316-1322, (1992)) a při dlouhodobějších infúzích se funkce β-buněk zcela normalizovala na úroveň zdravých jedinců (Rachman J. a kol., Diabetes 45: 1524-1530, (1996)). Nedávná zpráva ukázala, že GLP-1 zlepšuje schopnost β-buněk odpovídat na stav glukózy u subjektů s narušenou glukózovou tolerancí (Byrne M., a kol., Diabetes 47: 1259-1265 (1998)). Nicméně všechny tyto účinky jsou krátkodobě, v důsledku krátkého poločasu života peptidu. Před nedávnou dobou společnost Novo Nordisk přerušil klinické testy s GLP-1. proslýchá se, že toto selhání bylo způsobeno velmi krátkým, pouze několikaminutovým, poločasem peptidu vplazmě.
EXENDIN-4: Amylinová farmaceutka procházejí I. fází testů s EXENDINem-4 (AC2993), 39-aminokyselinovým peptidem, který byl prvně identifikován u komatce. Nedávno byla zahájena II. fáze testů. Amylin si nárokuje podle výsledků předklinických testů 4h zachování účinnosti na zvířecích modelech při subkutánním, orálním a nazálním podání AC2993. Nicméně v dávkách 0,2 pg/kg a 0,3 pg/kg, byl zaznamenán významný výskyt bolestí hlavy, posturální hypotenze, nevolnosti a zvracení.
Z výše uvedeného je zřejmé, že existuje oprávněná potřeba vyvinout vylepšený peptid, který bude mít glukózo-dependentní schopnost peptidů PACAP, GLP-1 nebo EXENDINu-4 stimulovat produkci inzulínu a který bude současně vykazovat méně vedlejších účinků.
Podstata vynálezu
Vynález poskytuje nové polypeptidy, které působí in vivo jako agonisty PACAP R3 receptorů (dále jen R3) a jsou účinné při léčbě chorob a stavů, které lze zmírnit pomocí látek majících aktivitu R3 agonisty. Výhodně jsou polypeptidy podle vynálezu selektivní R3 agonisty mající větší
-3 CZ 296858 B6 potenci a R3 až na R2 a Rl. Tyto polypeptidy například stimulují syntézu inzulínu a jeho uvolnění z pankreatických β-buněk glukózo-dependentním způsobem a následnou redukci glukózy v plazmě. Ukázalo se, že tyto polypeptidy stimulují produkci inzulínu stimulující uvolňování inzulínu v ostrůvkových buňkách u kiys a lidí, a to jak in vitro, tak in vivo. Na rozdíl do PACA27 tyto polypeptidy stimulují produkci hormonu rovněž snižují in vivo hladiny glukózy v krvi více, než kontrola vehikula po expozici glukózy.
Polypeptidy podle vynálezu poskytují novou terapii například pro pacienty trpící metabolickými poruchami, kterými jsou například poruchy způsobené sníženou endogenní sekrecí inzulínu, zejména pro diabetiky typu 2, nebo pro pacienty s porušenou glukózou tolerancí, prediabetickým stavem, u kterých došlo k mírné změně sekrece inzulínu.
Jedním aspektem vynálezu je konkrétně polypeptid zvolený z množiny sestávající z polypeptidů následujících sekvencí: SEQ ID NO: 11 až 14, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 21 až 26, SEQ ID NO: 32 až 36, SEQ ID NO: 40 až 53, SEQ ID NO: 57 až 61, SEQ ID NO: 63 až 99, SEQ ID NO: 102 až 119, SEQ ID NO: 121 až 137, SEQ ID NO: 139 až 177, SEQ ID NO: 179, 180, SEQ ID NO: 183 až 202, 322 až 341 a jejich fragmentů, derivátů a variant, které vykazují alespoň jednu biologickou funkci, která je v podstatě totožná s biologickou funkcí polypeptidů jmenovaných sekvencí (souhrnně budou označovány jako „polypeptidy podle vynálezu“), včetně jejich funkčních ekvivalentů. Výhodné provedení podle vynálezu představuje polypeptid zvolený z množiny sestávající z polypeptidů následujících sekvencí: SEQ ID NO: 12, 18, 21 až 26, 32 až 35, 41, 43 až 53, 63, 66, 70 až 92, 94 až 99, 102 až 104, 107, 109, 112 až 119, 121 až 137, 139, 140, 142 až 153, 156 až 174, 187, 322 až 341 a jejich fragmentů, derivátů a variant, které vykazují alespoň jednu biologickou funkci, která je v podstatě totožná s biologickou funkcí polypeptidů jmenovaných sekvencí. Výhodnější provedení podle vynálezu je polypeptid zvolený z množiny sestávající z polypeptidů následujících sekvencí: SEQ ID NO: 18. 24, 25, 32, 33, 43 až 50, 52, 53, 70 až 87, 92, 98, 99, 104, 107, 112 až 114, 129 až 131, 137, 140, 144, 147 až 151, 156 až 159 a 161 až 173, 323, 324, 326, 327, 335, 338, 341 a jejich fragmentů, derivátů a variant, které vykazují alespoň jednu biologickou funkci polypeptidů jmenovaných sekvencí. Nej výhodnějším provedením podle vynálezu je polypeptid zvolený z množiny sestávající z polypeptidů následujících sekvencí: SEQ ID NO: 18, 32, 43, 45, 47, 50, 52, 71, 72, 83, 86 a 87 a jejich fragmentů, derivátů a variant, které vykazují alespoň jednu biologickou funkci, která je v podstatě totožná s biologickou funkcí polypeptidů jmenovaných sekvencí.
Dalším provedením podle vynálezu je polynukleotid, který kóduje polypeptidy podle vynálezu, a doprovodné vektory a hostitelské buňky nezbytné pro rekombinantní expresi polypeptidů podle vynálezu. Tyto polynukleotidové sekvence zahrnují sekvence identifikované jako SEQ ID NO: 204, 207 až 211, 214 až 230 a 232 až 321. Výhodné polypeptidy zahrnují sekvenci identifikované jako SEQ ID NO: 204, 207 až 209, 215, 217 až 230, 232 až 234, 237, 239, 242 až 268, 270 až 281 a 284 až 321. Ještě výhodnější polynukleotidy zahrnují sekvence identifikované jako SEQ ID NO: 207, 218 až 224, 226 až 230, 234, 237, 242 až 244, 258 až 260, 266, 268, 272, 275 až 279, 284 až 287, 289 až 301 a 303, 304, 306, 307, 318 a 321. Nejvýhodnější polynukleotidy zahrnují sekvence identifikované jako SEQ ID NO: 217, 221 a 226.
Do rozsahu vynálezu rovněž spadají protilátky a jejich fragmenty, které selektivně váží polypeptidy podle vynálezu. Takové protilátky jsou použitelné při detekci polypeptidů podle vynálezu a lze je identifikovat a připravit v oboru známými způsoby, včetně postupů analogických s postupy popsanými v níže uvedeném příkladu 17.
Vynález se rovněž týká způsobu léčby diabetů a/nebo dalších chorob nebo stavů, které lze ovlivnit polypeptidy podle vynálezu, výhodně R3 agonistickou funkcí polypeptidů podle vynálezu, u savců, přičemž tento způsob zahrnuje podání terapeuticky účinného množství libovolných polypeptidů podle vynálezu nebo libovolného polypeptidu aktivního na R3, například se sekvencí SEQ ID NO: 5 a 9 savci.
-4CZ 296858 B6
Součástí vynálezu jsou rovněž způsoby přípravy polypeptidů podle vynálezu, a to jak rekombinantní, tak syntetické.
Stručný popis obrázků
Obr. 1 znázorňuje polypeptidy s aminokyselinovou sekvencí SEQ ID NO: 11 až 14, SEQ ID NO: 18 SEQ ID NO: 21 až 26, SEQ ID NO: 32 až 36, SEQ ID NO: 40 až 53,
SEQ ID NO: 57 až 61, SEQ ID NO: 63 až 99, SEQ ID NO: 102 až 119, SEQ ID NO: 121 až 137,
SEQ ID NO: 139 až 177, SEQ ID NO: 179, 180, SEQ ID NO: 183 až 202 a SEQ ID NO: 322 až
341, což jsou nárokované polypeptidy.
Obr. 2 znázorňuje srovnání sekvencí VIP mutantů a nativních polypeptidů VIP, PACAP38, GLP-1, EXENDIN-4 a příklady R3 selektivních polypeptidů. Konzervované zbytky jsou znázorněny tučně a vystínovány tmavě šedou, zatímco konzervativní změny jsou vystínované světle šedou.
Obr. 3 je restrikční mapou typického plazmidu obsahujícího GST-peptidovou fúzi.
Obr. 4A a 4B jsou grafy znázorňující vliv GLP-1 nebo R3P3 na uvolňování inzulínu z ostrůvků krys in vitro.
Obr. 5 je grafem znázorňujícím vliv RP3P peptidu na odstranění glukózy.
Obr. 6 je sloupcovým grafem ukazujícím vliv PACAp a příbuzných polypeptidů na obsah intestinální vody u myši Balb/C.
Obr. 7 je sloupcovým grafem ukazujícím, že subkutánně podaná dávka 1 nmol/kg, R3P3, R3P12, R3P13 nebo GLP-1 podporuje odstraňování glukózy u krysy.
Obr. 8 znázorňuje polynukleotidové sekvence SEQ ID NO: 54 až 56 a 203 až 301, kterékódují polypeptidy podle vynálezu.
První 6 nukleotidů reprezentuje Bam HI rozpoznávací místo restrikčního enzymu, následujících 12 nukleotidů kóduje rozpoznávací místo „IEGR“ faktor Xa. Posledních 6 nukleotidů reprezentuje rozpoznávací místo restrikčního enzymu Xho I nebo Eco RI, přičemž těmto 6 nukleotidům předchází 6 nukleotidů, které kódují dva koncové kodony. Nukleotidy mezi místem faktoru Xa a koncovými kodony kódují aminokyselinovou sekvenci odpovídajícího polypeptidů. Nukleotidy mezi dvěma restrikčními místy jsou nakloňovány do odpovídajících restrikčních míst na pGEX6P-1 vektoru (Amersham Pharmacia Biotech). Sekvence SEQ ID NO jsou uvedeny v závorkách.
Obr. 9 ukazuje vliv PACAP-27, VIP a receptorově selektivních agonistů na tepovou frekvenci u psů v bezvědomí (viz příklad 15).
Obr. 10 ukazuje detekci R3P66 polyklonálními protilátkami produkovanými v těle králíků imunizovaných R3P66 C-koncovou sekvencí (Ac-CRKQVAAKKYLQSIKNKRY-COOH) za použití ELISA.
Vynález poskytuje nové polypeptidy a jejich fragmenty, deriváty a varianty, které vykazují alespoň jednu biologickou funkci, která je v podstatě totožná s biologickou funkcí polypeptidů z obr. 1 (souhrnně polypeptidy podle vynálezu). Polypeptidy podle vynálezu působí in vivo jako R3 agonisty nebo jinak při prevenci a/nebo léčbě takových chorob nebo stavů, jakými jsou diabetes, astma, hypertenze, problémy mužského rozmnožování včetně pohyblivosti lidských spermií, kardiovaskulární choroby, vředy a další zde definované stavy, nebo působí jiným níže popsaným
-5CZ 296858 B6 způsobem. Výhodně budou polypeptidy podle vynálezu stimulovat uvolňování inzulínu zpankreatických β-buněk glukózo-dependentním způsobem.
Polypeptidy podle vynálezu jsou R3 agonisty. Výhodně jsou R3 selektivními agonisty alespoň s lOx vyšší selektivitou pro R3 než pro R2 a/nebo Rl. Ještě výhodněji jsou R3 selektivními agonisty alespoň se lOOx vyšší selektivitou pro R3 než pro R2 a/nebo Rl. Nejvýhodněji stimulují uvolňování inzulínu do plazmy glukózo-dependentním způsobem bez indukce stáze nebo zvýšení hladiny glukózy v plazmě, což jsou účinky působící proti léčbě, například proti léčbě diabetů typu 2. V případě polypeptidů podle vynálezu je výhodné, že jsou agonisty selektivními pro R3 receptor, takže způsobují například zvýšené uvolňování inzulínu do plazmy a současně jsou selektivními pro R3 receptor, takže způsobují například zvýšené uvolňování inzulínu do plazmy a současně jsou selektivní proti dalším receptorům, které jsou zodpovědné za takové nepřijatelné nebo nebezpečné vedlejší efekty, jakými jsou například zadržování gastrointestinální vody, a/nebo nežádoucí kardiovaskulární účinky, jakými jsou například zvýšené tepové frekvence. Nyní se zjistilo, že R3-Mediovaná sekrece inzulínu nezpůsobuje hypoglykémii, aktivace R2vede k uvolňování glukózy do plazmy, což je účinek působící proti léčbě diabetů typu 2 a způsobuje zadržování gastrointestinální vody a aktivizace Rl vede ke kardiovaskulárním účinkům, jakým je například zvýšená tepová frekvence.
Polypeptidy podle vynálezu poskytují novou terapii pro pacienty se sníženou endogenní sekrecí inzulínu nebo narušenou glukózovou tolerancí, zejména pro pacienty trpící diabetem typu 2.
A. Diskuse
PACAP, VIP, GLP-1 a EXENDIN-4 Jsou polypeptidy schopní stimulovat uvolňování inzulínu glukózo-dependentním způsobem. Nicméně samotný tento fakt negarantuje redukci glukózy in vivo. Protože je známo, že PACAp se váže na PACAP-R1, PACAP-R2 a PACAp-R3 receptory a rovněž je známo, že se VIP váže na PACAP-R2 a PACAP-R3 receptory, lze se domnívat, že mají podobné konzervované strukturní znaky. Níže uvedené zarovnání nad sebou ukazují primární strukturní vztahy:
SEQ ID NO
VIP 1 HSDAVFTDNY TRLRKQMAVK KYLNSILN-NH2 281
PACAP38 1 HSDGIFTDSY SRYRKQMAVK KYLAAVLGKR YKQRVKNK-NH2 382
GLP-1 1 HAEGTFTSDV SSYLEGQAAK EFIAWLVKGR-NH2 303
Exendin 4 1 HGEGTFTSDL SKQMEEEAVR LFIEWLKNGG PSSGAPPPS-NH2 394 (použité zkratky s jedním písmenem pro aminokyseliny lze nalézt v Zubay, Biochemístry 2. ed., 1988, MacMillan Publishing, New York, str. 33), které jsou definovány níže. Polypeptidy podle vynálezu (obr. 1) jsou nejblíže příbuzné VIP, ve smyslu jejich primární struktury, s výjimkou sekvencí SEQ ID NO: 57 až 61, 66 až 69 a 176, 177, 179, 180, 183 a 202, které jsou příbuznější PACAP.
Vynález tedy poskytuje nový polypeptid, který je R3 agonistem, výhodně selektivním R3 agonistem, a/nebo který vykazuje selektivní schopnost stimulovat produkci inzulínu glukózo-dependentním způsobme, přičemž selektivní aktivace PACAP R3 receptoru ve skutečnosti vede ke glukózo-dependentní dráze sekrece inzulínu pankreatickými β-buňkami a ke konkomitující redukci glukózy in vivo. V tomto ohledu byl nejprve studovány struktury PACAP-27 a VIP, ve snaze určit zbytky, které jsou nejpravděpodobněji zodpovědné za selektivitu receptoru. Je známo, že PACAP a VIP neredukují glukózu in vivo, ale spíše naopak stimulují uvolňování glukózy z jater. Ukázalo se, že aktivace R2 zvyšuje hladiny glukózy v plazmě in vivo. Jak PACAP, tak VIP byly v minulosti extenzívně mutagenizovány pro různé účely. Řada deleci v PACAP27
-6CZ 296858 B6 a PACAP38 z obou konců například potvrdily důležitost obou zakončení pro navázání receptoru (Gourlet a kol., Eur. J. Pharm. 287: 7-11, (1995); Gourlet a kol., Regul Peptides 62: 125-130, (1996)). Navázání membrána mozku krysy a adenylátcyklázové aktivity PACAP27/VIP hybridních muteinů prokázaly důležitost N-koncových zbytků PACAp pro rozpoznání PACAP-R1 (Ando a kol., Biomed. Pept. Proteins Nucleic Acids 2:41-46, (1996)). Zvýšení bazicity Leu17-PACAP27 a Leu17-VIP vytvořením K15R, K20R, a K21R mutací a prodloužením Ckonce „GKR“ sekvence vedlo k prodloužení trvání tracheální relaxační aktivity morčete, které, jak se předpokládá, bylo způsobeno ochranou zprostředkovanou heparinovou vazbou (Kashimoto a kol., Ann. NY Acad. Sci. 805: 505-510, (1996)). Gourlet a kol., (Biochim. Biophys. Acta 1314: 267-273, (1996)) demonstruje, že Q16R mutein VIP a PACAP vykazuje vyšší afinity pro PACAP-R2, resp. Rl, než jim odpovídající přírodní polypeptidy. Gourlet a kol. (Peptides 18: 1539-1545, (1997)) vyvinul R2-selektivního agonistu s vysokou afinitou tím, že připravil chiméricky substituovaný peptid [K15, R16, L27] VIP(l-7)/GRF(8-27). N-Koncová acylace a DPhe2 substituce tohoto selektivního agonisty vedla k získání účinného R2 selektivního antagonisty (Gourlet a kol., Peptides 18: 1555-1560, (1997). VIP Muteiny Y22L a Y22A, ale nikoliv Y22F, vykazují nižší afinitu pro PACAP-R3, z čehož vyplývá důležitost aromatické skupiny v poloze 22 pro navázání receptoru R3, ale nikoliv pro navázání receptoru R2 (Gourlet, Eur. J. Biochem. 348: 95-99, (1998). Helodermin a helospektin, což jsou VIP podobné peptidy izolované z jedu slinné žlázy ještěrek, vykazují lOOx vyšší selektivitu pro PACAP-R3 (Gourlet, Ann. NY Acad. Sci. 865: 247-252, (1998)). Fotoafinitní značení PACAP27 náhradou F6 a Y22 pBenzoyl-Z-fenylalaninem (pBz) nebo K15, K20 a k21 pBz2 ukazuje, že K.15 a F22 jsou bližší PACAP-R1 než F6, K20 a K21 (Cao a kol., Eur. J. Biochem. 244: 400-406, (1997); Cao a kol., Ann. NY Acad. Sci. 865: 82-91, (1998)).
Bylo nalezeno několik polypeptidů, které způsobují stimulaci uvolňování inzulínu glukózodependentním způsobem a redukci glukózy in vivo. Tyto polypeptidy nesou několik společných znaků s VIP a PACAP. Zejména zarovnám nad sebou ukazuje následující shody:
SEQ ID NO
VIP | 1 | HSDAVFTDNY | TRLRKQMAVK | kylnsiln-nh2 | 28 | 1 |
PACAP38 | 1 | HSDGIFTDSY | SRYRKQMAVK | kylaavlgkr ykqrvknk-nh2 | 38 | 2 |
R3P1 | Ac | :-HSDAVFTDNY TKLRKQLAAK KYLNDLKKGG T-NH2 | 31 | 6 | ||
R3P3 | 1 | HSDAVFTDNY | TKLRKQLAAK | KYLNDLKKGG T | 31 | 8 |
R3P12 | 1 | HSDAVFTDNY | TRLRKQLAAK | KYLNDLKKGG T | 31 | 15 |
R3P13 | 1 | HSDAVFTDNY | TRLRKQLAAK | KYLNDIKK-NH2 | 28 | 16 |
R3P36 | 1 | HSDAVFTDNY | TRLRKQLAAK | KYLNDIKKKR Y | 31 | 32 |
R3P66 | 1 | HSDAVFTDNY | TRLRKQVAAK | KYLQSIKNKR Y | 31 | 72 |
Nicméně žádná zmínka ani ve vědecké ani v patentové literatuře nenasvědčuje tomu, že by volba modifikací na VIP a PACAP sekvencích vedla k získání polypeptidu se schopností stimulovat sekreci inzulínu glukózo-dependentním způsobem a redukovat koncentraci glukózy v plazmě.
Nyní budou definovány některé výrazy použité v celém textu přihlášky vynálezu. Následuje přehled zkratek jednotlivých aminokyselin s jedním písmem, u kterých jsou v závorkách uvedeny i jejich zkratky se třemi písmeny): A, alanin (ala); C, cystein (cys); D, kyselina aspartová (asp); E, kyselina glutamová (glu); F, fenylalanin (phe); G, glycin (gly); H, histidin (his); I, izoleucin (ile); K, lysin (lys); L, leucin (leu); M, methionin (met); N, asparagin (asn); P, prolin (pro); Q, glutamin (gin); R, arginin (arg); S, serin (ser); T, threonin (thr); V, valin (val); W, tryptofan (trp); a Y, tyrosin (tyr).
