CZ286598A3

CZ286598A3 - Způsob imunomagnetického oddělování buněk

Info

Publication number: CZ286598A3
Application number: CZ982865A
Authority: CZ
Inventors: Oystein Fodstad; Johannes Eivind Hovig; Olav Engebraten; Anna Hansen Ree
Original assignee: Oystein Fodstad
Priority date: 1996-03-26
Filing date: 1997-03-25
Publication date: 1999-02-17
Also published as: TR199801916T2; BR9708256A; DE69725297T2; NZ331920A; AU703262B2; JP2000509250A; RU2180963C2; KR19990087833A; SK282091B6; CN1214738A; DE69725297D1; PL329038A1; ATE251223T1; PL185182B1; EP0894146B1; HUP9901786A3; IL126257A; CA2250202A1; SK141698A3; NO961221D0

Description

Způsob imunomagnetického oddělování buněk.

Oblast techniky

Vynález se týká způsobu imunomagnetického oddělování buněk, zejména při identifikaci genů s lokálně specifickým nebo lokálně preferovaným vyjádřením ve specifických cílových buňkách vyskytujících se v buňkovém prostředí odlišném nebo nikoli od prostředí jejich původu.

Dosavadní stav techniky

Je již známo, že mnohé druhy rakoviny mívají typická schémata svého šíření v tom smyslu, že metastázy se objevují preferenčně v určitých tkáních nebo orgánech, často v uspořádaném způsobu. Tak například se metastázy rakoviny prsu obvykle vyvíjejí nejprve v pomocných mízních uzlinách, kdežto metastázy kostní dřeně nebo kostí představují první a nej obvyklejší (50 %) místo dálkového šíření. Z jiných tkání se játra, plíce a centrální nervová soustava (až do 20 %) stávají hostiteli metastáz rakoviny prsu. Podobně dává prostata rakoviny skeletní metastázy; rakovina tlustého střeva se šíří do mízních uzlin a jater; zhoubný nádor kosti do plic a maligní melanom do mízních uzlin, jater a mozku. Velice málo je známo o činitelích, které určují takové šíření rakoviny s preferováním tkání, avšak vyskytují se v tom určitě specifické charaktetistiky nádorových buněk, např. umožňováním nádorovým buňkám najít cestu do cílového orgánu, pohybovat se a vnikat do hostitelské tkáně, reagovat na místní růstové faktory, vyvolávat angiogenesi nebo reagovat dosud neznámými způsoby.

Tyto charakteristiky se musí uvádět v souvislost s vyjadřováním

I

• i • ♦ ** ♦·♦ * · t · specifických proteinů, vyjadřovaných známými nebo neznámými geny. Pro identifikaci takových genů může být proto značně důležitým pochopení mechanismů metastázy a tím zajistit nová vodítka nebo záchytné body pro diagnózu a terapii. Při výzkumu se pro geny, které jsou vysoce vyjadřovány v určitých populacích buněk a nikoli v jiných, používá několik způsobů, včetně postupů, jako například subtraktivní hybrldizační klonování a používání postupu diferenciálního zobrazování. Většina takových klonovacích projektů zahrnuje používání in vitro buněčných linií nebo klonů jakožto výchozího materiálu.

Je však známo, že buňkové linie se mohou významně lišit od nádorových buněk, od nichž pocházejí, a že podmínky kultur in vitro mohou vyregulovat nahoru nebo dolů vyjádření genů zde se vyskytujících při rozhodování schopnosti buněk vnikat do mimobuněčných ložisek a stromální tkáně, jakož i jejich celkové metastatické kapacity. Logickou alternativou k buňkovým liniím na porovnávání vyjádření genových přepisů zajímavých proteinů by bylo používat vzorky tumorových tkání z primárních nádorů a metastáz od pacientů. Takový přístup však zahrnuje několik možností dopustit se omylu a též technické nesnáze. Při používání nádorových buněk od různých pacientů se vyjádření genových charakteristik každého individua musí substrahovat, než se porovnávávají schémata genového vyjádření týkajícího se cíle vyšetřování. Toto dodává takovému genovému klonování nesmírnou komplexnost. Proto by bylo prospěšné mít možnost porovnávání schémat vyjádření u rakovinných buněk získaných z nádorových projevů nacházejících se na různých místech u téhož jednotlivce. To může být možným sběrem národorových tkání jak z primárních nádorových a zjevných metastáz, zjištěných a odebraných při chirurgickém zákroku, a/nebo chirurgickým zákrokem nebo biopsií recidivující choroby, nebo ze sekundárních tumorů u pacientů s progresivní nemocí, kteří buď dostali nebo nedostali jiné modality ošetření po primárním

