CZ277698A3

CZ277698A3 - Komplexy železa makrocyklických ligandů obsahujících dusík, působící jako katalyzátory pro dismutaci superoxidu

Info

Publication number: CZ277698A3
Application number: CZ982776A
Authority: CZ
Inventors: Dennis P. Riley
Original assignee: Monsanto Company
Priority date: 1996-03-13
Filing date: 1997-03-11
Publication date: 1999-02-17
Also published as: BR9707978A; NO984165L; CA2248964A1; JP2000507929A; IL125993A0; KR19990087783A; NO984165D0; EP0888115A1; AU2065697A; WO1997033588A1

Description

Oblast techniky

Vynález se týká sloučenin účinných jako katalyzátory pro dismutaci superoxidu a týká se zejména železnatých a železitých komoplexů patnáctičlenných makrocyklických ligandů obsahujících dusík, které katalyticky dismutují superoxid. Přihláška 08/397,469 je zde proto zahrnuta v odkazu ve své úplnosti.

Enzym superoxid dismutáza katalyzuje přeměnu superoxidu na kyslík a peroxid vodíku podle rovnice (1) (zde uváděna pod pojmem dismutace).

O2 ' ~ + O2 ^{_ +} 2H⁺ —» O2 + H2O2

U reaktivních kyslíkových metabolitů odvozených od superoxidu se předpokládá jejich podíl na patologickém procesu tkáně u řady zánětlivých onemocnění a poruch, jako například reperfuzního poranění ischemického myokardu, zánětlivého onemocnění střev, revmatoidní arthritidy, osteoarthritidy, atherosklerózy, hypertenze, metastáz, psoirázy, rejekce transplantovaných orgánů, poškození vyvolaného radioaktivním zářením, astmatu, chřiky, mozkové příhody, popálenin a traumatu. Viz například Bulkley, G. B., Reactive oxygen metabolites and reperfusion injury: aberrant triggering of reticuloendothelial function, The Lancet, Vol. 344, strana 934-936, 1. října, 1994; Grisham, Μ. B., Oxidants and free radicals in inflamatory bowel disease, The Lancet, Vol 344, strana 859-861, 24. října, 1994; Cross, C. E. a kol., Reactive oxygen species and the lung, The Lancet, Vol. 344, strana 930-933, 1. října, 1944; Jenner P., Oxidative damage in neurodegenerative disease, The Lancet , Vol. 344, strana 796-798, 17. září, 1944; Cerutti, P. A., Oxy-radicals and cancer, The Lancet, Vol. 344, strana 862-863, 24. září 1994; Simic, M. G., a kol., Oxygen Rradicals in Biology and Medicine, Basic Life Science, Vol. 49, Plenům Press, New York a Londýn, 1988; Weiss J. Cell. Biochem., 1991 Suppl. 15C, 216 Abstrakt C110 (1991); Petkau, A., Cancer Treat. Rev. 13, 17 (1986); McCord, J. Free Radicals Biol. Med.J^ 307 (1986); a Bannister, J. V. a kol.,

• · <

‘1 • · • ·

Crit. Rev. Biochem., 22, 111, (1987). Odkazy z The Lancet odkazy, uvedené výše, pojednávají o souvislosti mezi volnými radikály odvoženými od superoxidu a různými onemocněními. Přesněji, Bulkleyovy a Grishamovy odkazy přímo pojednávají o spojitosti mezi dismutaci superoxidu a konečnou léčbou onemocnění.

Je též známo, že superoxid hraje roli při poruše vascular relaxing” faktoru pocházejícího z endotelinu (EDRF), který byl identifikován jako oxid dusnatý (NO), a že EDRF je chráněn před porušením superoxid dismutázou. Tento fakt předpokládá hlavní úlohu aktivovaných kyslíkových částic odvozených od superoxidu v patogeneze vazospazmu, trombózy a atherosklerózy. Viz například Gryglewski, R. J. a kol., Superoxide Anion is Involved in the Breakdown of Endothelium-derived Vascular Relaxing Factor”, Nátuře, Vol. 320, strana 454-456 (1986) a Palmer, R. M. J. a kol.,

Nitric Oxide Release Accounts fot the Biological Activity of Endothelium Derived Relaxing Factor”, Nátuře, Vol. 327, strana 523-526 (1987).

Klinické úspěchy a studie na zvířatech s přirozenými, rekombinantními a modifikovanými enzymy superoxid dismutázy, které byly provedeny nebo probíhají, dokazují terapeutický účinek snížení hladiny superoxidu u chorobných stavů uvedených výše. Vznikla však spousta problémů s použitím enzymů jako potenciálních terapeutických látek, zahrnujících nedostatek aktivity pro orální aplikaci, krátký poločas in vivo, imunogenicitu enzymů, které nejsou odvozeny od lidských, a špatnou distribuci v tkáních.

Komplexy železa patnáctičlenných makrocyklických ligandů obsahujících dusík, které mají nízkou molekulovou hmotnost, napodobují funkci superoxid dismutázy (SOD) a jsou využitelné jako terapeutické látky. Tím se odstraní řada problémům spojených s enzymy SOD.

Podstata vynálezu

Předmětem vynálezu jsou komplexy*železa patnáctičlenných makrocyklických ligandů obsahujících dusík, které mají nízkou molekulární hmotnost, napodobují funkci superoxid dismutázy (SOD), a jsou využitelné jako terapeutické látky při stavech zánětlivého onemocnění nebo poruchách, které jsou vyvolány, alespoň částečně, superoxidem. Dalším předmětem vynálezu jsou komplexy železa patnáctičlenných makrocyklických ligandů, které mají nečekaně vyšší stabilitu ve srovnání s odpovídajícími komplexy manganu.

Farmaceutická kompozice podle vynálezu v jednotkové dávce, využitelná pro dismutaci superoxidu, zahrnuje (a) terapeuticky nebo profylakticky účinné množství komplexu železa podle vynálezu a (b) netoxický, farmaceuticky účinný nosič, adjuvants nebo pojidlo.

Dále podle vynálezu způsob prevence nebo léčby onemocnění nebo poruchy, která je léčena přinejmenším částečně, superoxidem a tento způsob zahrnuje podání terapeuticky nebo profylakticky účinného množství komplexu železa podle vynálezu pacientovi.

Vynález je zaměřen na komplexy železa patnáctičlenných makrocyklických ligandů obsahujících dusík, které katalyzují přeměnu superoxidu na kyslík a peroxid vodíku. Tyto komplexy jsou charaktetrizovány vzorcem:

kde R, R’, R-ι, R/, R2. R2, R31 R3> R4> R41 R51 Rs> R61 R6> R₇, R₇, Re> Re> R9 a R9 jsou nezávisle vybrány ze skupiny zahrnující vodík, alkyl, alkenyl, alkynyl, cykloalkyl, cykloalkenyl, cykloalkylalkyl, cykloalkylcykloalkyl, cykloalkenylalkyl, alkylcykloalkyl, alkenylcykloalkyl, alkylcykloalkenyl, alkenylcykloalkenyl, heterocyklické, arylové a aralkylové radikály a radikály připojené k α-uhlíku a-aminokyseliny; nebo Rí nebo Rí a R₂ nebo R₂, R3 nebo R₃ a R4 nebo R4 , R5 nebo R₅ a R₆ nebo R₆, Ř7 nebo R₇ a R₈ nebo R₈ a Rg nebo Rg a R nebo R spolu s uhlíkovým atomem, ke kterému jsou připojeny, tvoří nezávisle nasycený, částečně nasycený nebo nenasycený kruh se 3 až 20 uhlíkovými atomy; nebo R nebo R a Rí nebo R/ a R₂ nebo R₂, R₃ nebo R₃ a R4 nebo R4 , R₅ nebo R₅ a R₆ nebo R₆, R₇ nebo R₇ a R₈ nebo R₈ a Rg nebo Rg , spolu s uhlíkovými atomy, ke kterým jsou připojeny, tvoří nezávisle heterocyklus se 2 až 20 uhlíkovými atomy, obsahující dusík, s výhradou, • · • 4» ·

že pokud heterocyklus obsahující dusík je aromatický heterocyklus, který neobsahuje vodík, připojený k dusíku, jak je ukázáno u výše uvedeného vzorce, jehož dusík je též v makrocyklickém ligandů nebo komplexu a skupiny R připojené ke stejnému uhlíkovému atomu makrocyklu nejsou přítomny.

X, Y a Z představují vhodné ligandy nebo náboj neutralizující anionty, které jsou odvozeny od jakéhokoli monodentálního nebo polydentálního koordinačního ligandů nebo ligandového systému nebo jeho odpovídajícího aniontu (například od kyseliny benzoové a benzoátového aniontu, fenolového nebo fenoxidového aniontu, alkoholu nebo alkoxidového aniontu). X, Y a Z jsou nezávisle vybrány ze skupiny obsahující halogenid, skupiny oxo, aquo, hydroxo, alkohol, fenol, molekulární kyslík, peroxo, hydroperoxo, alkylperoxo, arylperoxo, amoniak, alkylamino, arylamino, heterocykloalkylamino, heterocykloarylamino, aminoxid, hydrazin, alkylhydrazin, arylhydrazin, oxid dusičný, kyanid, kyanát, thiokyanát, izokyanát, izothiokyanát, alkylnitril, arylnitril, alkylizonitril, arylizonitril, dusičnan, dusitan, azido^ aikylsulfonovou kyselinu, arylsulfonovou kyselinu, alkylsulfoxid, arylsulfoxid, alkylarylsulfoxid, alkylsulfenovou kyselinu, arylsulfenovou kyselinu, alkylsulfinovou kyselinu, arylsulfinovou kyselinu, alkylthiolkarboxylovou kyselinu, arylthiolkarboxyiovou kyselinu, alkylthiolthiokarboxylovou kyselinu, arylthiolthiokarboxylovou kyselinu, alkylkarboxylovou kyselinu (jako například'kyselinu octovou, kyselinu trifluoroctovou, kyselinu oxalovou), arylkarboxylovou kyselinu (jako například kyselinu benzoovou, kyselinu ftalovou), močovinu, alkylmočovinu, arylmočovinu, alkylarylmočovinu, thiomočovinu, arylthiomočovinu, alkylarylthiomočovinu, síran, siřičitan, hydrogensíran, hydrogensiřičitan, thiosíran, thiosiřičitan, hydrogensiřičitan, alkylfosfan, arylfosfan, alkylkfosfinoxid, arylfosfinoxid, aikylarylfosfinoxid, alkylfosfinsulfid, arylfosfinsulfid, alkylarylfosfinsulfid, alkylfosforitou kyselinu, arylfosforitou kyselinu, alkylfosfinovou, kyselinu, aryl fosfinovou kyselinu, alkylfosfinitou kyselinu, arylfosfinitou kyselinu, fosforečnan, thiofosforečnan, fosforitan,pyrofosforitan, trifosfořečnán, hydrogenfosforečnan, dihydrogenfosforečnan, alkylguanidin, arylguanidin, alkylarylquanidin, alkylkarbamát, arylkarbamát, alkylarylkarbamát, alkylthiokarbamát, arylthiokarbamát, alkylaryltrhiokarbamát, alkyldithiokarbamát, aryldithiokarbamát, alkylaryldithiokarbamát, hydrogenuhličitan, uhličitan, chloristan, chlorečnan, chloritan, chlornan, bromistan, bromečnan, bromitan, bromnan, tetrahalogenmanganan, tetraflourborát, hexafluorfosforečnan, hexaflorantimoničnan, fosfornan, jodičnan, jodistan, metaboritan, tetraarylboritan, tetraalkylboritan, vinan, šťavelan, jantaran, citrát, askorbát, ?sacharinát, aminoky• · · · · ·

selinu, hydroxamovou kyselinu, thioparatoluensulfonát, a anionty iontoměničových pryskyřic, nebo systémy, kde jedna nebo více X, Y a Z jsou nezávisle připojeny k jedné nebo více skupinám ”R”, kde n je 0 nebo 1. Výhodné ligandy, z nichž jsou vybrány X, Y a Z, zahrnují halogenid, organickou kyselinu, dusičnanové a hydrogenuhličitanové anionty.

