CZ286529B6 - Produkční kmen mikroorganismu Aspergillus niger - Google Patents

Produkční kmen mikroorganismu Aspergillus niger Download PDF

Info

Publication number
CZ286529B6
CZ286529B6 CZ19982507A CZ250798A CZ286529B6 CZ 286529 B6 CZ286529 B6 CZ 286529B6 CZ 19982507 A CZ19982507 A CZ 19982507A CZ 250798 A CZ250798 A CZ 250798A CZ 286529 B6 CZ286529 B6 CZ 286529B6
Authority
CZ
Czechia
Prior art keywords
strain
fermentation
citric acid
aspergillus niger
molasses
Prior art date
Application number
CZ19982507A
Other languages
English (en)
Other versions
CZ250798A3 (cs
Inventor
Jiří Ing. Pendl
František Ing. Hotěk
Václav Ing. Černý
Ludmila Ing. Růžičková
Rudolf Ing. Rečka
Original Assignee
Jiří Ing. Pendl
František Ing. Hotěk
Václav Ing. Černý
Ludmila Ing. Růžičková
Rudolf Ing. Rečka
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Jiří Ing. Pendl, František Ing. Hotěk, Václav Ing. Černý, Ludmila Ing. Růžičková, Rudolf Ing. Rečka filed Critical Jiří Ing. Pendl
Priority to CZ19982507A priority Critical patent/CZ250798A3/cs
Publication of CZ286529B6 publication Critical patent/CZ286529B6/cs
Publication of CZ250798A3 publication Critical patent/CZ250798A3/cs

Links

Landscapes

  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

Byl vyšlechtěn nový produkční kmen Aspergillus niger, který se morfologicky odlišuje od parentálního změnou barvy sporulace z černé na světle hnědou, za stejných podmínek dosahuje vyšší procento konverze jednoduchých cukrů na kyselinu citronovou a je méně citlivý na kolísání složení substrátu. Kmen je použitelný nejen pro submerzní zkvašování definovaných substrátů, ale též pro zkvašování melasových substrátů povrchovým způsobem. S kmenem bylo dosaženo výtěžnosti 95,2 % kyseliny citronové monohydrátu při submerzní fermentaci sacharózy a 82,1 % při povrchovém zkvašování melasového cukru.ŕ