-3 0 0 ·' • · 0 «

0 00 • 0 0 *

0 0 « ·« 0· «'· «0 « · * 0 • 0 « · * 0 fc fcfc «

Φ 0 ·

0« ·« *0 00

0· « • * ·0 • · 0 · <

• 0 « «0 ♦· chirurgickém zákroku. U jakéhokoli projektu genového klonování je důležité pracovat s co nej čistšími populacemi cílových buněk a pokoušet se zamezovat irelevantní signály od necílových buněk, činící nejasnými schémata vyjádření určených k porovnávání. U vzorků z pevných nádorů se toho dosahuje nesnadno, protože u chirurgických vzorků a biopsií se nádorové buňky mísí s normální vazivovou tkání, včetně stromálních a endoteliálních buněk, které konvenční způsoby přípravy tkání nemohou uspokojivě odstraňovat. U hematologických rakovin sdílejí maligní buňky determinanty příslušné subpopulace normálních buněk, což zamezuje oddělování těchto dvou druhů buněk. Při pokusech identifikovat geny, které se vyskytují v ranných stádiích tumorového šíření by bylo důležité získávat nádorové buňky z relevantních míst, když velikost sekundárních tumorů je malá, nebo pokud možno též z subklínických ložisek nebo buněk. Jedním příkladem by byly maligní buňky vyskytující se v krvi nebo v kostní dřeni dříve, než konvenční diagnostická opatření mohou prokázat solidní projev metastázy. Jiným příkladem by byly rakovinné buňky vyskytující se v mozkomíšním moku, v moči, nebo v efúzích v pleurálních nebo abdominálních dutinách dříve, než se mohou konvenčními morfologickými postupy takové buňky zjistit. A dále, při primárním chirurgickém zásahu nebo při podezření na metastatické šíření se mízní uzliny často odstraňují, protože jsou zvětšené. Morfologické vyšetření však může být přesto negativní v případě, když se ještě může vyskytovat omezený počet nádorových buněk. Ve všech těchto příkladech popisuje tento vynález prostředek na zjišťování a selekci cílových nádorových buněk pro účel genového klonování. Dodatkem k používání rakovinných buněk získaných z různých tkání nebo orgánů u pacientů popisuje vynález též jiný způsob získávání metastatických lidských nádorových buněk k použití při výzkumu pro geny s lokálně specifickým vyjádřením. Buňky z několika lidských nádorů se pěstovaly in vitro nebo ve

-4fcfc

	fc ·	fcfc	fcfc	fcfc
• fc	«	• fc	• ·	♦ I
• • fc	fcfc •	fc · • · ·	« · fcfcfc	• fc • fcfcfc
• «	• • fc	fc fc fcfc	• fcfc	* fcfc

zvířatech s deficitem imunity in vivo, a takových buněk se použilo na vypracování experimentálních modelů metastázy nebo modelů, při nichž se buňky dají pěstovat ortotopicky, tj. v klinicky relevantních tkáních původu; maligní melanomy v kůži; osteosarkoma v kostí; kolorektální rakovina ve střevní stěně; prsní rakovina v prsním tukovém polštáři atd. U experimentálních modelů metastázy různých druhů nádorového šíření lze pozorovat, podle buňkové linie, trasu buněčné injekce a druh použitého hostitele. Metastázové vzory obvykle simulují šíření příslušného nádorového typu u souboru pacientů při předvádění. Použitím takových modelů se umožňuje též získávat nádorové buňky z metastatických míst, obvykle nikoli přístupných u pacientů, jako např. tkáň míchy a mozku. A opět, pro účely genového klonování by byla důležitá selekce lidských nádorových buněk z živočišných buněk, aby se vyloučily problémy s geny vyjádřenými v normálních hostitelských buňkách. Dosud bylo možné provádět smysluplné pokusy genového klonování na vzorcích pevných nádorů a metastáz a na maligních buňkách v krvi a kostní dřeni s cílem identifikovat geny s lokáně specifickým vyjádřením. Toto je kvůli tomu, že značný zlomek pevných nádorů a metastáz není maligními buňkami, nýbrž pojivovou tkání nosnou a rostoucí mezi maligními buňkami, a která též obsahuje krvinky, které zařizují potřebný přívod nutričních faktorů a kyslíku do nádoru. Dosud se nepovažovalo za možné adekvátně separovat nádorové buňky od normálních buněk bez zařazení určitého mezikroku pěstování buněk in vitro, včetně manipulace, jak se zbavit normálních buněk. Taková kultivace in vitro by však dávala selekci subpopulace nádorových buněk v prostředí naprosto odlišném od situace in vivo, čímž by se zaváděly významné změny ve vzorech genového vyjadřování. Proto se pro účel identifikování genů, souvisejících s metastatickým procesem, kultivace nádorových buněk z pevných metastáz nedá používat. Kromě toho se ··