Výraz „polynukleotid kódující polypeptid“ zahrnuje polynukleotid, který zahrnuje pouze kódovací sekvenci pro polypeptid a stejně tak polynukleotid, který zahrnuje další kódovací a/nebo nekódovací sekvenci: Vynález se dále týká polypeptidů, které hybridizují na výše uvedené sek vence, pokud je mezi sekvencemi alespoň 70%, výhodně alespoň přibližně 90%, a výhodněji alespoň přibližně 95% identita. Vynález se zejména týká polynukleotidů kódujících polypeptidy, které hybridizují za přísných podmínek ve výše popsané polynukleotidy. Výraz „přísné podmínky“, jak je zde použit znamená „přísné hybridizační podmínky“. Výhodně k hybridizaci dojde, pokud bude mezi sekvencemi alespoň přibližně 90% a výhodně přibližně 95% až 97% identita. Polynukleotidy, které hybridizují na výše popsané polynukleotidy, u výhodného provedení kódují polypeptidy, které si zachovávají v podstatě stejnou biologickou funkci nebo aktivitu jako zralý polynukleotid kódovaný cDNA.
Výrazy „funkční ekvivalent“ a „v podstatě stejná biologická funkce nebo aktivita“ se rozumí 30% až 100% nebo vyšší stupeň biologické aktivity, kterou vykazuje polypeptid sjehož aktivitou se srovnává, za předpokladu, že se biologická aktivita všech polypeptidů určuje stejným postupem. Polypeptid který je funkčně ekvivalentní k polypeptidu z obr. 1, je například polypeptid, který při testu scintilační poximity cyklického AMP, který je specificky popsán v příkladu 16, vykazuje akumulaci cAMP v CHO buněčné linii exprimující humánní PACAP/VIP R2 (PACAP R3) receptor.
Polypeptid podle vynálezu, který je R3 agonistou, je polypeptid, který vykazuje 30% až 100% nebo vyšší maximální PACAP-27 R3 agonistickou aktivitu, pokud se testuje podle protokolu z příkladu 16. Výhodnými polypeptidy podle vynálezu, které jsou selektivními agonisty pro R3 a nikoliv pro PACAP R2 a R1 receptory, jsou ty polypeptidy, které vykazují poměr agonistické aktivity R3 ku aktivitě R3 přibližně 10:1 nebo vyšší a výhodněji přibližně 100:1 nebo vyšší, a/nebo ty, které vykazují poměr agonistické aktivity R3 ku aktivitě R1 přibližně 10:1 nebo vyšší a výhodněji přibližně 100:1 nebo vyšší, pokud se polypeptid testuje podle protokolu z příkladu 16 a za použití buněk, které exprimují vhodné receptory.
„Přísné hybridizační podmínky“ označují celonoční inkubaci dvou druhů polynukleotidů určených pro hybridizaci při 42 °C v roztoku, který obsahuje 50% formami, 5x SSC (750 mM NaCl, 75 mM citrátu sodného), 50 mM fosforečnanu sodného (pH 7,6), 5x Denhardtův roztok, 10% dextransulfát a 20 pg/ml DNA denaturovaného, odstřeďovaného spermatu lososa, a následné propláchnutí filtrátů v 0,lx SSC při přibližně 65 °C.
Výrazy „fragment“, „derivát“ a „varianta“ ve spojení s polypeptidy z obr. 1 označují fragmenty, deriváty a varianty polypeptidů, které si, jak bude popsáno níže, zachovávají v podstatě shodnou biologickou funkci nebo aktivitu jako uvedené polypeptidy.
Výraz „analog“ zahrnuje propolypeptid, jehož součástí je aminokyselinová sekvence polypeptidu podle vynálezu. Aktivní polypeptid podle vynálezu lze odštěpit od dalších aminokyselin, které tvoří zbytek propolypeptidové molekuly, přirozenými in vivo procesy nebo dalšími v oboru známými postupy, jakými jsou například enzymatické nebo chemické štěpení. 28-Aminokyselinový nativní peptid VIP se například přirozeně exprimuje jako mnohem větší polypeptid, který se následně zpracuje in vivo tak, že uvolní 28-aminokyselinový aktivní zralý peptid.
Výrazem „fragment“ se rozumí část polypeptidu, která si zachovává v podstatě shodnou funkční aktivitu, jak ukazují zde popsané a níže diskutované in vivo modely.
Výraz „derivát“ zahrnuje veškeré modifikace polypeptidu, který si v podstatě chrání zde popsané funkce a obsahuje další strukturu a doprovodnou funkci, např. PEGylované polypeptidy, které mají delší poločas života, fúzní polypeptid,y které derivátů propůjčují cílovou specifičnost nebo další aktivitu, např. toxicitu pro určený cíl, viz níže.
Polypeptidy podle vynálezu mohou být rekombinantní polypeptidy, přírodní puntíkované polypeptidy nebo syntetické polypeptidy.
-8CZ 296858 B6
Fragmentem, derivátem nebo variantou polypeptidů podle vynálezu mohou být (i) takové, u kterých je jeden nebo více aminokyselinových zbytků nahrazeno konzervovaným nebo nekonzervovaným aminokyselinovým zbytkem (výhodně konzervovaným aminokyselinovým zbytkem) a takový substituovaný aminokyselinový zbytek může nebo nemusí být kódován genetickým kódem, nebo (ii) takové, u kterých zahrnuje jeden nebo více aminokyselinových zbytků substituční skupinu, nebo (iii) takové, u kterých je zralý polypeptid navázán na další sloučeninu, například na sloučeninu, která prodlužuje poločas života polypeptidů (například na polyethylenglykol), nebo (iv) takové, u kterých je na zralý polypeptid navázána další aminokyselina, například vedoucí nebo sekreční sekvence nebo sekvence, která se využívá při purifikaci zralé polypeptidové nebo propolypeptidové sekvence, nebo (v) takové, u kterých je polypeptidová sekvence navázána na větší polypeptid, tj. lidský albumin, protilátku nebo Fc, s cílem prodloužit dobu trvání účinku. Odborníkům v daném oboru jsou obsah i rozsah takto chápaných významů „fragment“, „derivát“, „varianta“ a „analog“ známy.
Deriváty podle vynálezu budou výhodně obsahovat konzervativní aminokyselinové substituce (definované níže) provedení na jednom nebo několika předem určených, výhodně neesenciálních aminokyselinových zbytcích. „Neesenciální“ aminokyselinový zbytek je zbytek, který lze změnit ve standardní sekvenci proteinu bez změny biologické aktivity, zatímco „esenciální“ aminokyselinový zbytek je pro biologickou aktivitu potřebný. Výrazem „konzervativní aminokyselinová substituce“ se rozumí substituce, při které je aminokyselinový zbytek nahrazen aminokyselinovým zbytkem majícím podobný boční řetězec. Rodiny aminokyselinových zbytků mající podobné boční řetězce již byly v dané oblasti definovány. Tyto rodiny zahrnuji aminokyseliny s bazickými bočními řetězci (např. lysin, arginin, histidin), s kyselinovými bočními řetězci (např. kyselina aspartová, kyselina glutamová), s polárními vedlejšími řetězci bez náboje (např. glycin, asparagin, glutamin, serin, threonin, tyrosin, cystein), s nepolárními vedlejšími řetězci (např. alanin, valin, leucin, izoleucin, prolin, fenylalanin, methionin, tryptofan), s β-větvenými bočními řetězci (např. threonin, valin, izoleucin) a s aromatickými bočními řetězci (např. tyrosin, fenylalanin, tryptofan, histidin). Nekonzervativní substituce se neprováděly u konzervovaných aminokyselinových zbytků nebo u aminokyselinových zbytků nacházejících se v konzervované proteinové doméně, například zbytků 19 a 27, pokud jsou esenciální pro aktivitu proteinu, například R3 aktivitu a/nebo R3 selektivitu. Fragmenty nebo biologicky účinné části zahrnují polypeptidové fragmenty vhodné pro použití jako léčivo, pro výrobu protilátky, jako analytické činidlo apod. Fragmenty zahrnují peptidy obsahující aminokyselinovou sekvenci dostatečně podobnou nebo odvozenou od aminokyselinové sekvence polypeptidů podle vynálezu a vykazují alespoň jednu aktivitu tohoto polypeptidů, ale zahrnují méně aminokyseliny než zde popsané celodélkové polypeptidy. Biologicky účinné části zpravidla obsahují doménu nebo motiv s alespoň jednou aktivitou polypeptidů. Biologicky účinnou částí polypeptidů může být například peptid o délce 5 nebo více aminokyselin. Takové biologicky účinné části lze připravit synteticky nebo pomocí rekombinantních technik a pomocí zde popsaných nebo v oboru známých technik lze u nich hodnotit jednu nebo více funkčních aktivit polypeptidů podle vynálezu.
Nicméně výhodné deriváty podle vynálezu zahrnují zralé polypeptidy, které jsou navázány na další sloučeninu, například na sloučeninu, která prodlužuje poločas života polypeptidů a/nebo redukuje potenciální imunogenicitu polypeptidů (například na polyethylenglykol „PEG“). V případě PEGylace lze navázání polypeptidů na PEG realizovat jakýmkoliv vdaném oboru známým způsobem. PEGylaci lze například provádět tak, že se nejprve zavede do polypeptidů cysteinová mutace a následně se provede místně specifická derivatizace pomocí PEG-maleinimidu. Na C-konec peptidů lze přidat cystein. (Viz například Tsutsumi a kol., Proč Nati. Acad Sci USA, 18. červenec 2000; 97(15):8548-53).
Varianty polypeptidů podle vynálezu zahrnují polypeptidy mající aminokyselinovou sekvenci dostatečně podobnou aminokyselinovým sekvencím SEQ ID NO: z obr. 1 nebo jejich doménám. Výraz „dostatečně podobný“ znamená, že první aminokyselinová sekvence obsahuje dostatečný nebo minimální počet aminokyselinových zbytků identických nebo ekvivalentních ke druhé aminokyselinové sekvenci, takže první a druhá aminokyselinová sekvence mají společnou struk-9CZ 296858 B6 turní doménu a/nebo společnou funkční aktivitu. Aminokyselinové sekvence, které obsahují společnou strukturní doménu, tj. jsou přibližně z alespoň 45 %, výhodně přibližně 75 % až 98 % identické, jsou zde například definovány jako dostatečně podobné. Výhodně budou varianty dostatečně podobné aminokyselinové sekvenci výhodných polypeptidů podle vynálezu. Varianty zahrnují varianty polypeptidů kódované polynukleotidem, kteiý hybridizuje na polynukleotid podle vynálezu nebo na jeho komplement za přísných podmínek. Tyto varianty si zpravidla zachovávají funkční aktivitu polypeptidů podle vynálezu. Pro vytvoření rozmanité populace fragmentů pro screening a následnou selekci lze využít knihovny fragmentů těchto polynukleotidů. Knihovnu fragmentů lze například připravit působením nukleázy na dvouřetězcový PCR fragment polynukleotidu za podmínek kde se v každé jednotlivé molekule vytvoří pouze jedno rozštěpení, denaturaci dvoušroubovice DNA, renaturací DNA za vzniku dvoušroubovice DNA, která může obsahovat smyslové/protismyslné páry různých štěpných produktů, odstraněním jednořetězcových částí z reformovaných duplexů působením S1 nukleázy a ligací výsledné knihovny fragmentů do expresního vektoru. Tímto způsobem lze odvodit expresní knihovnu, která kóduje N-koncové a vnitřní fragmenty různě dlouhého polypeptidů podle vynálezu.
Varianty zahrnují polypeptidy, jejichž aminokyselinová sekvence se odlišuje v důsledku mutageneze. Varianty, které působí jako R3 agonisty, lze identifikovat screeningem na R3 agonistickou aktivitu kombinatorických knihoven mutantů, například mutantů získaných sestřihem, polypeptidů podle vynálezu.
U jednoho provedení se široká knihovna analogů generuje kombinatorickou mutagenezí na úrovni nukleové kyseliny a je kódovaná širokospektrou genovou knihovnou. Širokospektrou knihovnu variant lze například produkovat enzymatickou ligací směsi syntetických oligonukleotidů do genových sekvencí, takže lze degenerovanou sadu potenciálních různých aminokyselinových sekvencí exprimovat jako individuální polypeptidy nebo, alternativně, jako sadu větších kondenzovaných proteinů (například pro zobrazení fágu) obsahujících sadu sekvencí. Existuje celá řada způsobů, které lze použít pro přípravu knihoven potenciálních variant z degenerované oligonukleotidové sekvence. Chemickou syntézu degenerované genové sekvence lze provádět v automatickém DNA syntetizéru a syntetický gen se následně liguje do vhodného expresního vektoru. Použití degenerované sady genů umožňuje vjediné směsi poskytnutí všech sekvencí kódujících požadovanou sadu sekvencí potenciálních variant. Způsoby syntetizace degenerovaných oligonukleptidů jsou v daném oboru známy (viz například Nurang (1983) Tetrahedron 39:3; Itakura a kol. (1984) Annu. Rev. Biochem. 53:323; Itakura a kol. (1984); Science 198:1056; Ike a kol. (1983) Nucleic acid Res. 11:477).
Pro screening genových produktů kombinatorických knihoven vyrobených bodovými mutacemi nebo sestřihem a pro screening cDNA knihoven na genové produkty vykazující zvolenou vlastnost je v daném oboru známo několik technik. Tyto techniky jsou přizpůsobitelné rychlému screeningu genových knihoven generovaných kombinatorickou mutagenezí R-agonistických polypeptidů. Nejběžněji používané metody, které lze přizpůsobit vysokovýkonné analýze pro screening velkých genových knihoven, zpravidla zahrnují klonování genové knihovny do replikovatelných expresních vektorů, transformaci vhodných buněk výslednou vektorovou knihovnou a expresi kombinatorických genů za podmínek, při kterých detekce požadované aktivity usnadní izolaci vektor kódujícího genu, jehož produkt byl detekován. Rekurzívní komplexní mutageneze „Recursive ensemble mutagenesis“ (REM), tj. technika, která zvyšuje frekvenci funkčních mutantů v knihovně, může být v kombinaci se screeningovou analýzou použita k identifikaci požadovaných variant.
Vynález rovněž poskytuje chimérické nebo fúzní polypeptidy. Příklady těchto polypeptidů podle vynálezu jsou sekvence SEQ ID NO: 18 a 172, které jsou fúzemi pankreatické targeting sekvence „SWCEPGWCR” [Rajotte D. a kol. (1998) J Clin Invest 102:430-437) se SEQ ID NO: 8, resp. 32: Targeting sekvence je navržena pro lokalizační dopravu polypeptidů do slinivky s minimalizací potenciálních vedlejších účinků. Polypeptidy podle vynálezu mohou být tvořeny aminokyselinami, které jsou vzájemně navázány pomocí peptidových vazeb nebo modifikova
-10CZ 296858 B6 ných peptidových vazeb, tj. peptidových izoesterů, a mohou obsahovat i další aminokyseliny, kromě 20 genem kódovaných aminokyselin. Polypeptidy lze modifikovat buď přirozenými způsoby, jakým je například posttranslační zpracování, nebo chemickými modifikačními technikami, které jsou vdaném oboru známy. Tyto modifikace jsou dobře popsány v základních textech a podrobných monografiích a rovněž v rozsáhlé odborné literatuře. Modifikace se mohou vyskytovat kdekoliv v polypeptidu, včetně hlavního peptidového řetězce, aminokyselinových bočních řetězců a aminového nebo karboxylového konce. Lze předpokládat, že stejný typ modifikace může být přítomen ve stejné nebo jiné míře na několika místech v daném polypeptidu. Daný polypeptid může rovněž obsahovat několik typů modifikací. Polypeptidy mohou být větvené, například v důsledku ubiquitinace, a stejně tak mohou být cyklické, a to s větvením nebo bez větvení. Cyklické, větvené a větvené cyklické polypeptidy mohou být připraveny syntetickými metodami. Modifikace zahrnují acetylaci, acylaci, ADP-ribosylaci, amidaci, kovalentní navázání flavinu, kovalentní navázání heme zbytku, kovalentní navázání nukleotidu nebo nukleotidového derivátu, kovalentní navázání lipidu nebo lipidového derivátu, kovalentní navázání fosfotidylinositolu, zesíťování, cyklizaci, tvorbu disulfidových vazeb, demethylaci, tvorbu kovalentních příčných vazeb, tvorbu cysteinu, tvorbu pyroglutamátu, formulaci, γ-karboxylaci, glykosylaci, tvorbu GPI ukotvení, hydroxylaci, jodizaci, methylaci, myristoylaci, oxidaci, pegylaci, proteolytické zpracování, fosforylaci, prenylaci, racemizaci, selenoylaci, sulfaci, t-RNA mediovanou adici aminokyselin do proteinů, například arginylaci, a ubiquitinaci. (Viz například, Proteines. Structure and Molecular Properties, B. C. Johnson, ed., Academie Press, New York, str. 1-12 (1983); Seifter a kol., Meth. Enzymol 182:626-646 (1990); Rettan a kol., Ann N.Y. Acad. Sci. 663:48-62 (1992)).
Polypeptidy podle vynálezu zahrnují polypeptidy z obr. 1, to jsou SEQ ID NO: 11 až 14, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 21 až 26, SEQ ID NO: 32 až 36, SEQ ID NO: 40 až 53, SEQ ID NO: 57 až 61, SEQ ID NO: 63 až 99, SEQ ID NO: 102 až 119, SEQ ID NO: 121 až 137, SEQ ID NO: 139 až 177, SEQ ID NO: 179, 180, SEQ ID NO: 183 až 202, 322 až 341 a rovněž ty sekvence, které mají nepodstatné změny v sekvenci oproti jmenovaným sekvencím. Výraz „nepodstatná změna“ zahrnuje libovolnou sekvenci, substituci, nebo deleci variant, při kterých zůstane v podstatě zachována alespoň jedna biologická funkce polypeptidů podle vynálezu, výhodně R3 agonistická aktivita, výhodněji selektivní R3 agonistická aktivita a nejvýhodněji zde demonstrovaná schopnost podporující sekreci inzulínu. Tyto funkční ekvivalenty mohou výhodně zahrnovat polypeptidy, které mají alespoň přibližně 90% identitu s polypeptidy z obr. 1 a výhodněji alespoň 95% identitu s polypeptidy z obr. 1 a ještě výhodněji alespoň 97% identitu s polypeptidy z obr. 1, a stejně tak zahrnují části těchto polypeptidů, které mají v podstatě stejnou biologickou aktivitu. Nicméně do rozsahu vynálezu spadá i jakýkoliv polypeptid, který má ve své aminokyselinové sekvenci nepodstatnou změnu oproti sekvencím polypeptidů z obr. 1 a který vykazuje funkční ekvivalenci, která bude dále popsána v popisu přihlášky vynálezu.
Jak je vdaném oboru známo, „podobnost“ mezi dvěma polypeptidy se určí porovnáním aminokyselinové sekvence a jejích konzervovaných aminokyselinových substitucí jednoho polypeptidu se sekvencí druhého polypeptidu. Tyto konzervativní substituce zahrnují výše popsané substituce a rovněž substituce, které popsal Dayhoff a Atlas of Protein Sequence and Structure 5 (1978) a Argos a EMBO J., 8:779-785 (1989). Například aminokyseliny patřící do jedné z následujících skupin reprezentují konzervativní změny:
- ala, pro, gly, gin, asn, ser, thr;
- cys, ser, tyr, thr;
- val, ile, leu, met, ala, phe;
- lys, arg, his;
phe, tyr, trp, his; a
- asp, glu.
Vynález se rovněž týká vektorů, které obsahují polynukleotidy podle vynálezu, hostitelských buněk, které byly geneticky upraveny vektory podle vynálezu, a produkce polypeptidů podle
-11 CZ 296858 B6 vynálezu rekombinantními technikami. Hostitelské buňky lze geneticky upravit (transdukovat nebo transformovat nebo transfektovat) pomocí vektorů podle vynálezu, kterými mohou být například klonovací vektory nebo expresní vektory. Vektor může mít například formu plazmidu, virové částice, fágu atd. Genovým inženýrstvím zpracované hostitelské buňky lze kultivovat v běžném živném médiu modifikovaném tak, aby bylo vhodné pro aktivaci promotorů nebo selekci transformantů. Kultivační podmínky, jakými jsou například teplota, pH apod., budou stejné jako podmínky dříve používané u hostitelské buňky zvolené pro expresi, což jsou podmínky odborníkům v daném oboru známé. Polynukleotid podle vynálezu lze použít pro výrobu polypeptidu rekombinantními technikami. Polynukleotidovou sekvenci lze například zabudovat do libovolného expresního vehikula, zejména do vektorů nebo plazmidů určených pro expresi polypeptidu. Tyto vektory zahrnují chromozomální, non-chromozomální a syntetické DNA sekvence, například derivát SV40; bakteriální plazmidy; fágovou DNA; kvasnicové plazmidy; vektory odvozené z kombinací plazmidů a fágové DNA, virové DNA, například vakcínie, adenovirus, virus způsobující neštovice u drůbeže a pseudovzteklina. Nicméně lze použít další vektory nebo plazmidy, pokud jsou replikovatelné a mají schopnost přežívat v hostiteli.