Jak se zde užívá, pojem alkyl” samostatně nebo v komnbinaci, znamená nerozvětvený nebo rozvětvený řetězec alkylového radikálu, obsahující 1 až 22 atomů uhlíku, s výhodou 1 až přibližně 18 atomů uhlíku a nejlépe 1 až přibližně 12 atomů uhlíku. Příklady takovýchto radikálů zahrnují, ale nejsou omezeny na methyl, ethyl, n-propyl, izopropyl, n-butyl, izobutyl, sek.butyl, terc.butyl, pentyl, izoamyl, hexyl, oktyl, nonyl, decyl, dodecyl, tetradecyl, hexadecyl, oktadecyl a eikosyl. Pojem alkenyl”, samostatně nebo v kombinaci, představuje alkylový radikál s jednou nebo dvěma dvojnými vazbami. Příklady takovýchto alkenylových radikálů zahrnují, ale nejsou omezeny na ethenyl, propenyl, 1-butenyl, cis-2-butenyl, trans-2-butenyl, izo-butenyl, cis-2-pentenyl, trans-2-pentenyl, 3-methyl-1-butenyl, 2,3dimethyl-2-butenyl, 1-pentenyl, 1-hexenyl, 1-oktenyl, decenyl, dodecenyl, tetradecenyl, hexadecenyl, cis- a trans-9-oktadecenyl, 1,3-pentadienyl, 2,4-pentadienyl, 2,3pentadienyl, 1,3-hexadienyl, 2,4-hexadienyl; 5,8,11,14-eikosatetraenyl, a 9,12,15oktadekatrienyl. Pojem alkinyl” představuje samostatně nebo v kombinaci, alkylový radikál s jednou nebo více trojnými vazbami. Příklady takovýchto alkynylových radikálů zahrnují, ale nejsou omezeny na ethinyl, propinyl (propargyl), 1-butinyl, 1-oktinyl, 9oktadecinyl, 1,3-pentadiinyl, 2,4-pentadiinyl, 1,3-hexadiinyl, a 2,4-hexadiinyl. Pojem cykloalkyl” představuje samostatně nebo v kombinaci, cykloalkylový radikál obsahující 3 až přibližně 10, s výhodou 3 až 8 a nejlépe 3 až 6 atomů uhlíku. Příklady takovýchto cykloalkylových radikálů zahrnují, ale nejsou omezeny na cyklopropyl, cyklobutyl, cykI o pentyl, cyklohexyl, cykloheptyl, cyklooktyl, a perhydronaftyl. Pojem cykloalkylalkyl” představuje alkylový radikál, jak je definováno výše, který je substituovaný cykloalkylovým radikálem, jak je definováno výše. Příklady cykloalkylalkylových radikálů zahrnují, ale nejsou omezeny na cyklohexylmethyl, cyklopentylmethyl, (4izopropylcyklohexyl)methyl, (4-t-butyl-cyklohexyl)methyl, 3-cyklohexyl propyl, 2-cyklohexylmethyl pentyl, 3-cyklopentylmethylhexyl, 1-(4-neopentylcyklohexyl)methylhexyl, a 1-(4-iozpropyl cyklohexyl)methylheptyl. Pojem cykloalkylcykloalkyl” znamená cykloalkylový radikál, jak je uvedeno výše, který je substituovaný jiným cykloalkylovým rádi• ·

kalem, definovaným výše. Příklady cykloalkylcykloalkylových radikálů zahrnují, ale nejsou omezeny na cyklohexylcyklopentyl a cyklohexylcyklohexyl. Pojem cykloalkenyl” samostatně nebo v kombinaci, zahrnuje cykloalkylový radikál s jednou nebo více dvojnými vazbami. Příklady cykloalkenylových radikálů zahrnují, ale nejsou omezeny na cyklopentenyl, cyklohexenyl, cyklooktenyl, cyklopentadienyl, cyklohexadienyl a cyklooktadienyl. Pojem cykloalkenylalkyl” představuje alkylový radikál, jak je definováno výše, který je substituovaný cykloalkenylovým radikálem, jak je definováno výše. Příklady cykloalkenylalkylových radikálů zahrnují, ale nejsou omezeny na 2-cyklohexen-1ylmethyl, 1-cyklopenten-1-ylmethyl, 2-(1-cyklohexen-1-yl)ethyl, 3-(1-cyklopenten-1yl)propyl, 1-(1-cyklohexen-1-ylmethyl)pentyl, 1-(1-cyklopenten-1-yl)hexyl, 6-(1cyklohexen -1-yl)hexyl, 1-(1-cyklopenten-1-yl)nonyl a 1-(1-cyklohexen-1-yl)nonyl a 1(1-cyklohexen-1-yl)nonyl. Pojem alkylcykloalkyl” a alkenylcykloalkyl” znamená cykloalkylový radikál, jak je definováno výše, který je substituován alkylovým nebo alkenylovým radikálem, jak je definováno výše. Příklady alkylcykíoalkylových a alkenylcykloalkylových radikálů zahrnují, ale nejsou omezeny na 2-ethylcyklobutyl, 1methylcyklopentyl, 1-hexylcyklopentyl, 1-methylcyklohexyl, 1-(9oktadecenyl)cyklopentyl a 1-(9-oktadecenyl)cyklohexyl. Pojem alkylcykloalkenyl” a alkenylcykloalkenyl” znamená cykloalkenylový radikál, jak je definováno výše, který je substituován alkylovým nebo alkenylovým radikálem, jak je definováno výše. Příklady alkylcykloalkenylových a alkenylcykloalkenylových radikálů zahrnují, ale nejsou omezeny na 1-methy l-2-cyklopentenyl, 1-hexyl-2-cyklopentenyl, 1-ethyl-2-cyklohexenyl, 1butyl-2-cyklohexenyl, 1-(9-oktadecenyl)-2-cyklohexenyl a 1-(2-pentenyl)-2cyklohexenyl. Pojem aryl” samostatně nebo v kombinaci, představuje fenylový nebo naftylový radikál, který je volitelně nese jeden nebo více substituentů vybraných ze skupiny alkyl, cykloalkyl, cykloalkenyl, aryl, heterocykl, alkoxyaryl, alkaryl, alkoxy, halogen, hydroxyl, aminu, kyan, nitro, alkylthio, fenoxy, ether, trifluormethyl a podobně, jako je například fenyl, p-tolyl, 4-methoxyfenyl, 4-(terc.butoxy)fenyl, 4-fluorfenyl, 4chlorfenyl, 4-hydroxyfenyl, 1-naftyl, 2-naftyl, a podobně. Pojem aralkyl” samostatně nebo v kombinaci, představuje alkylový nebo cykloalkylový radikál, jak je definováno výše, kde je jeden vodíkový atom nahrazen arylovým radikálem, jak je definováno výše, jako například benzylem, 2-fenylethylem, a podobně. Pojem heterocyklický” znamená cyklickou strukturu obsahující alespoň jeden jiný druh atomu kromě uhlíku v kruhu. Nejčastěji zastoupený jiný druh atomu zahrnuje dusík, kyslík a síru. Příklady heterocyklů

zahrnují, ale nejsou omezeny na pyrrolidinyl, piperidyl, imidazolidinyl, tetrahydrofuryi, tetrahydrothienyl, furyl, thienyl, pyridyl, chinolyl, izochinolyl, pyridazinyl, pyrazinyl, indolyl, imidazolyl, oxazolyl, thiazolyl, pyrazolyl, pyridinyl, benzoxadiazolyl, benzothidiazolyl, triazolyl a tetrazolylové skupiny. Pojem nasycený, částečně nasycený nebo nenasycený cyklus” představuje spojené kruhové struktury , kde jsou dva uhlíkové atomy kruhu též součástí patnáctičlenného makrocyklického ligandu. Kruhová struktura může též obsahovat 3 až 20 uhlíkových atomů, s výhodou 5 až 10 uhlíkových atomů, a může též obsahovat jeden nebo více jiných druhů atomů kromě uhlíku. Nejčastěji zastoupený jiný druh atomu zahrnuje dusík, kyslík, nebo síru. Kruhová struktura může též obsahovat více než jeden kruh. Pojem nasycená, částečně nasycená nebo nenasycená cyklická struktura” představuje kruhovou strukturu, kde je jeden uhlík kruhu též součástí patnáctičlenného makrocyklického ligandu. Kruhová struktura může obsahovat 3 až 20 uhlíkových atomů, s výhodou 5 až 10 uhlíkových atomů, a může též obsahovat atomy dusíku, kyslíku a/nebo atomy síry. Pojem heterocyklus obsahující dusík” znamená kruhovou strukturu, kde jsou dva uhlíkové a dusíkové atomy kruhu též součástí patnáctičlenného makrocyklického ligandu. Kruhová struktura může též obsahovat 2 až 20 uhlíkových atomů, s výhodou 4 až 10 atomů uhlíku, může být částečně nebo zcela nenasycená nebo nasycená a může též obsahovat atomy dusíku, kyslíku a/nebo atomy síry v té části kruhu, která není též součástí patnáctičlenného makrocyklického ligandu. Pojem organický kyselý aniont“ znamená karboxylové kyselé anionty s 1 až 18 atomy uhlíku. Pojem halogenid” znamená chlorid nebo bromid.

Celkový typ náboje komplexu se může měnit od negativního k pozitivnímu vhodně nabitými skupinami makrocyklů substitucí na uhlíku. Vežme-li se v úvahu dispozitivní chrakter železa v centru, celkový náboj komplexu je možné upravit podle potřeby pro zlepšení požadovaných farmaceutických vlastností jako například osmomolarity, tkáňové distribuce a nedleného vylučování. Například, nese-li komplex pouze funkční skupinu s neutrálním nábojem, například C-alkylovou substituci, pak celkový náboj komplexu určuje železo v centru, a je pozitivní. Několikanásobně pozitivně nabitých komplexů je možné dosáhnout včleněním přídavných kationtů, například protonovaných aminoalkylových skupin. Tyto typy komplexů se mohou vázat na endogenní anionty, aniontové proteiny, buněčné membrány a podobně. Pokud jsou připojenou aniontovou skupinou karboxyláty, fenoláty, fosfonáty, sulfonáty a podobně, celkový náboj komplexu může být nulový nebo pozitivní, to znamená, že vzikne aniontový komplex.

>

» · ·· ··· · • · «

Přidané skupiny mohou mít podobu axiálních chelátů a formálně nahrazovat aixální anionty, nebo mohou být navrženy specificky jako nechelatující, ale zachovávající charakter náboje.

Výhodnými sloučeninami jsou ty, kde alespoň jedna, s výhodou alespoň dvě skupiny R představuje alkyl nebo alkyl substituovaný -OR₁₀ nebo -NR10R11, kde R_1o a Rn je nezávisle vodík nebo alkyl, a zbývající skupiny R jsou zastoupeny vodíkem, nasyceným, částečně nasyceným nebo nenasyceným kruhem nebo heterocyklem obsahujícím dusík, s výhodou vodík nebo nasyceným, částečně nasyceným nebo nenasyý. ceným kruhem; kde alespoň jedna, s výhodou alespoň dvě Ri nebo Ri a R₂ nebo R₂, t R3 nebo R₃ a R4 nebo R₄ , R5 nebo R₅ a R₆ nebo R₆, R7 nebo R₇ a R₈ nebo R₈ a R₉ í nebo R₉ a R nebo R spolu s uhlíkovým atomem, ke kterému jsou připojeny, tvoří nasycený, částečně nasycený nebo nenasycený heterocyklus se 3 až 20 uhlíkovými atomy gú“ a všechny zbývající ”R” skupiny představuje vodík, heterocyklus obsahující dusík, alkyl |F nebo alkyl substituovaný skupinami -OR₁₀ nebo -NR₁₀Rn, s výhodou vodík alkyl nebo i alkyl substituovaný skupinami -OR₁₀ nebo -NR₁₀Rn; a ty, kde alespoň jedna, s výhodou dvě R1 nebo R/ a R₂ nebo R₂, R₃ nebo R₃ a R₄ nebo í? R₄ , R5 nebo R₅ a R₆ nebo Ř₆, R₇ nebo R₇ a R₈ nebo R₈ a R₉ nebo R₉ a R nebo R fc· <

jk spolu s uhlíkovým atomem, ke kterému jsou připojeny tvoří nasycený, částečně nasycený nebo nenasycený heterocyklus se 2 až 20 uhlíkovými atomy a všechny zbývající

Borí- ~ jfv ”R” skupiny jsou nezávisle vybrány ze skupiny obsahující vodík, nasycený, částečně ||Χ nasycený nebo nenasycený cyklus, alkyl nebo aryl substituovaný skupinami -OR₁₀ neS5r,

E bo -NR₁₀Rn. Jak se zde užívá, R” skupiny představují všechny ”R” skupiny připojené k

V*;

í atomům uhlíku makrocyklu, to znamená R, R’, R₁₍ R1 , R₂ , R₂, R₃ , R₃ , R₄ , R₄ , R5 ,

R₅ , Re, R₆, R7 , R7 . Re, Re , Rg a R₉ . Příklady komplexů podle vynálezu zahrnují, ale nejsou omezeny na sloučeniny charakterizované vzorcem:

·· ·« ·· ···· • · · · • · *

Λ · * * * · · · · ·· *· · ^Η\ / Λ ,^Η / \ ^Ηχ / \ Η c\í/a .» Q\Fp ^Ηζ i η-Ν-Fe-__X ._C| / e I 1 ^H / .· I N._h

qw . -ki__Xfl

III····

•Cl

Makrocyklické ligandy kde všechny R’ jsou H, se mohou se připravit podle obecného schématu syntézy A uvedeného níže za využití již známých metod pro přípravu určitých meziproduktů a určitých ligandů. Viz, například, Richman a kol., J. Am. Chem. Soc., 96, 2268 (1974); Atkins a kol. Org. Synth., 58, 86 (1978); a EP 287 465. Triazaalkan se tak tosyluje ve vhodném systému rozpouštědla za vzniku odpovídajícího trris(Np-toluensulfon)derivátu. Tento derivát pak reaguje s vhodnou bází za vzniku odpovídajícího disulfamidového aniontu. Disulfonamidový aniont pak reaguje s di-O-tosylovaným di-N-tosylovaným diazaalkan diolem za vzniku odpovídajícího pentaparatoluensulfonpentaazacykloalkanu. Paratoluensulfonové skupiny se pak odstraní a výsledná sloučenina reaguje se sloučeninou železa za nezbytných bezvodých a anaerobních podmínek a vzniku odpovídajícího pentaazacyklopentadekanového komplexu železa

R skupiny v makrocyklu, vzniklá cestou cyklického peptidu, to znamená R_1t R/ , R₂, R₂, R₃, Rs , R4 , R4 , R₅, Rs , Re, Re, R? , Ry, Re, Re , Rg a Rg , mohou být odvozeny od D nebo L forem aminokyselin, alaninu, kyseliny asparágové, argininu, asparaginu, cysteinu, glycinu, kyseliny glutámové, glutaminu, histidinu, izoleucinu, leucinu, lyzinu, methioninu, prolinu, fenylalaninu, šeřinu, tryptofanu, treoninu, tyrozinu, valinu a/nebo R skupin nepřirozených α-aminokyselin jako například alkylu, ethylu, butylu, ·· · : · · · · · · ·· * _a · * a · · ···· · ϊ ·· ^: · ·. ..··.· ·· ·· ··· ···· ·· ·· terc.butylu, cykloalkylu, fenylu, alkenylu, allylu, alkynulu, arylu, heteroarylů, polycykloalkylu, polycykloarylu, polycykloheteroarylu, iminu, aminoalkylu, hydroxyalkylu, hydroxylu, fenolu, aminoxidu, thiolalkylu, karboalkoxyalkylu, karboxylových kyselin a jejich derivátů, keto, ether, aldehyd, amin, nitril, halogen, thiol, sulfoxid, sulfon, sulfonová kyselina, sulfid, disulfíd, fosfonová kyselina, fosfinová kyselina, fosfinoxidu, amidy, aminokyseliny, peptidy, proteiny, hydrogenuhličitanu, nukleové kyseliny, mastné kyseliny, lipidů, nitro, hydroxy laminy, hydroxamové kyseliny, thiokarbonyly, boráty, borany, boraza, silyl, siloxy, silaza, a jejich kombinací.

