CZ20041105A3 - Nový zpusob kvantifikace nukleových kyselin - Google Patents

Abstract

Postup kvantifikace nukleových kyselin je veden tak, aby pro kvantifikovaný terc byla nalezena dostatecne dlouhá nealelická semiidentická sekvence mezi sekvence mezi sekvencemi prirozene prítomnými ve vzorku, obvykle jde o genomickou DNA, hnRNA nebomRNA. Tato semiidentická sekvence je vyuzita pro navrzení amplifikacního kvantifikacního systému tak, ze identické ci semiidentické oligonukleotidy navrzené z této sekvence produkují dva signály - z merené a kontrolní sekvence. Jejich pomer je pouzit k absolutní kvantifikaci, pricemz k rozlisení obou signálu je vyuzita semiidentita amplifikovanýchsekvencí.

Description

Název vynálezu:

Novy způsob kvantifikace nukleovych kyselin

Oblast techniky: Biotechnologie - molekulárně genetické diagnostické postupy založené na analýze nukleových kyselin.

Charakteristika dosavadního stavu:

Nutnost přesné, rychlé a automatizovatelné kvantifikace vybraných terčů nukleových kyselin (terč = sledovaný úsek DNA nebo RNA jakéhokoliv původu a typu) v biologickém materiálu je stále naléhavěji pociťována jak v experimentální, tak i v praktické, například medicínské praxi.

Kvantifikace DNA či RNA terčů v biologickém vzorku není přímočarým procesem. Tato potíž je způsobena více faktory, dva nejmarkantnější jsou 1) vysoce komplexní, individuálně odlišná sekvence jednotlivých polymerů nukleových kyselin samých a b) vysoká variabilita v kvalitě samotných biologických vzorků.

Například terč DNA 350 nukleotidů (nt) dlouhý tvoří jen 0,00001% z délky lidského genomu; pro množinu lidské buněčné mRNA je terč jedné průměrné mRNA o počtu 100 molekul v buňce jen 0,0036% zlomek. Pro zkoncentrování je nutné použít amplifikační krok, kdy je vybraný terč selektivně amplifikován na úroveň, kdy je jeho odečitatelný signál zřetelně rozlišitelný od pozadí (1-8).

Pokud je jako vstupní materiál použit biologický vzorek odebraný od dvou různých individuí anebo od téhož individua, ale s časovým odstupem, nelze téměř nikdy garantovat stejnou historii takovýchto dvou vzorků v důsledku řady faktorů: individuálních genetických rozdílů neimbredních osob, aktuálního zdravotního stavu pacienta tj. poskytovatele vzorku, způsob transportu, způsob a aktuální provedení izolace nukleových kyselin, vlastní provedení amplifikační reakce a její vyhodnocení a v neposlední řadě momenty vnesení pipetovacích chyb. Jedinou možností je pak tyto faktory co nejvíce omezit použití souběžného kontrolního systému kvantifikování a srovnání výsledku pro testovaný a kontrolní templát.

Výběr kontrolního systému je zásadním počinem a protože předkládaná patentová přihláška řeší právě tento problém, je nutné tuto problematiku detailněji analyzovat. Kontrolní systémy je možné rozdělit na:

O interní nebo externí,

Θ jednozkumavkové čí dvouzkumavkové,

Θ templátově semiidentické anebo neidentické.

Ad O: Interní kontroly jsou kvalitnější než externí, nicméně je jich možno použít pouze tam, kde v biologickém vzorku můžeme jednoznačně nalézt molekulu, jejíž koncentraci buď můžeme považovat za konstantní a tím například úměrné objemu vzorku apod. anebo ji nějakým způsobem přesně změřit. Externě můžeme tuto situaci navodit tak, že do zpracovávaného biologického vzorku přesné množství nějakého terče přidáme. Kvalita nukleových kyselin takovéto externí kontroly však nemusí být stejná jako vysoce variabilní kvalita nukleových kyselin v biologickém vzorku, proto je dávána přednost interním kontrolám.