Vhodnou DNA sekvenci lze do vektoru zabudovat různými postupy. Zpravidla se DNA sekvence zabuduje do vhodného místa restrikční endonukleázy postupy, které jsou v daném oboru známy. O těchto postupech se předpokládá, že budou odborníkům v daném oboru známy. DNA Sekvence v expresním vektoru se operativně naváže na vhodné expresi řídicí sekvence (promotor) potřebné pro přímou mRNA syntézu. Jako reprezentativní příklady těchto promotorů lze zmínit LTR nebo SV40 promotor, E. coli. lac nebo trp, fágový lambda PL promotor a další promotory, o kterých je známo, že řídí expresi genů v prokaryotických nebo eukaryotických buňkách nebo jejich virech. Expresní vektor rovněž obsahuje místo pro navázání ribozómu, kteréje důležité pro iniciaci translace, a transkripční terminátor. Vektor může dále zahrnovat vhodné sekvence pro zesílení exprese. Expresní vektory navíc výhodně obsahují gen, který jim poskytuje fenotypový znak pro selekci transformovaných hostitelských buněk, jakým je například dihydrofolátreduktázová nebo neomycinová rezistence pro eukaryotickou buněčnou kulturu nebo tetracyklinová nebo ampicillinová rezistence v E. coli. Vektor obsahující vhodnou výše popsanou DNA sekvenci, a stejně tak vhodný promotor nebo řídicí sekvenci, lze použít pro transformaci vhodného hostitele, která umožní hostiteli exprimovat protein. Jako reprezentativní příklady vhodných hostitelů lze zmínit bakteriální buňky, například buňky E. coli, Salmonella typhimurium, Streptomyces; fungální buňky, například buňky kvasinek; buňky hmyzu, například buňky Drosophila S2 a Spodoptera Sf9; zvířecí buňky, například CHO, COS nebo buňky Bowesova melanomu; adenoviry; rostlinné buňky atd. Předpokládá se, že volba vhodného hostitele je zcela v kompetenci odborníkům v daném oboru.
Vynález rovněž zahrnuje rekombinantní konstrukty obsahující jednu nebo několik sekvencí, které byly podrobně popsány výše. Konstrukty obsahují vektor, například plazmid nebo virový vektor, do kterého se začlení sekvence podle vynálezu, a to v přímé nebo reverzní orientaci. U výhodného provedení konstrukt dále obsahuje regulační sekvence, například včetně promotoru operativně navázaného na sekvenci. Odborníkům v daném oboru je znám velký počet vhodných vektorů, které jsou navíc komerčně dostupné. Mezi vhodné vektory lze zařadit například bakteriální vektory: pQE70, pQE60, pQE-9 (Qiagen), pBS, phagescript, psiX174, pBluescript SK, pBsKS, pNH8a, pNHlóa, pNH18a, pNH46a (Stratagene); pTRC99A, pKK223-3, pKK233-3, pDR540, PRIT5 (Pharmacia); a eukaryotické vektory, pWLneo, pSV2cat, pOQ44, pXTl, pSG (Stratagene) pSVK3, pBPV, pMSG, PSVL (Pharmacia). Nicméně lze použít i jakýkoliv další plazmid nebo vektor, pokud bude replikovatelný a pokud bude schopen přežít v hostiteli. Oblasti promotoru lze zvolit z libovolných požadovaný gen používajících CAT (chloramphenicol transferase) vektorů nebo dalších vektorů s volitelnými markéry. Dvěma vhodnými vektory jsou pKK232-8 a pMC7. Za zmínku stojí zejména bakteriální promotory zahrnující láci, lacZ, T3, T7, gpt, lambda PR, PL a trp. Eukaryotické promotory zahrnují raný (immediate early) CMV, HSV thymidinkinázu, raný a pozdní SV40, LTR z retroviru a myší metallothioneinI. Volba vhodného vektoru a promotoru spadá do kompetence odborníků v daném oboru.
- 12 CZ 296858 B6
Vynález se rovněž týká hostitelských buněk obsahujících výše popsaný konstrukt. Hostitelskou buňkou může být vyšší eukaryotická buňka, jakou je například savčí buňka, nebo nižší eukaryotická buňka, jakou je například kvasinková buňka, případně může být hostitelskou buňkou prokaryotická buňka, například bakteriální buňka, zavedení konstruktu do hostitelské buňky lze realizovat kalcium fosfátovou transfekcí, DEAE-dextranem mediovanou transfekcí nebo elektroporací (Davis L., Dibner, M., Battey, I., Basic Methods in Molecular Biology, (1986)). Konstrukty v hostitelských buňkách lze použít běžným způsobem k výrobě genového produktu kódovaného rekombinantní sekvencí. Alternativně lze polypeptidy podle vynálezu syntetizovat pomocí běžných peptidových syntetizátorů.
Zralé proteiny lze exprimovat v savčích buňkách, kvasnicích, bakteriích nebo dalších buňkách za řízení vhodnými promotory. Buněk prosté translační systémy lze rovněž použít k výrobě těchto proteinů, přičemž v tomto případě se používají RNA odvozené z DNA konstruktů podle vynálezu. Vhodné klonovací a expresní vektory použitelné v kombinaci s prokaryotickými a eukaryotickými hostiteli popsal Sambrook a kol., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. vydání, (Cold Spring Harbor, N.Y., 1989), zde uveden formou odkazů.
Transkripce DNA kódující polypeptidy podle vynálezu pomocí vyšších eukaryontů se zvýší zavedením sekvence zesilovače do vektoru. Zesilovačem jsou cis-působící prvky DNA, jejichž velikost zpravidla dosahuje přibližně 10 bp až 300 bp, které působí na promotor a zvyšují jeho transkripci. Příklady zahrnují SV40 zesilovač na pozdní straně replikačního původu (100 bp až 270 bp), zesilovač raného promotoru cytomegaloviru, zesilovač polyomu na pozdní straně replikačního původu a zesilovač adenovirů. Rekombinantní expresní vektory budou zpravidla zahrnovat počátky replikace a volitelné markéry umožňující transformaci hostitelské buňky, například gen ampicillinové rezistence n E. coli a S. cerevisiae TRPÍ gen a promotor odvozený z vysoce exprimovaného genu pro přímou transkripci downstream strukturní sekvence. Tyto promotory lze odvodit z operonů kódujících glykolytické enzymy, jakým je například 3-fosfoglycerátkináza (PGK), a faktor, kyselinofosfatáza nebo proteiny tepelného šoku. Heterologická strukturní sekvence se asembluje ve vhodné fázi s translační, iniciační a terminační sekvencí a výhodně je vedoucí sekvence schopna řídit sekreci translatovaného proteinu do periplazmického prostoru nebo extracelulámího média. Heterologická sekvence může případně kódovat fúzní protein zahrnující N-koncový identifikační peptid udílející požadované vlastnosti, například stabilizaci nebo zjednodušenou purifikaci exprimovaného rekombinantního produktu.
Použitelné expresní vektory pro bakteriální použití se konstruují zavedení strukturní DNA sekvence kódující požadovaný protein společně s vhodnými translačními, iniciačními a terminačními signály v řiditelné čtecí fázi s funkčním promotorem. Vektor bude obsahovat jeden nebo více fenotypových volitelných markérů a počátek replikace pro zajištění zachování vektoru a, pokud je to žádoucí, pro poskytnutí amplifikace uvnitř hostitele. Vhodnými prokaryotickými hostiteli pro transformaci jsou například E. coli, Bacillus subtilis, Salmonella typhimurium a různé druhy obsažené v rodech Pseudomonas, Streptomyces a Staphylococcus, nicméně lze použít i další druhy. Použitelné expresní vektory pro bakteriální použití mohou obsahovat volitelný markér a bakteriální počátek replikace odvoditelný z komerčně dostupných plazmidů obsahujících genetické prvky známého klonovacího vektoru pBR322 (ATCC 37017). Tyto komerční vektory zahrnují například pKK223-3 (Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Švédsko) a GEM1 (Promega Biotec, Medison, Wis., USA). Tyto pBR322 „backbone“ sekce jsou zkombinovány s vhodným promotorem a strukturní sekvencí, která má být exprimována.
Po transformaci vhodného hostitelského kmene a růstu hostitelského kmene až do dosažení vhodné buněčné hustoty je zvolený promotor opět potlačen pomocí vhodného prostředku (například teplotního posunu nebo chemické indukce) a buňky se kultivují pro další periodu. Buňky se zpravidla sklízí odstřeďováním, rozrušením pomocí fyzických nebo chemických prostředků a výsledný surový extrakt se uchová pro další purifikaci. Mikrobiální buňky použité při expresi proteinu lze rozrušit pomocí libovolné běžné metody zahrnující cyklické mražení a rozmrazování, sonikaci, mechanické rozrušení nebo použití činidel způsobujících buněčnou lyži.
-13 CZ 296858 B6
Pro expresi rekombinantního proteinu lze použít různé savčí buněčné kultury. Příklady savčích expresních systémů zahrnují COS-7 linie fibroblastů ledvin opice, které opsal Gluzman, Cell 23:175 (1981), a další buněčné linie, které jsou schopny exprimovat kompatibilní vektor, například Cl27, 3T3, CHO, HeL a BHK buněčné linie. Savčí expresní vektory budou obsahovat počátek replikace, vhodný promotor a zesilovač, a rovněž všechna nezbytná místa pro navázání ribozému, polyadenylační místo, místa spoje donoru a akceptoru, transkripční terminační sekvence a 5' lemovou nepřepsanou sekvenci. DNA Sekvence odvozená z SV40 virového genomu, například původ SV40, raný promotor, zesilovač, spoj a polyadenylační místa mohou být použita pro poskytnutí požadovaných nepřepsaných genetických prvků.
Polypeptidy podle vynálezu lze izolovat a purifikovat z rekombinatních buněčných kultur zde použitými metodami zahrnujícími vysrážení síranem amonným nebo ethanolem, kyselinovou extrakci, anionto- nebo kationtoměničovou chromatografií, fosfocelulózovou chromatografií, hydrofobní interakční chromatografií, afínitní chromatografií, hydroxyapatitovou chromatografií a lektinovou chromatografií. Pokud je to nezbytné, lze pro kompletaci konfigurace zralého proteinu použít kroky proteinového refoldingu. Pro finální purifikaci lze na závěr použít vysokovýkonnou kapalnou chromatografií (HPLC).
Polypeptidy podle vynálezu mohou být produktem chemických syntetických postupů nebo je lze připravit rekombinantními technikami z prokaryotického nebo eukaryotického hostitele (například z buněk bakterií, kvasinek, vyšších rostlin, hmyzu a savců v kultuře). V závislosti na hostiteli použité v procesu rekombinantní produkce mohou být polypeptidy podle vynálezu glykosylované cukry savce nebo jiného eukaryotického hostitele nebo mohou být neglykosylované. Polypeptidy podle vynálezu mohou rovněž obsahovat počáteční methioninový aminokyselinový zbytek. Izolovaný nebo purifikovaný polypeptid podle vynálezu nebo jeho biologicky aktivní část, pokud se produkují rekombinantními technikami, je v podstatě prostá biologického materiálu nebo kultivačního média, nebo, pokud se syntetizují chemicky, potom jsou v podstatě prosté chemických prekurzorů nebo jiných chemikálií. Výhodně je izolovaný polypeptid podle vynálezu v podstatě prostý buněčného materiálu a má méně než přibližně 30 % (hmotnosti sušiny) nepolypeptidu neboli kontaminujícího materiálu. Pokud se polypeptid podle vynálezu nebo jeho biologicky účinná část produkuje rekombinantním způsobem, potom kultivační médium výhodně reprezentuje méně než přibližně 30 % obj. připravovaného polypeptidu. Pokud se polypeptid podle vynálezu produkuje chemickou syntézou, potom obsahují přípravky výhodně méně než přibližně 30 % hmotn. sušiny chemických prekurzorů nebo jiných vedlejších produktů a příměsí.
Polypeptidy podle vynálezu lze běžně izolovat způsoby popsanými v níže uvedených příkladech. Přípravek purifikovaného polypeptidu má alespoň přibližně 70% čistotu; výhodně mají tyto přípravky 85% až 99% čistotu. Čistotu přípravků lze stanovit libovolným v daném oboru známým způsobem, například SDS-polyakrylamidovou gelovou elektroforézo a hmotovou spektroskopií/kapalinovou chromatografií.
Polynukleotidová sekvence kódující polypeptid podle vynálezu lze syntetizovat celý nebo jeho část, za použití v daném oboru známých chemických metod (viz například, Caruthers a kol., Nucl. Acids Res. Symp. Ser. 215-223, 1980; Hom a kol., Nucl. Acids Res. Symp. Ser 225-232, 1980). Polynukleotid, který kóduje polypeptid, lze následně klonovat do expresního vektoru pro expresi polypeptidu.
Jak bude odborníkům v daném oboru zřejmé, může být výhodné produkovat polypeptid kódující nukleotidové sekvence vykazující kodony, které se nevyskytují přirozeně. Například kodony preferované konkrétním prokaryotickým nebo eukaryotickým hostitelem lze zvolit tak, aby zvyšovaly hodnotu exprese polypeptidu nebo produkci RNA transkriptu majícího požadované vlastnosti, například poločas života, který je delší než poločas života transkriptu generovaného z přirozeně se vyskytující sekvence.
- 14CZ 296858 B6
Zde popsanou nukleotidovou sekvenci lze geneticky zpracovat za použití v daném oboru obecně známých metod tak, že se změní polypeptid kódující sekvence, a to z celé řady různých důvodů, přičemž tyto změny zahrnují změny, které modifikují uzavírání, zpracování a/nebo expresi polypeptidového nebo mRNA produktu. Pro genetické zpracování nukleotidové sekvence lze použít DNA tvořenou nahodilou fragmentací a PCR přeskupením genových fragmentů a syntetických oligonukleptidů. Například místně směrovaný mutagenezi lze použít pro zavedení nových restrikčních míst, změnu glykosylačních vzorů, změnu kodonové preference, produkci sestřihových variant, zavedení mutací atd.
Alternativně lze polypeptidy podle vynálezu produkovat za použití chemických metod syntetizujících jejich aminokyselinovou sekvenci, například přímou peptidovou syntézou za použití technik v pevné fázi (viz například Merrifield, J. Am. Chem. Soc. 85, 2149-2154, 1963; Roberge a kol, Science, 269, 202-204, 1995). Syntézu polypeptidů lze provádět manuálními technikami nebo automatizovanými technikami. K automatizovaným syntézám lze použít například Applied Biosystems 431A peptidový syntetizátor (Perkin Elmer). Fragmenty polypeptidů lze případně syntetizovat samostatně a následně kombinovat za použití chemických metod produkujících celodélkovou molekulu.
Nově syntetizovaný polypeptid lze v podstatě purifikovat preparativní vysoce výkonovou kapalinovou chromatografíí (viz například Creighton, PROTEINS: STRUCTURES AND MOLECULAR PRINCIPLES, WH Freeman and. Co., New York, N.Y., 1983). Kompozice syntetického polypeptidů podle vynálezu lze potvrdit aminokyselinovou analýzou nebo sekvencováním, například Edmanovým degradačním postupem (viz Creighton, viz výše). Kromě toho lze za použití chemických metod libovolné části aminokyselinové sekvence polypeptidů během přímé syntézy střídat a/nebo kombinovat se sekvencí z dalších proteinů za vzniku varianty polypeptidů nebo fúzního polypeptidů.
Polypeptidy podle vynálezu, které mají schopnost stimulovat sekreci inzulínu z pankreatických ostrůvkových buněk in vitro a způsobovat snížení glukózy v krvi in vivo, lze použít pro léčení diabetů typu 2 (non-inzulínově dependentní diabetes mellitus). Tyto polypeptidy podle vynálezu lze u subjektů s narušenou glukózovou tolerancí rovněž použít jako prevenci proti rozvoji diabetů typu 2. Kromě toho lze polypeptidy podle vynálezu léčit astma (Bolin a kol., Biopolymer 37:57-66 (1995); patent US 5 677 419) (ukazuje, že polypeptid R3P0 je aktivní při uvolnění tracheálního hladkého svalstva u morčat); indukci hypotenze (VIP indukuje hypotenzi, tachykardii, a faciální zarudnutí u astmatických pacientů (Marice A.H. a Sever P.S., Peptides 7:279-280 (1986); Morice A. a kol., The Lancet Π, 1225-1227 (1983)), při problémech s mužskou neplodností (Siow Y. a kol., Effects of vasoactive intestinal peptide on human sperm motility, Arch, Androl., červenec až srpen 1999; 43(1): 67-71); jako antiapoptózní/neuroprotekční činidla (Brenneman D.E. a kol., VIP neurotrophism in centrál nervous systém: multiple effectors and identifícation of a femtomolar-acting neuroprotective peptide, Ann. N.Y. Acad. Sci., 11 .prosince 1998; 865: 207-12); při kardioprotekci během ischemických příhod (Kalfin R. a kol., Protective role of intracoronary vasoactive intestinal peptide in ischemic and reperfused myocardium, J, Pharmacol. Exp. Ther., únor 1994; 268(2):952-8; Das D.K. a kol., Coordinated role of vasoactive intestinal peptide and nitric oxide in cardioprotection, Ann. N.Y. Acad. Sci., 11. prosinec 1998; 865:297-308) a konečně jako protivředové činidlo (Tuncel a kol., The protective effect of vasoactive intestinal peptide (VIP) on stress-induced gastric ulceration in rats, Ann. N.Y. Acad. Sci., prosinec 1998; 865:309-22),
Polypeptidy podle vynálezu lze použít v kombinaci s vhodným farmaceutickým nosičem pro přípravu farmaceutické kompozice pro parenterální podání. Tyto kompozice obsahují terapeuticky účinné množství polypeptidů a farmaceuticky přijatelný nosič nebo excipient. Takový nosič zahrnuje neomezujícím způsobem solný roztok, pufrovaný solný roztok, dextrózu, vodu, glycerol, ethanol a jejich kombinace. Formulace by měly vyhovovat způsobu podání. Vynález rovněž poskytuje farmaceutický balíček nebo kit obsahují jednu nebo více nádobek naplněných jednou nebo více ingrediencemi farmaceutických kompozic podle vynálezu. Součástí této nádobky
- 15CZ 296858 B6 (těchto nádobek) může být příbalový leták ve formě předepsané státním Úřadem regulujícím výrobu, použití nebo prodej farmaceutik nebo biologických produktů, přičemž tento leták odráží souhlas Úřadu s výrobou, použitím nebo prodejem pro humánní medicínu. Kromě toho mohou být polypeptidy podle vynálezu použity ve spojení s dalšími terapeutickými sloučeninami.
Farmaceutické kompozice lze podávat libovolným vhodným způsobem, například orálně, topicky, intravenózně, intraperitoneálně, intramuskulámě, subkutánně, intranazálně nebo intradermálně. Farmaceutické kompozice se podávají v množství, které je účinné při léčbě a/nebo profylaxi specifické indikace. Obecně se podávají v množství alespoň přibližně 350 ng (0,1 nmol)/kg tělesné hmotnosti a ve většině případ budou podávány v množství nepřesahujícím přibližně 35 pg (10 nmol)/kg tělesné hmotnosti na den. Ve většině případů dávku tvoří přibližně 0,1 pg/kg až přibližně 100 mg/kg tělesné hmotnosti denně, vezme-li se v úvahu způsob podání, příznaky atd. Tato čísla nezahrnují biologickou dostupnost peptidu in vivo. V případě, že by se tato biologická dostupnost brala v úvahu, bylo by toto číslo o něco vyšší, případně nižší. Odborník v daném oboru je schopen stanovit pomocí dávkových experimentů nebo dalších běžných prostředků hrubý odhad množství, které je třeba použít pro přípravu účinné dávky.
Polypeptid podle vynálezu lze v rámci vynálezu rovněž použít tak, že se exprimuje in vivo, přičemž toto využití se zpravidla označuje jako „genová terapie“. Buňky lze tedy například zmanipulovat polynukleotidem (DNA nebo RNA) kódujícím polypeptidy ex vivo a zmanipulované buňky se následně darují pacientovi, který má být léčen polypeptidem. Tyto metody jsou v daném oboru známy. Buňky lze například zpracovat v daném oboru známými postupy, které využívají retrovirové částice obsahující RNA kódující polypeptid podle vynálezu.