Makrocyklické ligandy využitelné v komplexech podle vynálezu se mohou též připravit cestou dichloridu dvojsytné kyseliny uvedenou ve schématu C níže. Triazaalkan se tak tosyluje ve vhodném systému rozpouštědla za vzniku odpovídajícího tris(Np-toluensulfon)derivátu. Tento detivát pak reaguje s vhodnou bází za vzniku odpovídajícího disulfonamidového aniontu. Disulfonamidový aniont se dialkyluje s vhodným elektrofilem za vzniku derivátu dikarboxylové kyseliny. Tento derivát dikarboxylové kyseliny reaguje za vzniku diakarboxylové kyseliny, která pak reaguje s vhodným činidlem za vznikudichloridu dvojsytné kyseliny. Požadovaný vicinální diamin se získá jednou z několika možných cest. Jednou z využitelných cest se připraví aldehyd reakcí s kyanidem v přítomnosti chloridu amonného za následné reakce s kyselinou a vzniku alfaamoniumnitrilu. Poslední uvedená sloučenina se redukuje v přítomnosti kyseliny, a pak reaguje s vhodnou bází za vzniku vicinálního diaminu. Kondenzací dichloridu dvojsytné kyseliny s vicinálním diamidem v přítomnosti vhodné báze vznikne tris(ptoluensulfon)diaminový makrocyklus. Paratoluensulfonové skupiny se odstraní, aminy se zredukují, a výsledná sloučenina reaguje se sloučeninou železa za nezbytných bezvodých a anaerobních podmínek a vzniku odpovídajícího substituovaného pentaazacykloalkanového komplexu železa.

Vicinální diaminy byly připraveny uvedenou cestou (známou pod názvem Streckarova syntéza) a nebo v případě komerční dostupnosti byly zakoupeny. Pro přípravu vicinálního diaminu je možné použít jakouli cestu přípravy.

Makrocyklické ligandy využitelné v komplexech podle vynálezu se mohou též připravit bis(halogenacetamidovou) cestou uvedenou ve schématu D níže. Triazaalkan se tak tosyluje ve vhodném systému rozpouštědla za vzniku odpovídajícího tris(N-ptoluensulfon)derivátu. Tento derivát pak reaguje s vhodnou bází za vzniku odpovídajícího disulfonamidového aniontu. Bis (halogenacetamid), například bis(chloracetamid),

ί. kterého se připraví vicinální diamin reakcí diaminu s přebytkem halogenacetylhalogenidu, například chloracetylchloridu, v přítomnosti báze. Disulfonamidový aniont tris(N-p-toluensulfon) triazaalkanu pak reaguje s bis(chloracetamidem) diaminu za vzniku substituovaného tris(N-p-toluensulfon)diamidového makrocyklu. Paratoluensulfonové skupiny se odstraní, amidy se zredukují, a výsledná sloučenina reaguje se sloučeninou železa za nezbytných bezvodých a anaerobních podmínek za vzniku odpovídajícího pentaazacykloalkanového komplexu železa.

Makrocyklické ligandy využitelné v komplexech podle vynálezu, kde R_1f R/, R₂,R₂ jsou součástí cis- nebo trans- cykloalkylového cyklického systému, a R₅, R5, R₇ a R7, R91 R9 mohou být H nebo jakákoli funkční skupina popsaná výše, se mohou připravit pseudo-peptidovou metodou uvedenou ve schématu E níže. C/s-1,2diaminocykloalkan nebo írans-(R,R))-1,2-diaminocykloalkan nebo trans-(S,S)-1,2diaminocykloalkan se může použít v této metodě v kombinaci s některou aminokyselinou. To umožňuje relativní stechiometrii cykloalkanového kruhu spojeného se substituentem, funkční skupiny R₅, R₅, R₇, R₇, R_g, R₉ a stechiometrii definovanou jakýmkoli způsobem. Například řrans-(R,R)-1,2-diaminocyklohexan se monotosyloval a reagoval s Boc anhydridem za vzniku odlišného N-Boc, N-p-toluensuifonového derivátu. Sulfonamid se alkyloval s methylbromacetátem za použití hydridu sodného jako báze a zmýdelnil se na volnou kyselinu. Cyklohexandiamin obsahující N-p-toluensulfonglycin se použil jako surový dipeptid pro standardní peptidovou syntézu na bázi roztoku. Sloučením se substituovaným esterem aminokyseliny se tak získal odpovídající pseudotripeptid. Dvěma následnými kroky, kterými jsou TFA štěpení a sloučení se získal pseudo-pentapeptid, z kterého se mohou odstranit chránící skupiny z N- a C-konce jedním krokem za použití směsi HCI/AcOH. Cyklizaci vyvolanou DPPA a následnou redukcí pomocí LiAIH₄ nebo boru se získal odpovídající makrocyklický ligand. Tento ligaridový systém reagoval se sloučeninou železa, jako například z chloridem železitým za nezbytných anaerobních podmínek a vzniku odpovídajícího substituovaného pentaazacykloalkanového komplexu železa.

Makrocyklické ligandy využitelné v komplexech podle vynálezu, kde R1, R/, R₂,R₂ jsou součástí cis- nebo trans- cykloalkylového cyklického systému a R₅, R5, R7, R7 a R₉, R_g mohou představovat H nebo jakoukoli funkční skupinu popsanou dříve, a mohou se připravit opakovanou pseudo-peptidovou metodou uvedenou ve schématu F níže. C/s-1,2-diaminocykloalkan nebo íra/7s-(R,R)-1,2-diaminocykloalkan nebo trans12

(S,S)-1,2-diaminocykloalkan se mohou v této metodě použít v kombinaci s jakoukoli aminokyselinou. To umožňuje relativní stechiometrii cykloalkanových kruhů spojených se substituentem, funkční skupiny R₅, R₅, R₇, R₇ Rg, Rg a stechiometrii definovanou jakýmkoli způsobem. Dipeptid (S,S)-1,2-diaminocyklohexyl-N-p-toluensulfonglycinu v surovém stavu, připravený z (S,S)-1,2-diaminocyklohexanu přesně podle schématu E pro přípravu (R,R)-1,2-diaminocyklohexanu, se tak může sloučit se substituovaným esterem aminokyseliny za vzniku odpovídajícího pseudo-tripeptidu. TFA štěpením se získala TFA sůl pseudo-tripeptidu, ktetrá se sloučila s (R,R)-diaminocyklohexyl N-ptoluensulfonglycinem. Zmýdelněním a TFA štěpením se získal bis-cyklohexan obsahující pseudo-pentapeptid. Cyklizací vyvolanou DPPA a následnou redukcí pomocí LiAIH₄nebo borem se získal odpovídající bis-cyklohexanový spojený makrocyklický ligand.

/ Tento ligandový systém reagoval se sloučeniou železa, jako například z chloridem žeF lezitým za nezbytných anaerobních podmínek a vzniku odpovídajícího substituovaného & i»' ·---— ------- -·-· ' — ^x -· ' pentaazacykloalkanového železitého komplexu.

Makrocyklické ligandy využitelné v komplexech podle vynálezu se mohou též f

> připravit obecnou metodou uvedenou ve schématu G níže. Amid aminokyseliny, což je odpovídající amidový derivát přirozeně nebo nepřirozeně se vyskytující aaminokyseliny, se redukuje na odpovídající substituovaný ethylendiamin. Tento amid aminokyseliny může být amidový derivát jakékoli z obecně známých aminokyselin. VýV hodné amidy aminokyselin charakterizuje vzorec:

kde R je definováno dříve. Nejlepší jsou ty, kde R představuje vodík, alkylové, cykloalkylové a atralkylové deriváty. Diamin se pak tosyluje za vzniku” di-N-ptoluensulfonového detrivátu, který réaguje s di-O-p-toluensulfonovaným tris-N-ptoluensulfonovaným triazaalkanovaným diolem za vzniku odpovídajícího substituovaného N-penta-p-toluensulfonpentaazacykloalkanu. Paratoluensulfonové skupiny se odstranily a výsledná sloučenina reagovala se sloučeninou železa za nezbytných bezvodých a anaerobních podmínek a vzniku odpovídajícího substituovaného pentaazacykloalkanového komplexu železa.

• ·

Komplexy podle vynálezu, kde R₉ a R₂ jsou alkyly a R₃ ,R₃ a R₄₎ R4, R5, R₅ Re , Re , R7, R7. Re a R₈, může být alkyl, aralkyl nebo cykloalkylalkyl a R nebo R a Rí nebo R1 spolu s atomy uhlíku, ke kterým jsou připojeny, tvoří heterocyklus obsahující dusík, se mohou připravit podle obecného schématu H, uvedeného níže, za využití známých metod pro přípravu prekurzoru pentaazabicyklo[12,3,1]oktadekapentanového komplexu železa. Viz, například, Alexander a kol., Inorg.

Nucl. Chem. Lett., 6, 445 (1970). 2,6-diketopyridin tak kondenzuje s triethylentetraaminem v přítomnosti sloučeniny železa za vzniku pentaazabicyklo[12,3,1]oktadekapentanového komplexu železa. Pentaazabicyklo[12,3,1]oktadekapentanový komplex se hydrogenuje 5% rhodiem na uhlíku při tlaku 6888,8 kPa za vzniku odpovídajícího pěntaazabicyklo[12,3,1]oktadekatrienového komplexu.

Makrocyklické ligandy, použitelné v komplexech podle vynálezu, se mohou připravit pyridin diaminovou cestou uvedenou ve schématu I níže. Polyamin, ve formě tetraaza sloučeniny, obsahující dva primární aminy, tak kondenzuje s dimethyl 2,6-pyridin dikarboxylátem při zahřátí ve vhodném rozpouštědle, jako například v methanolu, za vzniku makrocyklu se včleněným pyridinovým kruhem jako 2,6-dikarboxamidem. Pyridinový kruh v makrocyklu se zredukuje na odpovídající piperidinový kruh v makrocyklu, diaminy se zredukují, a výsledná sloučenina reaguje se slučeniou za nezbytných bezvodých a anaerobních podmínek a vzniku odpovídajícího substituovaného pentaazacykloalkanového komplexu železa.

Pokud ligandy nebo náboj neutralizující anionty, to znamená X, Y a Z, jsou anionty nebo ligandy, které nemohou být zavedeny přímo ze sloučeniny železa, komplex s těmito anionty nebo ligandy může vzniknout provedením výměnné reakce s komplexem, který se připravil reakcí makrocyklu se sloučeninou železa.

Schéma A

II ···· · · · ·· ·« «Λ · ,·? * í’»

I^N

TsHN

Ts/pyridin

Pí NHTs Ts

Na/TsOH

TsN N Pia Ts

NTs

H. /-A ^N OH

N OH H^ZU

TsCl/Et₃N CH₂CI₂ l

N OTs

N---------OTs (

_Ts ^z V?

Na

DMF, 100®C

Γ\ /H ✓—*N N—

N

FcX ^h\ /T\ z¹¹ n* _H Me OH

H

H ♦ 9 99 ' ··

9 9 9 9 ·

9 9 99

9 9999 ·

9 9 9

9999 99 99 ·« »♦·· · ♦ • · · * 9 9 • 9 9 9 ··

Schéma Β

R.. *ι

BocMX t *· n

V ZHJC+tCJ. HOBT. DMF.TEA.RT nebo ethyl-(chlorforniiat)

DMF, TEA,0*C

O Ri Rl

NaOH.HgO

CHjOH

O 'SA» «r. «.

EDC-HO.HOBT.

DMF.TEA.RT nebo ethyl-(chlorfomiiát)

DMF.TEA.0-C

BocNH

EDC-HCI, ΗΟΘΤ. DMF.TEART nebo ethyl-(chlorfonniat) □MF.TEA.0-C

NaOH.HgO

CHjOH

BocNH

EDOHCIHOBT,

DMF.TEART __jjebo_____ cthyl-fchlorformiat) £»SF.TEA.0^eC

Schéma C

Hj.PtOj.Ha

l.TíO.

pyridin

N*·

Ta

-N

2.NaOCjH,

CjHsOH

• · » 4 » 4 • ·

Na’ Ν-Τ»

KR·. R .

a - HjN* *nhj _a P«

BrCRjCOOCHj

DMF

• · · ·

Schéma D • * • · • ·

9 9 • · • · ·

9 999 9

Schéma E (pokračování)

LIAIH₄ nebo ^BH3

·· ·· ·· • · · · · ·

·· ·· » · · « • · ·· • · · ··« ·· ··

uaih₄ nebo BH ^w o

FeCl «-i

MeOH

Schéma G • 9 · · · • · · 99 ·· 99 o

Η,Ν

NH,

LÍAIH4/THF

R

NH,

Tsa

Tarf^^J NTa * Ta

Na Na*

O o^o .DMF

T«HN

Ta.

xw v

Ta

HO^

NHTt

1. HBr neboHjSO^eb» Na*JCyjHJ

2. NaOH

C ^N3

Η** N

FeX

Ή MeOH

Ul/TÁ · _Mn__/ \í!7 ·· ····

Schéma Η

FeCI

MeOH

Ha Ρφ CH3OH HCt

Pentaazamakrocykly podle vynálezu mohou obsahovat jeden nebo více asymetrických uhlíků a jsou tak schopny existovat ve formě optických izomerů, stejně jako ve formě svých racemických nebo neracemických směsí. Optické izomery se mohou získat z racemických směsí běžnými postupy, například tvorbou diastereomerních solí reakcí s opticky aktivní kyselinou. Příkladem vhodné kyseliny je kyselina vinná, diacetylvinná, dibenzoylvinná, ditoluoylvinná a kafrsulfonová Pak následuje separace směsi diastereomerů krystalizací a následným uvolněním opticky aktivních baží z jejich solí. Různé postupy pro oddělení opticky aktivních izomerů zahrnují použití chirální chromatografické kolony optimálně vybrané pro maximální separaci enantiomerů. Další vhodná metoda zahrnuje syntézu kovalentních diastereomerních molekul reakcí jedné nebo více sekundárních aminoskupin sloučenin podle vynálezu s opticky čistou kyselinou v aktivované formě nebo jako opticky čistý izokyanát. Syntetizované diastereomery se mohou připravit běžnými metodami, jako například chromatografií, destilací, krystalizací nebo sublimací, a pak hydrolýzou pro získání enantiomerně čistého ligandu. Opticky aktivní sloučeniny podle vynálezu se mohou získat také využitím opticky aktivní výchozí látky, jako například přírodní aminokyseliny.