Ad Θ: Optimální je, když je kontrolní a testovaný templát amplifikován ve stejné zkumavce. Odpadají především pipetovací chyby. Některé amplifikační postupy však nedovolují amplifikaci několika terčů najednou anebo je víceterčová amplifikace zatížena sníženou citlivostí či specificitou (9). Pokud je přesná kvantifikace nutná, je třeba provést více reakcí z jednoho biologického vzorku najednou a výsledek statisticky ošetřit.

Ad ©: Samotný enzymatický amplifikační systém využívá bez^zýjimky hybridizačních vlastností nukleových kyselin - schopnosti tvořit dvouřetězové konjugáty na základě komplementarity adenosinu s thyminem, cytosinu s guanosinem. Optimální kontrolní systém je tedy takový, který má nukleotidovou sekvenci shodnou nebo jen nepatrně odlišnou (semiidentickou). Tato semiidentita se týká jak vlastní sekvence, tak i olégonukleotidových primerů použitých při enzymatických amplifikacích. Přímočaré je využití přirozené alelické semiidentity DNA polymorfismů nebo mutací ke kvantifikaci aneuploidií či mutací samotných. Požadovaná a nutná alelicita je však jedním z limitujících faktorů - pro některé úseky nukleových kyselin (např. mRNA) nelze nalézt alelicky odlišné sekvence, u řady dalších je nutné zařadit předcházející vyhodnocovací krok, kdy je u sledovaného individua zjišťován genotyp vytypovaných alel a teprve na základě tohoto šetření provedeno testování (10,11). Sekvenčně semidentické kontrolní molekuly lze připravit uměle a do měřeného roztoku je přidat jako například u kompetitivních kvantifikačních variant (12), pak ale vstupují v účinnost omezení popsané v případě O.

V souhrnu lze konstatovat, že nejpřesnější a nejuniverzálnější kvantifikační systém využívá vnitřní, jednozkumavkový a semiidentický kontrolní systém. V praxi je pak preferováno provedení se značením fluorescenčními márkry a přímým měřením v reálném čase a/nebo vyhodnocení fluorescence na sekvenátoru. Hranice přesnosti v těchto uspořádáních dosahují i standardní odchylku měření na úrovni 0,5% (13-15).

Podstata vynálezu:

Podstatou vynálezu je nalezení zcela nového, originálního způsobu, jakým by bylo možné jednak univerzálně zajistit optimální kontrolní kvantifikační systém: vnitřní, jednozkumavkový a semiidentický a jednak, aby byl robustní, přesný a jednoduchý natolik, aby byl zužitkoýíeíný i v klinických podmínkách. Řešení vychází z toho, že kompletní lidská genomická sekvence je od roku 2001 známa a veřejně přístupná, ale také z faktu, že i genomické sekvence klinicky nejdůležitějších patogenních organizmů jsou determinovány. Dále vychází z příznivého výsledku teoretického výpočtu, který ukazuje jaká je statisticky vypočítaná délka sekvenčně identického či semiidentického fragmentu mezi dvěma nezávislými řetězci DNA nebo RNA (kvantifikačně sledovaného a kontrolního) podle vzorce:

A x B x 2 = 4ⁿ (1-1) kde A je délka vytcene kvantifikované sekvence, B jsou délka srovnávané sekvence a n je teoretická délka shodné, nepřerušené sekvence. Podmínkou je, aby B»A, faktor 2 je odrazem skutečnosti, že lze použít ke srovnání jak sekvencí čtenou v 5'-3' směru, tak i v 3'-5' směru.