-5• · · ftftft • · · · * ft ftft ft · • ft ft ftft • ftft ft · • · • ft ftft •

ftftft · ft ftft ftft • ftft ft ft ftftft · • · • ft nepřihlíželo k zájmům osob známých v oboru klonování genů na porovnávání vzorů genového vyjadřování v maligních buňkách v neošetřovaných pevných primárních a metastatických tumorech. Dále, u vzorků krve a kostní dřeně tvoří nádorové buňky, pokud se vůbec vyskytují, velmi nízký zlomek celkového počtu nukleovaných buněk, a maligní buňky v krvi a kostní dřeni se nepokládají za zajímavé pro pokusy genového klonování. Je tomu tak proto, že nádorové buňky se nedaly adekvátně separovat od normálních buněk a je to důležité též proto, že lidé významní v oboru genového klonování neočekávali, že takové maligní buňky jsou dostatečně odlišné ve vzorech genového vyjadřování od těch, které se vyskytují v matečních tumorech. Rakovinných buněk izolovaných z lidských nádorů metastázujících do různých klinicky relevantních cílových tkání a orgánů u zvířat s defektem imunity se nepoužívalo v pokusech identifikovat s tumorem související geny s lokálně specifickým vyjádřením, a to prostě proto, že takové lidské nádorové modely jsou velmi vzácné, avšak hlavně též proto, že nejsou způsoby na získání čistých populací rakovinných buněk. Cílem tohoto vynálezu je odstranit nedostatky dosavadního stavu a dát k dispozici nový přístup ke zjišťování nových genů s lokálně specifickými schématy vyjadřování novotvarových buněk vyskytujících se v různých tkáních. Konkrétně je cílem dát k dispozici způsob, jímž se cílové buňky dají oddělovat od populace buněk na identifikaci genových sledů od cílových buněk ve specifickém prostředí buňkové populace.

Podstata vynálezu

Nedostatky známého stavu podstatnou měrou odstraňuje a vytčený cíl vynálezu splňuje způsob imunomagnetického oddělování buněk, zejména při identifikaci genů s lokálně ·· • ♦ · «

9 99 • 9 9 9 9

9 9 9

specifickým nebo lokálně preferovaným vyjádřením ve specifických cílových buňkách vyskytujících se v buňkovém prostředí odlišném nebo nikoli od prostředí jejich původu, podle kterého jsou cílové buňky zprvu zjišťovány a izolovány opakovanými imuno-magnetickými postupy na získání až 100 % specifických cílových buněk před vystavením uvedených cílových buněk známým postupům klonování buněk, přičemž se porovnávají neznámé geny s rozdíly v hladinách vyjádření mRNA v cílových buňkách izolovaných z různých tkání. Použité cílové buňky mohou být s výhodou maligní buňky získané z pevných primárních nebo recidivujících nádorů, a/nebo z metastáz z takových nádorů do mízních uzlin, a/nebo krve, a/nebo kostní dřeně, a/nebo kostní tkáně, a/nebo jater, a/nebo plic, a/nebo centrální nervové soustavy, a/nebo maligních pleurálních efuzí a břišní vodnatelnosti, moči, a/nebo mozkomíšního moku, a/nebo jiných míst orgánů. Maligní buňky mohou být s výhodou izolované z jednobuněčných suspenzí připravených z projevů pevného nádoru, a/nebo z frakcí mononukleárních buněk, získaných ze vzorků kostní dřeně nebo krve, a/nebo buněk vyskytujících se v jiných tělesných tekutinách. Maligní buňky mohou být i in vitro kultivované lidské nádorové buňky, a/nebo lidské nádorové buňky vyrostlé ve specifických tkáních zvířat s deficiencí imunity, a/nebo experimentální lidské nádorové metastázy v takových zvířatech. RNA a/nebo DNA mohou být s výhodou extrahovány z izolovaných buněk, extrahované nukleové kyseliny lze s výhodou použít pro účely klonování genů. Genového klonování lze činit postupem diferenciálního displeje nebo subtraktivní hybridizace nebo jakéhokoli jiného postupu, jehož se dá použít na identifikaci genů s odlišným vyjádřením. S výhodou se zesílené cDNA získané z maligních buněk vybraných různých míst vyšetřují a porovnávají na sekvenční gely a kde tyto se zajímavými lokálně specifickými nebo lokálně preferovanými vzory jsou sekvenčně zařazeny a identifikovány nebo se vyšetřují vzory • 4