Sloučeniny nebo komplexy podle vynálezu se mohou využít při léčbě mnoha zánětlivých chorobných stavů a poruch, které jsou alespoň částečně způsobeny superoxidem. Například, reperfuzní poranění ischemického orgánu, reperfuzní poranění ischemického myokardu, chirurgickým zákrokem vyvolané ischemie, zánětlivé onemocnění střev, revmatoidní artritida, osteoartritida, psoriáza, rejekce transplantovaného orgánu, radiací vyvolané poškození, oxidací vyvolané poranění tkáně a poškození, atheroskleróza, trombóza, agregace destiček, mozkové příhody, akutní pankreatitidy, diabetus mellitus závislý na inzulínu, roztroušená intravaskulární koagulace, tukové embolie, respirační nedostatečnosti u dospělých a dětí, metastázy a karcinogeneze.

Aktivita sloučenin nebo komplexů podle vynálezu při katalýze’dismutace superoxidu může být vysvětlena za použití techniky kinetické analýzy zastaveného toku, jak popisuje Riley, D. P., Rivers, W. J. a Weiss, R. H., ”Stopped-Flow Kinetic Analysis fór Monitoring Superoxide Decay in Aqueous Systems,” Anal. Biochem.. 196, 344-349 (1991), která je zde zahrnuta v odkazu. Kinetická analýza zastaveného toku je přesná a přímá metoda pro kvantitativní sledování rychlosti rozkladu superoxidu ve vodě. Kinetická analýza zastaveného toku je vhodná pro screening sloučenin s SOD aktivitou a katalytickou aktivitou sloučenin nebo komplexů podle vynálezu pro dismutaci superoxi• ·«·· du, jak ukazuje analýza zatstaveného toku, korelující s léčbou výše uvedených chorobných stavů a poruch. Celková denní dávka, podaná pacientovi jednorázově nebo v několika dávkách, se může pohybovat například od 1 do přibližně 100 mg/kg tělesné hmotnosti denně a vyšší většinou přibližně od 3 do 30 mg/kg. Kompozice jednotkové dávky by měla obsahovat několikanásobně nižší množství, než je denní dávka.

Množství aktivní látky, které se může smíchat s nosnou látkou, pro získání jednotkové dávky, se může lišit v závislosti na léčeném pacientovi a způsobu aplikace.

Dávkování pro léčbu chorobných stavů sloučeninami a/nebo kompozicemi podle vynálezu závisí na mnoha faktorech, včetně typu, věku, hmotnosti, pohlaví, stravovacího režimu a zdravotního stavu pacienta, míry onemocnění, frekvence podávání, farmakologického hlediska, jako například aktivity, účinnosti, farmakokinetického a toxikologického profilu určité sloučeniny, zda je léčivo využité v systému aplikace, a zda je podaná sloučenina součástí lékové kombinace. V aktuálních režimech dávkování tak mohou být velké rozdíly, a mohou se proto lišit od výhodného režimu dávkování uvedeného výše.

Sloučeniny podle vynálezu se mohou podat orálně, perenterálně, pomocí inhalačního spreje, rektálně, nebo lokálně v podobě jednotkové dávky obsahující běžné, netoxické, farmaceuticky přijatelné nosiče, případně adjuvans a pojidla. Lokální podání může také zahrnovat transdermální aplikaci, jako například pomocí transdermálních náplastí nebo iontoforetických zařízení. Pojem parenterální, jak se zde užřívá, zahrnuje podkožní injekce, intravenózní, intramuskuiární, intrasternální injekce, nebo infuzní techniky.

Injekční preparáty, jako například sterilní voda pro injekce nebo olejové suspenze, se mohou připravit podle známých metod za použití vhodných disperzních nebo zvlhčujících látek a suspenzních činidel. Sterilním injekčním preparátem může být také sterilní injekční roztok nebo suspenze v netoxickém parenterálně přijatelném ředidle nebo rozpouštědle, jako například roztok v 1,3-butandiolu. Mezi přijatelné nosiče a rozpouštědla, která se mohou využít, patří voda, Ringersův roztok a izotonický roztok chloridu sodného. Sterilní, fixované oleje jsou navíc běžně dostupné jako rozpouštědla nebo suspendující média. Pro tento účel se může použít jakákoli směs fixovaného oleje, zahrnující syntetické mono- nebo diglyceridy. Mastné kyseliny, jako například kyselina olejová, navíc našly uplatnění v přípravě injekčních látek.

•· ···· • · · • ·

Čípky pro rektální aplikaci léčiva se mohou připravit smícháním léčiva s vhodným nedráždivým nosičem, jako například s kakaovým máslem a polyethylenglykolem, které jsou při běžných teplotách v pevném stavu, ale kapalné při rektální teplotě, a proto v rektu roztají a uvolní léčivo.

Pevné formy dávky pro orální aplikaci mohou zahrnovat kapsle, tablety, pilulky, prášky, granule a gely. U těchto pevných forem může být aktivní sloučenina smíchaná s alespoň jednou ředící látkou, jako například s laktózovým cukrem nebo škrobem. Tyto formy dávek mohou také obsahovat běžně kromě inertních ředidel další látky, jako například lubrikační činidla, například stearát hořečnatý. V případě kapslí, tablet a pilulek mohou dávkovači formy obsahovat také pufrující látky. Připravené tablety a pilulky mohou mít navíc enterický povlak.

Kapalné formy pro orální aplikaci mohou zahrnovat farmaceuticky přijatelné emulze, roztoky, suspenze, sirupy a tinktury obsahující běžně používaná inertní ředící látky, jako například vodu. Tyto kompozice mohou také obsahovat přídavné látky, například zvlhčovadla, emulzifikační a suspendující látky a sladidla, barviva a aromatické látky.

Zatímco se mohou sloučeniny podle vynálezu podat jako samostatné aktivní farmaceutické látky, mohou se také použít v kombinaci s jednou nebo více sloučeninami, které jsou známy jako účinné látky při určitém chorobném stavu, z nichž jedna působí léčebně.

Předpokládané ekvivalenty obecných vzorců uvedených výše u sloučenin a derivátů, stejně jako meziproduktů, jsou deriváty tomuto jinak odpovídající, se shodnými obecnými vlastnostmi, jako například tautomery sloučenin a takové, kde jedna nebo více různých skupin R jsou jednoduché obměny substituentů, jak je zde definováno, například kde R je vyšší alkylová skupina než je uvedena, nebo kde jsou paratoluensulfonově skupiny jiné dusíkové nebo kyslíkové čhaníčí skupiny, nebo kde Opara-toluensulfon je halogenid. Anionty s jiným nábojem než 1, například uhličitany, fosforečnany a hydrogenfosforečnany, se mohou použít místo aniontů s nábojem 1 tehdy, pokud nemají jinak vliv na celkovou aktivitu komplexu. Použití aniontů s nábojem' jiným než 1 však způsobí mírnou modifikaci obecného vzorce komplexu uvedeného výše. Navíc tam, kde substituent je, nebo může být vodík, přesná chemická podstata substituentu jiného než je vodík v této pozici, například uhlovodíkového radikálu nebo halogenidové, hydroxy, amino a podobné funkční skupiny, není rozhodující, pokud jinaK ·· ···· nepůsobí na obecnou aktivitu a/nebo postup syntézy. Dále se předpokládá, že železité komplexy budou ekvivalentní uvedeným železitým komplexům.

Chemické reakce popsané výše jsou obecně uvedeny z hlediska uplatnění jejich širšího uplatnění při přípravě sloučenin podle vynálezu. V některých případech reakce nejsou použitelné podle popisu pro každou uvedenou sloučeninu. Tyto sloučeniny rozpoznají odborníci v tomto oboru. Ve všech těchto případech se reakce může úspěšně provést za použití běžných modifikací známých odborníkům v této oblasti, například pomocí vhodné ochrany interferujících skupin, změnou běžných činidel, běžnou modifikací reakčních podmínek a podobně, nebo jinými reakcemi zde uvedenými, nebo jinou běžnou metodou, použitelnou k přípravě odpovídajících sloučernin podle vynálezu. Všechny metody přípravy, všechny výchozí látky jsou známé, nebo je možné je jednoduše připravit ze známých výchozích látek.

Bez dalšího popisu se předpokládá, že odborník v této oblasti může za použití uvedeného popisu využít tento vynález v jeho plném rozsahu. Následující výhodná provedení jsou proto stavěna pouze jako ilustrativní a neomezují jakékoli další možné rozšíření.

Příklady provedení vynálezu

Všechny reagencie se použily v původním stavu bez přečištění, není-li jinak uvedeno. Všechna spektra NMR byla získána na spektrometrech pro nukleární magnetickou rezonanci typu Varian VXR-300 nebo VXR-400. Kvalitativní a kvantitativní hmotnostní spektroskopie byla provedena na zařízení Finigan MAT90 a Finigan 4500 a VG40-250T za použití m-nitrobenzylalkoholu (NBA) a směsi m-nitrobenzyl alkohol/LiCI (NBA + Li). Teploty tání nejsou upraveny.

Následující zkratky, vztahující se k aminokyselinám a jejich ochranným skupinám, jsou v souladu s ustanovením komise IUPAC-IUB pro biochemickou nomenklatu-

ru (Biochemistry 11,1726 , (1972)) a všeobecným užíváním
Ala	L-alanin
DAla	D-alanin
Gly	glycin
Ser	L-serin
DSer	D-serin
Bzl	benzyl

···· >·· 4444 ··

Boc	terč. butoxykarbonyl
Et	ethyl
TFA	kyselina trifluoroctová
DMF	dimethylformamid
HOBT . H₂O	1-hydroxy-(ÍH)-benzotriazol monohydrát
EDC . HCI	1 -(3-dimethylaminopropyl)-3-ethylkarbodiimid hydrochlorid
TEA	triethylamin
DMSO	dimethylsulfoxid
THF	tetrahydrofuran
DPPA	difenylfosforyl azid
DMPU	dimethylpropylenmočovina
c	koncentrace
DME	1,2-dimethoxyethan
Zkratka Cyc znamená 1,2-cyklohexandiamin (stereochemie, to znamená použití
označení Rj,R nebo Si,S). Následuje třípísmenový kód peptidové nomenklatury použité

u pseudopeptidů obsahujících 1,2-cyklohexandiaminový zbytek

Příklad 1

A. Syntéza 1,4.7-tris(p-toluensulfonvl)-1,4.7-triazaheptanu

Sloučenina se syntetizovala podle postupu Atkins, T. J.; Richman, J. E.; a Oettle, W.F.; Org. Synth., 58, 86-98 (1978). K míchanému roztoku p-toluensulfonylchloridu (618 g, 3,24 mol) v pyridinu (1500 ml) se při 0°C přidal roztok 1,4,7-triazaheptanu (95,5 g, 0,926 mol) v pyridinu (150 ml) v suché argonové atmosféře, teplota se udržovala při < 50°C. Přidávání trvalo 30 minut. Po zchlazení směsi na laboratorní teplotu se za míchání během 3 h pomalu přidala ke zchlazené směsi (ledová lázeň) H₂O (2 I). Vytvořil se objemný bílý precipitát, který se přefiltroval a promyl H₂O. Světle žlutá pevná látka se rozpustila v DMF (3 I) a pomalu se přidala při 5°C 0,1 N HCI (4 I). Suspenze se přefiltrovala, světle žlutá pevná látka se důkladně promyla vodou H₂O, vysušila ve vakuu a získalo se 486 g (93% výtěžek) produktu: teplota tání: 180°C^:181°C; ¹H NMR (DMSOd₆) δ 2,39 (s, 3H), 2,40 (s, 6H), 21,84 (m, 4H), 3,04 (t, J = 6,9 Hz, 4H), 7,40 (d, J = 8,1 Hz, 4H), 7,59 (d, J = 8,3 Hz, 2H), 7,67 (m, 6H).

* ·

B. Syntéza 1,4.7-tris(p-toluensulfonyl)-1,4,7-triazaheptan-1,7-disodné soli

Tato sloučenina se syntetizovala podle postupu Atkins, T. J.; Richman, J. E.; a Oettle, W.F.; Org. Synth., 58, 86-98 (1978). K mechanicky míchanému roztoku 1,4,7tris(p-toluensulfonyl)-1,4,7-triazaheptanu připravenému v příkladu 1A (486 g, 0,859 mol) v ethanolu (1150 ml), zahřátému k refluxu v suché argonové atmosféře, se co nejrychleji přidal roztok ethoxidu sodného (připravený rozpuštěním kovového sodíku (39,5 g, 1,72 mol) v absolutním ethanolu (1,0 I)). Čirý hnědý roztok, který se brzy vytvořil, se zchladil na laboratorní teplotu a přidal se ethylether (1,0 I). Krystaly se přefiltrovaly přes suchý argonový filtr, promyly směsí ethanol : ethylether 3:1 a ethyletherem. Krystaly se vysušily za vakua a získalo se 509 g (97% výtěžek) produktu ve formě bílého prášku: ¹H NMR (DMSO-d₆) δ 2,30 (s, 6H), 2,36 (s, 3H), 2,63 (t, J = 8,7 Hz, 4H), 2,89 (t, J = 7,2 Hz, 4H), 7,11 (d, J = 8,1 Hz, 4H), 7,28 (d, J = 8,0 Hz, 2H), 7,46 (m, 6H).