Stringence rovnice (1-1) může být zmírněna nejméně dvěma parametry:

Jelikož cílem hledání není 100% shodná sekvence, nýbrž nalezení semiidentické sekvence, takové, jež obsahuje mezi dvěma sekvencemi nějakou neshodu. Pouze semiidentická sekvence je pak ve výsledném amplifikátu rozeznatelná. Do rovnice (1-1) je tedy třeba zanést parametr „p“, který udává, jak dlouhá může být sekvence, která přerušuje kdekoliv souvislou sekvenci homologní - tato nehomologie zastupuje buď 3 zbývající nukleotidy anebo jeho úplné chybění (Obr. 1) - tedy 4 možnosti a tím je vložený zmírňující parametr dán faktorem 4^P.

Druhým zmírňujícím faktorem je odraz faktu, že pro návrh amplikačních oligonukleotidů pro obě - kontrolní i měřenou sekvenci - je akceptovatelná i 20% nehomologie, tedy zhruba každých 5 nukleotidů může být do uměle připravovaného oligonukleotidu inkorporovány oba nukleotidy. Tím se parametr 4ⁿ mění na 4°'⁸ a výsledná rovnice na tvar:

A x B x 2 x 4^P = 4^θδη čili A x B = 2¹'⁶ⁿ-^2p’¹ (1-2)

Tento výpočet je teoretický, nicméně v praktickém případě je situace příznivější v tom, že porovnávané sekvence A a B mají obvykle stejnou evoluční historii, tj. lze předpokládat výskyt semiidentických sekvencí v důsledku evolučního procesu. Na druhou stranu je cílem většiny kvantifikací sekvence unikátní a tudíž je nutné alespoň vzít v patrnost, že jen 60% sekvencí v eukaryotním genomu je unikátních, zbytek tvoří repetitivní sekvence, pro semiidentickou kvantifikaci nevyužitelné. Vzorec (1-2) tak poskytuje ten krajní hodnotu v praxi i o řád překračovanou (viz Příklady uskutečnění vynálezu).

PŘÍKLADY USKUTEČNĚNÍ VYNÁLEZU:

I. kvantifikace exprese mRNA a hnRNA

II. kvantifikace virů lil. kvantifikace fetální DNA ve směsi s mateřskou v mateřské plazmě

I. Kvantifikace exprese informačních RNA (mRNA) a heteronukleární RNA (hnRNA) vůči expresi house-keeping genů nebo genomické DNA.

V lidském genomu je asi 30 000 genů. Z těchto je exprimována odpovídající hnRNA, potažmo mRNA a její hladina v různých podmínkách je předmětem experimentálního či klinického sledování. Průměrná délka mRNA je asi 3300 nt (= hodnota A), započteny jsou 5'a 3' netranslatované úseky. Celkově tedy tvoří sekvence mRNA délku 3300 x 30 000 = 10⁸ nukleotidů (tj. asi 3,3% z celkové délky lidského genomu). Pro srovnávací sekvenci B lze zařadit buď spojenou množinu tzv. house-keeping genů, jichž je v buňce asi 1%, tj o celkové délce asi 10⁶ nukleotidů anebo zařadit i celkovýgenom - u lidí asi 2x10⁹ unikátních sekvencí. Délka n podle rovnice (1-1) pro daný parametr p = 14 je rovná

AxB = 2^1,6n'^2p_1

300 x 10⁶ = 2^1,6n_28‘¹

9.52 = 0.3 (1,6n - 29) = 0,48n - 8,7

18.22 = 0.48n (rovnice 1-1)

Hhkg ⁼ 38 to znamená, že pro danou mRNA lze v alespoň jedné „house keeping“ mRNA nalézt semidentickou sekvenci dlouhou asi 38 nt, přerušenou uvnitř až 14ti nukleotidovým ostrovem nehomologie včetně gapu. Z této semidentícké sekvence lze pak navrhnout dva oligonukleotidy, které budou pro obě mRNA společné.

Pro situaci, kdy je kompetitorem genomická DNA je tatáž rovnice ve tvaru:

300 x 2 x 10⁹ = 2^1,6-²⁸-¹

3.52 + 9,3 = 0,48n - 8,7

21.52 = 0,48n n_g = 45 a návrh oligonukleotidových primerů je ještě pohodlnější, přičemž je realizovatelný i návrh nested primerů pro amplífikace z jedné buňky nebo omezeného množství vstupního templátu.