4

-Ί 4« ·

«

4

44 • 4 4 4

4 4 4

4 ···

4 4 *4 • 4

444 4 4 4 vyjádření identifikovaných genových sekvencí, a to na materiálu získaném ze všech relevantních míst nádorových buněk, popsaných v nárocích 1-4. Dříve neznámé geny identifikované v předcházejících nárocích mohou tak být použity pro účely genové terapie, a/nebo jako cíle pro postupy zaměřené na měnění nebo inaktivaci genů nebo jejich produktů nebo na získání specifických genových sledů a jejich produktů vyjádření v cílových buňkách, vyskytujících se v buněčných prostředích odlišných či nikoli od jejich původu. Ježto cílem vynálezu je identifikovat geny vyjadřované specificky během ranných stádií tumorového šíření (dissiminace), měly by být solidní tumory a metastázy rozměrové malé, a maligní buňky v krvi a kostní dřeni by měly představovat tak zvanou mikrometastatickou nemoc, tj. měl by se jich vyskytovat omezený počet. Pokud možno by se takové nádorové buňky měly sbírat i v případech, kde uvedené buňky se nedají zjišťovat konvenčními morfologickými vyšetřeními, nebo diagnostickými postupy jako např. radiologií a rezonančním zobrazováním. Ježto takové buňky se nedávaly rozpoznat, nebyly zřejmě zajímavými pro účely genového klonování. Používání imunomagnetických postupů umožňuje izolaci uvedených maligních buněk i tehdy, když se vyskytují v malých počtech. Různé metody zvětšování sledů DNA a RNA umožňují genové klonování na tak malém počtu maligních buněk, za předpokladu, že tato populace buněk je dostatečně čistá. Pozitivní selekce cílových nádorových buněk se dá dosahovat použitím samo o sobě známých postupů, jak je popsáno v přihlášce patentu PCT/N093/00136 (WO 94/07139) a v

PCT/N095/00052. Ježto v tomto případě je čistota finální populace cílových buněk důležitá, může se postup imunomagnetické selekce provádět vícekráte než jednou, nebo se dá provádět jako kombinace pozitivní (s cílovými buňkami rozpoznávajícími monoklonální protilátky) a negativní (s protilátkami, které se vážou na nežádoucí buňky) selekcí.