C. Syntéza 3,6-bis(p-toluensulfonyl)-3,6-diazaoktan-1,8-di-p-toluensulfonátu

K míchanému roztoku p-toluensulfonylchloridu (566 g, 2,97 mol) a triethylaminu (300 g, 2,97 mol) v CH₂CI₂ (2,0 I) se při 0°C v suché argonové atmosféře po částech přidal 3,6-diazaoktan-1,8-diol (100 g, 0,675 mol) a teplota se udržovala < 10°C. Přidávání trvalo 30 minut. Směs se pak během 18 hodinového míchání zahřála na laboratorní teplotu a nalila se do ledu (1000 g). Vrstva CH₂CI₂ se oddělila, promyla 10% HCI, H₂O, nasyceným roztokem NaCl a vysušila (MgSO₄). Roztok se zakoncentroval ve vakuu na objem 1,5 I. Krystalizací po přídavku hexanu (4 I) se získalo 477 g (92% výtěžek) produktu ve formě bezbarvých jehliček: teplota tání 151°C-153°C; ¹H NMR (CDCI₃) δ 2,43 (s, 12H), 3,29 (s, 4H), 3,36 (t, J = 5,2 Hz, 4H), 4,14 (t, J = 5,2 Hz, 4H), 7,33 (d, J = 7,8 hz, 8H), 7,71 (d, J = 8,2 Hz, 4H), 7,79 (d,J = 8,3 Hz, 4H).

D. Syntéza 1,4,7,10,13-penta(p-toluensulfonyl)-1,4,7,10.13-pentaazacyklopentadekanu

Sloučenina se syntetizovala podle postupu Richman, J. E.; Atkins, T. J.; j. Am. Chem. Soc., 96, 2268-70 (1974). K míchanému roztoku 1,4,7-tris(p-toluensulfonyl)1,4,7-triazaheptanu-1,7-disodné soli, připravenému v příkladu 1B (146 g, 0,240 mol) v bezvodém DMF (2250 ml) v suché argonové atmosféře po kapkách během 3 hodin přidal roztok 3,6-bis(p-toluensulfonyl)-3.6-diazaoktan-1,8-di-p-toluensulfonátu, připraveného v příkladu 1C (184 g, 0 240 mol) v bezvodém DMF (1020 ml) v suché argonové atmosféře, teplota se udržovala při 100°C. Po následném 1 h míchání při 100°C se • ·

roztok zakoncentroval ve vakuu na objem 1,5 I. Pomalu se při 80°C přidala H₂O (500 ml) a produkt rekrystaloval. Výsledná suspenze se pomalu zchladila na 0°C a přidala se další H₂O (1250 ml). Pevná látka se přefiltrovala, řádně promyla H₂O, pak 90% ethanolem a vysušila ve vakuu. Ne zcela bílá pevná látka se rozpustila v CH₂CI₂, nerozpustné nečistoty se odstranily filtrací, filtrát se promyl H₂O, a pak vysušil (MgSO₄). Rozpouštědlo se odstranilo ve vakuu a získala se žlutá pevná látka, která se přečistila rekrystalizaci ze směsi CH₂CI₂-hexan, a získalo se 164 g (69% výtěžek) produktu ve formě bílé krystalické pevné látky: teplota tání 290°C-293°C; ¹H NMR (CDCI₃) δ 2,44 (s, 15H), 3,27 (s, 20H), 7,32 (d, J = 8,3 Hz, 10H), 7,66 (d, J = 8,3 Hz, 10H).

E. Syntéza 1.4,7.10,13-pentaazacyklopentadekanu

Směs 1,4,7,10,13-penta(p-toluensulfonyl)-1,4,7,10,13pentaazacyklopentadekanu, připraveného v příkladu 1D (168 g, 0,170 mol) a koncentrované H₂SO₄ (500 ml) se zahřívala při 100°C 70 hodin při míchání v argonové atmosféře. K výslednému tmavě hnědému roztoku se při 0°C po kapkách za míchání přidal ethanol (500 ml) a následně ethylether (3 I). Bílá pevná látka se přefiltrovala a promyla ethyletherem. Pevná látka se pak rozpustila v H₂O (500 ml) a výsledný roztok se promyl ethyletherem. Po snížení objemu roztoku ve vakuu na 200 ml se upravilo pH 10 N NaOH na 10 až 11 a rozpouštědlo se odstranilo ve vakuu. Pak se přidal ethanol (500 ml) a odstranil se ve vakuu až do suchého zbytku. Výsledná žlutohnědá olejovitá pevná látka se extrahovala horkým THF (2 x 500 ml) a přefiltrovala při laboratorní teplotě. Filtráty se smíchaly a rozpouštědlo se odstranilo ve vakuu a získal se surový produkt ve formě žluté krystalické pevné látky, který se pak rozpusytil v CH₃CN a přefiltroval z důvodu odstranění nerospustných neščistot. Rekrystalizaci ze zchlazeného (-20°C) CH₃CN se získalo 11,3 g (31% výtěžek) produktu ve formě bezbarvých jehliček: teplota tání 108°C-109°C; ¹H NMR (CDCI3) δ 1,74 (široké s, 5H), 2,73 (s, 20H); přesná hmotnost (M + Li)⁺: vypočtená, 222,2270; skutečná, 222,2269 (C10H₂₅N₅Li).

F. Syntéza fdichlor(1.4.7,10.13-pentaazacyklopentadekan)lhexafluorofosfátu železitéhol

V inertní atmosféře v suchém boxu se rozpustilo 108 mg (0,50 mmol) ligandu, 1,4,7,10,13-tetraazacyklopentadekanu v 15 ml bezvodého methanolu. K tomuto roztoku za intenzivního míchání přidaly 2 ml roztoku pyridinu, obsahující 0,50 mmol (80 mg)

bezvodého FeCI₃. Výsledný tmavý roztok se za míchání 2 hodiny refluxoval, pak se zchladil na laboratorní teplotu, a přefiltroval. K filtrátu se přidalo 20 ml čistého methanolového roztoku NH₄PF₆ (163 mg). Okamžitě se vytvořil žlutý precipitát, který se nashromáždil filtrací, promyl ethyletherem a vysušil ve vakuu přes noc. Po vysušení se získalo 170 mg (0,338 mmol) odpovídající 68% teoretického výtěžku. Analýza vypočtená pro C₁₀H₂₀N₅CI₂FeF₆P. CH₃OH: C, 25,07; H, 5,41: N, 13,92. Skutečné hodnoty: C, 25,18; H, 5,60; N, 13,89. Hmotnostní spektrum (FAB, NBA matrix): m/z 306 ([Fe(L)CI+e]⁺ a m/z 341 ([Fe(L)CI₂r.

Příklad 2

A. Syntéza N-(p-toluensulfonvl)-(R,R)-1.2-diaminocyklohexanu

K míchanému roztoku (R,R)-1,2-diaminocyklohexanu (300 g, 2,63 mol) v CH₂CI₂(5,00 I) se během 7 hodin po kapkách při -10°C přidal roztok p-toluensulfonylchloridu (209 g, 1,10 mol) v CH₂CI₂ (5,00 I) a teplota se udržovala v rozmezí od -5°C do -10°C. Směs se během míchání přes noc zahřála na laboratorní teplotu. Směs se zakoncentrovala ve vakuu na objem 3 I a bílá pevná látka se odstranila filtrací. Roztok se pak promyl H₂O (10 x 1 I) a vysušil nad MgSO₄. Odstraněním rozpouštědla ve vakuu se získalo 286 g (97,5% výtěžek) produktu ve formě žluté krystalické pevné látky: ¹H NMR (CDCI₃) δ 0,98 - 1,27 (m, 4H), 1,54-1,66 (m, 2H), 1,81-1,93 (m, 2H), 2,34 (dt, J = 4,0 Hz, 10,7Hz, 1H), 2,42 (s, 3H), 2,62 (dt, J = 9,9 Hz, 1H), 7,29 (d, J = 8,1 Hz, 2H), 7,77 (d, J '8,3 Hz, 2H); MS (LRFAB - DTT - DTE) m/z 269 [M + H]⁺.

B. Syntéza N-(p-toluensulfonyl)-N’-(Boc)-(R,R)-1.2-diaminocyklohexanu

K míchanému roztoku N-(p-toluensulfonyl)-(R,R)-1,2-diaminocyklohexanu, připravenému v příkladu 2A (256 g, 0,955 mol) v THF (1,15 I) se přidal 1N roztok vodného NaOH (1,15 I, 1,15 mol). Pak se přidal di-t-butyldikarbonát (229 g, 1,05 mol), a výsledná směs se míchala přes noc. Vrstvy se oddělily a u vodné vrstvy se upravilo pH na 2 pomocí 1N HCI a nasyceného NaCl. Vodný roztok se pak extrahoval CH₂CI₂(2 χ 500 ml), extrakty a vrstva THF se smíchaly a vysušily nad MgSO₄. Rozpouštědlo se odstranilo ve vakuu se získala žlutá pevná látka. Surový produkt se přečistil krystalizací ze směsi THF-ether-hexan a získalo se 310 g (88,1% výtěžek) produktu ve formě bílé krystalické pevné látky: teplota tání 137°C-139°C ¹H NMR (CDCI₃) δ 1,04-1,28 (rn, 4H),

1,44 (s, 9H), 1,61-1,69 (m, 2H), 1,94-2,01 (m, 2H), 2,43 (s, 3H), 2,86 (široké s, 1H), ·· · ·

3,30 (široké d, J = 9,6 Hz, 1H), 4,37 (široké d, J = 6,7Hz, 1H), 5,48 (široké d, J = 4,6

Hz, 1H), 7,27 (d, J = 9,7 Hz, 2H), 7,.73 (d, J = 8,1 Hz, 2H); MS (LRFAB, NBA - Li) m/z

375 [M + Li]*.

C. Syntéza Boc-(R,R)-Cvs(Ts)-Gly-OMe

K míchanému roztoku N-(p-toluensulfonyl)-N’-(Boc)-(R,R)-1,2diaminocyklohexanu připravenému v příkladu 2B (310 g, 0,841 mol) v bezvodém DMF (3,11 I) se po částech při 0°C přidal NaH (37,4 g - 60% v oleji, 0,934 mol) a výsledná směs se míchala 30 minut. Během 45 minut se pak po kapkách přidal methylbromacetát (142 g, 0,925 mol) a směs se pak při míchání přes noc zahřála na laboratorní teplotu. Po 17 hodinovém míchání se rozpouštědlo odstranilo ve vakuu a zbytek se rozpustil v ethylacetátu (3 I) a H₂O (1 I). Roztok ethylacetátu se promyl nasyceným NaHCO₃ (1 I), nasyceným NaCI (500 ml) a vysušil nad MgSO₄. Rozpouštědlo se odstranilo ve vakuu a výsledný olej se rozpustil v etheru. Krystalizací po přídavku hexanu se získalo 364 g (98% výtěžek) produktu (TLC (98:2 CHCI₃-MeOH/si,ikagel/UV detekce), což ukazuje, že produkt obsahoval 5% výchozí látky) ve formě bezbarvých jehliček: teplota tání čistého vzorku 151°C-152°C ¹H NMR (CDCI₃) δ 1,11 - 1,22 (m, 4H), 1,45 (s, 9H), 1,64 -1,70 (m, 3H), 2,16-2,19 (m,1H), 2,43 (s, 3H), 3,34-3,40 (m, 2H), 3,68 (s,3H), 4,06 (ABq, J = 18,5Hz, Δν = 155 Hz, 2H), 4,77 (široké s, 1H), 7,30 (d, J = 8,3 Hz, 2H), 7,82 (d, J = 8,3 Hz, 2H); MS (LRFAB, DTT - DTE) m/z 441 [M + H]⁺.

D. Syntéza Boc-(R,R)-Cys(Ts)-Gly-OH

K míchanému roztoku nepročištěného Boc-(R,R)-Cys(Ts)-Gly-OMe připraveného v příkladu 2C (217 g, 0,492 mol) v MeOH (1,05 I) se pomalu přidal 2,5 N roztok vodného NaOH (295 ml, 0,737 mol) a výsledný roztok se míchal 2 hodiny. Rozpouštědlo se odstranilo ve vakuu a zbytek se rozpustil v H₂O (1,5 I). Roztok se přefiltroval pro odstranění malého množství pevné látky, a promyl se etherem (7x11) pro odstranění nečistot (sloučenina B). Po následném vysušení nad MgSO₄ a odstranění rozpouštědla ve vakuu zůstalo 8,37 g. pH vodné vrstvy se pak upravilo na 2 pomocí 1N HCI a produkt se extrahoval ethylacetátem (3 χ 11). Extrakty se smíchaly, promyly nasyceným NaCI (500 ml) a NaCI (500 ml) a vysušily nad MgSO₄. Rozpouštědlo se odstranilo ve vakuu a zbytkový ethylacetát se odstranil vypařením s etherem (500 ml) a pak CH₂CI₂(500 ml) a získalo se 205 g (97,6% výtěžek) produktu ve formě bílé pěny: ¹H NMR

(CDCh) δ 1,15-1,22 (m, 4H), 1,48 (s, 9H), 1,55-1,68 (m, 3H), 2,12-2,15 (m, 1H), 2,43 (s,

3H), 3,41 - 3,49 (m, 2H), 3,97 (ABq, J = 17,9Hz, Δν = 69,9 Hz, 2H), 4,79 (široké s, 1H),

7,31 (d, J = 8,1 Hz, 2H), 7,77 (d, J = 8,3 Hz, 2H), 8,81 (široké s, 1H); MS (LRFAB, NBA