Lokální doprava činidla stimulujícího produkci inzulínu při použití genové terapie může dopravit terapeutické činidlo do cílové oblasti, tj. do slinivky. Pro vytvoření myšího modelu β-buněčného pankreatického tumoru se například použije pankreaticky specifický promotor (Hanahan D., Heritable formation of pancreatic beta-cell tumors in transgenic mice expressing recombinant insulin/simian virus 40 oncogenes, Nátuře 315 (6015):115-22 (1985)).
V úvahu se berou jak in vitro, tak in vivo genové terapeutické metodologie. Několik metod přenosu potenciálně terapeutických genů do definovaných buněčných populací jsou známy. Viz například Mulligan, „The Basic Science Of Gene Therapy“, Science, 260:926-31 (1993). Tyto metody zahrnují:
1) Přímý přenos genu, viz například Wolff a kol., „Direct Gene transfer Into Mouše Muscle In Vivo“, Scince, 247:1465-68 (1990);
2) Lipozomy mediovaný přenos DNA, viz například Caplen a kol., „Liposome-mediate CFTR Gene Transfer To the Nasal Epithellium of Patients With Cystic Fibrosis“, Nátuře Med., 3.39-46 (1995); Cryslatal, „The Gene As A Drug“, Nátuře Med. 1:15-17 (1995); Gao a Huang, „A Novel Cationic Liposome Reagent For Effícient Transfection Of Mammalian Cells“, Biochem. Biophys. Res. Comm., 179:280-85 (1991);
3) Retrovirem mediovaný přenos DNA, viz například Kay a kol., „In Vivo Gene Therapy OfHemophilia B: Sustained Partial Correction In Factor IX-Defícient Dogs“, Science, 262:117-19 (1993); Anderson, „Human Gene Therapy“, Science“, 256:808-13 (1992).
4) DNA Virem mediovaný přenos DNA. Takové DNA viry zahrnují adenoviry (výhodně vektory na bázi Ad-2 nebo Ad-5), herpesviry (výhodně vektory na bázi herpes simplex viru) a parvoviry (výhodně vektory na bázi „defektních“ nebo non-autonomních parvovirů, výhodněji vektory na bázi adeno-asociovaného viru, nejvýhodněji vektory na bázi AAV-2). Viz například Ali a kol., „The Use Of DNA Viruses As Vectors For Gene Therapy“, Gene Therapy, 1:367-84 (1994); patent US 4 797 368, zabudovaný zde formou odkazu, a patent US 5 139 941, zabudovaný zde formou odkazu.
- 16CZ 296858 B6
Volba konkrétního vektorového systému pro přenos požadovaného genu bude záviset na celé řadě různých faktorů. Jedním důležitým faktorem je povaha cílové buněčné populace. Přesto, že retrovirové vektory byly poměrně extenzivně studovány a použity v určitém počtu genovým terapeutickým aplikací, nejsou tyto vektory zpravidla vhodné pro infikaci nedělených buněk. Kromě toho mají retroviry potenciál pro onkogenicitu. Nicméně nedávný vývoj na poli lentivirových vektorů může obejít některá z těchto omezení. Viz Naldini a kol., In vivo gene delivery and stable transduction of nondividing cells by a lentiviral vector, Science 272:263-7 (1996).
Retroviry, ze kterých lze výše uvedené retrovirové plazmidové vektory odvodit, zahrnují neomezujícím způsobem virus Moloneyho myší leukémie, virus nekrózy, sleziny, retrovirus, jakým je například virus Rousova sarkomu, virus Harveyova sarkomu, virus ptačí leukózy, virus leukémie gibbona, HIV, adenoviru, virus myeloproliferačního sarkomu a virus tumoru prsní žlázy. U jednoho provedení je retro virovým plazmidovým vektorem vir odvozený od viru Moloneyoho myší leukémie.
Adenoviry mají výhodu vtom, že mají široké hostitelské možnosti, mohou infikovat inaktivní buňky nebo buňky v závěrečném stádiu diferenciace, například neurony nebo hepatocyty, a zdají se být v podstatě neonkogenní. Viz například Ali a kol., viz výše, str. 367. Nezdá se, že by se adenoviry integrovaly do genomu hostitele. Protože existují extrachromozomálně,riziko vkládací mutageneze je značně zredukované. Ali a kol., viz výše, str. 373.
Adeno-asociované viry vykazují podobné výhody jako vektory na bázi adenovirů. Nicméně AAV vykazují místně specifickou integraci na lidském chromozómu 19 (Ali a kol., viz výše, str. 377).
U výhodného provedení se DNA kódující polypeptid stimulující produkci inzulínu podle vynálezu použije v rámci genové terapie při léčbě takových poruch, jakou je například diabetes.
Podle tohoto provedení se genová terapie využívající DNA kódující polypeptid stimulující produkci inzulínu nebo muteiny podle vynálezu aplikuje u pacienta, který tuto terapii potřebuje, souběžně nebo bezprostředně po určení diagnózy.
Odborník v daném oboru si je vědom, že v rámci vynálezu lze použít libovolný vhodný genově terapeutický vektor obsahující polypeptid stimulující produkci inzulínu, DNA nebo DNA fragmentu, derivátu nebo varianty polypeptidu stimulujícího produkci inzulínu. Techniky konstrukce takového vektoru jsou známy. Viz například Anderson W.F., „Human Gene Therapyů, Nátuře, 392:25-30 (1998); Verma I.M. a Somia N„ „Gene Therapy - Promises, Problems, and Prospects“, Nátuře, 389:239-242 (1998). Zavedení vektoru obsahujícího DNA polypeptidu stimulujícího produkci inzulínu do cílového místa lze realizovat za použití běžných technik.
Vektor zahrnuje jeden nebo více promotorů. Vhodné promotory, které lze použít, zahrnují neomezujícím způsobem retrovirový LTR; SV40 promotor; a promotor lidského cytomegaloviru (CMV); popsaný vMiller a kol., Biotechniques, 7(9):980-990 (1989), nebo libovolný další promotor (například celulámí promotory, jako například eukaryotické celulární promotory zahrnující neomezujícím způsobem histon, pol III a β-aktinový promotor). Další virové promotory, které lze použít, zahrnují neomezujícím způsobem promotory adenoviru, promotory thymidinkinázy (TK) a promotory B19 parvoviru. Volba vhodného promotoru bude odborníkům v daném oboru zřejmá po prostudování zde popsaných technik.
Nukleokyselinová sekvence kódující polypeptid podle vynálezu je řízena vhodným promotorem. Vhodné promotory, které lze použít, zahrnují neomezujícím způsobem adenovirové promotory, například adenovirový hlavní pozdní promotor; nebo heterologické promotory, například promotor cytomegaloviru (CMV); promotor viru respiračního syncytia (RSV); indukovatelné promotory, například MMT promotor, promotor metallothioneinu; promotory tepelného šoku; pro
- 17CZ 296858 B6 motor albuminu; promotor ApoAI; promotory lidského globinu; promotory virové thymidinkinázy, například herpes simplex promotor thymidinkinázy; retrovirová LTR (včetně modifikovaných výše popsaných retrovirových LTR); promotor β-aktinu; a promotory lidského růstového hormonu. Promotorem může být rovněž nativní promotor, který řídí gen kódující polypeptid.
Retrovirový plazmidový vektor se použije pro transdukční balení buněčných linií za vzniku produkčních buněčných linií. Příklady balení buňky, kterou lze transfektovat, zahrnují neomezujícím způsobem PE501, PA317, ψ-2, ψ-ΑΜ, PA12, T19-14X, VT-19-17-H2, qCRE, igCRIP, GP+4-86, GP+envAml2 a DAN buněčnou linii, které popsal Miller vHuman Gene Therapy, 1:5-14 (1990), zde zabudováno formou odkazu. Vektor může transdukovat balení buňky přes libovolný v daném oboru známý prostředek. Tento prostředek zahrnuje neomezujícím způsobem elektroporaci, použití lipozomů a CaPO4 precipitaci. U jedné alternativy lze retrovirový plazmidový vektor zapouzdřit do lipozomů nebo navázat do kapaliny a následně aplikovat do hostitele. Produkční buněčná linie generuje infekční částici retrovirového vektoru, která obsahuje nukleokyselinovou sekvenci(e) kódující polypeptidy. Tyto částice retrovirového vektoru lze následně použít pro transdukci eukaryotických buněk buď in vitro, nebo in vivo. Tyto transdukované eukaryotické buňky budou exprimovat nukleokyselinovou sekvenci(e) kódující polypeptid. Eukaryotické buňky, které lze transdukovat, zahrnují neomezujícím způsobem embryonální karcinomové buňky, a stejně tak hematopoietické kmenové buňky, hepatocyty, fibroblasty, myoblasty, karatinodyty, endoteliální buňky a bronchiální epiteliální buňky.
Odlišným přístupem genové terapie je „transkaryotická terapie“, při které jsou buňky pacienta ošetřeny ex vivo s cílem indukovat latentní chromozómové geny a produkovat požadovaný protein po znovuzavedení do těla pacienta. Transkaryotická terapie předpokládá, že jednotlivec má normální komplement genů nezbytných pro aktivaci. Transkaryotická terapie zahrnuje zavedení promotoru nebo jiné exogenní regulační sekvence schopné aktivovat vznikající geny do chromozomální DNA buňky pacienta ex vivo, kultivaci a selekci na aktivní protein produkující buňky a následné zpětné zavedení aktivované buňky do těla pacienta s předpokladem, že budou následně zcela přijaty tělem pacienta. „Genem aktivované“ buňky budou následně po určitou významnější dobu, pravděpodobně po dobu života pacienta, produkovat požadovaný protein. Tento koncept podrobně popisují patenty US 5 641 670 a US 5 733 761, zde zabudovaný formou odkazů.
Vynález bude lépe pochopen po prostudování následujících příkladů provedení vynálezu, které mají pouze ilustrativní charakter a nikterak neomezují rozsah vynálezu, jenž je jednoznačně vymezen přiloženými patentovými nároky.
Příklady provedení vynálezu
Příklad 1
Protokol pro izolaci ostrůvků z těla krys
Krysy Sprague Dawley (275 g až 320 g) se použily jako zdroj donorových ostrůvků. Stručně řečeno, slinivka se naplnila 10 ml studeného rekonstituovaného enzymu Liberase Rl (Boehringer Manheim), ostrůvky se sklidily a 30 min inkubovaly dalšími 5 ml enzymatického roztoku ve vodní lázni. Tkáňová suspenze se 2x propláchla studeným 10% FBS/Hanksovým pufrem (Gibco), resuspendovala v 8 ml 25% ficoll (Sigma) a následně rozvrstvila 5 ml 23%, 20% a 11% ficoll. Ostrůvky ve 20% vrstvě se po odstředění izolovaly, 2x propláchly 10% FBS/Hankovým pufrem a resuspendovaly v 10% FBS/RPMI 1640 médiu (Sigma).
-18CZ 296858 B6
Příklad 2
Protokol pro analýzy peptidem indukovaného zvýšení hladiny inzulínu u krys
Krysy Wistar se nechaly přes noc vyhladovět (17 h) a následně se provedla anestézie pentobarbitálem (0,1 ml/100 g BW). Glukóza (0,4 g/kg rozpuštěná v 1% roztoku lidského albuminu v solném roztoku) +/- peptid (rozpuštěný v 1% roztoku lidského albuminu v solném roztoku) se vstříkl intravenózně do ocasní žíly.
Krysám se 1 min po injekci z oka odebralo 50 μΐ až 100 μΐ plazmy, která se analyzovala na hladinu inzulínu pomocí Lineo RIA kitu (Lineo Research, lne., St. Charles, MO).
Příklad 3
Protokol pro určení vlivu peptidů na intraperitoneální tolerance glukózy u krys
Krysy Wistar se nechaly přes noc hladovět a následně se znecitlivěly pentobarbitálem. Krysám se odebrala krev z oka (čas nula) a do ocasní žíly se pomocí injekce aplikoval peptid (v 1% roztoku lidského albuminu). O 5 min později se pomocí intraperitoneální injekce aplikoval 1 g/kg glukózy (v solném roztoku) a po 15 min, 30 min a 60 min se provedl odběr krve z oka. Hladina glukózy v plazmě se určila za použití autoanalyzéru Technicon Axon, od divize Bayer Diagnostics společnosti Bayer Corporation, Tyrrytown NY, a za použití metody č. SM4-2143F90 „Glucose“.
Příklad 4
Protokol pro určení vlivů peptidů na zadržování intestinální vody u krys
Samečci krys se nechali 24 h hladovět a 2 h až 3 h před zahájením experimentu se jim odebraly jejich lahve s vodou. Peptid nebo solný roztok se indikoval subkutánně do těla krys s provedenou anestézií. Krysy se usmrtily CO2 10 min po podání dávky peptidu a tenké střevo se vyřízlo a zvážilo (1). Střevo se otevřelo řezem, voda v průsvitu se absorbovala filtračním papírem a střevo se opět zvážilo (2). Množství intestinální vody (g) = hmotnost (1)- hmotnost (2).
Příklad 5
Metodologie syntézy peptidu
Pro syntézu některých polypeptidů podle vynálezu se použil následný obecný postup. Pro syntézu peptidu se použije FMOC/t-butylová strategie (Peptide Synthesis Protokols (1994), svazek 35 od Michaela W. panningtona & Bena M. Dunna), podmínky kontinuálního tečení a Rapp-Polymere PEG-polystyrenové pryskyřice (Rapp-Polymere, Tubingen, Německo). Po ukončení syntézy se peptidy odštěpí od pryskyřice a zbaví ochranných skupin pomocí TFA/DTT/H2O triizopropylsilanu (88/5/5/2). Peptidy se vysráží z koktejlu získaného štěpení pomocí studeného diethyletheru. Sraženina se třikrát propláchne studeným etherem a následně se rozpustí v 5% roztoku kyseliny octové a lyofilizuje. Peptidy se analyzují chromatografií s reverzní fází na koloně YMC-Pack ODS-AQ (YMC, lne., Wilmington, NC) na systému Waters ALLIANCE (Waters Corporation, Milford, MA) za použití eluční soustavy tvořené vodou a acetonitrilem s 3% TFA jako gradientem od 0 % do 100 % acetonitrilu a MALDI hmotovou spektrometrií na VOYAGER DE MALDI hmotovém spektrometru, (model 5-2386-00, PerSeptive BioSystems, Framingham, MA). Kmatrix pufru 1/1 se přidá (50/50 dH2O/acetonitril s 3% roztokem TFA) vzorek matrix pufrovaného peptidu. Tyto peptidy nesplňují kritéria kladená na čistotu, která má být vyšší než
-19CZ 296858 B6
95%, se purifikují chromatografíí s reverzní fází na HPLC systému Waters Delta Prep 4000 (Waters Corporation, Milford, MA).
Příklad 6
Klonování peptidů
Pokusy o rekombinantní expresi VIP měly doposud smíšené výsledky. Simoncsits a kol. (Eur. J. Biochem. 178: 343-350, (1988)) exprimoval Leu17, Gly29-VIP nebo Leu17Gly29Lys30-VIP jako C-terminační fúzi na N-koncovou část E. coli β-galaktosidázový gen v£. coli. Odstranění methioninu v poloze 17 eliminuje CNBR štěpné místo. C-Koncová adice Gly nebo Gly-Lys-Arg byla navržena pro potenciál in vivo C-koncovou amidaci savčí PAMázy. Po CNBR štěpení fúzních proteinů na methioninu se zavedl N-konec na VIP mutanty, volné VIP mutanty se purifikovaly a ukázalo se, že vykazují podobné aktivity jako nativní VIP, nicméně aktivity se měřily pouze za nasycených koncentrací peptidů. Raingeaud a kol. (Biochemie 78:14—25 (1996)) exprimoval VIP jako polymerní C-koncové fúze na glutathion S-transferáze (GST) v E. coli. Volné polymerní nebo monomemí VIP peptidy se uvolnily po sekvenčních štěpeních pomocí faktoru Xa a hydroxylaminu. Požadavek na dvoustupňové štěpení vedl k neúčinnosti a získání směsi produktů. Polymerní nebo monomemí VIP peptidy produkované tímto postupem byly méně aktivní než nativní VIP. Vylepšená verze konstruktu využívá pouze štěpení pomocí faktoru Xa, které poskytlo VIP mutant s prodloužením C-konce sedmi zbytky, přičemž tento VIP mutant je rovněž méně aktivní než nativní VIP (Ottavi a kol., Biochemie 80:289-293 (1998)). Žádná exprese PACAP nebyla doposud zaznamenána. Po určení masivního způsobu exprese PACAP, VIP a jejich mutantů se jejich genetické kódy nakloňují na C-konec GST pomocí jediné separace monomerního peptidů s GST za použití rozpoznávacího místa faktoru Xa. Gen kódující rozpoznávací místo pro faktor Xa navázaný na DNA sekvenci peptidů, který se má připravit, se syntetizuje hybridizaci dvou překrývajících se jednořetězcových DNA fragmentů (70-90mery) obsahujících Bam Hl nebo Xho I restrikční enzymové místo bezprostředně za 5' na DNA sekvenci genu, který má být klonován, načež následuje DNA syntéza protilehlých řetězců přes velký fragment DNA polymerázy I (Life Technologies, lne., Gaithersburg, MD). Sekvence DNA, zvolená pro každý gen, je založena na reverzní translaci navržené aminokyselinové sekvence každého peptidů. V některých případech se gen kódující peptid generuje PCR mutagenezí (Picard V. a kol, Nucleic Acids Res 22:2587-91 (1994); Sambrook J., Fritsch, E.F. & Maniatis T. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. vydání, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York) genu již vyrobeného výše popsanou metodou. Dvoušroubovice produktu se následně digeruje Bam Hl a Xho I a liguje do pGEX-6P-l (Amersham Pharmacia Biotech), který by rovněž štěpen jako Bam Hl a Xho I. Seznam sekvencí DNA klonovaných peptidových genů je na obr. 8.
Pokud se například DNA sekvence SEQ ID NO: 54, 55, a 56 nakloňují do pGEX-6P-l, potom se polypeptidové sekvence exprimují jako fúze z glutathion S-transferázy (GST):
PACAP38: IEGRHSDGIFTCSYSRYRKQMAVKKYLAAVLGKRYKQRVKNK (SEQ ID NO: 2)
VIP: IEGRHSDAVFTDNYTRLRKQMAVKKYLNSILN (SEQ ID NO: 1)
R3P3: IEGPBSDAVFTENYTKLRKQLAAKKYLNDLKKGGT (SEQ ID NO: 8)
Příklad 7
Rekombinantní exprese a purifíkace peptidů
Buňky BL21 (Stratagene) transformované GST-peptidovou fúzí obsahující plazmidy se pěstovaly při teplotě 37 °C, dokud OD600 nedosáhlo 0,6 až 1,0 a 2 h se při teplotě 37 °C indukovaly 1
-20CZ 296858 B6 mM IPTG (Life Technologies). 2 Litry buněk se 15 min odstřeďovaly při 7700 g, zvážily, a alespoň 3 h se skladovaly při teplotě -20 °C. Zmrazené buněčné pelety se resuspendovaly ve 100 ml ledové studené PBS s 250 μΐ proteázového inhibičního koktejlu (Kat. č. P-8465, Sigma Chemical) na 1 g buněk a 3x 1 min sonikovaly s 15s přestávkami. Buněčné úlomky se odstřeďovaly 20 min při 10 000 g. Supernatant se při 4 °C přes noc mísil na protřepávačce se 2 ml 50% roztoku pryskyřice Glutathione Sepharose 4B (Pharmacia). Pryskyřice se 15 min odstřeďovaly při 1500 G, zavedly do prázdných Poly-Prep chromatografíckých kolon (Bio-Rad), propláchly 30 ml PBS a následně 10 ml pufru faktoru Xa (1 mM CaCl2, 100 mM NaCl, a 50 mM Tris-HCl, pH 8,0). Peptidy se přes noc při 4 °C štěpily z kolony 60ti jednotkami faktoru Xa (Pharmacia) v 1 ml pufrového faktoru Xa na C18 HPLC (Backham Systém Gold) za použití 2 ml smyčky a rychlosti proudění 2 ml/min s následujícím programem: 10 min pufr A (0,1% TFA/H2O), 30 min gradient ku pufru B (0,1% TFA/ACN), 10 min pufr A, 10 min gradient a 10 min pufr A. Píkové frakce (1 ml každý) se jímaly a screenovaly 10% až 20% Tricin-SDS gelovou elektroforézou. Frakce obsahující peptidy, jejichž seznam uvádí tabulka 1, se jímaly a sušily. Za typické výtěžky se považuje několik set mikrogramů volných peptidů na 1 litr kultury E. coli. Ukázalo se, že rekombinantní peptidy mají stejné aktivity jako jejich syntetické verze.
