CZ296587B6 - Nový zpusob kvantifikace nukleových kyselin - Google Patents

Abstract

Postup kvantifikace nukleových kyselin je veden tak, aby pro kvantifikovaný terc byla nalezena dostatecne dlouhá nealelická semiidentická sekvence mezi sekvencemi prirozene prítomnými ve vzorku, obvykle jde o genomickou DNA, hnRNA nebo mRNA. Tato semiidentická sekvence je vyuzita pro navrzení amplifikacního kvantifikacního systému tak, ze identické ci semiidentické oligonukleotidy navrzené z tétosekvence produkují dva signály - z merené a kontrolní sekvence. Jejich pomer je pouzit k absolutní kvantifikaci, pricemz k rozlisení obou signálu je vyuzita semiidentita amplifikovaných sekvencí.

Description

(57) Anotace:

Postup kvantifikace nukleových kyselin je veden tak, aby pro kvantifikovaný terč byla nalezena dostatečně dlouhá nealelická semiidentická sekvence mezi sekvencemi přirozeně přítomnými ve vzorku, obvykle jde o genomickou DNA, hnRNA nebo mRNA. Tato semiidentická sekvence je využita pro navržení amplifikačního kvantifikačního systému tak, že identické či semiidentické oligonukleotidy navržené z této sekvence produkují dva signály - z měřené a kontrolní sekvence. Jejich poměr je použit k absolutní kvantifikaci, přičemž k rozlišení obou signálů je využita semiidentita amplifikovaných sekvencí.

Nový způsob kvantifikace nukleových kyselin

Oblast techniky

Biotechnologie - molekulárně genetické diagnostické postupy založené na analýze nukleových kyselin.

Dosavadní stav techniky

Nutnost přesné, rychlé a automatizovatelné kvantifikace vybraných terčů nukleových kyselin (terč = sledovaný úsek DNA nebo RNA jakéhokoliv původu a typu) v biologickém materiálu je stále naléhavěji pociťována jak v experimentální, tak i v praktické, například medicínské praxi.

Kvantifikace DNA či RNA terčů v biologickém vzorku není přímočarým procesem. Tato potíž je způsobena více faktory, dva nejmarkantnější jsou 1) vysoce komplexní, individuálně odlišná sekvence jednotlivých polymerů nukleových kyselin samých a b) vysoká variabilita v kvalitě samotných biologických vzorků.

Například terč DNA 350 nukleotidů (nt) dlouhý tvoří jen 0,00001% z délky lidského genomu; pro množinu lidské buněčné mRNA je terč jedné průměrné mRNA o počtu 100 molekul v buňce jen 0,0036% zlomek. Pro zkoncentrování je nutné použít amplifikační krok, kdy je vybraný terč selektivně amplifikován na úroveň, kdy je jeho odečitatelný signál zřetelně rozlišitelný od pozadí 25 (1-8).

Pokud je jako vstupní materiál použit biologický vzorek odebraný od dvou různých individuí anebo od téhož individua, ale s časovým odstupem, nelze téměř nikdy garantovat stejnou historii takovýchto dvou vzorků v důsledku řady faktorů: individuálních genetických rozdílů neimbred30 nich osob, aktuálního zdravotního stavu pacienta tj. poskytovatele vzorku, způsob transportu, způsob a aktuální provedení izolace nukleových kyselin, vlastní provedení amplifikační reakce a její vyhodnocení a v neposlední řadě momenty vnesení pipetovacích chyb. Jedinou možností je pak tyto faktory co nejvíce omezit použitím souběžného kontrolního systému kvantifikování a srovnání výsledku pro testovaný a kontrolní templát.

Výběr kontrolního systému je zásadním počinem a protože předkládaná patentová přihláška řeší právě tento problém, je nutné tuto problematiku detailněji analyzovat.

Kontrolní systémy je možné rozdělit na:

O interní nebo externí, © jednozkumavkové či dvouzkumavkové,

Θ templátově semiidentické anebo neidentické.