- Li) m/z 433 [M + Li]⁺

E. Syntéza N-(p-toluensulfonyl)-(S,S)-1,2-diaminocyklohexanu

K míchanému roztoku (S,S)-1,2-diaminocyklohexanu (300 g, 2,63 mol) v CH2CI2 (5,00 I) se po kapkách během 8 hodin při -10°C přidal roztok p-toluensulfonylchloridu (209 g, 1,10 mol) v CH₂CI₂ (5,00 I) a teplota se udržovala při -5°C až -10°C. Směs se pak během míchání přes noc zahřála na laboratorní teplotu. Směs se zakoncentrovala ve vakuu na objem 3 I a bílá pevná látka se odstranila filtrací. Roztok se pak promyl H₂O (10 x 11) a vysušil nad MgSO₄. Odstraněním rozpouštědla ve vakuu se získalo 289 g (98,3% výtěžek) produktu ve formě žluté krystalické pevné látky:¹H NMR (CDCI₃) δ 0,98 - 1,27 (m, 4H), 1,55 - 1,66 (m, 2H), 1,81-1,94 (m, 2H), 2,32 (dt, J = 4,0, 10,9Hz, 1H), 2,42 (s, 3H), 2,61 (dt, J = 4,0, 9,9 Hz, 1H), 7,30 (d, J = 7,9Hz, 2H), 7,77 (d, J = 8,3 Hz, 2H); MS (LRFAB, GT - HCl) m/z 269 [M + Hf

F. Syntéza N-(p-toluensulfonvl)-N’-(Boc)-(S,S)-1.2-diaminocyklohexanu

K míchanému roztoku N-(p-toluensulfonyl-(S,S)-1,2-diaminocyklohexanu připravenému v příkladu 2E (289 g, 1,08 mol) v THF (1,29 I) se přidal 1N roztok vodného NaOH (1,29 1,1,29 mol). Pak se přidal di-t-butyldikarbonát (258 g, 1,18 mol) a výsledná směs se míchala přes noc. Pevná látka se odstranila filtrací a promyla THF. Vrstva THF se oddělila a u vodné vrstvy se upravilo pH na 2 pomocí 1N HCl nasycenou NaCI. Vodný roztok se pak extrahoval CH2CI2 (2 x 500 ml), extrakty se smíchaly s vrstvou THF, promyly nasyceným NaCI (500 ml) a vysušily MgSO₄. Rozpouštědlo se odstranilo ve vakuu a získala se žlutá suspenze. Krystalizací s přídavkem etheru se získalo 364 g (91,9% výtěžek) produktu ve formě bezbarvých jehliček: teplota tání 137°C-139°C; ¹H NMR (CDCI3) δ 1,06 - 1,31 (m, 4H), 1,44 (s, 9H), 1,60 -1,69 (m, 2H), 1,95-1,99 (m, 2H),

2,42 (s, 3H), 2,86 (široké s, 1H), 3,30 (široké d, J = 2,6 Hz, 1H), 4,41 (široké d, J = 7,3Hz, 1H), 5,54 (široké d, J = 5,4 Hz, 1H), 7,28 (d, J = 8,1 Hz, 2H), 7, 73 (d, J = 8,3 Hz, 2H); MS (LRFAB, NBA - HCl) m/z 369 [M + Hf.

G. Syntéza Boc-(S,S)-Cvs(Ts)-Gly-OMe

0

K míchanému roztoku N-(p-toluensulfonyl-N’-(Boc)-(S,S)-1,2diaminocyklohexanu připravenému v příkladu 2F (364 g, 0,989 mol) v bezvodém DMF (3,66 I) se při 0°C po částech přidal NaH (47,4 g - 60% v oleji, 1,19 mol) a výsledná směs se míchala 1,5 hodiny. Směs se zahřála na laboratorní teplotu a míchala dalších 30 minut a pak se zchladila na 0°C. Po kapkách se pak během 30 minut přidal bromacetát (189 g, 1,24 mol) a směs se během míchání přes noc zahřála na laboratorní teplotu. Po 17 hodinovém míchání se rozpouštědlo odstranilo za vakua a zbytek se rozpustil ve směsi ethylacetát (3 I) a H₂O (1 I). Vrstvy se oddělily a roztok ethylacetátu se promyl nasyceným NaHCO₃ (1 I), H₂O (1 I), nasyceným NaCl (2 χ 500 ml), a vysušil nad MgSO₄. Rozpouštědlo se odstranilo ve vakuu a výsledný olej se rozpustil v etheru. Krystalizací po přídavku hexanu se získalo 290 g surového produktu ve formě žlutých jehliček. Z filtrátu se získalo dalších 180 g ve formě oleje. TLC (98:2 CHCI₃ MeOH/silikagel/UV detekce) ukázala, že pevná látka i olej obsahovali výchozí látku: ¹H NMR (CDCI₃) δ 1,06 - 1,29 (m, 4H), 1,44 (s, 9H), 1,58 - 1,66 (m, 3H), 2,17 - 2,19 (m, 1H), 2,43 (s, 3H), 3,28 - 3,43 (m, 2H), 3,68 (s, 3H), 4,25 (Abq, J = 18,5 Hz, Δ v = 115 Hz, 2H), 4,76 (široké r, 1H), 7,31 (d, J = 8,3 Hz, 2H), 7,83 (d, J = 8,3 Hz, 2H); MS (LRFAB, NBA - Li) m/z 447 [M + H]⁺.

H. Syntéza Boc-(S.S)-Cvs(Ts)-Glv-OH

K míchanému roztoku nepřečistěného Boc-(S,S)-Cys(Ts)-Gly-OMe připraveného v příkladu 2G (197 g, 0,447 mol) v MeOH (925 ml) se pomalu přidal 2,5 N roztok vodného NaOH (268 ml, 0,670 mol) a výsledný roztok se míchal 2 hodiny. Rozpouštědlo se odstranilo ve vakuu a zbytek se rozpustil v H₂O (1 I). Roztok se promyl etherem (4 χ 1 I) pro odstranění nečistot (sloučenina 2F) a po vysušení promytého roztoku nad MgSO₄ a odstranění rozpouštědla ve vakuu zůstalo 14,8 g. pH vodného roztoku se pak upravilo na 2 pomocí 1N HC! a produkt se extrahoval ethylacetátem (3x1 I). Extrakty se smíchaly, promyly nasyceným NaCl a vysušily nad MgSO₄. Rozpouštědlo se odstranilo za vakua a získalo se 171 g (89,7% výtěžek) produktu ve formě oleje, který při stání krystalizoval. ¹H NMR (CDCI₃) δ 1,10 - 1,22 (m, 4H), 1,45 (s, 9H), 1,55 - 1,68 (m, 3H), 2,13-2,16 (m, 1H), 2,43 (s, 3H), 3,39 - 3,43 (m, 2H), 4.00 (Abq, J = 18,1 Hz, Δ v = 80,4 Hz, 2H), 4,82 (široké s, 1H), 7,31 (d, J = 8,3 Hz, 2H), 7,75 (d, J = 8,3 Hz, 2H), 9,28 (široké s, 1H); MS (LRFAB, NBA - Li) m/z 433 [M + Lif.

• ·

I. Syntéza Boc-(S,S)-Cvs(Ts)-Gly-Gly-OEt

K míchanému roztoku Boc-(S,S)-Cys(Ts)-Gly-OH připravenému v příkladu 2H (26,7 g, 62,5 mmol) v odplyněném bezvodém DMF (690 ml) se přidal HOBT (10,1 g, 75,0 mmol) a EDC-HCI (14,4 g, 75,0 mmol). Výsledný roztok se míchal 30 minut, pak se přidal hydrochlorid ethylesteru glycinu (9,60 g, 68,8 mmol) a pH se upravilo na 8 pomocí TEA. Roztok se míchal 2,75 dnů a rozpouštědlo se pak odstranilo ve vakuu. Zbytek se rozpustil ve směsi ethylacetátu (1 I) a H₂O (1 I) a vrstvy se oddělily. Vodná vrstva se extrahovala ethylacetatem (1 I) a extrakty se smíchaly. Roztok ethylacetátu se promyl 0,1 N HCI (1 I), nasyceným NaHCO₃ (1 I) a nasyceným NaCl (500 ml) a vysušil nad MgSO₄. Rozpouštědlo se odstranilo ve vakuu a získalo se 30,2 g (94,4% výtěžek) produktu ve formě bílé pěny. ¹H NMR (CDCI₃) δ 1,19 -1,23 (m, 3H), 1,28 (t, J = 7,05 Hz, 3H), 1,42 (s, 11H), 1,63-1,71 (m, 2H), 2,16 - 2,18 (m, 1H), 2,43 (s, 3H), 3,50-3,57 (m, 2H), 3,83 (Abq, J = 17,7 Hz, Δ v = 35,7 Hz, 2H), 4,20 (q, J = 7,3 Hz, 2H), 4,88 (široké s, 1H), 7,31 (d, J = 8,3 Hz, 2H); MS (LRFAB, NBA - HCI) m/z 512 [M + Hf.

J. Syntéza TFA soli (S,S)-Cys(Ts)-Glv-Gly-OEt

K míchanému roztoku Boc-(S,S)-Cys(Ts)-Gly-Gly-OEt připravenému v příkladu 2I (30,1 g, 58,8 mmol) v CH₂CI₂ (265 ml) se přidala TFA (63 ml) a výsledný roztok se míchal 30 minut. Rozpouštědlo se odstranilo ve vakuu a zbytek TFA se odpařil s CH₂CI₂ (2 x 1 I) a etherem (1 I). Olej se pak smíchal s etherem (2x11) a ether se dekantoval. Výsledná pěna se vysušila ve vakuu a získalo se 33,7 g (předpokládaný kvantitativní výtěžek) produktu ve formě hnědožlutého prášku: ¹H NMR (CDCI₃) δ 0,96 1,23 (m, 4H), 1,25 (t, J = 7,3 Hz, 3H), 1,51-1,66 (m, 3H), 2,12 - 2,26 (m, 1H), 2,41 (s, 3H), 2,98 - 3,10 (široké s, 1H), 3,67 - 3,71 (m, 1H), 4,04 (Abq, Δν = 154Hz, 2H), 4,04 (d, J = 4,4 Hz, 2H), 4,17 (q, J = 7,3 Hz, 2H), 7, 29 (d, J = 8,3 Hz, 2H), 7,70 (d, J = 8,3 Hz, 2H), 8,04 (široké s, 1H), 8,14 (široké s, 3H); MS (LRFAB, NBA - HCI) m/z 412 [M + Hf.

K. Syntéza Boc-(R.R)-Cvs(Ts)-Glv(S.S)-Cys(ts)-Gly-Gly-OEt

K míchanému roztoku Boc-(S,S)-Cys(Ts)-Gly-OH připravenému v příkladu 2D (25,1 g, 58,8 mmol) v odplyněném bezvodém DMF (650 ml) se přidal HOBT (9,54 g,

70,6 mmol) a EDC-HCI (13,5 g, 70,6 mmol). Výsledný roztok se míchal 30 minut, přidala se TFA sůl (S,S)-Cys(Ts)-Gly-Gly-Gly-OEt připravená v příkladu 1J (33,6 g, 58,8 • ·· ·

mmol) a pH se upravilo na 8 pomocí TEA. Roztok se míchal 2,75 dnů a rozpouštědlo se pak odstranilo ve vakuu. Zbytek se rozpustil ve směsi ethylacetátu (1 I) a H₂O (1 I) sa vrstvy se oddělily. Roztok ethylacetátu se promyl 0,1 N HCI (2x1 I), nasyceným NaHCO₃ (2x1 I), nasyceným NaCl (500 ml) a vysysušil se nad MgSO₄. Rozpouštědlo se odstranilo ve vakuu a získalo se 47,5 g (98,4% výtěžek) produktu ve formě bílé pěny: ¹H NMR (CDCI₃) δ 1,12 -1,83 (m, 26H), 2,21-2,24 (m, 2H), 2,42 (s, 3H), 3,36 - 3,51 (široké s, 2H), 3,68 -.3,96 (m, 6H), 4,00 (d, J = 5,4 Hz, 2H), 4,19 (q, J = 7,1 Hz, 2H),

4,72 (široké s, 1H), 6,78 (široké s, 1H), 7,31 (d, J = 8,1 Hz, 4H), 7,46 (široké s, 1H),

7,79 (m, 4H); MS (LRFAB, NBA - HCI) m/z 820 [M + H]⁺.

L. Syntéza Boc-(R.R)-Cys(Ts)-Gly(S,S)-Cys(ts)-Glv-Gly-OH

K míchanému roztoku Boc-(R,R)-Cys(Ts)-Gly-(S,S)-Cys (Ts)-Gly-Gly-OEt při-, pravenému v příkladu 2K (47,4 g, 57,8 mmol) v MeOH (240 ml) se přidal 2,5 N roztok vodného NaOH (34,7 ml, 86,7 mmol) a výsledný roztok se míchal 2 hodiny. Rozpouštědlo se pak odstranilo ve vakuu a zbytek se rozpustil v H₂O (1 I). Vodný roztok se promyl etherem (2 x 1 I) a pH se upravilo na 2 pomocí 1N HCI. Roztok se pak nasytil NaCl a extrahoval ethylacetátem (3 χ 1 I). Smíchané extrakty se vysysušily nad MgSO₄a rozpouštědlo se odstranilo ve vakuu. Zbytek ethylacetátu se odstranil odpařením s CH₂CI₂, výsledná pěna se vysušila ve vakuu a získalo se 45,7 g (99,7% výtěžek) produktu ve formě hnědožlutého prášku: ¹H NMR (CDCI₃) δ 1,16 - 1,75 (m, 23H), 2,13 2,17 (m, 2H), 2,41 (s, 3H), 2,42 (s, 3H), 3,49 - 4,16 (m, 10H), 4,53 (široké s, 1H), 7,01 (široké s, 1H), 7,30 (d, J = 8,1 Hz, 4H), 7,40 (široké s, 1H), 7,79 (d, J = 8,1 Hz, 2H),

7,86 (d, J = 7,7 Hz, 2H), 10,40 (široké s, 1H); MS (LRFAB, NBA - HCI) m/z 792 [M + Hf.