Následující tabulka obsahuje některé zvolené polypeptidy vyrobené za použití výše diskutovaného protokolu pro syntézu peptidu (příklad 5) nebo vyrobené rekombinantním způsobem, viz příklad 7. Peptidy vyrobené rekombinantním způsobem jsou označeny malým písmem „r“ před označením peptidu. Peptidy produkované jak rekombinantním tak syntetickým způsobem jsou označeny hvězdičkami (*) vedle čísla peptidu. Peptidy R3P0 a P3P4 popsal Bolin a kol. (Biopolymers 37:57-66 (1995); patent US 5 677 419).
-21 CZ 296858 B6
Tabulka 1
Peptid č. | Sekvence | SEQ ID NO |
R3P0 | Ac-HSDAVFTENYTKLRKQNIeAAKKYLNDLKKGGT-NH2 | 5 |
R3P1 | Ac-HSDAVFTENYTKLRKQLAAKKYLNDLKKGGT-NH2 | 6 |
R3P2 | Ac-HSDAVFTENYTKLRKQLAAKKYLNDLKKGGT | 7 |
rR3P3* | HSDAVFTENYTKLRKQLAAKKYLNDLKKGGT | 8 |
R3P4 | Ac-HSDAVFTEN (CH3O-Y) TKLRKQNIeAAKKYLNDLKK-NH2 | 9 |
R3P5 | HSDAVFTENYTKLRKQLAAKKYLNDLKK | 10 |
R3P8 | HSDAVFTDNYTRLRKQMAVKKYLNSIKK-NHn | 11 |
rR3P9* | HSDAVFTDNYTRLRKQMAVKKYLNSIKKGGT | 12 |
R3P1 0 | HSDAVFTENYTKLRKQLAAKKYLNDLLNGGT | 13 |
R3P11 | HSDAVFTDNYTKLRKQLAAKKYLNDILNGGT | 14 |
R3P12* | HSDAVFTDNYTRLRKQLAAKKYLNDIKKGGT | 15 |
R3P13 | HSDAVFTDNYTRLRKQLAAKKYLNDIKK-NH2 | 16 |
R3P14 | H S DAVFT DN YT RLRKQMAVKKYLN DLKKGGT | 17 |
R3P19 | SDAVFTENYTKLRKQLAAKKYLNDLKKGGTSWCEPGWCR | 18 |
R3P20 | HSDAVFTDNYTRLRKQMAAKKYLNDIKKGGT | 19 |
R3P21 | HSDAVFTDNYTRLRKQLAVKKYLNDIKKGGT | 20 |
R3P22 | HSDAVFTDNYTRLRKQLAAKKYLNSIKKGGT | 21 |
R3P24 | HSDAVFTDNYTRLRKQLAAKKYLNDIKNGGT | 22 |
R3P25 | HSDAVFTDNYTRLRKQLAVKKYLNSIKKGGT | 23 |
R3P26 | H S DAVFT DN YT RLRKQMAAKKYLN SIKKGGT | 24 |
R3P29 | HSDAVFTDNYTRLRKQLAVKKYLNDIKNGGT | 25 |
R3P30 | HSDAVFTDNYTRLRKQLAAKKYLNSIKNGGT | 26 |
R3P31 | HSDAVFTDNYTRLRKQLAAKKYLNDIKKGG | 27 |
R3P32 | HSDAVFTDNYTRLRKQLAAKKYLNDIKKG | 28 |
rR3P33* | HSDAVFTDNYTRLRKQLAAKKYLNDIKK | 29 |
R3P34 | HSDAVFTDNYTRLRKQLAAKKYLNDIKKQ | 30 |
R3P35 | H S DAV FT DN YT RLRKQLAAKKYLN DlKKNQ | 31 |
R3P36 | HSDAVFTDNYTRLRKQLAAKKYLNDIKKKRY | 32 |
rR3P41 | HSDAVFTDNYTRLRKQMAVKKYLNSIKK | 33 |
rR3P42 | HS DAVFT DNYTRLRKQMAVKKYLNSIKN | 34 |
rR3P43 | HSDAVFTDNYTRLRKQMAVKKYLNSILK | 35 |
rR3P44 | HSDAVFTDNYTELRKQMAVKKYLNSILN | 36 |
rR3P45 | HSDAVFTDNYTRLREQMAVKKYLNSILN | 37 |
rR3P46 | HSDAVFTDNYTRLRKQLAVKKYLNSILN | 38 |
rR3P47 | HSDAVFTDNYTRLRKQMAAKKYLNSILN | 39 |
rR3P48 | HSDAVFTDNYTRLRKQMAVKKYLNDILN | 40 |
rR3P49 | HSDAVFTDNYTRLRKQMAAKKYLNSIKN | 41 |
rR3P50 | HSDAVFTDNYTRLRKQMAAKKYLNSILK | 42 |
rR3P51* | H S DAVFT DNYTRLRKQMAAKKYLNSIKK | 43 |
rR3P52 | HSDAVFTDNYTRLRKQMAAKKYLNSIKKKRY | 44 |
rR3P53* | HSDAVFTDNYTRLRKQMAAKKYLNSIKKKR | 45 |
-22CZ 296858 B6
Tabulka 1 - pokračování
rR3P54 | HSDAVFTDNYTRLRKQMAAKKYLNSIKKK | 46 |
rR3P55·*· | HSDAVFTDNYTRLRKQMAAKKYLNSIKNKRY | 47 |
rR3P56 | H S DAVFTDN YTRLRKQMAVKKYLNSIKKKRY | 48 |
Γ.Η3Ρ57 | HSDAVFTDNYTRLRKQMAVKKYLNSIKKKR | 49 |
rR3P58 | HSDAVFTDNYTRLRKQMAVKKYLNSIKKK | 50 |
rR3P59 | HSDAVFTDNYTRLRKQMAVKKYLNSIKNKRY | 51 |
rR3P60 | HSDAVFTDNYTRLRKQVAAKKYLQSIKK | 52 |
rR3P61 | HSDAVFTDNYTRLRKQIAAKKYLQTIKK | 53 |
R3P6 | HSDGIFTESYSRYRKQMAVKKYLAALKKKRYKQRVKNK | 57 |
R3P7 | HSDAVFTENYTRLRKQMAVKKYLNSLKK-NH2 | 58 |
R3P15 | hsdgiftdsysryrkqmavkkylsavrhgqt-nh2 | 59 |
R3P16 | hsdgiftdsysryrkqmavkkylaavkqggt-nh2 | 60 |
R3P17 | HSDGIFTDSYSRYRKQMAVKKYLAAVKKYLAAVRHG-NH2 | 61 |
R3P18 | WCEPGWCRHSDAVFTENYTKLRKQLAAKKYLNDLKKGGT | 62 |
R3P23 | HSDAVFTDNYTRLRKQLAAKKYLNDILKGGT | 63 |
R3P27 | HSDAVFTDNYTRLRKQLAAKKYLNDILNGGT | 64 |
R3P28 | HSDAVFTDNYTRLRKQLAVKKYLNDILKGGT | 65 |
R3P37 | HSDGIFTDSYSRYRKQLAAKKYLADVKKGGT | 66 |
R3P38 | HSDGIFTDSYSRYRKQLAAKKYLADVKK | 67 |
R3P3 9 | HSDGIFTDSYSRYRKQLAVKKYLAAVKK | 68 |
R3P40 | HSDGIFTDSYS RYRKQMAVKKY LAAVKK | 69 |
R3P62 | HS DAV FT DNYT RLRKQVAAKKYLNSIKK | 70 |
R3P65 | HSDAVFTDNYTRLRKQMAAKKYLNSIKNKR | 71 |
R3P66 | HSDAVFTDNYTRLRKQVAAKKYLQSIKNKRY | 72 |
R3P67 | HSDAVFTDNYTRLRKQLAAKKYLNTIKNKRY | 73 |
R3P69 | HSDAVFTDNYTRLRKQVAAKKYLNSIKNKRY | 74 |
R3P69 | HSDAVFTDNYTRLRKQMAAKKYLQSIKNKRY | 75 |
R3P70 | HSDAVFTDNYTRLRKQMAAKKYLNTIKNKRY | 76 |
R3P71 | HSDAVFTDQYTRLRKQMAAKKYLNSIKNKRY | 77 |
R3P72 | HSDAVFTDQYTRLRKQLAAKKYLNTIKNKRY | 78 |
R3P73 | HSDAVFTDNY7RLRKQMAAHKYLNSIKNKRY | 79 |
R3P7 4 | HSDAVFTDNYTRLRKQMAAKHYLNSIKNKRY | 80 |
R3P75 | HSDAVFTDQYTRLRKQLAAHKYLNTIKNKRY | 81 |
R3P76 | HSDAVFTDQYTRLRKQLAAKHYLNTIKNKRY | 82 |
R3P7 7 | HSDAVFTDNYTRLRKQVAAKKYLQSIKKKR | 83 |
R3P78 | HSDAVFTDNYTRLRKQVAAKKYLNSIKKKR | 84 |
R3P79 | HS DAVFTDN YTRLRKQVAAKKYLNSIKN KRY | 85 |
R3P80 | HSDAVFTDNYTRLRKQVAVKKYLQSIKKKR | 86 |
R3P81 | HSDAVFTDNYTRLRKQVAVKKYLQSIKKK | 87 |
R3P82 | HS DAVFTDNYTRLRKQVAVKKYLQSIKNKRY | 88 |
R3P8 3 | HSDAVFTDNYTRLRKQVAAKKYLQSILKKRY | 89 |
R3P84 | HS DAVFT DNYTRLRKQVAAKKYLQSILKKR | 90 |
R3P85 | HSDAVFTDNYTRLRKQVAAKKYLQSILKK | 91 |
R3P86 | HSDAVFTDNYTRLRKQVAAKKYLQSIKNK | 92 |
R3P87 | HSDAVFTDNYTRLRKQVAVKKYLQSILKKRY | 93 |
-23CZ 296858 B6
Tabulka 1 - pokračování
R3P88 | HSDAVFTDNYTRLRKQVAVKKYLQSILKKR | 94 |
R3P89 | HSDAVFTDNYTRLRKQVAVKKYLQSILKK | 95 |
R3P92 | HS DAVFT DNYTRLRKQVAAKKYLQSILNKRY | 97 |
R3P93 | HSDAVFTDNYTRLRKQVAAKKYLQSILNKR | 98 |
R3P94 | H S DAV FTON YTRLRKQVAAKKYLQSILNK | 99 |
rR3P97 | H S DAV FT DN YT RLRKQMACKKYLN SIKNKR | 100 |
rR3P98 | HS DAV FT DN YTRLRKQMADKKYLN SIKNKR | 101 |
rR3P99 | HS DAVFT DNYT RLRKQMAEKKYLNSIKNKR | 102 |
rR3P100 | HS DAVFT DNYT RLRKQMAFKKYLNSIKN KR | 103 |
rR3P101 | HSDAVFTDNYTRLRKQMAGKKYLNSIKNKR | 104 |
rR3Pl02 | HSDAVFTDNYTRLRKQMAHKKYLNSIKNKR | 105 |
I-R3P103 | H S DAV FT DN YT RLRKQMAIKKYLN SIKNKR | 106 |
rR3Pl04 | HS DAV FT DNYTRLRKQMAKKKYLNSIKNKR | 107 |
rR3P105 | H S DAV FT DN Y TRLRKQMALKKYLN SIKNKR | 108 |
rR3P106 | HSDAVFTDNYTRLRKQMAMKKYLNSIKNKR | 109 |
rR3P107 | HSDAVFTDNYTRLRKQMANKKYLNSIKNKR | 110 |
rR3P108 | HSDAVFTDNYTRLRKQMAPKKYLNSIKNKR | 111 |
rR3P109 | HSDAVFTDNYTRLRKQMAGKKYLNSIKNKR | 112 |
rR3P110 | HSDAVFTDNYTRLRKQMARKKYLNSIKNKR | 113 |
rR3Plll | HSDAVFTDNYTRLRKQMASKKYLNSIKNKR | 114 |
rR3P112 | HSDAVFTDNYTRLRKQMATKKYLNSIKNKR | 115 |
rR3P113 | HSDAVFTDNYTRLRKQMAVKKYLNSIKNKR | 116 |
rR3P114 | HSDAVFTDNYTRLRKQMAWKKYLNSIKNKR | 117 |
rR3P115 | HSDAVFTDNYTRLRKQMAYKKYLNSIKNKR | 118 |
rR3P116 | HSDAVFTDNYTRLRKQMAAKKYLNSIANKR | 119 |
rR3P117 | HSDAVFTDNYTRLRKQMAAKKYLNSICNKR | 120 |
TR3P118 | HSDAVFT DN YT RLRKQMAAKKYLNSIDNKR | 121 |
I-R3P119 | HSDAVFTDNYTRLRKQMAAKKYLNSIENKR | 122 |
rR3P120 | HSDAVFTDNYTRLRKQMAAKKYLNSIFNKR | 123 |
rR3P121 | HSDAVFTDNYTRLRKQMAAKKYLNSIGNKR | 124 |
rR3P122 | HSDAVFTDNYTRLRKQMAAKKYLNSIHNKR | 125 |
rR3P123 | HSDAVFTDNYTRLRKQMAAKKYLNSIINKR | 126 |
rR3P124 | HSDAVFTDNYTRLRKQMAAKKYLNSIMNKR | 127 |
rR3P12b | HSDAVFTDNYTRLRKQMAAKKYLNSINNKR | 128 |
rR3P126 | HSDAVFTDNYTRLRKQMAAKKYLNSIPNKR | 129 |
rR3P127 | HSDAVFTDNYTRLRKQMAAKKYLNSIQNKR | 130 |
rR3P128 | HSDAVFTDNYTRLRKQMAAKKYLNSIRNKR | 131 |
rR3P129 | HSDAVFTDNYTRLRKQMAAKKYLNSISNKR | 132 |
rR3P130 | HSDAVFTDNYTRLRKQMAAKKYLNSITNKR | 133 |
rR3P131 | HSDAVFTDNYTRLRKQMAAKKYLNSIVNKR | 134 |
1-R3P132 | HSDAVFTDNYTRLRKQMAAKKYLNSIWNKR | 135 |
rR3P133 | H S DAVFT DNYT RLRKQMAAKKYLN SIYN KR | 136 |
rR3P134 | HSDAVFTDNYTRLRKQMAAKKYLNSIKNAR | 137 |
rR3P135 | H S DAV FT DN YT RLRKQMAAKKYLNSIKNC R | 138 |
rR3P136 | HSDAVFTDNYTRLRKQMAAKKYLNSIKNDR | 139 |
-24CZ 296858 B6
Tabulka 1 - pokračování
rR3P137 | HSDAVFTDNYTRLRKQMAAKKYLNSIKNER | 140 |
rR3P138 | HSDAVFTDNYTRLRKQMAAKKYLNS1KNFR | 141 |
rR3Pl39 | HSDAVFTDNYTRLRKQMAAKKYLNSIKNGR | 142 |
rR3P140 | H S DAV FT DNYT RLRKQMAAKKYLNSIKNHR | 143 |
rR3P141 | H S DAV FT DNY T RLRKQMAAKKYLN SIKNIR | 144 |
rR3P142 | HSDAVFTDNYTRLRKQMAAKKYLNSIKNLR | 145 |
rR3P143 | HSDAVFTDNYTRLRKQMAAKKYLNSIKNMR | 146 |
rR3P144 | HSDAVFTDNYTRLRKQMAAKKYLNSIKNNR | 147 |
rR3P145 | HS DAV FT DN YT RLRKQMAAKKY LN SIKN P R | 148 |
rR3Pl46 | HSDAVFTDNYTRLRKQMAAKKYLNSIKNQR | 149 |
rR3P147 | HSDAVFTDNYTRLRKQMAAKKYLNSIKNRR | 150 |
rR3P148 | HS DAV FT DM Y T RLRKQMAAKKYLN SIKN S R | 151 |
rR3P149 | HSDAVFTDNYTRLRKQMAAKKYLNSIKNTR | 152 |
rR3P150 | HSDAVFTDNYTRLRKQMAAKKYLNSIKNVR | 153 |
rR3P151 | HS DAV FT DN YT RLRKQMAAKKYLNSIKNWR | 154 |
TR3P152 | HSDAVFTDNYTRLRKQMAAKKYLNSIKNYR | 155 |
rR3P153 | HS DAV FT DN YT RLRKQMAAKKYLNSIKNKA | 156 |
rR3P155 | HSDAVFTDNYTRLRKQMAAKKYLNSIKNKD | 157 |
rR3P156 | HSDAVFTDNYTRLRKQMAAKKYLNSIKNKE | 158 |
TR3PI57 | H SDAV FT DN YTRLRKQMAAKKYLN SIKN KF | 159 |
rR3P158 | H S DAV FT DNY T RLRKQMAAKKYLNSIKN KG | 160 |
rR3P159 | HSDAVFTDNYTRLRKQMAAKKYLNSIKNKH | 161 |
rR3P.l 60 | HSDAVFTDNYTRLRKQMAAKKYLNSIKNKI | 162 |
rR3P161 | HSDAVFTDNYTRLRKQMAAKKYLNSIKNKK | 163 |
rR3P162 | HSDAVFTDNYTRLRKQMAAKKYLNSIKNKL | 164 |
TR3P163 | HSDAVFTDNYTRLRKQMAAKKYLNSIKNKM | 165 |
rR3P164 | H S DAV FT DN YTRLRKQMAAKKYLN SIKN KN | 166 |
1-R3PL65 | H S DAV FT DN Y TR l, RKQMAAKKYLN SIKN KP | 167 |
rR3P165 | HSDAVFTDNYTRT.RKQMAAKKYLNSIKNKQ | 168 |
rR3P167 | HSDAVFTDNYTRLRKQMAAKKYLNSIKNKS | 169 |
TR3P168 | HSDAVFTDNYTRLRKQMAAKKYLNSIKNKT | 170 |
rR3P169 | H S DAV FT DN YT RLRKQMAAKKYLN SIKN KV | 171 |
rR3P170 | H S DAV FT D N YT RLRKQMAAKKYLN SIKNKW | 172 |
rR3P171 | H S DAV FT DN Y TRL RKQMAAKKYLNSIKN KY | 173 |
R3P172 | HSDAVFTDNYTRLRKQVAAKKYLQSIKNKRYSWCEPGWCR | 174 |
R3P173 | HSDAVFTDDYTRLRKEVAAKKYLESIKDKRY | 175 |
PAC1 | ESDGIFTDSYSRYRKQMAVKKYLAAVL-NHí | 176 |
PAC2 | HKDGIFTDSYSRYRKQMAVKKYLAAVL-NH2 | 177 |
PAC3 | HSKGIFTDSYSRYRKQMAVKKYLAAVL-NH2 | 178 |
PAC4 | HSDKIFTDSYSRYRKQMAVKKYLAAVL-NH2 | 179 |
PAC5 | HSDGKFTDSYSRYRKQMAVKKYLAAVL-NH2 | 180 |
PAC6 | HS DGIKT DS Y S R Y RKQMAVKK YLAAVL - NH? | 181 |
PAC7 | HSDGIFKDSYSRYRKQMAVKKYLAAVL-NH2 | 182 |
PAC8 | HS DG IFTKSY S R Y R KQM A VK K Y LAAVL - N H 2 | 183 |
PAC9 | HSDGIFTDKYSRYRKQMAVKKYLAAVL-NH2 | 184 |
-25 CZ 296858 B6
Tabulka 1 - pokračování
PAC10 | HSDGIFTDSKSRYRKQMAVKKYLAAVL-NH2 | 185 |
PACH | HSDGIFTDSYKRYRKQMAVKKYLAAVL-NH2 | 186 |
PAC12 | HSDGIFTDSYSEYRKQMAVKKYLAAVL-NH2 | 187 |
PAC13 | HSDGIFTDSYSRKRKQMAVKKYLAAVL-NH2 | 188 |
PAC14 | HSDGIFTDSYSRYEKQMAVKKYLAAVL-NH2 | 189 |
PAC15 | HSDGIFTDSYSRYREQMAVKKYLAAVL-NH? | 190 |
PAC16 | hsdgiftdsysryrkkmavkkylaavl-nh2 | 191 |
PAC17 | HSDGIFTDSYSRYRKQKAVKKYLAAVL-NH2 | 192 |
PA.C18 | HSDGIFTDSYSRYRKQMKVKKYLAAVL-NHj | 193 |
PAC19 | HSDGIFTDSYSRYRKQMAKKKYLAAVL-NHj | 194 |
PAC20 | HSDGIFTDSYSRYRKQMAVEKYLAAVL-NH2 | 195 |
PAC21 | HSDGIFTDSYSRYRKQMAVKEYLAAVL-NH2 | 196 |
PAC22 | HSDGIFTDSYSRYRKQMAVKKKLAAVL-NHs | 197 |
PAC23 | HSDGIFTDSYSRYRKQMAVKKY KAAVL-N H2 | 198 |
PAC24 | HSDGIFTDSYSRYRKQMAVKKYLKAVL-NHz | 199 |
PAC25 | HSDGIFTDSYSRYRKQMAVKKYLAKVL-NH2 | 200 |
PAC2 6 | HSDGIFTDSYSRYRKQMAVKKYLAAKL-NH2 | 201 |
PAC27 | HSDGIFTDSYSRYRKQMAVKKYLAAVK-NH2 | 202 |
rR3P174 | HSDAVFTDNYTRLRKQMAAKKYLNSIKNRI | 322 |
rR3P175 | HSDAVFTDNYTRLRKQMAGKKYLNSIKNRI | 323 |
rR3P17 6 | H S DAV FT DNYTRLRKQMAKKKYLNSIKN RI | 324 |
rR3P177 | HSDAVFTDNYTRLRKQMARKKYLNSIKNRI | 325 |
rR3P178 | HSDAVFTDNYTRLRKQMASKKYLNSIKNRI | 326 |
rR3P179 | HSDAVFTDNYTRLRKQMAAKKYLNSIPNRI | 327 |
rR3P180 | HSDAVFTDNYTRLRKQMAGKKYLNSIPNRI | 328 |
rR3P181 | HSDAVFTDNYTRLRKQMAKKKYLNSIPNRI | 329 |
rR3P182 | HSDAVFTDNYTRLRKQMARKKYLNSIPNRI | 330 |
rR3P183 | HSDAVFTDNYTRLRKQMASKKYLNSIPNRI | 331 |
rR3P184 | HSDAVFTDNYTRLRKQMAAKKYLNSIQNRI | 332 |
rR3P185 | HSDAVFTDNYTRLRKQMAGKKYLNSIQNRI | 333 |
rR3P186 | HSDAVFTDNYTRLRKQMAKKKYLNSIQNRI | 334 |
rR3P187 | HSDAVFTDNYTRLRKQMARKKYLNSIQNRI | 335 |
rR3P188 | HSDAVFTDNYTRLRKQMASKKYLNSIQNRI | 336 |
rR3P189 | HSDAVFTDNYTRLRKQMAAKKYLNSIRNRI | 337 |
rR3P190 | HSDAVFTDNYTRLRKQMAGKKYLNSIRNRI | 338 |
rR3P191 | HSDAVFTDNYTRLRKQMAKKKYLNSIRNRI | 339 |
TR3P192 | HSDAVFTDNYTRLRKQMARKKYLNSIRNRI | 340 |
rR3P193 | HSDAVFTDNYIRLRKQMASKKYLNSIRNRI | 341 |
Příklad 8
Sekrece inzulínu ostrůvky u krys ío Peptid R3P3 (0,1 nM až 100 mM) stimuluje glukózo-dependentní sekreci inzulínu z izolovaných ostrůvků u krys. Tyto studie porovnávají účiny R3P3 peptidu a GLP-1 na buňkách ostrůvků.