·· « · · • 9 ··

9 9 9 · • ♦ · ·

9 9 9 999 9

9 9 ·

Těchto postupů se s úspěchem použilo na izolování cílových buněk z krve, kostní dřeně, maligních efúzí a z jednotlivých buňkových suspenzí připravených z tuhé nádorové tkáně primárních tumorů a mízní uzliny jiných metastáz. Podobně byla též demonstrována selekce lidských maligních buněk z normálních stromálních nebo hematopoietických buněk ve zvířecích hostitelích, a to dokonce i v případech, kdy nádorové buňky se vyskytovaly v kosti, kostní dřeni, míše nebo mozkové tkáni. Ježto jedním cílem by bylo vyhledávat geny s produkty vyskytujícími se v ranných stádiích vytváření metastázy, může se přihodit, že se dá získat pouze poměrně málo nádorových buněk, jejichž čistota je zvláště důležitá. Tímto přístupem je možno získávat lépe očištěnou populaci cílových buněk od pacientů a zvířecích hostitelů, než jakýmkoli jiným známým postupem, dávajícím jedinečné možnosti pro klonování genů s lokálně specifickým vyjádřením. Další přednost vynálezu zahrnuje používání známých postupů genového klonování, jako např. používání diferenciálního displejového postupu, poprvé popsaného A. Liangem a A.B. Pardeem (ve Science, vol.257, s.967-971, 1992). Při tomto postupu se provádějí polymerázové řetězové reakce s enzymy a primery (startéry), které dávají opačnou transkripci a nahodilé zvětšování genových transkriptů vyskytujících se v cílových buňkách. Výsledné cDNA fragmenty z buňkových populací určených k porovnání se pak vyšetřují na sekvenčním gelu a extrahovaných lokálně-specifických fragmentech. Zajímavé genové fragmenty se pak dají vyšetřovat dále, včetně vyšetření jejich schémat vyjadřování v materiálu podobném tomu, jehož se používá při klonování. A opět je velmi důležité to, že máme přístup k očištěným populacím nádorových buněk bez rušení irelevantních necílových buněk u výsledků. Možnost použití lidských nádorových buněk izolovaných z modelu metastázy u zvířat s nedostatkem imunity je výhodné též proto, že modely poskytují spolehlivý a trvalý zdroj cílových * »· · • · · · ·« ·»

-9·· • » · ·· ··· · ··· · 4 • » · « důležité/ nádorových buněk pro rozšířené vyšetřování. Je též aby cílové buňky, buď od pacientů nebo od zvířecích modelů, byly izolovány a upravily se pro vyšetřování DNA a RNA přímo a značně rychle, aby nedocházelo k nežádoucím změnám v genovém vyjadřování nesouvisejícím s cílem identifikovat geny s lokálně specifickým vyjádřením. Různé metody, používané na klonování nových genů, mají své inherentní omezení. Diferenciální zobrazovací metody na podkladě postupů reakce polymerázového řetězce mohou trpět problémy, týkajícími se reprezentativnosti a reprodukovatelnosti. S naším přístupem jsme tudíž zahrnuli kroky zaměřené na co nejmenší výskyt takových problémů. Toho se dosáhlo hlavně použitím postupu imunokuličkové selekce, která umožňuje vyšetřovat specificky biologicky reprezentativní buňky, nejen pro první diferenciální zobrazovací krok, nýbrž též v krocích, kde v úvahu přicházející geny se vyšetřují na úroveň vyjádření v relevantních buňkách a tkanivech.

Příklad 1:

Nádorové buňky z primárního nádoru a pomocných mízních uzlin od pacienta s rakovinou prsu se připravily fyzikálními a enzymatickými postupy na získání jednobuněčné suspenze. Vzorek kostní dřeně (50 ml) byl nasáván a získal se vzorek periferijní krve žilovou punkcí a mononukleární buňky z obou případů byly izolovány na zařízení Lymphoprep (od Nycomed Pharma v Oslu). Buněčné suspenze byly samostatně inkubovány s monoklonálními protilátkami MOC-31 a BM7 rozpoznávajícími pan-epiteliový antigen a genový produkt MUC-1. Po omytí a inkubaci byly přidány Dynabeads (kuličky) M-450 SAM SD (od Dynal, Oslo,

Norsko), které vážou na Fc-oblast primárních protilátek.

Tumorové buňky s vázaným komplexem protilátkových Dynabeads M450 STÝM SD se daly potom izolovat od normálních mononukleárních buněk použitím silného magnetu. Povaha oddělených buněk byla potvrzena mikroskopicky. Z různých populací buněk byla • 0 0 • · • · * • · • 0

- 1000

0 « «0

000

0

0· 0 0 • 00 0 0 0

00 extrahována RNA a materiál se vystavil účinku postupu diferenciálního displejového klonování (Liang a Pardee, 1992), při němž částečné cDNA sledy ze subpopulací mRNA získaných reverzní transkripcí byly zesilovány reakcí s polymerázovým řetězcem. Fragmenty cDNA z různých populací nádorových buněk byly porovnávány na sekvenční gel a fragmenty specificky vyjádřené v buňkách získaných z jednoho z těchto míst byly extrahovány a zařazeny do pořadí. Mezi určitým, počtem zajímavých genových sledů se specifickým vyjádřením buďto v izolovaných nádorových buňkách, s technologií magnetickou imunokuličkovou technologií, od kostní dřeně nebo v nádorových buňkách imunomagneticky izolované od metastází mízních uzlin jsme nalezli transkripční faktor, týkající se jednoho buněčného cyklu, jeden ontogenní produkt vedle genů ještě neidentifikovaných. Právě se analyzuje vyjádření těchto dvou identifikovaných genových sledů v biologicky relevantních modelových systémech a klinickém materiálu.