M. Syntéza TFA soli (R,R)-Cys (Ts)-Gly (Š S)-Cvs (Ts)-Gly-Glv-OH

K míchanému roztoku Boc-(R,R)-Cys(Ts)-Gly-(S,S)-Cys (Ts)-Gly-Gly-OH připravenému v příkladu 2L (45,5 g, 57,5 mmol) v CH₂CI₂ (260 ml) se přidal TFA (60 ml). Výsledný roztok se míchal 30 minut a rozpouštědlo se odstranilo ve vakuu. Zbytek TFA se odstranil odpařením s CH2CI2 (3x1 I), výsledná pěna se promíchala s etherem (1 I, 2 χ 750 ml), ether se pokaždé dekantoval. Po vysušení ve vakuu se získalo 47,4 (100% výtěžek) produktu ve formě ne zcela bílého prášku: ¹H NMR (CDCI₃) δ 1,05 - 1,31 (m, 9H), 1,48 - 1,63 (m, 5H), 2,11 - 2,21 (m, 2H), 2,40 (s, 3H), 2,42 (s, 3H), 3,25 (široké s, ·

·..··..· ..·*

Η). 3,60 - 3,80 (m, 3Η), 3,83 - 4,19 (m, 6H), 6,94 (široké s, 1H), 7,31 (m, 4H), 7,69 (m, 4H), 7,83 (široké s, 3H), 13,17 (široké s, 2H); MS (LRFAB, DTT - DTE) m/z 692 [M + H]⁺.

N. Syntéza Cvclo-f(R.R)-Cvs(Ts)-Glv(S,S)-Cys(ts)-Glv-Glv1

K míchanému roztoku TFA soli (R,R)-Cys (Ts)-Gly(S,S)-Cys (Ts)-Gly-Gly-OH připravenému v příkladu 2M (32,2 g, 40,0 mmol) v odplyněném bezvodém DMF (10,0 I) se při -78°C přidal DPPA (13,4 g, 48,8 mmol). pH roztoku se upravilo na 8 pomocí TEA a roztok se nechal stát 6 hodin při

-78°C. pH roztoku se upravilo na 8 pomocí TEA a roztok se zahříval 24 hodin na -45°C. pH se upravilo jako v předchozím případě a roztok se zahříval 24 hodin na -40°C. pH roztoku se upravilo jako v předchozím případě a roztok se zahříval 24 hodin na -20°C. pH se upravilo jako v předchozím případě a roztok se zahříval 24 hodin na 2°C. pH pokleslo jen mírně. pH roztoku se upravilo jako v předchozím případě, a roztok se nechal stát dalších 24 hodin, během této doby se pH nezměnilo. Roztok se ekvivalentně rozdělil do šesti 41 nádob a do každé se přidala H₂O (1,1 I). Pak se k roztoku přidalo celkem 5,00 kg kuliček smíšeného lože iontoměničové pryskyřice (rozdělených ekvivalentně do 6 nádob) a směs se míchala 6 hodin. Pryskyřice se pak přefiltrovala a promyla DMF. Rozpouštědlo se odstranilo ve vakuu, pevný zbytek se rozpustil v MeOH (100 ml) a filtrací se odstranily poslední zbytky pevné látky. Roztok se pak zakoncentroval ve vakuu na objem 25 ml a pravidelně se přidával ether, až se krystalizací získalo

22,2 g ( 82,5% výtěžek) produktu ve formě bezbarvých jehliček; teplota tání 190°C 200°C; ¹H NMR (CDCI₃) δ 0,87- 2,13 (m, 16H), 2,41 (S, 3H), 2,45 (s, 3H), 3,56 - 3,97 (m, 10H), 6,66 (široké s, 1H), 7,18 (široké s, 1H), 7,34 (d, J = 8,1Hz, 4H), 7,65 (široké s, 1H), 7,71 (d, J = 7,3Hz, 2H), 7,89 (d, J = 7,3 Hz, 2H); MS (LRFAB, NBA - Li) m/z 680 [M + Lif.

O, _Syntéza_2,3-(R,R)-8,9-(S,S)-bis-cyklohexan-1,4,7,10,13pentaazacyklopentadekanu

K míchanému roztoku cyclo-[(R,R)-Cys(Ts)-Gly(S,S)-Cys (Ts)-Gly-Gly] připravenému v příkladu 2N (19,4 g, 28,8 mmol) v bezvodém THF (475 ml) se po kapkách během 30 minut přidal roztok 1,0 LiAIH₄ v THF (345 ml, 345 mmol). Žlutý homogenní roztok se refluxoval 20 hodin (během této doby se stal heterogenní) a pak se zchladil ·· ·· • · · · • » na 0°C. Reakce se zastavila přídavkem 10% roztoku Na₂SO4 po kapkách (50 ml) při současném chlazení v ledové lázni. Pevná látka se odstranila filtrací přes argonový filtr, THF se odstranil ve vakuu a získal se olej, ktetrý rychle zkrystalizoval. Pevná látka se pak refluxovala se směsí THF (1 I), směs se přefiltrovala a rozpouštědlo se odstranilo ve vakuu jako v předchozím případě. Pevné látky se pak refluxovaly se směsí THF(1 I) a MeOH ( 500 ml) 1 hodinu a zpracovaly jako v předchozím případě. Zbytky z extrakce se rozpusytily v bezvodém THF, smíchaly a pevné látky se odstranily filtrací. Rozpouštědlo se odstranilo ve vakuu a žlutá pěna se vysušila azeotropní destilací H₂O s toluenem (1,75 I) ve vakuu při 90°C. Pevná látka se pak refluxovala s hexanem (1 I) 30 minut, horký roztok se nalil do zvážené nádoby, rozpouštědlo se odstranilo ve vakuu a získalo se 6,1 g oleje, který během stání krystalizoval. Zbývající pevná látka se pak refluxovala s hexanem jako v předchozím případě a získalo se 4,1 g oleje, který během stání krystalizoval. Pevná látka se pak rozpustila v přidaném MeOH a toluenu (1 I). Rozpouštědlo se odstranilo ve vakuu a zbývající H₂O se odstaranila azeotropní destilací s toluenem (1 I) a pak s hexanem (3x1 I). Výsledný jemný prášek se refluxoval 2 hodiny s hexanem (1 I) v argonové atmosféře a přefiltroval do zvážené nádoby. Rozpouštědlo se odstranilo ve vakuu a získalo se 1, 7 g oleje, který během stání krystalizoval. Krystalické zbytky ze tří extraktů se rozpustily v hexanu s smíchaly. Malé množství zákalu se odstranilo filtrací, roztok se zakoncentroval, a získalo se 5,3 g (57% výtěžek) produktu ve formě žluté krystalické pevné látky. Rekrystalízací z acetonitrilu se získalo 4,47 g (48,0% výtěžek) bezbarvé krystalické pevné látky: teplota tání 107°C - 108°C; ¹H NMR (CDCI₃) δ 0,95 -1,01 (m, 4H), 1,19 -1,24 (m, 4H), 1,70 - 1,73 (m, 4H),

I, 97 (široké s, 5H), 2,08 - 2,14 (m, 8H), 2,49 - 2,68 (m, 6H), 2,74 - 2,80 (m, 2H), 2,85 2,90 (m, 2H), 2,94 - 2,99 (m, 2H); MS (LRFAB, NBA) m/z 324 [M + Hf; Analýza vypočtená pro Ci₈H₃₇N₅: C, 66,83; H, 11,53; N, 21,65. Nalezené hodnoty: C, 66,80; H,

II, 44; N, 21 71.

P._Syntéza dichlor f(2.3-(R,R)-8,9-(S.S)-bis-cvklohexan-1,4,7,10,13pentaazacvklopentadekanlchloridu železitého

V inertní atmosféře v suchém boxu se rozpustilo 199 mg (0,615 mmol) ligandu

2,3-(R,R)-8,9-(S,S)-bis-cyklohexan-1,4,7,10,13-tetraazacyklopentadekanu v 10 ml bezvodého roztoku methanolu obsahujícího 0,615 mmol (100 mg) bezvodého FeCI₃. Výsledný tmavý, žluto-oranžový roztok se ·· ···· ·· ·· ·· ft · · 9 9 · · · · · ·

9 9 9 9 9 9 99

ΑΊ 9 9 9 9 9 9 9 999 9 9 “¹ ···· ·· · · ·

99 999 9999 99 99 při míchání 1,5 hodiny refluxoval, pak se zchadil na laboratorní teplotu a přefiltroval. Filtrát se zredukoval na suchý zbytek, který se rozpustil v 25 cm³ horkého absolutního ethanolu, a pak se přefiltroval přes celit. Roztok ethanolu se zradukovat na objem 10 ml. K roztoku horkého ethanolu se přidal diethylether až do zakalení. Roztok se pak nechal vklidu stát 16 hodin, zatímco se vytvořil žlutý mikrokrystalický precipitát. Žlutá pevná látka se vyizolovala filtrací, promyla diethyletherem a vysušila ve vakuu přes noc. Výtěžek po vysušení byl 235 mg ( 0,486 mmol), odpovídající 79% teoretického výtěžku. Analýza vypočtená pro C_1oH2oN₅FeCI₃ . CH₃CH₂ OH: C, 44,97; H, 8,07; N, 13,01; Cl, 19,88. Hmotnostní spektrum (FAB, NBA matrix): m/z 449 [[Fe(L)CI+ef a skutečná hodnota m/z 431 [[Fe(L)CI₂ ]⁺.

A. Syntéza N,N’-bis(chloracetyl) 1R, 2R-diaminocyklohexanu

1R, 2R-(-)-diaminocyklohexan (6,98 g, 61,13 mmol) se rozpustil v 75 ml CHCI₃ neobsahujícího alkohol v 4 hrdlové 2000 ml nádobě s kulatým dnem, a pak se přidalo 37 ml H₂O v atmosféře argonu. K reakční nádobě se připojily dvě dělící nálevky Normag, naplnily se zvlášť chloracetylchloridem (15 ml, 188,3 mmol) v 75 ml CHCI₃ neobsahujícího alkohol (88 ml) a K₂CO₃ (24,1 g, 174,4 mmol) v 918 ml H₂O. Dovnitř reakční nádoby se umístil teploměr. Po zchlazení dvoufázové směsi v reakění nádobě na 0°C v ledové lázni se zahájil přídavek roztoků z dělících nádobek tak, aby přídavek každého z roztoků byl během 1 hodiny a 20 minut přibližně stejný. Pro udržení teploty v rozmezí od 3°C do -3°C se během přidávání použila ledová lázeň obsahující sůl. Vrstva ledu vzniklá uvnitř reakční nádoby nebránila míchání. Na konci přídavku se nádoba odstranila z ledové lázně a míchala se 2 hodiny a 20 minut. Nižší chloroformová vrstva obsahovala při teplotě ledové lázně značné množství jemné pevné látky, která se rozpustila při zahřátí reakce. Reakční směs se umístila do dělící nálevky, přidal se chloroform, a vrstvy se oddělily. Vodná vrstva se extrahovala s dalším množtvím CHCI₃, smíchané chloroformové vrstvy se promyly vodou, pak nasyceným NaCI, vysušily (Na₂SO₄) a vznikla hnědobílá pevná látka.Tato pevná látka se míchala přes noc s přibližně 450 ml etheru, pak se přefiltrovala, většina zbarvení se ztratila v etheru za vzniku 13,68 g,

51,60 mmol béžové pevné látky s 84,4% výtěžkem. ¹H NMR (CDCI3,400 MHz) d 1,34 (m, 4H), 1,80 (m, 2H), 2,08 (m, 2H), 3,74 (m, 2H), 3,99 (Abq, J = 15,1 Hz, dn = 8,2Hz, 4H), 7,26 (široké s, 2H); ¹³C NMR (CDCI3, 100 Mhz) d 24,59, 32,07, 42,45, 53,94, •η ···· «· · ·» · · ·<··· • · * · ····· An · · «·· *··♦··· *+Ζ ···· · · · · · • · ·· ··· «··« ·* ··

166,65; MS (FAB, NBA-LiCI matrix): m/z (relativní intenzita) 273 (100) [M + Li]*, 275 (71) [M + Li]*.

B. Syntéza N-p-toluensulfonylglvcvl-1R, 2R-diaminocvklohexanu

1R, 2R-diaminocyklohexan (10,0 g, 87,57 mmol) se rozpustil v suchém DMF (150 ml) v atmosféře argonu a zchladil na -10°C. V suchém DMF (150 ml) zchlazeném na -10°C se postupně rozpustil N-p-toluensulfonylglycin (10,04 g, 43,62 mmol), 1hydroxybenzotriazol (6,75 g, 44,08 mmol) a 1-ethyl-3-(3dimethylaminopropyl)karbodiimid hydrochlorid (8,45 g, 44,05 mmol) a roztok se zchladil na -10°C. Poslední uvedený roztok se přidal k roztoku diaminocyklohexanu pomocí hadičky při -10°C. Po 2 hodinách se při této teplotě přidala voda (8 ml), reakce se během hodiny zahřála na 0°C a pak během další půl hodiny na laboratorní teplotu. Rozpouštědlo se odsranilo na rotační odparce za sníženého tlaku. Ke zbytku se přidala po malých částech během míchání voda (150 ml), roztok se zahřál na 40°C - 42°Č, po 25 minutách se tento roztok přefiltroval. Bílý precipitát měl dvakrát větší hmotnost než adukt (5,55 g). Přesně s 68 ml filtrátu se opakovaně provedla extrakce dichlormethanem (9 χ 50 ml). Smíchaná organická fáze se vysušila (síran sodný), přefiltrovala a rozpouštědlo se odstranilo. Výsledná bílá pevná látka, která obsahovala zbytek DMF, se rozpustila v dichlormethanu (30 ml) a k míchanému roztoku se po kapkách přidal roztok směsi 9:1 ether: hexan (250-300 ml) za okamžitého vzniku precipitátu, který se míchal přes noc, a pak přefiltroval. Tento postup se opakoval, přičemž míchání probíhalo tři hodiny místo přes noc. Po vysušení za vakua se získal bílý produkt, 2,36 g, 7,25 mmol, což je ekvivalentní 36,7% výtěžku celkové reakce. ¹H NMR (CDCh, 400 MHz) d 1,10 - 1,34 (m, 4H), 1,70 (d, J = 9,7 Hz, 2H), 1,81 -1,97 (2m, 2H), 2,41 (s, 3H), 2,51 (td, J = 10,2, 3,8Hz, 1H), 3,53 (m+ABq, J = 16,9 Hz, dn = 51,6 Hz, 3H), 3,69 (široké s, 3H), 6,84 (d, J = 9,1 Hz, 1H), 7,30 (d, J = 8,3 Hz, 2H), 7,73 (d, J = 8,3 Hz, 2H); ¹³C NMR (CDCh, 100 Mhz) d 21,48, 24,87, 24,97, 32,08, 35,16, 46,09, 54,85, 55,78, 127,15, 129,85, 136,02, 143,84, 168,69; MS (GTHCI): m/z 326 (100) [M + Hf.