Ostrůvky krys se podle příkladu 1 izolovaly a ošetřily GLP-1 nebo R3P3 buď při 3 mM, nebo 8 mM glukózy v médiu. Jak ukazují obr. 4A a 4B, peptid R3P3 významně zesiluje uvolnění
-26CZ 296858 B6 inzulínu z ostrůvků způsobem dependentním na koncentraci a tento účinek je podobný účinku GLP-1, což je známé činidlo stimulující produkci inzulínu.
Příklad 9
In vivo inzulínová a glukózová odezva
Jak ukazují níže uvedené tabulky 2 a 3, polypeptidy, které aktivují R3 receptor, rovněž vyvolávají glukózou indukované zvýšení hladiny inzulínu v plazmě, v porovnání se samotnou glukózou. Toto zvýšení inzulínu způsobí současné snížení glukózy v plazmě.
V souladu s protokolem zvýše uvedeného příkladu 2 se krysy Wistar, které se nechaly přes noc o hladu, znecitlivěly pentobaritálem; načež se jim i.v. injikovala glukóza ± peptid a po 1 min se odebrala krev z oka. N=12 krys/supina. Graf na obr. 5 ukazuje, že polypeptid R3P3 způsobuje vyšší odstranění glukózy, které je dopravováno zvýšením sekrece inzulínu. Peptid nebo vehikulum se podaly i.v. a následně se i.p., v souladu s příkladem 3, zvýšila hladina glukózy. Hladina glukózy v plazmě se sledovala po naznačenou časovou periodu. Jak ukazuje graf, R3P3 výrazně urychluje odstranění glukózy z krve.
Příklad 10
Průjmové vedlejší účinky
Jak uvádí protokol ve výše uvedeném příkladu 4, krysy, které se nechaly hladovět, se injikovaly s.c. naznačeným peptidem (5 nmol/kg nebo 22 nmol/kg až 24 nmol/kg). Pět minut po injekci, se p.o. aplikovalo 0,3 ml vody. Pět minut po aplikaci vody se zvířata znecitlivěla a určil se obsah vody v tenkém střevě. Jak znázorňuje obr. 6, VIP injekce aplikované ve dvou dávkách způsobily významné zvýšení obsahu vody v tenkém střevu oproti kontrolnímu vehikulu (solný roztok). Při nej vyšší dávce způsobily R3 peptidy pouze velmi malé zvýšení obsahu vody (tj. zhruba 10%) v porovnání s VIP. Při dávce 5 nmol/kg peptidy nezpůsobily žádnou změnu, pokud jde o obsah vody v tenkém střevu. Stupeň zadržení vody se použil jako index R2 aktivity zn vivo.
Příklad 11
Vliv peptidů na intraperitoneální glukózovou toleranci u krys
Krysy Wistar se nechaly přes noc hladovět a následně znecitlivěly pentobartibálem. Krysám se odebrala krev z oka (čas nula) a subkutánně se injikoval peptid (v 1% roztoku lidského albuminu). O 5 min později se intraperitoneálně injikoval 1 g/kg glukózy (v solném roztoku) a po 30 min se krysám odebral vzorek krve z oka. Hladina glukózy v plazmě se určila za použití autoanalyzéru Axon a výsledky jsou shrnuty v obr. 7.
Obr. 7 ukazuje, že 30 min po IPGTT (testu IP glukózové tolerance) se hladina glukózy v plazmě zvýšila na 160 mg/dl, zatímco krysy otevřené vehikuly dosahovaly bazální hodnoty lOOmg/dl. U krys, kterým se injikovaly peptidy R3P3, R3P12 a R3P13, bylo toto zvýšení plazmové glukózy značně zredukováno, čímž se ověřila jejich schopnost produkovat inzulín. Při s.c. dávce 1 nmol/kg byl vliv každého peptidu, ve smyslu snižování obsahu glukózy, podobný jako v případě ekvivalentní dávce GLP-1.
-27CZ 296858 B6
Příklad 12
Polypeptidy vylučující inzulín glukózo-dependentním způsobem
Tabulka 2 obsahuje seznam peptidů, které stimulují uvolňování inzulínu in vivo vIPGTT testu nebo in vitro při testu ostrůvků krys. Jak ukazují výsledky, peptidy zvyšují glukózou mediované uvolnění inzulínu in vivo i in vitro.
Plazmový inzulín: výsledky jsou vyjádřeny jako % plazmového inzulínu 1 min o IVGTT (0,4 g/kg glukózy) buď se solným roztokem, nebo 0,1 nmol/kg P51, P55, P60, P66 nebo 1 nmol/kg dalších peptidů v těle krys Wistar. Krev se odebrala z oka a hodnoty inzulínu se měřily pomocí „rat insulinu RIA“ kitu (Lineo Research, lne., St. Charles, MO).
Plazmová glukóza: výsledky jsou vyjádřeny jako % vehikula plochy plazmové glukózy pod křivkou po IPGTT (1 g/kg glukózy) po ošetření 1 nmol/kg peptidů. V minulosti bylo zaznamenáno, že PACAP27 indukuje sekreci inzulínu, ale neovlivňuje hladinu glukózy v plazmě (Filipsson K. a kol., J. Clin. Endocrin. & Metabolism 82:3093-3098 (1997)). Nyní se poprvé ukázalo, že tato skutečnost je způsobena vzájemně se rušícím vlivem R2 a R3 na glukózu. R2-Selektivní agonista [K15, R16, L27]VIP(l-7)/GRF(8-27) (Gourlet P. a kol. Peptides 18:1539-45 (1997)), definovaný jako R2P1, zvyšuje hladinu plazmové glukózy o 14 %, zatímco R3-selektivní agonisty snižují hladinu plazmové glukózy přibližně o 20 %. Zdá se tedy, že objevení R3-selektivity je významným atributem pro léčiva určená pro dosažení redukce glukózy v krvi a současně pro léčbu diabetů typu 2.
Uvolnění inzulínu z ostrůvků: ostrůvky se izolovaly z těla krys Sprague-Dawley způsobem popsaným v příkladu 1 a po dobu 2 h se ošetřovaly vehikulem nebo specifikovaným peptidem (10 nM). Koncentrace inzulínu v médiu se měřila pomocí kitu „Lineo rat insulin RIA“. Koncentrace glukózy v médiu dosahovala 8 mM. Výsledky jsou vyjádřeny jako % [inzulínu] v 8 mM samotné glukóze. Při 3mM koncentraci glukózy nebylo pozorováno žádné polypeptidem indukované zvýšení koncentrace inzulínu, takže je patrné, že schopnost těchto polypeptidů uvolňovat inzulín je glukózo-dependentní.
-28CZ 296858 B6
Tabulka 2
Peptid | Plazmový | Plazmová | Uvolnění inzulínu z | |
inzulín | glukóza | ostrůvků | ||
(% bazální) | ; bazální) | (% bazální) | ||
PACAP 27 | 320 | 186 | ||
R2P1 | 216 | 114 | ||
R3P0 | 77 | 264 | ||
R3P1 | 480 | 73 | 250 | |
R3P3 | 361 | 77 | 72 | 275 |
R3P9 | 221 | |||
R3P10 | 174 | |||
R3P12 | 302 | 76 | 324 | |
R3P13 | 465 | 77 | 170 | |
R3P19 | 285 | |||
R3P36 | 255 | 73 | 78 | |
P51 | 259 | |||
P55 | 208 | |||
P60 | 283 | |||
R3P66 | 388 | 82 | 184 |
R3P77 388
R3P80 360
R3P81 302
Příklad 13
Farmaceutická kom pozice - IV. Formulace
Sterilní injekční formulace se vyrobila ze 4 mg polypeptidů SEQ ID NO: 72 a 1 litru sterilního solného roztoku za použití v daném oboru známého výrobního způsobu.
Příklad 14
Farmaceutická kompozice - TV. Formulace
Sterilní injekční formulace se vyrobila ze 400 mg polypeptidů SEQ ID NO: 174 a 1 litru sterilního solného roztoku za použití v daném oboru známého výrobního způsobu.
Příklad 15
Vliv PACAP27, VIP a PACAP receptorově selektivních peptidových agonistů na tepovou frekvenci u psů u bezvědomí
Protokol:
Psi plemene bígl se uvázali na řemen a trénovali na 3 h stání. Okolo ocasů psů se umístila manžeta monitoru tepové frekvence.
Do cefalické žíly se injikoval solný roztok a tepová frekvence se monitorovala každé 2 min, ve snaze stanovit základní linii. Po 10 min se injikoval peptid a následujících 20 min se každé 2 min
-29CZ 296858 B6 monitorovala tepová frekvence. Pokud byla po tuto dobu tepová frekvence normální, potom se aplikovala vyšší dávka a tepová frekvence se monitorovala dalších 20 min. Plocha po křivkou (AUC) prvních 10 min změny tepové frekvence indukované polypeptidem byla vynesena do grafu v %, vztaženo k AUC vehikula, proti koncentraci polypeptidů. PACAP27 a Rl-Selektivní agonista maxadilan (moro O., J. Biol. Chem. 272:966-970 (1997)) vykazují podobnou potenci, ve smyslu zvyšování tepové frekvence. Peptid VIP, který aktivuje R2 i R3, ale nikoliv Rl, R2-selektivní agonista R2P1 a R3-selektivní agonisté R3PI, R3P3, R3P19, R3P36, R3P51 aR3P53 mají alespoň lOx nižší účinnost než PACAP27 nebo maxidilan. Kardiovaskulární účinky PACAP27 může tedy významně přispívat kPACAP-Rl aktivaci. Všechny peptidy jsou úplnými agonisty na svých příslušných receptorech se srovnatelnou afinitou. R3PO Odpovídá Roche analogu RO 25-1553, který, jak se ukázalo, vykazuje alespoň lOOx vyšší selektivitu pro PACAP-R3 než pro Rl a R2 (Gourlet a kol., Peptides 18:4030408 (1997)).
Příklad 16
Cyklické AMP SPA
CHO Buňky exprimují PACAP R3 se umístily do 96jamkových ploten (Costar) v koncentraci 8x 104 buněk/jamka a nechaly růst 24 h při 37 °C v α MEM+nukleosidy+glutamin (Gibco BRL), 10% FBS, 100 pg/ml Pen/Strep, 0,3 mg/ml glutaminu, 1 mM HEPES, 0,5 mg/ml Geneticinu (Gibco BRL). Médium se odstranilo a plotny se propláchly PBS. Buňky se inkubovaly 15 min při 37 °C peptidem v Hepes-PBS-BSA s 0,4 mg/ml trypsinového inhibitoru ze sójových bobů, 0,5 mg/ml Bacitracinu, 100 μΜ IBMX. Cyklický AMP v buněčných extraktech se kvantifikoval za použití cAMP SPA přímého screeningového analytického systému (Amersham Pharmacia Biotech lne., Piscataway, NJ). Peptidy uvedené v tabulce 3 byly testovány na cAMP aktivitu.
Tabulka 3 uvádí in vitro cAMP SPA výsledky na CHO buňkách transfektovaných pomocí PACAP-R2 nebo PACAP-R3. EC50 Je definováno jako koncentrace polypeptidů, při které se dosáhne 50 % maximální PACAP27 aktivity. „NA“ označuje nedetekovatelné aktivity. „R3 Selektivita“ je odvozena poměru EC50 na R2 ku EC50 na R3. Většina následujících polypeptidů je navržena na bázi VIP, který vykazoval nedostatečnou aktivitu na Rl (Vaudry D. a kol., 2000, Pharmacological Reviews, 52:269-324). Dá se tedy předpokládat, že tyto polypeptidy nebudou vykazovat výraznější aktivitu na Rl. Peptidy navržené na bázi VIP zahrnují SEQ ID NO: 6 až 53, 62 až 65 a 70 až 175.