Ad O: Interní kontroly jsou kvalitnější než externí, nicméně je jich možno použít pouze tam, kde 45 v biologickém vzorku můžeme jednoznačně nalézt molekulu, jejíž koncentraci buď můžeme považovat za konstantní a tím například úměrnou objemu vzorku apod. anebo ji nějakým způsobem přesně změřit. Externě můžeme tuto situaci navodit tak, že do zpracovávaného biologického vzorku přesné množství nějakého terče přidáme. Kvalita nukleových kyselin takovéto externí kontroly však nemusí být stejná jako vysoce variabilní kvalita nukleových kyselin v biologickém 50 vzorku, proto je dávána přednost interním kontrolám.

Ad Θ: Optimální je, když je kontrolní a testovaný templát amplifikován ve stejné zkumavce.

Odpadají především pipetovací chyby. Některé amplifikační postupy však nedovolují amplifikaci několika terčů najednou anebo je víceterčová amplifíkace zatížena sníženou citlivostí či specifícitou (9). Pokud je přesná kvantifikace nutná, je třeba provést více reakcí z jednoho biologického vzorku najednou a výsledek statisticky ošetřit.

Ad ©: Samotný enzymatický amplifikační systém využívá bez výjimky hybridizačních vlastností nukleových kyselin - schopnosti tvořit dvouřetězcové konjugáty na základě komplementarity adenosinu s thyminem, cytosinu s guanosinem. Optimální kontrolní systém je tedy takový, který má nukleotidovou sekvenci shodnou nebo jen nepatrně odlišnou (semiidentickou). Tato semiidentita se týká jak vlastní sekvence, tak i oligonukleotidových primerů použitých při enzymatických amplifíkacích. Přímočaré je využití přirozené alelické semiidentity DNA polymorfismů nebo mutací ke kvantifikaci aneuploidií či mutací samotných. Požadovaná a nutná alelicita je však jedním z limitujících faktorů - pro některé úseky nukleových kyselin (např. mRNA) nelze nalézt alelicky odlišné sekvence, u řady dalších je nutné zařadit předcházející vyhodnocovací krok, kdy je u sledovaného individua zjišťován genotyp vytypovaných alel a teprve na základě tohoto šetření provedeno testování (10, 11). Sekvenčně semiidentické kontrolní molekuly lze připravit uměle a do měřeného roztoku je přidat jako například u kompetitivních kvantifikačních variant (12), pak ale vstupují v účinnost omezení popsaná v případě O.

V souhrnu lze konstatovat, že nejpřesnější a nejuniverzálnější kvantifikační systém využívá vnitřní, jednozkumavkový a semiidentický kontrolní systém. V praxi je pak preferováno provedení se značením fluorescenčními markéry a přímým měřením v reálném čase a/nebo vyhodnocení fluorescence na sekvenátoru. Hranice přesnosti v těchto uspořádáních dosahují i standardní odchylku měření na úrovni 0,5 % (13-15).

Podstata vynálezu

Podstatou vynálezu je nalezení zcela nového, originálního způsobu, jakým by bylo možné jednak univerzálně zajistit optimální kontrolní kvantifikační systém: vnitřní, jednozkumavkový a semiidentický a jednak, aby byl robustní, přesný a jednoduchý natolik, aby byl zužitkovatelný i v klinických podmínkách. Řešení vychází z toho, že kompletní lidská genomická sekvence je od roku 2001 známa a veřejně přístupná, ale také z faktu, že i genomické sekvence klinicky nejdůležitějších patogenních organizmů jsou determinovány. Dále vychází z příznivého výsledku teoretického výpočtu, který ukazuje jaká je statisticky vypočítaná délka sekvenčně identického či semiidentického fragmentu mezi dvěma nezávislými řetězci DNA rtebo RNA (kvantifíkačně sledovaného a kontrolního) podle vzorce:

AxBx2 = 4ⁿ (1-1) kde A je délka vytčené kvantifikované sekvence, B je délka srovnávané sekvence a n je teoretická délka shodné, nepřerušované sekvence. Podmínkou je, aby B»A, faktor 2 je odrazem skutečnosti, že lze použít ke srovnání jak sekvencí čtenou v 5-3' směru, tak i v 3-5' směru.