Příklad kvantifikace hnRNA genu WDR9 v leukocytech vůči genomické DNA.

Nalezená semiidentita mezi WDR9 hnRNA a genomickou DNA :

^FAMWDR9GA 5' CCT GTA CAC TCT ATT AAA GAA CAC 3'

WDR9GB 5' GGG ATT TAA CCA AAA TCT TGC TCT 3'

Provedení RT-PCR (reverzně-transkriptázové polymerázové řetězové reakce):

Izolace RNA ze vzorku jaderných buněk periferní krve byla provedena lýzou červených krvinek pomocí pomocí Qiagen Mini RNA kit, kdy byl použit pouze 1. krok. Izolované bílé krvinky byly naředěny do fyziologického roztoku NaCI s přibližnou koncentrací 100 buněk v μΙ izolátu. 2 μΙ pak byly použity do 5 nezávislých reakcí standardní jednozkumavkové RTPCR reakce pomocí Qiagen OneTube kitu ve složení:

ml voda ml 10x pufr ml hrubého izolátu bílých krvinek ml OneTube RT-polymerázy

0,4 ml 10 mM dNTPs

0,4 ml prímer WDR9GA (300 ng/ml)

0,4 ml primer WDR9GB (300 ng/ml) provedení PCR sledovalo teplotní a časový profil:

(50°C/10 min)1x - (94°C/12/< 53°C/12yť^ 72°C/12yf)40x.

0,5 výsledného amplifikátu bylo testováno na automatickém sekvenátoru ABI Prism 310 a zaznamenány výšky a plochy píků (WDR9 hnRNA = 102 bp, genomické DNA = 106 bp).

II. Kvantifikace cizího genomu ve vzorcích hostitelských organizmů.

Zcela obdobně jako u popisu a výpočtů kvantifikace mRNA lze postupovat u sekvencí cizího genomu. Pokud jde o viry, baktérie nebo nižší eukaryota, pak délka jejich genomu je dosaditelná do vzorce (1-2) a pro jeden z nejmenších virů - viru hepatitidy B pak můžeme dosadit do výpočtů jeho délku = 3200 nukleotidů jako parametr A a tudíž můžeme hodnotu n_g vypočítanou pro kvantifikace mRNA vůči genomické DNA přímo použít (tj. hodnota n_g = 45). Pro viry o větších rozměrech - papilomavirus, virus hepatitidy C atd., je situace ještě příznivější - nalezené semidentické sekvence budou delší a bude jich více. Pro baktérie s genomy o velikosti asi 1 000 000 nukleotidů pak bude možno nalézt téměř vždy semiidentickou sekvenci vhqdnou ke kvantifikaci a tudíž je možné kvantifikační reakci zpřesnit-mmfcpUkaeípj. několika nezávislými kvantifikacemi v jedné zkumavce najednou. Situaci ještě příznivě ovlivní přítomnost interních sekvencí velmi podobných sekvencím virovým, známý je i fenomén konzervativnosti některých genů a to i mezi eukaryotními a prokaryotnímu organizmy.

I zde je standardizace vůči genomické DNA výhodná, protože systémy determurjjící koncentraci genomické DNA jsou nejpropracovanější a jejich užití jako kontrolních pak účelně zužitkuje tento fakt.