-30CZ 296858 B6
Tabulka 3
Peptid | SEQ ID NO | R2 EC50, nM | R3 EC50, nM | R3 Selektivita |
VIP | 1 | 0,1 | 0,08 | 1,3 |
R3P0 | 5 | >100 | 0,4 | >250 |
R3P1 | 6 | >100 | 2 | >50 |
R3P2 | 7 | >1000 | 3 | >300 |
R3P3 | 8 | 100 | 0,75 | 130 |
R3P5 | 10 | 200 | 7 | 30 |
R3P8 | 11 | 2 | 1,4 | 1,5 |
R3P9 | 12 | 40 | 2 | 20 |
R3P10 | 13 | 3 | 11 | 0,3 |
R3P11 | 14 | 10 | 3 | 3 |
R3P12 | 15 | >100 | 0,5 | >200 |
R3P13 | 16 | 163 | 5 | 33 |
R3P14 | 17 | 50 | 17 | 3 |
R3P19 | 18 | 42 | 1,4 | 30 |
R3P20 | 19 | 330 | 1,4 | 230 |
R3P21 | 20 | 17 | 0, 3 | 60 |
R3P22 | 21 | 38 | 1,6 | 24 |
R3P24 | 22 | 45 | 1,3 | 34 |
R3P25 | 23 | 15 | 0,7 | 20 |
R3P26 | 24 | >100 | 0,55 | >180 |
R3P29 | 25 | >100 | 0, 5 | >200 |
R3P30 | 26 | 20 | 0,4 | 50 |
R3P31 | 27 | >100 | 0,3 | >300 |
R3P32 | 28 | 84 | 0,4 | 200 |
R3P33 | 29 | >100 | 0, 5 | >200 |
R3P34 | 30 | >100 | 1,4 | >70 |
R3P35 | 31 | >100 | 2,6 | >40 |
R3P36 | 32 | >90 | 0,4 | >200 |
R3P41 | 33 | 8 | 0, 08 | 100 |
R3P42 | 34 | 0,3 | 0,03 | 10 |
R3P43 | 35 | 0, 8 | 0, 08 | 10 |
R3P44 | 36 | 8 | 1,3 | 6 |
R3P45 | 37 | NA | NA | |
R3P46 | 38 | 0,4 | 0,06 | 7 |
R3P47 | 39 | 0,7 | 0,12 | 6 |
R3P48 | 40 | 1 | 0,13 | 8 |
R3P49 | 41 | 8 | 0,27 | 30 |
R3P50 | 42 | 0,7 | 0,13 | 6 |
R3P51 | 43 | 23 | 0,26 | 90 |
R3P52 | 44 | >100 | 0,4 | >250 |
R3P53 | 45 | 500 | 0,2 | 2500 |
R3P54 | 46 | >100 | 0,5 | >200 |
R3P55 | 47 | 50 | 0,17 | 280 |
R3P56 | 48 | 40 | 0,4 | 100 |
R3P57 | 49 | 42 | 0,23 | 190 |
R3P58 | 50 | 55 | 0,32 | 170 |
-31 CZ 296858 B6
Tabulka 3 - pokračování
R3P59 | 51 | 10 | 0,15 | 70 |
R3P60 | 52 | 120 | 1 | 120 |
R3P61 | 53 | 110 | 0,8 | 140 |
R3P6 | 57 | 220 | 80 | 3 |
R3P7 | 58 | 2 | 4 | 0,5 |
R3P15 | 59 | 12 | 5 | 2 |
R3P16 | 60 | 14 | 10 | 1,4 |
R3P17 | 61 | 9 | 4 | 2 |
R3P18 | 62 | NA | NA | |
R3P23 | 63 | 10 | 0,43 | 23 |
R3P27 | 64 | 6,4 | 0,8 | 8 |
R3P28 | 65 | 8 | 7 | 1 |
R3P37 | 66 | 71 | 4 | 18 |
R3P38 | 67 | 17 | 2,3 | 7 |
R3P39 | 68 | 1 | 0,5 | 2 |
R3P40 | 69 | 1,4 | 0,7 | 2 |
R3P62 | 70 | 180 | 1,8 | 100 |
R3P65 | 71 | 80 | 0, 6 | 130 |
R3P66 | 72 | 100 | 0,4 | 250 |
R3P67 | 73 | 100 | 0,3 | 330 |
R3P68 | 74 | 130 | 0, 5 | 260 |
R3P69 | 75 | 90 | 0,5 | 190 |
R3P70 | 76 | >100 | 0,4 | >250 |
R3P71 | 77 | 56 | 0,09 | 660 |
R3P72 | 78 | >100 | 0,16 | >600 |
R3P73 | 79 | 50 | 0, 3 | 170 |
R3P74 | 80 | 90 | 0, 6 | 150 |
R3P75 | 81 | >150 | 0, 3 | >500 |
R3P76 | 82 | >150 | 0,1 | >1500 |
R3P77 | 83 | 200 | 0,4 | 500 |
R3P78 | 84 | 250 | 1,1 | 230 |
R3P79 | 85 | 100 | 0, 5 | 200 |
R3P80 | 86 | 88 | 0, 44 | 200 |
R3P81 | 87 | 50 | 0, 5 | 100 |
R3P82 | 88 | 10 | 0,4 | 23 |
R3P83 | 89 | 5 | 0, 08 | 60 |
R3P84 | 90 | 2,5 | 0,06 | 40 |
R3P85 | 91 | 5 | 0, 18 | 30 |
R3P86 | 92 | 90 | 0,8 | 110 |
R3P87 | 93 | 0,6 | 0,2 | 3 |
R3P88 | 94 | 0,9 | 0,08 | 12 |
R3P89 | 95 | 0,9 | 0,06 | 15 |
R3P92 | 98 | 2 | 0,02 | 100 |
R3P93 | 98 | 6 | 0,14 | 40 |
R3P94 | 99 | 9 | 0, 09 | 100 |
R3P98 | 101 | NA | NA | |
R3P99 | 102 | 40 | 1,0 | 40 |
R3P100 | 103 | 10 | 0,3 | 30 |
R3P101 | 104 | 400 | 1,0 | 400 |
-32CZ 296858 B6
Tabulka 3 - pokračování
R3P102 | 105 | 300 | 60, 0 | 5 |
R3P103 | 106 | 0,4 | 0,05 | 8 |
R3P104 | 107 | 100 | 0,2 | 500 |
R3P105 | 108 | 1 | 0,3 | 3 |
R3P106 | 109 | 2 | 0,1 | 20 |
R3P107 | 110 | 1000 | 200,0 | 5 |
R3P108 | 111 | 1000 | 300, 0 | 3 |
R3P109 | 112 | 1000 | 10,0 | 100 |
R3P110 | 113 | 100 | 0,5 | 200 |
R3P111 | 114 | 1000 | 3,0 | 300 |
R3P112 | 115 | 4 | 0,1 | 40 |
R3P113 | 116 | 3 | 0, 3 | 10 |
R3P114 | 117 | 20 | 2,0 | 10 |
R3P115 | 118 | 300 | 6,0 | 50 |
R3P116 | 119 | 20 | 1,0 | 20 |
R3P118 | 121 | 15 | 0,5 | 30 |
R3P119 | 122 | 15 | 0, 5 | 30 |
R3P120 | 123 | 10 | 0,2 | 50 |
R3P121 | 124 | 50 | 1,0 | 50 |
R3P122 | 125 | 10 | 0,2 | 50 |
R3P123 | 126 | 5 | 0,1 | 50 |
R3P124 | 127 | 3 | 0,2 | 15 |
R3P125 | 128 | 60 | 2,0 | 30 |
R3P126 | 129 | 200 | 1,0 | 200 |
R3P127 | 130 | 300 | 0,5 | 600 |
R3P128 | 131 | 60 | 0,3 | 200 |
R3P129 | 132 | 50 | 1,0 | 50 |
R3P130 | 133 | 40 | 1,0 | 40 |
R3P131 | 134 | 20 | 0, 3 | 70 |
R3P132 | 135 | 10 | 0,2 | 50 |
R3P133 | 136 | 8 | 0,1 | 80 |
R3P134 | 137 | 40 | 0,4 | 100 |
R3P136 | 139 | 20 | 0,3 | 70 |
R3P137 | 140 | 30 | 0, 3 | 100 |
R3P139 | 142 | 20 | 0,4 | 50 |
R3P140 | 143 | 15 | 0,3 | 50 |
R3P141 | 144 | 20 | 0,2 | 100 |
R3P142 | 145 | 6 | 0,2 | 30 |
R3P143 | 146 | 6 | 0,2 | 30 |
R3P144 | 147 | 300 | 3,0 | 100 |
R3P145 | 148 | 50 | 0, 5 | 100 |
R3P146 | 149 | 30 | 0, 3 | 100 |
R3P147 | 150 | 100 | 0,2 | 500 |
R3P148 | 151 | 30 | 0,3 | 100 |
R3P149 | 152 | 40 | 0, 5 | 80 |
R3P150 | 153 | 40 | 0, 8 | 50 |
R3P153 | 156 | 40 | 0,2 | 200 |
R3P155 | 157 | 40 | 0,4 | 100 |
R3P156 | 158 | 100 | 1,0 | 100 |
-33CZ 296858 B6
Tabulka 3 - pokračování
R3P157 | 159 | 50 | 0, 3 | 170 |
R3P158 | 160 | 6 | 0, 07 | 90 |
R3P159 | 161 | 200 | 0, 5 | 400 |
R3P160 | 162 | 100 | 0,2 | 500 |
R3P161 | 163 | 60 | 0,2 | 300 |
R3P162 | 164 | 20 | 0,1 | 200 |
R3P163 | 165 | 40 | 0,2 | 200 |
R3P164 | 166 | 100 | 0, 3 | 300 |
R3P165 | 167 | 150 | 0,5 | 300 |
R3P166 | 168 | 50 | 0,1 | 500 |
R3P167 | 169 | 300 | 1,0 | 300 |
R3P168 | 170 | 60 | 0, 2 | 300 |
R3P169 | 171 | 60 | 0, 2 | 300 |
R3P170 | 172 | 20 | 0,1 | 200 |
R3P171 | 173 | 80 | 0,4 | 200 |
R3P172 | 174 | 77 | 2,6 | 29 |
R3P173 | 175 | NA | 200 | |
PAC1 | 176 | 970 | 10 | 97 |
PAC2 | 177 | NA | 34 | |
PAC 3 | 178 | NA | NA | |
PAC4 | 179 | 45 | 7 | 6 |
PAC 5 | 180 | 1,8 | 0,7 | 2 |
PAC 6 | 181 | NA | NA | |
PAC 7 | 182 | NA | NA | |
PAC 8 | 183 | 43 | 47 | 1 |
PAC 9 | 184 | 0,9 | 0,7 | 1 |
PAC 10 | 185 | 110 | 27 | 4 |
PACH | 186 | 10 | 140 | 0,1 |
PAC12 | 187 | 150 | 3 | 50 |
PAC 13 | 188 | 3 | 0, 5 | 6 |
PAC 14 | 189 | 110 | 1,6 | 70 |
PAC 15 | 190 | 2,4 | 0, 2 | 12 |
PAC 16 | 191 | 0,2 | 0,2 | 1 |
PAC 17 | 192 | 0,25 | 0,15 | 1,5 |
PAC 18 | 193 | 0,7 | 1, 1 | 0,7 |
PAC 1 9 | 194 | 8 | 0,4 | 20 |
PAC 2 0 | 195 | 20 | 0,7 | 30 |
PAC 21 | 196 | 2,5 | 0,24 | 10 |
PAC 2 2 | 197 | 2 | 15 | 0,1 |
PAC2 3 | 198 | 170 | 13 | 13 |
PAC2 4 | 199 | 0, 3 | 0,2 | 1,5 |
PAC 2 5 | 200 | 0,13 | 0,04 | 3 |
PAC 2 6 | 201 | 0,25 | 0,3 | 1 |
PAC2 7 | 202 | 1,5 | 1,1 | 1,4 |
rR3P174 | 322 | 18 | 0,20 | 90 |
rR3P175 | 323 | 400 | 2,2 | 180 |
rR3P176 | 324 | 300 | 2,0 | 150 |
rR3P177 | 325 | 110 | 1,6 | 70 |
rR3P178 | 326 | 80 | 0,75 | 110 |
-34CZ 296858 B6
Tabulka 3 - pokračování
rR3P179 | 327 | 230 | 1,5 | 150 |
rR3P180 | 328 | >100 | 6,7 | >20 |
rR3P181 | 329 | 280 | 5,1 | 50 |
rR3P182 | 330 | 280 | 3,2 | 90 |
rR3P183 | 331 | >150 | 5,4 | >30 |
rR3P184 | 332 | 10 | 0, 37 | 30 |
rR3P185 | 333 | 180 | 4,5 | 40 |
rR3P186 | 334 | 70 | 1,6 | 44 |
rR3P187 | 335 | >130 | 1,6 | >80 |
rR3P188 | 336 | 150 | 2,2 | 70 |
rR3P189 | 337 | 1,3 | 0,04 | 30 |
rR3P190 | 338 | 220 | 2,2 | 100 |
rR3P191 | 339 | >200 | 2,7 | >80 |
rR3P192 | 340 | 40 | 0,60 | 60 |
rR3P193 | 341 | 200 | 1,9 | 110 |
Příklad 17
Výroba polyklonální látky
Syntéza peptidu Ac-CRKQVAAKKYLQSIKNKRY COOH se provedla na peptidovém syntetizátoru Applied Biosystems 430A z použití fmoc chemie s HBTU aktivací aminokyselin, peptid se štěpil za použití štěpného koktejlu tvořeného 84,6 % TFA, 4,4% fenolu, 4,4 % vody, 4,4 % thioanizolu a 2,2 %> ethandithiolu. Surový peptid se purifíkoval na Cl8 koloně s reverzní fází a jako eluent se použil 0,1% TFA/CH2CN gradient. Hodnocení čistoty se provádělo na hmotovém spektrometru PerSeptive V Biosystems Voyager DE Pro MALDI. Cysteinový zbytek se navázal na KLH za použití kitu „Pierce Imject Maleimide Activated mcKLH“ a přiloženého produktu (Pierce, Rockford, IL). Králíci se imunizovali za použití následujícího schématu imunizace polyklonálním antisérem:
den 0 - odběr 10 ml krve pro stanovení základní hodnoty séra, 250 pg každého peptidu v 1 ml emulze kompletního Freundsova adjuvansu, 0,1 ml/místo x 10 míst subkutánně;
den 14 - zesílení 250 pg každého peptidu v místo x 10 míst subkutánně;
ml emulze nekompletního Freundova adjuvansu den 21 - odběr 35 m krve;
den 35 - zesílení 250 pg každého peptidu v místo x 10 míst subkutánně;
ml emulze nekompletního Freundsova adjuvansu den 42 - odběr 35 ml krve;
den 56 - zesílení 250 pg každého peptidu v místo x 10 míst subkutánně;
ml emulze nekompletního Freundsova adjuvansu den 63 - odběr 35 ml krve;
den 77 - zesílení 250 pg každého peptidu v místo x 10 míst subkutánně;
ml emulze nekompletního Freundsova adjuvansu
-35CZ 296858 B6 den 84 - konečný odběr.
Protilátky se charakterizovaly pomocí následujícího protokolu:
Plotna Immulon III (DYNATECH Laboratories, INC, Chantilly, Virginia) se 3 h při pokojové teplotě (dále jen RT) potáhla PE66 peptidem (rozmezí 0,3 ng až 100 ng) ve 100 μΐ EIA potahového pufru (1,6 1 0,lM NaHCO3 + 0,4 1 0,lM Na2CO3, pH 9,5). Plotna se 1 h blotovala 100 μΐ 5% mléčného TBS Tween 20 (lOmM tris pH 8,0, 150mM NaCl, 0,05% Tween-20 (SIGMA P1379)) při RT a 3x propláchla TBS Tween. Protilátka P3P66 se na 2 h při RT přidala do jamky v 100 μΐ 5% bloto (TBS-Tween 20 + 5% mléko) a následně propláchla TBS Tween (průplach se 5x zopakoval). Druhá protilátka (BioRad kozí anti králičí alkalických fosfatázový konjugát) se přidala do jamky při naředění 1:1000 ve 100 μΐ 5% bláto a zde ponechala 1 h. Plotna se 5x propláchla TBS Tween, μ-nitrofenylfosfátem (SIGMA 104-105), 0,5 mg/ml substrátového pufřu (1 M diethanolaminu, 0,5 μΜ MgCl2.6H2O, pH 9,8 voda/HCl) ve 100 μΐ a inkubovala 1 h při RT na O/N. Odečet plotny se provedl při OD 405 v SPECTRAmax 250 (Molecular Devices Corporation, Sunnyvale, CA).
Ve snaze určit, zda protilátky produkované v těle králíků proti peptidu Ac-CRKQVAAKKYLQSIKNKRY COOH podle příkladu 17 rozpoznají peptid R3P66 (SEQ ID NO: 72), se provedl test ELISA (enzyme-linked immunoadsorbent assay). V případě, že protilátky rozpoznávají peptid, dojde při OD405 k detekci signálu. Obr. 10 ukazuje, že tyto protilátky rozpoznají R3P66, ale nereagují s homologickými peptidy PACAP-27 nebo VIP až do koncentrace peptidu 30 pg.
Příklad 18
Přecitlivělost dýchacích cest u modelu akutního astmatu primáta
Pro tuto studii se použili samečci opic rodu cynomolgus (Macaca foscicularis), jejichž prostředí se ponechalo v podmínkách konstantní teploty a vlhkosti a při 12h světelném cyklu. Strava jim byla podávána 2x denně s výjimkou dne experimentu, kdy jim noc před experimentem byla strava pozastavena. Po celou dobu měli k dispozici vodu dle potřeby.
Základní hodnota přecitlivělosti dýchacích cest (AHR) se měřila 1 týden před kontrolní (žádné ošetření) antigenovou provokací a znovu 24 h po antigenové provokaci. Přecitlivělost dýchacích cest indukovaná antigenem se měřila jako pokles PCioo (koncentrace methacholinu potřebná pro 100% zvýšení rezistence plic) po 24 h, v porovnání se základní hodnotou. Po 2 týdnech odpočinku se provedlo další stanovení základní hodnoty AHR. O 1 týden později se 10 min před antigenovou provokací podaly opicím peptidy podle vynálezu ve formě aerosolu. Po 24 h se opět změřila hodnota AHR a pokles PCioo byl v tomto případě srovnatelný s předchozím případem, kdy nebylo provedeno žádné ošetření.
Experimentální postup: každý den, kdy probíhal experiment, se zvířata ve svých klecích znecitlivěla směsí ketaminu a cylazinu (70:12 mg.kg1 při 0,1 ml.kg'1). V bezvědomí se zvířata přenesla do laboratoře pro primáty, kde se umístila do polohy v leže na zádech na vyhřívané vodní podušky na vozíčku. Do každého oka se vetřela oční mast a do hrdla a zadní části hrdla se vstříklo 0,2 ml lidocainu (2%). Čelisti se udržovaly od sebe pomocí čelistní rozpěrky a pomocí laringoskopu se do hrdla zvířat zavedla 5,0 měřící endotracheální trubice (jejíž konec byl dostatečně obalen xylocainem gelem, 2%). Zvíře se následně umístilo do speciálně navrženého zádržného křesla, takže bylo mírně nakloněno, ale ve vzpřímené sedící poloze a přidržováno pouze límcem kolem krku. Vodou vyhřívaná podložka obklopovala zvíře.
-36CZ 296858 B6
Endotracheální trubice se připojila k ventilátoru Harvard nastaveném na dopravu 30 až 35 vdechů za minutu. Průtok vzduchu se měřil pomocí pneumotachografu Fleisch a hrudní tlak se měřil pomocí validynového tlakového transduceru (jako rozdíl mezi tlakem na vzdáleném konci endotracheální trubice a okolním tlakem).
Pneumotachograf a validyn se připojily k předzesilovaěi a následně MI2 respiraěnímu analyzátoru. na základě primárních signálů průtoku a tlaku analyzátor vypočetl rezistenci a komplienci dýchacích cest (a stejně tak celou řadu dalších respiračních parametrů). Účelem počátečního 5min až 6min měření bylo zajištění stability signálů a toho, že hodnoty rezistence a komplience budou ležet mezi rozpoznanými limitami.
Antigenová provokace: jednalo se o inhalační provokaci pomocí Ascaris suum. Dodaný extrakt Ascaris suum se lOx naředil PBS a poskytl 1000 pg/ml roztoku. Aerosil byl dopravován pomocí tlakově hnaného nebulizéru Rainbow drop (Puritan-Bennett) připojeného k respirátoru Bird mark 7A, který byl nastaven na dopravu 15 vdechů za minutu. Do těla zvíře se vpravilo 30 vdechů antigenu, načež se 15 min monitorovala akutní bronchokostrikce.
Po ukončení provokace se zvířata odpojila od ventilátoru a, pokud dýchala sama, potom se uvolnila za záchytného křesla a položila v poloze na zádech na vozík. Jakmile se navrátily normální reflexy (mrkání očí, polykání) společně se svalovým napětím v končetinách, vrátila se zvířata zpět do svých klecí.
Podání peptidů: hodnocené peptidy se podávaly do těla zvířat výše popsaným inhalačním způsobem. Zásobní roztoky peptidů se naředily sterilní vodou do dosažení koncentrace 0,5 pg/4 μΐ. Při předchozích měřeních se ukázalo, že nebulizér dopraví 4 μΐ/vdech a počet vdechů dodaných každému zvířeti se nastavil tak, že nebulizér dodal zvířeti správnou finální koncentraci. Jednotlivé peptidy měly následující finální koncentrace:
R3P0 (SEQ ID NO:5) - 0,6 pg/kg
R3P76 (SEQ ID NO:82) - 3 pg/kg
R3P82 (SEQ ID NO:88) - 1,8 pg/kg
Methacholinová provokace: pro stanovení přecitlivělosti dýchacích cest se zjistily křivky závislosti odezvy na methacholinové dávce. Měření na akutním modelu se provedla po 24 h a porovnala s citlivostí 7 dní před ošetřením. Aerosol fosfátem pufrovaného solného roztoku (PBS) se dopravoval pomocí nebulizéru výše popsaným způsobem. Po aplikaci 15 vdechů aerosolu se 10 min monitorovala plicní rezistence. Methacholin (Sigma) byl vyroben v koncentraci 100 mg/ml v PBS a tento zásobní roztok se ředil PBS do finálního rozmezí koncentrací 0,1 mg/ml až 100 mg/ml. Po podání methacholinu (0,1 mg/ml, 15 vdechů) se provedlo další lOmin monitorování. Následné dávky methacholinu se vždy o půl logaritmu dávky zvýšily v každém kroku až do okamžiku zdvojnásobení plicní rezistence nebo do okamžiku, kdy maximální podaná dávka methacholinu dosáhla 100 mg/ml. Za základní hodnotu (0%) rezistence se vzala rezistence dosažená po podání PBS. Zvýšení plicní rezistence (%) a methacholinové dávky se vynesly do grafu, ze kterého se následně vypočetla hodnota PCioo (dávka methacholinu způsobující 100% zvýšení rezistence). Tyto hodnoty se převedly na hodnoty logl0. Delta PCioo (hodnota po 24 h základní hodnota) v případě testu se porovnala s kontrolním případem.
Tabulka 4 ukazuje PCIOo hodnoty pro tři peptidy. Jak vyplývá z těchto hodnot, tyto peptidy jsou účinné proti přecitlivělosti dýchacích cest indukované antigenem, a jsou tedy pravděpodobně účinné při léčbě astmatu.
-37CZ 296858 B6
Tabulka 4: PCioo hodnoty pro všechny tři peptidové studie
Peptid (dávka)
R3P0 (0,6 Rg/mg) R3P76 (3,0 pg/kq) R3P82(1,8 pg/kq)
Kontrola Ošetření Kontrola Ošetřeni
Kontrola Ošetření
Delta log10PCioo | |
N | 4 4 |
Průměr* | -0,325 -0,150 |
SD | 0,177 0,152 |
P (ošetřeni vs kontrola) | 0,240 |
% Inhibice indukované AHR** | 54 |
5 | 5 | 4 | 4 |
-0,468 | +0,047 | -0,567 | -0,067 |
0,128 | 0,253 | 0,361 | 0,329 |
0,031 | 0,087 | ||
100 | 88 |
* čím zápornější hodnota, tím přecitlivějším se zvíře stává ** AHR = přecitlivělost dýchacích cest
Claims (35)
- PATENTOVÉ NÁROKY1. Polypeptid zvolený z množiny sestávající z polypeptidů se sekvencí SEQ ID NO: 11 až 14, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 21 až 26, SEQ ID NO: 32 až 36, SEQ ID NO: 40 až 53, SEQ ID NO: 57 až 61, SEQ ID NO: 63 až 99, SEQ ID NO: 102 až 119, SEQ ID NO: 121 až 137, SEQ ID NO: 139 až 177, SEQ ID NO: 179, 180, SEQ ID NO: 183 až 202, 322 až 341, přičemž polypeptid se zvolí ze selektivního agonisty PACAP R3, kdy má polypeptid selektivitu pro R3 a selektivita polypeptidů pro R3 je větší než R3 selektivita SEQ ID NO: 5 nebo SEQ ID NO: 9.
- 2. Polypeptid podle nároku 1, který je reprezentován SEQ ID NO: 18.
- 3. Polypeptid podle nároku 1, který je reprezentován SEQ ED NO: 32.
- 4. Polypeptid podle nároku 1, který je reprezentován SEQ ID NO: 43.
- 5. Polypeptid podle nároku 1, který je reprezentován SEQ ID NO: 45.
- 6. Polypeptid podle nároku 1, který je reprezentován SEQ ED NO: 47.
- 7. Polypeptid podle nároku 1, který je reprezentován SEQ ID NO: 50.
- 8. Polypeptid podle nároku 1, který je reprezentován SEQ ID NO: 52.
- 9. Polypeptid podle nároku 1, který je reprezentován SEQ ID NO: 71.-38CZ 296858 B6
- 10. Polypeptid podle nároku 1, který je reprezentován SEQ ID NO:72.
- 11. Polypeptid podle nároku 1, který je reprezentován SEQ ID NO:83.
- 12. Polypeptid podle nároku 1, který je reprezentován SEQ ID NO:86.
- 13. Polypeptid podle nároku 1, který je reprezentován SEQ ID NO:87.
- 14. Polypeptid podle nároku 1, který se zvolí z množiny sestávající ze SEQ ID NO: 328, SEQ ID NO: 331, SEQ ID NO: 335 a SEQ ID NO: 339.