Příklad 2:

V tomto příkladu bylo použito buněk z modelu pro experimentální metastázy rakoviny lidského prsu. U athymických obnažených krys má injekce buněk MA-11 rakoviny lidského prsu do cisterna magna (CM) za výsledek leptomeningeální šíření a růst maligních buněk. A dále, MA-11 buňky vstřiknuté do levé srdeční komory (LV) vytvářejí metastázy v míše, což má za následek vývoj paralýzy zadní nohy u zvířat zhruba po 35 dnech. Nádorové buňky z obou lokací se získaly rozemletím hostitelské tkáně a přípravou jednobuněčných suspenzí a imunokuličková technika popsaná pod příkladem 1 byla použita na pozitivní selekci maligních buněk. Potom se provedla RNA extrakce buněk z těch dvou míst spolu s MA-11 buňkami pěstovanými in vitro a materiál byl vystaven podobně diferenciálnímu displejovému klonovacímu postupu, jak bylo již popsáno. Dodatkem k tomu byla zařazena

- 11 44 • · 4 • · • · · • · · «4

4« · ·

4 4

4

4 • 4 • 44

4 4

4

444 4

4 44 •

jako kontrola mRNA extrahovaná z relevantních normálních tkání v krysách. Je nutno poznamenat, že se pořídila linie buněk ΜΆ11 z izolátů mikrometastatických nádorových buněk imunomagnetickou metodou z kostní dřeni pacienta s rakovinou prsu stupeň II. Bylo zjištěno několik v úvahu přicházejících fragmentů specifických pro růst buněk v leptomeninges nebo jako netastázy na míchu. Sekvenční analýza ukázala, že tyto fragmenty představují nové i známé geny. Mezi fragmenty potvrzenými jako diferenciálně vyjádřené v MA-11 buňkách zvolených z metastatické buňky byly dosud podrobněji vyšetřeny čtyři v úvahu přicházející geny. Dva z nich, označené LVI a LV12 jsou zvláště zajímavé. LVI ukazuje značně vysokou selektivitu vyjádření v nádorových buňkách z míšních metastáz, kdežto LV12 je vyregulována dolů u leptomeningeálně rostoucích buněk. Shledává se, že LVI je regulována nahoru v určitém počtu buňkových linií, o nichž je známo, že mají vysokou kapacitu vytvářet experimentální metastázy u zvířat s deficiencí imunity. V panelu primárních nádorů od pacientů s rakovinou prsu bylo nízké vyjádření LV12 uvedeno ve vztah ke krátkému přežívání příslušných pacientů. Celkem ukazují výsledky, že LVI mRNA se zdá být regulovanou nahoru u vysoce metastatických buněk a že úroveň LV12 mRNA je v inverzním vztahu k postupu a metastázi buněk prsní rakoviny. Oba geny jsou nové. Kromě toho je třetí slibný, v úvahu přicházející gen CM13, též novým genem vyregulovaným nahoru v nádorových buňkách rostoucích v leptomeninges. Několik jiných v úvahu přicházejících musí být ještě dále analyzováno. Pro LVI i LV12 bylo již zahájeno klonování cDNA v plné délce.

·· ·· • · · · • · ·· ··· · · • · ·

Příklad 3:

V podobném modelu k tomu, který je popsán v příkladu 2, vyvolávají buňky MT1 lidské rakoviny prsu růst v leptomeninges po vstřiknutí CM, kdežto LV vstřiknuté buňky metastázují do kostní dřeně a kosti v obratlích páteře a v dlouhých kostech. Buňky z těchto dvou lokací, jakož i in vitro pěstované buňky byly izolovány a extrahovala se RNA z různých populací buněk. Na tento materiál je možno aplikovat podobné klonovací postupy jako jsou ty, popsané v příkladu 2.