Kvantifikace genomické DNA cytomegaloviru vůči lidské genomické DNA z krve pacientů. Semidentická sekvence CMV a lidské DNA:

CMVGA 5' CATCGGGCTGTGTTTCGA 3' = 104 bp produkt (Tm = 51 °C)

CMVGB 5' GGACTCAAACCTGCAGCA 3' = 92 bp produkt (Tm = 51 °C)

Provedení RT-PCR (reverzně-transkriptázové polymerázové řetězové reakce):

Izolace RNA ze vzorku jaderných buněk periferní krve byla provedena lýzou červených krvinek pomocí pomocí Qiagen Mini RNA kit, kdy byl použit pouze 1. krok. Izolované bílé krvinky byly naředěny do fyziologického roztoku NaCI s přibližnou koncentrací 100 buněk v μΙ izolátu. 2 μΙ pak byly použity do 5 nezávislých reakcí standardní jednozkumavkové RTPCR reakce pomocí Qiagen OneTube kitu ve složení:

μΙ voda 2 μΙ 10x pufr μΙ hrubého izolátu bílých krvinek 1 μΙ OneTube RT-polymerázy

0,4 μΙ WmMdNTPs

0,4 μΙ primer CMVGA (300 ng/ml) 0,4 μΙ primer CMVGB (300 ng/ml)

0,5 μΙ výsledného amplifikátu bylo testováno na automatickém sekvenátoru ABI Prism 310 a zaznamenány výšky a plochy píků.

III. Kvantifikace fetálního genomu v mateřské plazmě - detekce aneuploidií.

V praktické medicínské rovině je nejúčelnější strategií léčby prevence. Z tohoto důvodu jsou prováděny či připravovány preventivní zdravotnické programy, jedním z nich je preventivní skrínink aneploidických plodů - konkrétně trizomie 21 (tvoří 95% záchytů). Zde je nejmodernější metodou vyšetření fetálního materiálu vyplavovaného od časných stádií těhotenství do mateřského krevního oběhu. Patentovaný postup ošetření krve těhotných umožňuje to, aby již pro těhotné I. trimestru (do 13. týdne těhotenství) byl zajištěn poměr fetální/maternální DNA v plazmě matky >5%. Pokud je takovýto materiál zpracován např. technikou popsanou vjPatentu České republiky č. 293497, pak je možné garantovat pro 95% těhotných výsledek s 99% přesností (citlivost = 95%, specificita = 99%), což jsou údaje plně akceptovatelné (srv. citlivost a specificitu masově prováděného biochemického skríninku II. trimestru odhadované na 70% a 80%).

Vynalezený způsob kvantifikace fetálního příspěvku dále navyšuje oba parametry, které pak mohou dosáhnout až k 99% v obou hodnotách. Hlavním přínosem nově vynalezeného kvantifikačního postupu je však výrazné zjednodušení celé operace, kdy, při zachování vysoké přesnosti citlivosti, není třeba s výjimkou vlastního izolačního a amplifikačního kroku žádná další operace ohrožující přesnost (restrikce restrikčními endonukleázami, post-amplifikační inkorporace značených (di)deoxynukleotidů, případně nutné purifikační kroky. Proto je možná přímá automatizace procesu, nemyslitelná v žádném dosud publikovaném postupu.

Teoretický výpočet pro nejmenší lidský chromozóm 21 (A = 4,8 x 10⁷) a jeho srovnání vůči zbytku genomu je, při nastavení parametru p = 3, následující:

4,8 x 10⁷ x 2 x 10⁹ = 2¹·⁶“⁶'¹

18,98 = 0,3(1,6n -7) n_g = 44

Semidentická DNA sekvence lidských chromozómů 21 (kvantifikovaný) a 12 (kontrolní): ^fam12-21F 5’ TGTTGAGCAAGRGTTGTATAG 3’

12-21R 5 ’ CATTTACAAAACACTGTAATGAAAAA 3'

Provedení amplifikační reakce:

Izolace DNA ze vzorku plazmy periferní krve byla provedena z objemu 1 ml krve dárce s karyotypem 46,XY a také z 1 ml krve pacienta s Downovým syndromem (47, XY,+21) standardním izolačním postupem kitu Qiagen DNA Mini kit s výslednou elucí do 50 μΙ destilované vody. Výsledný výtěžek DNA byl pečlivě určen densitometrickou triplikovanou kvantifikací 5 μΙ izolátu na agarózové elektroforéze a adjustován na koncentraci 100 ng/μΙ. Z obou DNA pak byl vytvořen směsný vzorek s 0, 5, 10, 15 a 20, 25% aberantní DNA v DNA normální. Amplifikační krok byl proveden triplikátně:

135 μΙ voda μΙ 10x pufr μΙ HotStart DNA polymerázy 4 μ110 mM dNTPs 4 μΙ primer 12-21A (300 ng/μΙ) μΙ primer 12-21B (300 ng/μΙ) a po 7x bylo pipetováno po 25 μΙ a k tomuto roztoku přidáno buď 5 μΙ z každého mixu DNA (tj. 0-25% aberantní DNA) a také 5 μΙ vody jako negativní kontroly.

Provedení PCR sledovalo teglotní a časoyý profil:

(94°C/15 min)1x - (94°C/12yf- 53°C/12yf- 72°C/12yt)40x.

0,5 μΙ z každého výsledného amplifikátu bylo testováno na automatickém sekvenátoru ABI Prism 310 a zaznamenány výšky a plochy píku. Přesně byly identifikovány všechny smíšené vzorky a to detekcí adjustovaných píků v poměru 1,00 pro 0% (aktuální naměřený poměr byl 1,07, ale tato hodnota byla vzata j^ko základní poměrová a definována jako 1,00); 1,027 pro 5%; 1,050 pro 10%; 1,073 pro 15%; 1,098 pro 20% a 1,125 pro 25% poměr DNA.

Velkou výhodou postupu s použitím vynalezené kvantifikace při identifikaci počtu fetálníťí^X chromozómů v plazmatické DNA mateřského oběhu je kromě vysoké přesnosti a jednoduchosti i to, že k testu není třeba otcovského vzorku a tedy žádných předcházejících vyšetření. Tím je otevřena cesta k automatizaci a přenesení testu do ambulantních podmínek.

Reference:

(1) Saiki R.K. et al. Science 230: 1350 (1985) (2) Notomi T. et al. Nucleic Acids Research 28: e63 (2000) (3) WalkerG.T. etal. Nucleic Acids Research 20: 1691 (1992) (4) Guatelli J.C. et al. Proč. Nati. Acad. Sci. USA 87: 1874 (1990) (5) Erice A. et al. J. Clin. Microbiol. 38: 2837 (2000) (6) Lyamichev V. et al. Nátuře Biotechnology 17: 292 (1999) (7) Lee H.H. Biologicals 24: 197-9 (1996) (8) Lizardi P.M. et al. Nátuře Genetics 19: 225 (1998) (9) Randěn I., et al. Vox Sang. 85: 300-6 (2003) (10) Caskey-C.T. US patent č. 5364759 (1994) (11) Mansfield J. US Patent č. 5994057 (1999) (12) Han J. US Patent č. 5888740 (2001) (13) Žďárský E., Patent České republiky č. 293497 (2004) (14) Robledo R. et al. Genomics 82: 580-2 (2003) (15) Tse C. et al. Ann Biol Clin (Paris) 61: 279-93 (2003) (16) Dhallan R. etal. JAMA. 291: 1114-9 (2004)

Způsob průmyslového využití vynálezu:

Analýza trendů poptávky po kvantifikačních reakcích, zaměřených na nukleové kyseliny, má zřetelně dynamický a náběhový charakter. Přesné, jednoduché, ekonomické a pokud možno automatizované uspořádání kvantifikačních reakcí nukleových kyselin je stále častějším požadavkem jak experimentální, tak i praktické sféry - hlavně klinické.

V experimentální sféře je spektrum požadavků velmi pestré, od základního po aplikovaný výzkum biologických, medicínských, potravinářských i zemědělských věd. Je-li vzat v úvahu dokument 6. rámcového projektu Evropské Unie o hlavních směrech směrování podpory vědy, je výzkum kvantitativní a kvalitativní analýzy nukleových kyselin vůdčí.