Stringence rovnice (1-1) může být zmíněna nejméně dvěma parametry:

Jelikož cílem hledání není 100% shodná sekvence, nýbrž nalezení semiidentické sekvence, takové, jež obsahuje mezi dvěma sekvencemi nějakou neshodu. Pouze semiidentická sekvence je pak ve výsledném amplifíkátu rozeznatelná. Do rovnice (1-1) je tedy třeba zanést parametr „p“, který udává, jak dlouhá může být sekvence, která přerušuje kdekoliv souvislou sekvenci homologní tato nehomologie zastupuje buď 3 zbývající nukleotidy anebo jeho úplné chybění (Obr. 1) - tedy 4 možností a tím je vložený zmírňující parametr dán faktorem 4’.

Druhým zmírňujícím faktorem je odraz faktu, že pro návrh amplifikačních oligonukleotidů pro obě - kontrolní i měřenou sekvenci - je akceptovatelná i 20% nehomologie, tedy zhruba každých

-2CZ 296587 B6 nukleotidů mohou být do uměle připravovaného oligonukleotidu inkorporovány oba nukleotidy. Tím se parametr 4 mění na 4°⁸ⁿ a výsledná rovnice na tvar:

A x B x 2 x 4^P = 4⁰'⁸” čili A x B = 2¹’⁶ⁿ“^2p“¹ (1-2)

Tento výpočet je teoretický, nicméně v praktickém případě je situace příznivější v tom, že porovnávané sekvence A a B mají obvykle stejnou evoluční historii, tj. lze předpokládat výskyt semiidentických sekvencí v důsledku evolučního procesu. Na druhou stranu je cílem většiny kvantifikací sekvence unikátní a tudíž je nutné alespoň vzít v patrnost, že jen 60 % sekvencí v eukaryotním genomu je unikátních, zbytek tvoří repetitivní sekvence, pro semiidentickou kvantifikaci nevyužitelné. Vzorec (1-2) tak poskytuje ten krajní hodnotu v praxi i o řád překračovanou (viz příklady uskutečnění vynálezu).

Příklady provedení vynálezu

I. kvantifikace exprese mRNA a hnRNA

II. kvantifikace virů

III. kvantifikace fetální DNA ve směsi s mateřskou v mateřské plazmě

I. Kvantifikace exprese informačních RNA (mRNA) a heteronukleámí RNA (hnRNA) vůči expresi house-keeping genů nebo genomické DNA.

V lidském genolu je asi 30 000 genů. Z těchto je exprimována odpovídající hnRNA, potažmo mRNA a její hladina v různých podmínkách je předmětem experimentálního či klinického sledování. Průměrná délka mRNA je asi 3300 nt (= hodnota A), započteny jsou i 5' a 3' netranslatované úseky. Celkově tedy tvoří sekvence mRNA délku 3300 x 30 000= 10⁸ nukleotidů (tj. asi 3,3 % z celkové délky lidského genomu). Pro srovnávací sekvenci B lze zařadit buď spojenou množinu tzv. house-keeping genů, jichž je v buňce asi 1 %, tj. o celkové délce asi 10⁶ nukleotidů anebo zařadit i celkový genom - u lidí asi 2x10⁹ unikátních sekvencí. Délka n podle rovnice (1-1) pro daný parametr p = 14 je rovná

AxB = 2¹’⁶ⁿ~^2p“¹

300 x 10⁶ = 2¹’⁶”²⁸“¹

9.52 = 0.3 (l,6n- 29) = 0,48n - 8,7

18.22 = 0.48n (rovnice 1-1)

Djikg 38 to znamená, že pro danou mRNA lze v alespoň jedné „house keeping“ mRNA nalézt semiidentickou sekvenci dlouhou asi 38 nt, přerušovanou uvnitř až 14ti nukleotidovým ostrovem nehomologie včetně gapu. Z této semiidentické sekvence lze pak navrhnout dva oligonukleotidy, které budou pro obě mRNA společné.