Description

Oblast techniky
Vynález se týká vysokoprodukčního kmene Aspergillus niger, určeného zvláště pro výrobu kyseliny citrónové na substrátech, obsahujících jednoduché cukry.
Dosavadní stav techniky
Kyselina citrónová (KC) se vyrábí průmyslovou fermentací jednoduchých cukrů od 20. let tohoto století. Zpočátku se jednalo o povrchovou fermentaci, zejména melasových substrátů. Tento způsob je využíván dodnes, hlavně u malých producentů, zásobujících lokální trhy. V porovnání se submerzní fermentací se povrchová fermentace vyznačuje komparativními výhodami, zejména nižší cenou suroviny, nižšími nároky na elektrickou energii a relativně dobrou stabilitou a odolností procesu vůči kontaminantům, výpadkům energií a podobně. První průmyslová aplikace submerzní fermentace byla zavedena v 50. letech firmou MILES LABORATORIES v USA. V současné době je submerzní fermantací vyráběna většina světové produkce kyseliny citrónové. Na rozdíl od povrchové fermentace pracuje submerzní způsob většinou s definovanými substráty, založenými na dekationizovaných roztocích mono a disacharidů. Cesta zkvašování N - alkanů na KC pomocí kvasinek se ukázala zejména pro potravinářské a farmaceutické účely jako slepá (AO 196 003).
Co se týká kmenové základny, pracují všichni výrobci i výzkumná pracoviště s mutanty Aspergillus niger, přičemž hlavně vzhledem k použité technologii a surovině docházelo k diferenciaci původních kmenů s důrazem na specifické požadavky různých producentů. Jedná se např. zejména o způsob fermentace - povrchový nebo submerzní, použité fermentory - míchané mechanicky nebo vzduchem, suroviny - melasa, dextróza, škrob. V současné době se prosazuje použití vzduchem míchaných velkoobjemových věžových fermentorů vzhledem k nízké investiční náročnosti. Jednou z nutných podmínek úspěšného využití tohoto typu fermentoru je nízká viskozita fermentovaného substrátu. Tuto podmínku není možné splnit v případě, že mycelium mikroorganismu roste ve vláknité difuzní formě, která ovšem na druhé straně vzhledem k velkému povrchu je výhodná pro přenos živin a metabolitů. Jedním z kmenů, který během správně vedené fermentace netvoří difuzní mycel, ale vykazuje peletámí morfologii, je kmen CCM 8225 (Patent 284 205). Za pomoci tohoto kmene lze v optimálních provozních podmínkách dosáhnout výtěžnosti vyšší než 85 % při době kvasného cyklu 168 - 175 hodin. Nevýhodou tohoto kmene je jeho vysoká citlivost na kolísání složení substrátu, např. poměr K : Na iontů, nebo obsah stopových prvků Fe, Mg, Zn, Cu.
Obvykle se uvádí, že pro ekonomicky úspěšnou povrchovou a submerzní fermentaci kyseliny citrónové nelze použít stejný mutant Aspergillus niger (AO 201 807, AO 217 939).
Tato skutečnost velmi často platí pro použití kmene, vhodného v povrchové technologii, pro technologii submerzní. Na druhé straně je pravděpodobné, že výše uvedené tvrzení mohlo být ovlivněno úzkou specializací jednotlivých vývojových pracovišť. Tato pracoviště obvykle nemají zvládnuty submerzní, resp. povrchovou technologii na stejné úrovni, zejména v průmyslovém rozsahu.
Příprava nových mutantů se vesměs provádí mutačně - selekčním programem, kdy se jako mutagen používá např. krátkovlnné světelné záření, γ-záření nebo chemické mutageny. Po mutagenezi následuje zdlouhavý a pracný screening jednotlivých izolátů s cílem najít mutant, který předčí ve svých užitných vlastnostech (jako je výtěžnost produktu, produktivita, genetická
-1 CZ 286529 B6 stabilita, tvorba vedlejších metabolitů) parentální, vesměs průmyslově používaný kmen. Je zajímavé, že vysokoprodukční mutanty se od přírodních kmenů Aspergillus niger odlišují nejen svými produkčními vlastnostmi, ale často též barvou sporulace. Lze tedy vyslovit domněnku, že genetický zásah do schopnosti tvořit pigment může souviset se změnami metabolismu mutantu v požadovaných vlastnostech.
Podstata vynálezu
Výše uvedené technicko - ekonomické nedostatky, tzn. vysokou citlivost produkčního kmene na změny ve složení substrátu a nemožnost použití stejného kmene pro povrchovou i submerzní fermentací odstraňuje použití nově vyšlechtěného kmene (mutantu), značeného HCR 1, uloženého v České sbírce mikroorganismů pod označením CCM 8241, podle vynálezu. Tento kmen byl získán zvýše uvedeného kmene CCM 8225 tak, že na suspenzi spor parentálního kmene ve sterilním fyziologickém roztoku o koncentraci přibližně 106 spor/1 ml bylo působeno ultrafialovým zářením 30 W germicidní lampy ze vzdálenosti 10 cm po dobu 10 minut při teplotě 25 °C. Za těchto podmínek bylo procento životaschopných spor asi 10'3 %. Suspenze spor