V praktické sféře je možné doložit rozsáhlé aplikace vynálezu při medicínském sledování koncentrace patogenních organizmů v biologickém vzorku - například virů v krvi, baktérií v moči a jiných tělních tekutinách. Jen v České republice je ročně provedeno asi 5000 testů viru hepatitidy C a B v krvi krevních dárců a z diagnostických příčin. Při dané citlivosti a specificitě detekce aneuploidií neinvazivním způsobem je možné očekávat plošné nasazení, což jen v České republice znamená 95 000 testů ročně. Při násobení faktorem 45x, postihující poměr populace České republiky a populace ve státech, v nichž lze předpokládat podobné ekonomické podmínky a tím i zdravotnickou praxi, je možný odhadovaný počet testů až 4 500 000 ročně. Tento předpoklad je nejnověji podpořen i nálezem Dhallana a spolupracovníků (též patentováno (16)), který umožní, aby námi vynalezená metodologie byla spolehlivě uplatněna u přesného určení fetálního karyotypu pro více než 95% těhotenství již před skončením I. trimestu.

Claims (6)

1. Patentové nároky

   1) Metoda kvantifikace nukieových kyselin vyznačující se tím, že zahrnuje kroky:

   a) souběžná enzymatická nebo neenzymatická koamplifikace vytčeného regionu jmenovaných nukieových kyselin a semiidentického nealelického regionu preferenčně, nikoliv však výhradně, polymerázovou řetězovou reakcí, ligázovou řetězovou reakcí, izotermální amplifikací, metodou výměny DNA řetězců,

   b) detekce signálu indikující množství vytčeného a semiidentického nealelického simplifikovaného regionu, preferenčně, nikoliv však výhradně, přímým odečtem exonukleázově produkovaného signálu využívající fluorescenčně rezonanční energetického transferu,

   c) kalkulace množství vytčeného simplifikovaného regionu z poměru obou simplifikovaných signálů.

   přičemž semiidentických nealelické sekvence pro testovaný a referenční segment jsou charakterizovány tím, že jsou nalezeny ze sekvencí přítomných v jednom a téže^ sledovaném vzorku, navzájem se liší alespoň jedním nukleotidem nebo alespoň jednonukleotidovou delecí a míra odlišnosti obou sekvencí nepřekročí 10% odlišných nukleotidů či delecí.
2. 2} Metoda podle nároku 1/vyznačující se tím, že výběr terčové a kontrolní semiidentické

   JZ. ' nealelické sekvence je proveden v množině ruznycfi heteronukleámí RNA (hnRNA), informační RNA (mRNA) nebo je kontrolní sekvencí sekvence genomické DNA/RNA.
3. 3/ Metoda podle nároku 1/vyznačující se tím, že výběr terčové a kontrolní semiidentické nealelické sekvence je proveden mezi nukleotiovými sekvencemi dvou organizmů*
4. 4) Metoda podle nároku 1/vyznačující se tím, že výběr terčové a kontrolní semiidentické nealelické sekvence je proveden mezi nezávislými sekvencemi, preferenčně téhož chromozómu nebo i ze dvou či více chromozómů téhož organizmu.
5. 5) . Metoda podle nároku 4>fvyznačující se tím, že kvantifikace využívá semiidentických nealelických sekvencí preferenčně, nikoliv nutně z telomérické části téhož chromozómu nebo dvou různých chromozómů a je použita pro zjištění počtu a kvality těchto chromozómů^fk určení karyotypu.
6. 6}. Metoda podle nároku 5/, vyznačující se tím, že je použita pro odlišení fetální a mateřské frakce v plazmě matek nebo ze speciálně odebraného vzorku preferenčně, ale nikoliv omezeně ze vzorků choriové biopsie nebo amniocentézy £4ίη/ι stanovení^ kvality a počtu chromozómů fétu ^úplného nebo jen částečného fetálního karyotypu^přímo nebo ve směsi s mateřským karyotypem.