Pro situaci, kdy je kompetitorem genomická DNA je tatáž rovnice ve tvaru:

3 00 x 2 x 10⁹ = 2^{,,6n 28}~¹

3.52 + 9,3 = 0,48n - 8,7

21.52 = 0,48n n_g = 45 a návrh oligonukleotidových primerů je ještě pohodlnější, přičemž je realizovatelný i návrh nested primerů pro amplifikace z jedné buňky nebo omezeného množství vstupního templátu.

Příklad kvantifikace hnRNA genu WDR9 v leukocytech vůči genomické DNA.

-3 CZ 296587 B6

Nalezená semiidentita mezi WDR9 hnRNA a genomickou DNA:

^FAMWDR9GA 5' CCT GTA CAC TCT ATT AAA GAA CAC 3'

WDR9GB 5' GGG ATT TAA CCA AAA TCT TGC TCT 3'

Provedení RT-PCR (reverzně-transkriptázové polymerázové řetězové reakce):

Izolace RNA ze vzorku jaderných buněk periferní krve byla provedena lýzou červených krvinek pomocí Qiagen Mini RNA kit, kdy byl použit pouze 1. krok. Izolované bílé krvinky byly naředěny do fyziologického roztoku NaCl s přibližně koncentrací 100 buněk v μΐ izolátů. 2 μΐ pak byly použity do 5 nezávislých reakcí standardní jednozkumavkové RT-PCR reakce pomocí Qiagen One Tube kitu ve složení:

ml voda ml lOxpufř ml hrubého izolátů bílých krvinek ml One Tube RT-polymerázy

0,4 ml 10 mM dNTPs

0,4 ml primer WDR9GA (300 ng/ml)

0,4 ml primer WDR9GB (300 ng/ml) provedení PCR sledovalo teplotní a časový profil:

(50 °C/10 min)lx - (94 °C/12s -53 °C/12s - 72 °C/12s)40x.

0,5 výsledného amplifikátu bylo testováno na automatickém sekvenátoru ABI Prism 310 a zaznamenány výšky a plochy píků (WDR9 hnRNA =102 bp, genomické DNA = 106bp).

II. Kvantifikace cizího genomu ve vzorcích hostitelských organizmů.

Zcela obdobně jako u dopisu a výpočtů kvantifikace mRNA lze postupovat u sekvencí cizího genomu. Pokud jde o viry, bakterie nebo nižší eukaryota, pak délka jejich genomu je dosaditelná do vzorce (1-2) a pro jeden z nejmenších virů - viru hepatitidy B pak můžeme dosadit do výpočtů jeho délku = 3200 nukleotidů jako parametr A a tudíž můžeme hodnotu n_g vypočítanou pro kvantifikace mRNA vůči genomické DNA přímo použít (tj. hodnota n_g = 45). Pro viry o větších rozměrech - papilomavirus, virus hepatitidy C atd., je situace ještě příznivější - nalezené semiidentické sekvence budou delší a bude jich více. Pro bakterie s genomy o velikosti asi 1 000 000 nukleotidů pak bude možno nalézt téměř vždy semiidentickou sekvenci vhodnou ke kvantifikaci a tudíž je možné kvantifikační reakci zpřesnit multiplikací, tj. několika nezávislými kvantifikacemi v jedné zkumavce najednou. Situaci ještě příznivě ovlivní přítomnost interních sekvencí velmi podobných sekvencím virovým, známý je i fenomén konzervativnosti některých genů a to i mezi eukaryotními a prokaryotními organizmy.

I zde je standardizace vůči genomické DNA výhodná, protože systémy determinující koncentraci genomické DNA jsou nepropracovanější ajejich užití jako kontrolních pak účelně zužitkuje tento fakt.

Kvantifikace genomické DNA cytomegaloviru vůči lidské genomické DNA zkrve pacientů.