byla rozlita na Sabouraud - maltose agar v Petriho miskách o výšce substrátu 2-3 mm. Po kultivaci při 32 °C byly získány monosporické kultury. Tyto byly přeneseny na šikmé agary. Spory byly dále pomnoženy na sladino - peptonovém agaru. První screening nově připravených mutantů byl proveden na melasovém substrátu, čiřeném ferokyanidem draselným, povrchovou fermentací při výšce substrátu 2 cm. Izoláty, vykazující nej vyšší aktivitu, byly dále testovány na třepáčkových pokusech s dekationizovaným cukerným substrátem a posléze v laboratorních bublaných fermentorech o objemu substrátu 10 1. Paralelně byly izoláty testovány na melasovém substrátu povrchovým způsobem zkvašování při výšce vrstvy 12 cm. Výše uvedeným způsobem testování bylo shledáno, že při všech způsobech testací byl nejaktivnější jeden izolát, který byl dále pomnožen na velkoplošném produkčním zařízení pro výrobu spor. Nový mutant byl pojmenován HCR 1 a uložen v České sbírce mikroorganismů pod označením CCM 8241.
Produkční mikroorganismus CCM 8241 lze pomnožovat na Babouraud - maltose agaru, na sladino - peptonovém agaru, nebo na Czapek Dox agaru. Pro pomnožení před zaočkováním produkčního média lze použít půdu, jejíž hlavní komponentou jsou kukuřičné otruby či vláknina. Na uvedených agarových půdách tvoří kmen při inkubační teplotě 35 °C během 28 - 32 hodin kulaté bílé až bílo - béžové kolonie o průměru cca 3-5 mm. Spodní strana je zvrásněná, zejména na okrajích. Kolonie tvoří světle hnědou sporulaci. K úplnému vysporulování dojde po 48 hodinách. Konidie jsou hladké kulovité útvary o velikosti 5-7 pm. Konidiofory jsou vysoké cca 1 mm, konidiální hlavice o průměru cca 0,1 mm jsou sférické s primárními a sekundárními sterigmaty.
Hlavní výhodou nového mutantu je mimořádně vysoká konverze jednoduchých sacharidů na kyselinu citrónovou, vysoká stabilita procesu a nízká citlivost na změny ve složení substrátu. Např. úspěšnou fermentací neruší koncentrace železa 1,5 mg/1 substrátu. Neméně důležitá je v porovnání s parentálním kmenem zvýšená rychlost přeměny cukru na kyselinu citrónovou, vyjádřená zkrácením kvasného cyklu o cca 20 % oproti mutantu CCM 8225. Tento kmen si zachoval schopnost zkvašovat vysoce koncentrované cukerné roztoky, nehodí se však pro zkvašování oligo a polysacharidů. Na rozdíl od parentálního kmene je nově vyvinutý kmen HCR i výkonným producentem kyseliny citrónové na melasových substrátech při povrchové fermentací. Vedle kyseliny citrónové však tento kmen má tendenci v počáteční fázi povrchové fermentace tvořit kyselinu šťavelovou v množství 10-30 g/1.
-2CZ 286529 B6
Příklady provedení vynálezu
Příklad 1
Submerzní fermentační pokusy byly prováděny v laboratorních skleněných bublaných fermentorech na dekationizovaném roztoku sacharózy. Teplota fermentace byla 34 °C, délka kvasného cyklu 7 dní, objem substrátu byl 101, vzdušnění 5 wm. Koncentrace spor byla 108 zárodků/1 ml. Během fermentace bylo upravováno pH přídavkem čpavkové vody. K odpěňování byl použit polypropylenglykol.
Základní dávky živin a stopových prvků na 1 litr substrátu byly následující:
Sacharóza (NH4)2SO4 MgSO4.7 H2O
CaCl2.2 H2Ó
KCL
KH2PO4
CuSO4. 5 H2O ZnSO4.7 H2O
230 g
2,0 g
1,0 g
0,5 g
0,3 g
0,09 g
0,025 g
0,0015 g
Do části pokusů byl přidán síran železnatý tak, aby výsledná koncentrace železa byla 1,5 mg/1. Fermentory byly zaočkovány suspenzí spor ve fyziologickém roztoku parentálního kmene (70) a kmene HCR1. Po ukončení fermentace byla stanovena výtěžnost kyseliny citrónové monohydrátu na vnesený cukr.
Kmen bez přídavku Fe
HCR 1 výtěžek 95,2 % výtěžek 86,3 % přídavek Fe 1,5 mg/1 výtěžek 86,3 % výtěžek 0
Příklad 2
Povrchové fermentační pokusy byly prováděny ve skleněných jednolitrových kádinkách s výškou melasového substrátu 12 cm. Substrát byl čiřen ferokyanidem draselným v dávce 750 mg/1 za varu. Očkovací pH bylo upraveno na 6,2 kyselinou sírovou. Koncentrace cukru v substrátu byla 150 g/1, fosfát byl doplněn na koncentraci 90 mg/1 dihydrogenfosforečnanem draselným, před očkováním byl přidán síran zinečnatý tak, aby dávka zinku byla 1 mg/1. Pokusy byly očkovány suspenzí spor produkčního kmene vkarborafmu v množství cca 107 zárodků/dm2. Po 8 dnech fermentace byla hodnocena výtěžnost kyseliny citrónové monohydrátu na vnesený cukr. Byl porovnáván starší průmyslový kmen, značený FL 310 (CCM 8141), a nově vyvinutý kmen HCR 1 (CCM 8241). Výtěžek kyseliny citrónové monohydrátu s kmenem HCR 1 byl 82,1 % ve srovnání s 80,9 % u kmene FL 310.
Průmyslová využitelnost
Kmen CCM 8241 je využitelný pro výrobu kyseliny citrónové z jednoduchých cukrů.