- 15. Polypeptid podle nároku 1, který se zvolí z množiny sestávající ze SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 32 a SEQ ID NO: 46.
- 16. Polypeptid podle nároku 1, který se zvolí z množiny sestávající ze SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 72, SEQ ID NO: 74 a SEQ ID NO: 76.
- 17. Polypeptid podle nároku 1, který se zvolí z množiny sestávající ze SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 104, SEQ ID NO: 114, SEQ ID NO: 161, SEQ ID NO: 163, SEQ ID NO: 166, SEQ ID NO: 167 a SEQ ID NOs: 169 až 171.
- 18. Polypeptid podle nároku 1, který se zvolí z množiny sestávající ze SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 83, SEQ ID NO: 107, SEQ ID NO: 130, SEQ ID NO: 150, SEQ ID NO: 162 a SEQ ID NO: 168.
- 19. Polypeptid podle nároku 1, který je reprezentován SEQ ED NO: 82.
- 20. Polypeptid kódující polypeptidovou sekvenci podle kteréhokoliv z nároků 1 až 19 nebo jeho degenerační varianta.
- 21. Vektor obsahuj icí polynukleotid podle nároku 20.
- 22. Kultura obsahující hostitelskou buňku, která obsahuje vektor podle nároku 21.
- 23. Způsob přípravy polypeptidu, vyznačující se tím, že zahrnuje:a) kultivaci kultury podle nároku 22 za podmínek vhodných pro expresi uvedeného polypeptidu; ab) izolaci polypeptidu z kultury.
- 24. Farmaceutický přípravek pro léčbu choroby nebo stavu, které mohou být zmírněny pomocí selektivního agonisty PACAP R3, vyznačující se tím, že obsahuje polypeptid podle kteréhokoliv z nároků 1 až 19 v kombinaci s farmaceuticky přijatelným nosičem.
- 25. Přípravek pro genovou terapii pro léčbu choroby nebo stavu, které mohou být zmírněny pomocí selektivního agonisty PACAP R3, vyznačující se tím, že obsahuje polypeptid podle nároku 20 v kombinaci s terapeuticky účinným genovým vektorem.
- 26. Purifikovaná protilátka, která se specificky váže na polypeptid podle kteréhokoliv z nároků 1 až 19.
- 27. Použití polypeptidu pro přípravu léčiva pro léčení metabolické poruchy u savce, které zahrnuje podání terapeuticky účinného množství polypeptidu podle nároku 1, který se zvolí z množiny sestávající ze SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 45,-39CZ 296858 B6SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 71, SEQ ID NO: 72, SEQ ID NO: 83, SEQ ID NO: 86 a SEQ ID NO: 87.
- 28. Varianta vasoaktivního intestinálního peptidů, kterou je polypeptid podle nároku 1, zvolený z množiny sestávající ze SEQ ID NOs: 11 až 14, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NOs: 21 až 26, SEQ ID NOs: 32 až 36, SEQ ID NOs: 40 až 53, SEQ ID NOs: 57 až 61, SEQ ID NOs: 63 až 99, SEQ ID NOs: 102 až 119, SEQ ID NOs: 121 až 137, SEQ ID NOs: 139 až 177, SEQ ID NO: 179, SEQ ID NO: 180 a SEQ ID NOs: 183 až 202.
- 29. Použití polypeptidu pro výrobu léčiva pro stimulaci uvolňování insulinu glukózodependentním způsobem u savce, u něhož je tato stimulace potřebná, podáním polypeptidu podle nároku 1, přičemž tento polypeptid je zvolen z množiny sestávající ze SEQ ID NOs: 11 až 14, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NOs: 21 až 26, SEQ ID NOs: 32 až 36, SEQ ID NOs: 40 až 53, SEQ ID NOs: 57 až 61, SEQ ID NOs: 63 až 99, SEQ ID NOs: 102 až 119, SEQ ID NOs: 121 až 137, SEQ ID NOs: 139 až 177, SEQ ID NO: 179, SEQ ID NO: 180, a SEQ TD NOs: 183 až 202, savci.
- 30. Použití polypeptidu pro výrobu léčiva pro léčbu respiračního onemocnění u savce, kdy se savci podává terapeuticky účinné množství polypeptidu podle kteréhokoliv z nároku 1 až 19.
- 31. Použití polypeptidu pro výrobu léčiva pro léčbu astmatu u savce zahrnující podání terapeuticky účinného množství polypeptidu podle kteréhokoliv z nároků 1 až 19 savci.
- 32. Použití polypeptidu pro výrobu léčiva pro léčbu přecitlivělosti dýchacích cest u savce zahrnující podání terapeuticky účinného množství polypeptidu podle kteréhokoliv z nároků 1 až 19 savci.
- 33. Použití polypeptidu pro výrobu léčiva pro léčbu astmatu u savce zahrnující podání terapeuticky účinného množství polypeptidu podle nároku 1, který je reprezentován SEQ ID NO: 82 nebo SEQ ID NO: 88, savci.
- 34. Použití polypeptidu pro výrobu léčiva léčbu přecitlivělosti dýchacích cest u savce zahrnující podání terapeuticky účinného množství polypeptidu podle nároku 1, který je reprezentován SEQ ID NO: 82 nebo SEQ ID NO: 88, savci.
- 35. Použití polypeptidu pro výrobu léčiva pro léčbu respiračního onemocnění u savce zahrnující podání terapeuticky účinného množství polypeptidu podle nároku 1, který je reprezentován SEQ ID NO: 82 nebo SEQ ID NO: 88, savci.
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US40783299A | 1999-09-28 | 1999-09-28 | |
US59528000A | 2000-06-15 | 2000-06-15 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CZ20021085A3 CZ20021085A3 (cs) | 2003-01-15 |
CZ296858B6 true CZ296858B6 (cs) | 2006-07-12 |
Family
ID=27020026
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CZ20021085A CZ296858B6 (cs) | 1999-09-28 | 2000-09-27 | Agonisté receptoru 3 (R3) hypofyzárního peptidu aktivujícího adenylátcyklázu (PACAP) a jejich farmaceutické pouzití |
Country Status (19)
Country | Link |
---|---|
EP (1) | EP1192182B1 (cs) |
AT (1) | ATE397625T1 (cs) |
AU (1) | AU7726600A (cs) |
CA (1) | CA2379604A1 (cs) |
CO (1) | CO5280048A1 (cs) |
CZ (1) | CZ296858B6 (cs) |
DE (1) | DE60039111D1 (cs) |
DO (1) | DOP2000000071A (cs) |
ES (1) | ES2307534T3 (cs) |
GT (1) | GT200000162A (cs) |
HU (1) | HUP0202175A3 (cs) |
MY (1) | MY131983A (cs) |
PE (1) | PE20010612A1 (cs) |
RU (1) | RU2269354C2 (cs) |
SK (1) | SK5552002A3 (cs) |
SV (1) | SV2002000184A (cs) |
TW (1) | TWI264438B (cs) |
UY (1) | UY26360A1 (cs) |
WO (1) | WO2001023420A2 (cs) |
Families Citing this family (36)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
UA74912C2 (en) | 2001-07-06 | 2006-02-15 | Merck & Co Inc | Beta-aminotetrahydroimidazo-(1,2-a)-pyrazines and tetratriazolo-(4,3-a)-pyrazines as inhibitors of dipeptylpeptidase for the treatment or prevention of diabetes |
CA2472956A1 (en) * | 2002-02-14 | 2003-08-21 | Bayer Pharmaceuticals Corporation | Formulation strategies in stabilizing peptides in organic solvents and in dried states |
US7615219B2 (en) | 2003-01-16 | 2009-11-10 | Life Sciences Research Partners Vzw | Inhibition of PACAP signalling for the prevention and treatment of thrombocytopenia |
US7947261B2 (en) | 2003-05-23 | 2011-05-24 | Nektar Therapeutics | Conjugates formed from polymer derivatives having particular atom arrangements |
TR201907313T4 (tr) | 2003-05-23 | 2019-06-21 | Nektar Therapeutics | İki PEG zinciri içeren PEG türevleri. |
US20090143283A1 (en) * | 2004-01-27 | 2009-06-04 | Bayer Pharmaceuticals Corporation | Pituitary Adenylate Cyclase Activating Peptide (PACAP) Receptor (VPAC2) Agonists and Their Pharmacological Methods of Use |
DE602005010578D1 (de) * | 2004-05-21 | 2008-12-04 | Lilly Co Eli | Selektive peptidische agonisten des vpac2-rezeptors |
CA2567635A1 (en) * | 2004-05-21 | 2005-12-01 | Eli Lilly And Company | Selective vpac2 receptor peptide agonists |
WO2005123109A2 (en) * | 2004-06-12 | 2005-12-29 | Bayer Pharmaceuticals Corporation | Pegylation of vasoactive intestinal peptide (vip)/pituitary adenylate cyclase activating peptide (pacap) receptor 2 (vpac2) agonists and methods of use |
EP1781693A2 (en) * | 2004-08-18 | 2007-05-09 | Eli Lilly And Company | Selective vpac2 receptor peptide agonists |
WO2006042152A2 (en) * | 2004-10-08 | 2006-04-20 | Forbes Medi-Tech (Research) Inc. | Vasoactive intestinal polypeptide pharmaceuticals |
US7595294B2 (en) * | 2004-10-08 | 2009-09-29 | Transition Therapeutics, Inc. | Vasoactive intestinal polypeptide pharmaceuticals |
ATE528005T1 (de) | 2005-01-10 | 2011-10-15 | Cortendo Ab Publ | 2s,4r ketoconazol zur behandlung von diabetes, metabolischem syndrom und anderen erkrankungen |
EP1896048A4 (en) * | 2005-05-06 | 2010-11-03 | Bayer Pharmaceuticals Corp | PEPTIDE RECEPTOR (VPAC2) AGONISTS THAT ACTIVATE HYPOPHYSIC ADENYLATE CYCLASE (PACAP) AND THEIR PHARMACOLOGICAL METHODS OF USE |
US20080194482A1 (en) * | 2005-08-11 | 2008-08-14 | Jorge Alsina-Fernandez | Selective Apac2 Receptor Peptide Agonists |
BRPI0617740A2 (pt) | 2005-10-26 | 2011-08-02 | Lilly Co Eli | agonistas seletivos peptìdicos do receptor vpac2, composição farmacêutica e uso dos referidos agonistas |
EP1801098A1 (en) | 2005-12-16 | 2007-06-27 | Merck Sante | 2-Adamantylurea derivatives as selective 11B-HSD1 inhibitors |
TW200745163A (en) * | 2006-02-17 | 2007-12-16 | Syntonix Pharmaceuticals Inc | Peptides that block the binding of IgG to FcRn |
BRPI0719835A2 (pt) | 2006-10-02 | 2014-05-06 | Cortendo Invest Ab | Enantiômero de cetoconazol em humanos |
EP1935420A1 (en) | 2006-12-21 | 2008-06-25 | Merck Sante | 2-Adamantyl-butyramide derivatives as selective 11beta-HSD1 inhibitors |
EP2110374A1 (en) | 2008-04-18 | 2009-10-21 | Merck Sante | Benzofurane, benzothiophene, benzothiazol derivatives as FXR modulators |
EA201100049A1 (ru) | 2008-06-27 | 2011-08-30 | Новартис Аг | Органические соединения |
CA2743489A1 (en) | 2008-11-17 | 2010-05-20 | Merck Sharp & Dohme Corp. | Substituted bicyclic amines for the treatment of diabetes |
US20120010135A1 (en) | 2009-04-01 | 2012-01-12 | Xenon Pharmaceuticals Inc. | Spiro derivatives for the modulation of stearoyl-coa desaturase |
WO2011011508A1 (en) | 2009-07-23 | 2011-01-27 | Schering Corporation | Benzo-fused oxazepine compounds as stearoyl-coenzyme a delta-9 desaturase inhibitors |
WO2011011506A1 (en) | 2009-07-23 | 2011-01-27 | Schering Corporation | Spirocyclic oxazepine compounds as stearoyl-coenzyme a delta-9 desaturase inhibitors |
IN2012DN01913A (cs) | 2009-10-01 | 2015-07-24 | Novartis Ag | |
JP2013510834A (ja) | 2009-11-16 | 2013-03-28 | メリテク | [1,5]‐ジアゾシン誘導体 |
CN102791701B (zh) | 2009-12-30 | 2014-02-12 | 深圳信立泰药业股份有限公司 | 作为二肽基肽酶iv(dpp-iv)抑制剂的3-(3-氨基哌啶-1-基)-5-氧代-1,2,4-三嗪衍生物 |
CU24075B1 (es) * | 2011-08-26 | 2015-01-29 | Ct De Ingeniería Genética Y Biotecnología | Composición vacunal que comprende el péptido activador de la adenilato ciclasa de pituitaria como adyuvante molecular. |
AU2013248880A1 (en) | 2012-04-16 | 2014-11-06 | Kaneq Pharma Inc. | Fused aromatic phosphonate derivatives as precursors to PTP-1B inhibitors |
WO2015023890A1 (en) * | 2013-08-14 | 2015-02-19 | The Arizona Board Of Regents On Behalf Of The University Of Arizona | Glycosylated pacap/vip analogues with enhanced cns penetration for treatment of neurodegenerative diseases |
CA2945681A1 (en) | 2014-04-17 | 2015-10-22 | Merck Sharp & Dohme Corp. | Sitagliptin tannate complex |
EP3283517A4 (en) | 2015-04-16 | 2019-03-06 | Alder Biopharmaceuticals, Inc. | ANTI-PACAP ANTIBODIES AND USES THEREOF |
AU2017250807A1 (en) | 2016-04-15 | 2018-10-25 | H. Lundbeck A/S. | Anti-PACAP antibodies and uses thereof |
WO2020074958A1 (en) | 2018-10-12 | 2020-04-16 | Strongbridge Dublin Limited | Levoketoconazole for treatment of congenital adrenal hyperplasia and primary aldosteronism |
Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5677419A (en) * | 1991-10-11 | 1997-10-14 | Hoffmann-La Roche Inc. | Cyclic vasoactive peptide analogs |
WO1999047159A1 (fr) * | 1998-03-13 | 1999-09-23 | Assistance Publique - Hopitaux De Paris | Utilisation d'analogues du vip dans la prevention et le traitement des lesions cerebrales du nouveau-ne humain |
Family Cites Families (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
DE69132864T2 (de) * | 1990-03-17 | 2002-08-08 | Takeda Chemical Industries, Ltd. | Antikörper gegen hypophysäre adenylatzyklase aktivierende peptid-pacap, hybridome und bestimmung von pacap |
EP0796867B1 (en) * | 1995-06-09 | 2003-11-05 | Itoham Foods Inc. | Peptide, bronchodilator and blood flow ameliorant |
WO1998002453A2 (en) * | 1996-07-15 | 1998-01-22 | Universite Libre De Bruxelles | Peptidic ligands having a higher selectivity for the vip1 receptor than for the vip2 receptor |
ATE449789T1 (de) * | 1998-07-20 | 2009-12-15 | Ipsen Pharma | Pacap-peptidanaloga |
-
2000
- 2000-09-27 WO PCT/US2000/026638 patent/WO2001023420A2/en active IP Right Grant
- 2000-09-27 PE PE2000001015A patent/PE20010612A1/es not_active Application Discontinuation
- 2000-09-27 HU HU0202175A patent/HUP0202175A3/hu unknown
- 2000-09-27 SK SK555-2002A patent/SK5552002A3/sk unknown
- 2000-09-27 CA CA002379604A patent/CA2379604A1/en not_active Abandoned
- 2000-09-27 DE DE60039111T patent/DE60039111D1/de not_active Expired - Lifetime
- 2000-09-27 CZ CZ20021085A patent/CZ296858B6/cs not_active IP Right Cessation
- 2000-09-27 RU RU2001136014/15A patent/RU2269354C2/ru active
- 2000-09-27 ES ES00967002T patent/ES2307534T3/es not_active Expired - Lifetime
- 2000-09-27 AU AU77266/00A patent/AU7726600A/en not_active Abandoned
- 2000-09-27 EP EP00967002A patent/EP1192182B1/en not_active Expired - Lifetime
- 2000-09-27 AT AT00967002T patent/ATE397625T1/de not_active IP Right Cessation
- 2000-09-28 GT GT200000162A patent/GT200000162A/es unknown
- 2000-09-28 TW TW089120330A patent/TWI264438B/zh not_active IP Right Cessation
- 2000-09-28 UY UY26360A patent/UY26360A1/es unknown
- 2000-09-28 DO DO2000000071A patent/DOP2000000071A/es unknown
- 2000-09-28 SV SV2000000184A patent/SV2002000184A/es not_active Application Discontinuation
- 2000-09-28 MY MYPI20004551A patent/MY131983A/en unknown
- 2000-09-28 CO CO00073865A patent/CO5280048A1/es active IP Right Grant
Patent Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5677419A (en) * | 1991-10-11 | 1997-10-14 | Hoffmann-La Roche Inc. | Cyclic vasoactive peptide analogs |
WO1999047159A1 (fr) * | 1998-03-13 | 1999-09-23 | Assistance Publique - Hopitaux De Paris | Utilisation d'analogues du vip dans la prevention et le traitement des lesions cerebrales du nouveau-ne humain |
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
Gourlet P. et al., Vasoactive intestinal peptide modification at position 22 allows discrimination between receptor subtypes, European Journal of Pharmacology, 348(1),95-99,1998 * |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
ATE397625T1 (de) | 2008-06-15 |
CZ20021085A3 (cs) | 2003-01-15 |
HUP0202175A2 (en) | 2002-10-28 |
WO2001023420A2 (en) | 2001-04-05 |
TWI264438B (en) | 2006-10-21 |
RU2269354C2 (ru) | 2006-02-10 |
DOP2000000071A (es) | 2002-02-28 |
CA2379604A1 (en) | 2001-04-05 |
HUP0202175A3 (en) | 2005-01-28 |
WO2001023420A3 (en) | 2001-08-30 |
GT200000162A (es) | 2002-03-22 |
EP1192182A2 (en) | 2002-04-03 |
AU7726600A (en) | 2001-04-30 |
PE20010612A1 (es) | 2001-07-12 |
EP1192182B1 (en) | 2008-06-04 |
UY26360A1 (es) | 2001-04-30 |
ES2307534T3 (es) | 2008-12-01 |
SV2002000184A (es) | 2002-06-07 |
CO5280048A1 (es) | 2003-05-30 |
MY131983A (en) | 2007-09-28 |
DE60039111D1 (de) | 2008-07-17 |
SK5552002A3 (en) | 2003-05-02 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CZ296858B6 (cs) | Agonisté receptoru 3 (R3) hypofyzárního peptidu aktivujícího adenylátcyklázu (PACAP) a jejich farmaceutické pouzití | |
US9938335B2 (en) | Glucagon and GLP-1 co-agonist compounds | |
CN106715466B (zh) | 作为选择性胰高血糖素受体激动剂的毒蜥外泌肽-4衍生物 | |
US7488716B2 (en) | Peptides acting as both GLP-1 receptor agonists and glucagon receptor antagonists and their pharmacological methods of use | |
US7378494B2 (en) | Pituitary adenylate cyclase activating peptide (PACAP) receptor (VPAC2) agonist peptide | |
US7507714B2 (en) | Pituitary adenylate cyclase activating peptide (PACAP) receptor 3 (R3) agonists and their pharmacological methods of use | |
AU2003200839A1 (en) | Extended glucagon-like peptide-1 analogs | |
US20080261871A1 (en) | Y2/Y4 Selective Receptor Agonists for Therapeutic Interventions | |
TW201609800A (zh) | 做為雙重glp-1/升糖素受體促效劑之艾塞那肽-4胜肽類似物 | |
US20210340211A1 (en) | Gip peptide analogues | |
US11572399B2 (en) | Long-acting GIP peptide analogues | |
US20030124669A1 (en) | Peptides acting as both GLP-1 receptor agonists and glucagon receptor antagonists and their pharmacological methods of use | |
US6972319B1 (en) | Pituitary adenylate cyclase activating peptide (PACAP)receptor 3 (R3) agonists and their pharmacological methods of use | |
US20110269680A1 (en) | Glp-1 analogs and uses thereof | |
CN114867742A (zh) | 胰高血糖素和glp-1受体的钉合内酰胺共激动剂 | |
AU2002341961A1 (en) | Peptides acting as both GLP-1 receptor agonists and glucagon receptor antagonists and their pharmacological methods of use | |
KR20050018988A (ko) | 뇌하수체 아데닐레이트 사이클라제 활성화펩타이드(pacap) 수용체(vpac2) 효능제 및 그의약물학적 사용방법 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
MM4A | Patent lapsed due to non-payment of fee |
Effective date: 20090927 |