Semiidentická sekvence CMV a lidské DNA:

CMVGA 5' CATCGGGCTGTGTTTCGA 3' = 104 bp produkt (Tm = 51 °C) CMVGB 5' GGACTCAACCTGCAGCA 3' = 92 bp produkt (Tm = 51 °C)

Provedení RT-PCR (reverzně-transkriptázové polymerázové řetězové reakce):

-4CZ 296587 B6

Izolace RNA ze vzorku jaderných buněk periferní krve byla provedena lýzou červených krvinek pomocí Qiagen Mini RNA kit, kdy byl použit pouze 1. krok. Izolované bílé krvinky byly naředěny do fyziologického roztoku NaCl s přibližnou koncentrací 100 buněk v μΐ izolátu. 2 μΐ pak byly použity do 5 nezávislých reakcí standardní jednozkumavkové RT-PCR reakce pomocí Qiagen

One Tube kitu ve složení:

μΐ voda μΐ lOxpufr μΐ hrubého izolátu bílých krvinek μΐ One Tube RT-polymerázy

0,4 μΐ 10 mM dNTPs

0,4 μΐ primer CMVGA (300 ng/ml)

0,4 μΐ primer CMVGB (300 ng/ml) provedení PCR sledovalo teplotní a časový profil:

(50 °C/10 min)lx - (94 °C/12s - 53 °C/12s - 72 °C/12s)40x.

0,5 μΐ výsledného amplifikátu bylo testováno na automatickém sekvenátoru ABI Prism 310 a zaznamenány výšky a plochy píků.

III. Kvantifikace fetálního genomu v mateřské plazmě - detekce aneuploidií.

V praktické medicínské rovině je nejúčelnější strategií léčby prevence. Z tohoto důvodu jsou prováděny či připravovány preventivní zdravotnické programy, jedním z nich je preventivní skrínink aneuploidických plodů - konkrétně trizomie 21 (tvoří 95 % záchytů). Zde je nejmodemější metodou vyšetření fetálního materiálu vyplavovaného od časných stádií těhotenství do mateřského krevního oběhu. Patentovaný postup ošetření krve těhotných umožňuje to, aby již pro těhotné I. trimestru (do 13. týdne těhotenství) byl zajištěn poměr fetální/maternální DNA v plazmě matky >5 %. Pokud je takovýto materiál zpracován např. technikou popsanou v patentu České republiky č. 293497, pak je možné garantovat pro 95 % těhotných výsledek s 99% přesností (citlivost = 95%, specificita = 99%), což jsou údaje plně akceptovatelné (srv. citlivost a specificitu masově prováděného biochemického skríninku II. trimestru odhadované na 70 % a 80 %).

Vynalezený způsob kvantifikace fetálního příspěvku dále navyšuje oba parametry, které pak mohou dosáhnout až k 99 % v obou hodnotách. Hlavním přínosem nově vynalezeného kvantifikačního postupu je však výrazné zjednodušení celé operace, kdy, při zachování vysoké přesnosti citlivosti, není třeba s výjimkou vlastního izolačního a amplifikačního kroku žádná další operace ohrožující přesnost (restrikce restrikčními endonukleázami, post-amplifikační inkorporace značených (di)deoxynukleotidů, případně nutné purifikační kroky). Proto je možná přímá automatizace procesu, nemyslitelná v žádném dosud publikovaném postupu.

Teoretický výpočet pro nejmenší lidský chromozom 21 (A= 4,8 x 10⁷) a jeho srovnání vůči zbytku genomu je, při nastavení parametru p = 3, následující:

4,8 x 10⁷ x 2 x lO⁹ = 2¹’⁶¹' ⁶¹

18,98 = 0,3(1,6n-7) n_g = 44

Semiidentická DNA sekvence lidských chromozomů 21 (kvantifikovaný) a 12 (kontrolní):

^FAM12-21F 5' TGTTGAGCAAGRGTTGTATAG 3'

12-21R 5' CATTTACAAAACACTGTAATGAAAAA 3'

Provedení amplifikační reakce:

Izolace DNA ze vzorku plazmy periferní krve byla provedena z objemu 1 ml krve dárce s karyotypem 46,XY a také z 1 ml krve pacienta s Downovým syndromem (47, XY,+21) standardním izolačním postupem kitu Qiagen DNA Mini kít s výslednou elucí do 50 μΐ destilované vody. Výsledný výtěžek DNA byl pečlivě určen denzitometrickou triplikovanou kvantifikací 5 μΐ izolátu na agarózové elektroforéze a adjustován na koncentraci 100 ng/μΐ. Z obou DNA pak byl vytvořen směsný vzorek s 0, 5, 10, 15 a 20, 25% aberantní DNA v DNA normální. Amplifikační krok byl proveden triplikátně:

135 μΐ voda μΐ lOx pufr μΐ HotStart DNA polymerázy μΐ 10 mM dNTPs μΐ primer 12-21A (300 ng/μΐ) μΐ primer 12-21B (300 ng/μΐ) a po 7x bylo pipetováno po 25 μΐ a k tomuto roztoku přidáno buď 5 μΐ z každého mixu DNA (tj. 0-25% aberantní DNA) a také 5 μΐ vody jako negativní kontroly.

Provedení PCR sledovalo teplotní a časový profil:

(94 °C/15 min)lx - (94 °C/12s - 53 °C/12s - 72 °C/12s)40x.

0,5 μΐ z každého výsledného amplifikátu bylo testováno na automatickém sekvenátoru ABIPrism 310 a zaznamenány výšky a plochy píků. Přesně byly identifikovány všechny smíšené vzorky a to detekcí adjustovaných píků v poměru 1,00 pro 0 % (aktuální naměřený poměr byl 1,07, ale tato hodnota byla vzata jako základní poměrová a definována jako 1,00); 1,027 pro 5%; 1,050 pro 10%; 1,073 pro 15%; 1,098 pro 20% a 1,125 pro 25% poměr DNA.

Velkou výhodou postupu s použitím vynalezené kvantifikace při identifikaci počtu fetálních chromozomů v plazmatické DNA mateřského oběhu je kromě vysoké přesnosti a jednoduchosti i to, že k testu není třeba otcovského vzorku a tedy žádných předcházejících vyšetření. Tím je otevřena cesta k automatizaci a přenesení testu do ambulantních podmínek.

Reference:

(1) Saiki R. K. et al. Science 230: 1350 (1985) (2) Notomi T. et al. Nucleic Acids Research 28: e63 (2000) (3) Walker G. T. et al. Nucleic Acids Research 20: 1691 (1992) (4) Guatelli J. C. et al. Proč. Nati. Acad. Sci. USA 87: 1874 (1990) (5) Erice A. et al. J. Clin. Microbiol. 38: 2837 (2000) (6) Lyamichev V. et al. Nátuře Biotechnology 17: 292 (1999) (7) Lee Η. H. Biologicals 24: 197-9 (1996) (8) Lizardi P. M. et al. Nátuře Genetics 19: 225 (1998) (9) Randěn I., et al. Vox Sang. 85: 300-6 (2003) (10) Caskey-C.T. US patent č. 5364759 (1994) (11) Mansfíeld J. US patent č. 5994057 (1999) (12) Han J. US patent č. 5888740 (2001) (13) Žďárský E., Patent České republiky č. 293497 (2004) (14) Robledo R. et al. Genomics 82: 580-2 (2003) (15) Tse C. et al. Ann Biol Clin (Paris) 61: 279-93 (2003) (16) Dhallan R. et al. JAMA. 291: 1114-9 (2004)