Příklad 4:

Nádorové buňky izolované postupem popsaným v příkladu 1 byly izolovány od jiných pacientů s rakovinou prsu, od pacientů s kolorektální rakovinou, kdy nádorové buňky byly izolovány z primárních a recidivujících nádorů, z mízních uzlin a jaterní metastázy, a vzorku krve a kostní dřeně, a z rakoviny prostaty u pacientů s buňkami vybranými ze vzorků primárního nebo recidivujícího nádoru, z mízních uzlin dodatkem ke vzorkům z krve a kostní dřeně. Izolované buňky se dají použít na účel genového klonování.

Dodatkem k používání materiálu popsaného v příkladech 1-4 na klonování genů se dá použít na vyšetřování vzorku vyjádření všech genových sledů s dostatečnou nadějí.

Claims

1. Způsob imunomagnetického oddělování buněk, zejména při identifikaci genů s lokálně specifickým nebo lokálně preferovaným vyjádřením ve specifických cílových buňkách vyskytujících se v buňkovém prostředí odlišném nebo nikoli od prostředí jejich původu, vyznačující se tím, že cílové buňky jsou zprvu zjišťovány a izolovány opakovanými imuno-magnetickými postupy na získání až 100 % specifických cílových buněk před vystavením uvedených cílových buněk známým postupům klonování buněk, přičemž se porovnávají neznámé geny s rozdíly v hladinách vyjádření mRNA v cílových buňkách izolovaných z různých tkání.

2. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že použité cílové buňky jsou maligní buňky získané z pevných primárních nebo recidivujících nádorů, a/nebo z metastáz z takových nádorů do mízních uzlin, a/nebo krve, a/nebo kostní dřeně, a/nebo kostní tkáně, a/nebo jater, a/nebo plic, a/nebo centrální nervové soustavy, a/nebo maligních pleurálních efuzí a břišní vodnatelnosti, moči, a/nebo mozkomíšního moku, a/nebo jiných míst orgánů.

3. Způsob podle nároku 1-2, vyznačující se tím, že maligní buňky jsou izolované z jednobuněčných suspenzí připravených z projevů pevného nádoru, a/nebo z frakcí mononukleárních buněk, získaných ze vzorků kostní dřeně nebo krve, a/nebo buněk vyskytujících se v jiných tělesných tekutinách.

- 14·· ·· ·· ·· ·· ·· • · · · « · · · fc··· ···· ♦ · 4 · ···· • · · · · · · ··· · ··· · · • · · · ·· · ···

4. Způsob podle nároků 1-2, vyznačující se tím, že použité maligní buňky jsou in vitro kultivované lidské nádorové buňky, a/nebo lidské nádorové buňky vyrostlé ve specifických tkáních zvířat s deficiencí imunity, a/nebo experimentální lidské nádorové metastázy v takových zvířatech.

5. Způsob podle nároků 1-4, vyznačující se tím, že RNA a/nebo DNA jsou extrahovány z izolovaných buněk.

6. Způsob podle nároku 5, vyznačující se tím, že extrahované nukleové kyseliny se používá na účely klonování genů.

7. Způsob podle výše uvedených nároků, vyznačující se tím, že řečený způsob genového klonování je postup diferenciálního displeje nebo subtraktivní hybridizace nebo jakéhokoli jiného postupu, jehož se dá použít na identifikaci genů s odlišným vyjádřením.

8. Způsob podle nároku 7, vyznačující se tím, že se zesílené cDNA získané z maligních buněk vybraných různých míst vyšetřují a porovnávají na sekvenční gely a kde tyto se zajímavými lokálně specifickými nebo lokálně preferovanými vzory jsou sekvenčně zařazeny a identifikovány.

- 15

9. Způsob podle nároku 8, vyznačující se tím, že se vyšetřují vzory vyjádření identifikovaných genových sekvencí, a to na materiálu získaném ze všech relevantních míst nádorových buněk, popsaných v nárocích 1-4.

10. Způsob podle předcházejících nároků, vyznačující se tím, že dříve neznámé geny identifikované v předcházejících nárocích jsou použity pro účely genové terapie, a/nebo jako cíle pro postupy zaměřené na měnění nebo inaktivaci genů nebo jejich produktů.

11. Používání způsobu podle nároku 1 na získání specifických genových sledů a jejich produktů vyjádření v cílových buňkách, vyskytujících se v buněčných prostředích odlišných či nikoli od jejich původu.