Claims (1)

  1. PATENTOVÉ NÁROKY
    1. Průmyslový kmen houby Aspergillus niger CCM 8241.
    Konec dokumentu
CZ19982507A 1998-08-10 1998-08-10 Produkční kmen mikroorganismu Aspergillus niger CZ250798A3 (cs)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CZ19982507A CZ250798A3 (cs) 1998-08-10 1998-08-10 Produkční kmen mikroorganismu Aspergillus niger

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CZ19982507A CZ250798A3 (cs) 1998-08-10 1998-08-10 Produkční kmen mikroorganismu Aspergillus niger

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CZ286529B6 true CZ286529B6 (cs) 2000-05-17
CZ250798A3 CZ250798A3 (cs) 2000-05-17

Family

ID=5465084

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CZ19982507A CZ250798A3 (cs) 1998-08-10 1998-08-10 Produkční kmen mikroorganismu Aspergillus niger

Country Status (1)

Country Link
CZ (1) CZ250798A3 (cs)

Also Published As

Publication number Publication date
CZ250798A3 (cs) 2000-05-17

Similar Documents

Publication Publication Date Title
AU2020103076A4 (en) Method of preparing Lepista sordida culture spawn with mushroom residue
Gold et al. Conditions for fruit body formation in the white rot basidiomycete Phanerochaete chrysosporium
KR900007936B1 (ko) 오레오베이시디움속의 신규 미생물 및 그 취득방법과 이 균주를 사용한 에리쓰리톨의 제조방법
AU2020102268A4 (en) Edible fungus culture medium based on disposable bamboo chopsticks and preparation method and application thereof
IL22367A (en) Production of amyloglucosidase
Sarangbin et al. Yam bean starch: a novel substrate for citric acid production by the protease-negative mutant strain of Aspergillus niger
SK280654B6 (sk) Kmeň mikroorganizmu penicillium oxalicum var. arme
CN101717727A (zh) 嗜热毁丝霉菌株及其在产角蛋白酶方面的应用
CZ286529B6 (cs) Produkční kmen mikroorganismu Aspergillus niger
Olutiola et al. Utilization of Carbohydrates by Rhynchosporium secalis. I. Growth and Sporulation on Glucose, Galactose, and Galacturonic acid
Alhadithy et al. Product concentration, yield percentage and productivity of citric acid formation using Aspergillus niger isolated from palm dates
US3012944A (en) Enzyme preparation
CN114426991B (zh) 一种优化的工程菌酿酒酵母w2发酵体系及其应用
Elliott et al. A developmental variant of Agaricus bisporus
US5079145A (en) Process for preparing microorganisms used for making phenyl acetyl carlinol (pac)
US4380583A (en) Method of preparing seeding material for production of citric acid
CN116354520B (zh) 丛毛红曲菌在处理超高浓度白酒废水中的应用
EP0146378A2 (en) Fermentation process for the preparation of aconitic acid
CN85100412B (zh) 用嗜热放线菌生产固定化葡萄糖异构酶的方法及其用于高果糖糖浆的生产方法
Oh Improvement of Aspergillus niger 55, a raw corn meal saccharifying enzyme hyperproducer, through mutation and selective screening techniques
CN111317058A (zh) 一种有机铜饲料添加剂的制备方法
US2938835A (en) Production of mutants of the genus penicillium
CZ400297A3 (cs) Produkční kmen mikroorganismu Aspergillus niger
Quratulain et al. Development and characterization of butanol—Resistant strain of Clostridium acetobutylicum in molasses medium
Pridham et al. Studies on variation and mutation in Ashbya gossypii

Legal Events

Date Code Title Description
IF00 In force as of 2000-06-30 in czech republic
MM4A Patent lapsed due to non-payment of fee

Effective date: 20040810