-6CZ 296587 B6

Průmyslová využitelnost

Analýza trendů poptávky po kvantifíkačních reakcích, zaměřených na nukleové kyseliny, má zřetelně dynamický a náběhový charakter. Přesně, jednoduché, ekonomické a pokud možno automatizované uspořádání kvantifíkačních reakcí nukleových kyselin je stále častějším požadavkem jak experimentální, tak i praktické sféry - hlavně klinické. V experimentální sféře je spektrum požadavků velmi pestré, od základního po aplikovaný výzkum biologických, medicínských, potravinářských i zemědělských věd. Je-li vzat v úvahu dokument 6. rámcového projektu Evropské Unie o hlavních směrem směrování podpory vědy, je výzkum kvantitativní a kvalitativní analýzy nukleových kyselin vůdčí. V praktické sféře je možné doložit rozsáhlé aplikace vynálezu při medicínském sledování koncentrace patogenních organizmů v biologickém vzorku například virů v krvi, bakterií v moči a jiných tělních tekutinách. Jen v České republice je ročně provedeno asi 5000 testů viru hepatitidy C a B v krvi krevních dárců a z diagnostických příčin. Při dané citlivosti a specifícitě detekce aneuploidií neinvazivním způsobem je možné očekávat plošné nasazení, což je v České republice znamená 95 000 testů ročně. Při násobení faktorem 45x, postihující poměr populace České republiky a populace ve státech, v nichž lze předpokládat podobné ekonomické podmínky a tím i zdravotnickou praxi, je možný odhadovaný počet testů až 4 500 000 ročně. Tento předpoklad je nejnověji podpořen i nálezem Dhallana a spolupracovníků (též patentováno (16)), který umožní, aby námi vynalezená metodologie byla spolehlivě uplatněna u přesného určení fetálního karyotypu pro více než 95 % těhotenství již před skončením I. trimestru.

Claims (6)

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Metoda kvantifikace nukleových kyselin, v y z n a č u j í c í se t í m , že zahrnuje kroky:

a) souběžná enzymatická nebo neenzymatická koamplifíkace vytčeného regionu jmenovaných nukleových kyselin a semiidentického nealelického regionu preferenčně, nikoliv však výhradně, polymerázovou řetězovou reakcí, ligázovou řetězovou reakcí, izotermální ampli fikací, metodou výměny DNA řetězců,

b) detekce signálu indikujícího množství vytčeného a semiidentického nealelického amplifikovaného regionu, preferenčně, nikoliv však výhradně, přímým odečtem exonukleázově produkovaného signálu využívající fluorescenčně rezonančního energetického transferu,

c) kalkulace množství vytčeného amplifikovaného regionu z poměru obou amplifíkovaných signálů, přičemž semiidentické nealelické sekvence pro testovaný a referenční segment jsou charakterizovány tím, že jsou nalezeny ze sekvencí přítomných v jednom a témže sledovaném vzorku, navzájem se liší alespoň jedním nukleotidem nebo alespoň jednonukleotidovou delecí a míra odlišnosti obou sekvencí nepřekročí 10 % odlišných nukleotidů či delecí.

2. Metoda podle nároku 1, vyznačující se tím, že výběr terčové a kontrolní semiidentické nealelické sekvence je proveden v množině různé heteronukleámí RNA (hnRNA), informační RNA (mRNA) neboje kontrolní sekvencí sekvence genomické DNA/RNA.

3. Metoda podle nároku 1, vyznačující se tím, že výběr terčové a kontrolní semiidentické nealelické sekvence je proveden mezi nukleotidovými sekvencemi dvou organizmů.

-7CZ 296587 B6

4. Metoda podle nároku 1, vyznačující se tím, že výběr terčové a kontrolní semiidentické nealelické sekvence je proveden mezi nezávislými sekvencemi, preferenčně téhož chromozomu nebo i ze dvou či více chromozomů téhož organizmu.

5 5. Metoda podle nároku 4, vyznačující se tím, že kvantifikace využívá semiidentic- kých nealelických sekvencí preferenčně, nikoliv nutně ztelomérické části téhož chromozomu nebo dvou různých chromozomů a je použita pro zjištění počtu a kvality těchto chromozomů, tj. k určení karyotypu.

ío

6. Metoda podle nároku 5, vyznačující se tím, že je použita pro odlišení fetální a mateřské frakce v plazmě matek nebo ze speciálně odebraného vzorku preferenčně, ale nikoliv omezeně ze vzorků choriové biopsie nebo amniocentézy ke stanovení kvality a počtu chromozomu fétu tj. úplného nebo jen částečného fetálního karyotypu, přímo nebo ve směsi s mateřským karyotypem.