C. Syntéza 2R, 3R,8R,9R-bis(cvklohexan)-13-p-toluensulfonvl-1,4,7,10,13pentaazacyklopentadekan-6,11,15-trionu

V 1 I nádobě se smíchal N-p-toluensulfonylglycyl-1R,2R-diaminocyklohexan (1,11 g, 3,42 mmol) a N,N’-bis(chloracetyl)-1R,2R-diaminocyklohexan (0,913 g, 3,42 mmol) a přidal se suchý N,N’-dimethylacetamid (650 ml). Nádoba se upevnila. Po 10 minutách se přímo do homogenní směsi přidal hydrid sodný. Reakční nádoba se umístila do 70°C olejové lázně. Po dosažení vnitřní teploty 45°C - 50°C nastal konstantní vývoj plynu. Teplota olejové lázně se ustálila na 65°C z odchylkou v rozmezí 60°C až 75°C. Reakční směs se přes noc stala homogenní. Po 17 hodinovém zahřívání se rekční nádoba odstranila z lázně a zchladila se. Rozpouštědlo se odstranilo za sníženého tlaku a za vakua se získal nažloutlý olej. Zbytek zreagovat s dichlormethanem (300 ml), promyl se vodou (40 ml) a dvakrát nasyceným chloridem sodným (pokaždé 40 ml). Po smíchání se vodné vrstvy opět promyly dichlormethanem (100 ml). Smíchané organické vrstvy se vysušily nad síranem sodným, přefiltrovaly a za vakua se získalo

2,14 g viskózního žlutého oleje. Tento zbytek se podrobil chromatografií za použití směsi 0,5% NH₄OH/ 9% CH₃OH/ 90,5% CH2CI2. Podle TLC na silikagelu za použití stejného systému, Rf = 0,25. Frakce obsahující správnou skvrnu se smíchaly a odpařily na ne zcela bílou pevnou látku, 0,89 g, 1,71 mmol, 50,1% výtěžek. ¹H NMR (CDCI3, 300 MHz) d 0,92-2,1 (několik m, 15H), 2,27 (m, 1H), 2,41 (s, 3H), 3,10 (Abq, J = 16 Hz, dn = 34,2 Hz, 2H), 3,39 (m, 1H), 3,58 (m, 3H), 3,83 (m, 1H), 4,08 (d, J = 17,6 Hz, 1H), 4,39 (d, J = 17,4 Hz, 1H), 7,30 (m, 3H), 7,44 (d, J = 5,9 Hz, 1H), 7,76 (d, J = 7,8 Hz, 2H), 8,05 (d, J = 8,4 Hz, 1H); ¹³C NMR (CDCi3, 100 MHz) d 21,39, 24,20, 24,69, 24,87 (dvojitá, intenzita), 31,49, 31,54, 31,58, 32,43, 47,01, 52,19, 52,25, 52,49, 52,97, 55,63, 58,36, 127,65, 129,67, 135,28, 143,97, 167,52, 170,04, 172,84; MS (FAB, NBALiCI matrix): m/z (relativní intenzita) 526 (100) [M + Li]⁺, 370 (29) [M⁺ Li -Ts]⁺.

D. Syntéza 2R, 3R.8R,9R-bis(cvklohexan)-1,4,7,10,13-pentaazacyklopentadekanu

2R, 3R,8R,9R-bis(cyklohexan)-13-p-toluensulfonyl-1,4,7,10,13pentaazacyklopentadekan-6,11,15-trion (4,072 g, 7,84 mmol) se přenesl v argonové atmosféře do 1 litrové nádoby a přidal se suchý 1,2-dimethoxyethan (DME, 220 ml). Prášek se rozptýlil, rozpuštění se napomohlo pomocí špachtle, a při míchání ve zchlazené vodní lázni se během 10 minut po částech přidal hydrid hlinito-lithný (0,5 M v DME, 140 ml, 70 mmol). Roztok se nejprve zakalil a obsahoval nerozpuštěné kousky sloučeniny. Po 70 ml přídavku se roztok zhomogenmizoval až na několik zbývajících nerozpuštěných částic, které se rozpustily s vývojem plynu. Během několika minut se roztok začal zahřívat a postupně zežloutl a stal se heterogenní. Reakční směs se refluxovala přes noc. Po 16,5 hodinách se reflux ukončil. Reakční směs se zchladila ve stu• ·

děné vodní lázni a pak v lázni o teplotě -18°C lázni. Po malých částech se opatrně v 5 až 10 minutových periodách přidala voda (2,2 ml), pak rychle 15% NaOH (2,2 ml) a pak voda (6,6 ml). Míchání pokračovalo další 2 hodiny v ledové lázni. Přidal se tetrahydrofuran (THF, 210 ml) a míchání pokračovalo přibližně jednu hodinu. Hustá bílá suspenze se nechala usadit a přefiltrovala pomocí filtračního zařízení (filtrační papír č.1 Whatman). Filtrát se vymyl. Bílý pevný zbytek se míchal s THF (150 ml) a přefiltroval do prvního odděleného filtrátu. Rozpouštědlo se odstranilo za sníženého tlaku a nakonec ještě za vakua. Výsledná žlutobílá pevná látka se extrahovala s horkým hexanem (nejprve 70 ml, 65°C; pak s dalšími 15 ml) a přefiltroval pomocí filtračního zařízení (filtrační papír č.50 Whatman) a rozpouštědlo se odstranilo za sníženéího tlaku. Tento surový produkt o hmotnosti 1,5 g se rozpustil v horkém (>70°C) suchém acetonitrilu (přibližně 60 ml), přefiltroval (filtrační zařízení, filtrační papír č.50 Whatman), zakoncentroval na více než polovinu, opět zahřál pro zozpuštění veškeré bílé pevné látky, a pak pomalu zchladil na laboratorní teplotu. Získaly se bílé krystaly, 0,923 g, 2,85 mmol, 36,4% výtěžek. ¹H NMR (C₆D₆,300 MHz) d 0,75 - 1,21 (několik m, 8H), 1,23 - 2,19 (několik m, 17H), 2,36 - 2,61 (několi Η, 6H), 2,61 - 2,73 (m, 2H), 2,74 - 2,85 (m, 2H),

2,90 (d, J = 7,5 Hz, 2H); ¹³C NMR (C₆D₆,75 MHz) d 25,48, 25,56, 32,41, 32,48, 46,50, 47,82, 49,56, 61,86, 62,88; Analýza vypočtená pro C₁₈H₃₇N₅: C, 66,83; H, 11,54; N, 21,65. Nalezené hodnoty: C, 66,66; H, 11,46; N, 21,78.

Příklad 3

E. Syntéza rdichlor(2,3-(R.R)-8.9-(R.R)-bis-cyklohexan-1.4,7.10,13 pentaazacyklopentadekan)lhexa fluorfosfátu železitého

V inertní atmosféře v suchém boxu se rozpustilo 97 mg (0,30 mmol) ligandú, 2R,3R,8R,9R-bis(cyklohexan)-1,4,7,10,13-tetraazacyklopentadekanu v 15 ml bezvodého methanolu. K tomuto roztoku se za důkladného míchání přidaly 2 ml roztoku pyridinu obsahující 0,30 mmol (48 mg) bezvodého FeCI₃. Výsledný tmavě hnědý roztok se při míchání tři hodiny refluxoval, pak se zchladil na laboratorní teplotu a přefiltroval. K filtrátu se přidalo 20 ml čistého methanolového roztoku NH₄PF₆ (120 mg). Tento roztok se odpařil dosucha a k suchému zbytku se přidaly 2 ml bezvodého acetonitrilu. Tato směs se důkladně míchala 2 hodiny, pak se přefiltrovala, a výsledný žlutý filtrát se odpařil dosucha. Výsledná žlutá pevná látka se rozpustila v ethanolu a přefiltrovala.

• ·

Roztok se odpařil dosucha a výsledná žlutá pevná látka se nashromáždila filtrací po promytí diethyletherem. Žlutý precipitát se vysušil ve vakuu přes noc. Výtěžek po vysušení činil 75 mg odpovídající 42% teoretickému výtěžku. Analýza vypočtená pro

CieHayNsChFeFeP: C, 36,35; H, 6,28; N, 11,78. Nalezené hodnoty: C, 36,37; H, 6,34;

N, 11,58.

Příklad 4

A. Syntéza Boc-DAIa-Ala-OEt

K roztoku Boc-DAIa (25,0 g, 132,1 mmol) v DMF (1450 ml) se přidal HOBT . H₂O (19,8 g, 129,3 mmol) a EDC . HCI (28,0 g, 146,3 mmol) a výsledný roztok se míchal 30 minut při laboratorní teplotě. K tomuto roztoku se přidal hydrochlorid ethylesteru alaninu (20,3 g, 132,1 mmol) a TEA (20,4 ml, 146,3 mmol) a reakce se míchala 3 dny (pro zabezpečení úplného dokončení reakce). DMF se odpařil a zbytek se rozdělil mezi vodu (500 ml) a ethylacetát (500 ml). Roztok ethylacetátu se promyl 1N NaHSO₄ (250 ml), vodou (250 ml), nasyceným NaHCO₃ (250 ml), solankou (250 ml) a vysušil nad Na₂SO₄. Filtrací a zakoneentrováním se získalo 31,7 g (83% výtěžrek) požadovaného dipeptidu ve formě bílé pěny: ¹H NMR (DMSO-d₆) δ 1,14 (d, J = 7,4 Hz, 3H), 1,16 (t, J = 7,4 Hz, 3H), 1,16 (t, J = 7,4 Hz, 3H), 1,24 (d, J = 7,0 Hz, 3H), 1,36 (s, 9H), 3,96 - 4,09 (m, 3H), 4,17 - 4,22 (zřetelný kvintet, J = 7,4 Hz, 1H), 6,77 (d, J = 7,7 Hz, 1H), 8,09 (d, J = 7,0 Hz, 1H); MS (LRCI, CH₄ ): m/z (relativní intenzita) = 317 (5) [M + C₂H₅ ]⁺, 289 (60) [M⁺ + Hf.

B. Syntéza Boc-Ala-Ala-OH

K suspenzi dipeptidu (15,0 g, 93,6 mmol) v THF (192 ml) se přidal roztok 0,5 N NaOH (192 ml). K výslednému roztoku se naráz přidal di-t-butyldikarbonát (26,6 g,

121,7 mmol). pH reakce se udržovalo při přibližně 10 po dobu 5 hodin a směs se pak míchala přes noc. pH reakce se opět upravilo na přibližně 10 a roztok se extrahoval ethylacetátem (2 x 100 ml). pH vodné vrstvy se upravilo na přibližně 3,5 vodným hydrogensíranem draselným a tato směs se extrahovala ethylacetátem (3 χ 100 ml). Smíchané extrakty se vysušily (MgSO₄), přefiltrovaly, zakoncentrovaly, a získalo se 20,7 g (85% výtěžek) požadovaného produktu ve formě bílého prášku: ¹H NMR (DMSO-d₆) δ

1,16 (d, J = 6,8 Hz, 3H), 1,28 (d, J = 7,3 Hz, 3H), 1,38 (s, 9H), 3,95 - 4,09 (m, 1H), 4,20

(kvintet, J = 7,3 Hz, 1H), 6,87 (d, J = 8,0 Hz, 1H), 8,00 (d, J = 7,3 Hz, 1H); MS (HRFAB, NBA - Li): m/z = 267,1557 [M⁺ + Hf; 267,1532, vypočteno pro CnH₂₀N₂O₅ Li.

C. Syntéza DAla-Ala-OEt .TFA

Chráněný dipeptid (31,4 g, 109 mmol) se rozpustil v dichlormethanu (200 ml) a přidal se TFA (66 ml). Výsledný roztok se míchal 30 minut při laboratorní teplotě, a pak se zakoncentroval. Zbytek se odpařil s dimethylchloridem (2 χ 200 ml), rozpustil v etheru a přídavkem přebytku hexanu vznikl olej. Rozpouštědla se dakantovala a zbytek se přečerpával při vysokém vakuu 12 hodin a získalo se 39,6 g (100% výtěžek obsahující zbytek TFA) požadovaná TFA sůl ve formě oranžového oleje: ¹H NMR (DMSO-d₆) δ

1,16 (d, J = 7,0 Hz, 3H), 1,28 (d, J = 7,0 Hz, 3H), 1,34 (d, J = 7,0 Hz, 3H), 3,86 (široké s, 1H), 4,07 (q, J = 7,0 Hz, 2H), 4,26 (kvintet, J = 7,0 Hz, 1H), 8,21 (široké s, 3H), 8,86 (d, J = 7,4 Hz, 1H); MS (LRCI, CH₄): m/z (relativní intenzita) 217 (5), [M⁺ + C₂H₅ f, 189 (40), [M⁺+H]⁺.

D. Syntéza Boc-Ala-Ala-DAIa-Ala-DAIa-OEt

K roztoku Boc-Ala-Ala-DAIa-Ala-OH (20,1g, 77,2 mmol) v DMF (850 ml) se přidal

HOBT . H₂O (13,1 g, 85,4 mmol) a EDC . HCI (16,4 g, 85,4 mmol). K tomuto roztoku se přidal

DAla-Ala-OEt (23,3g, 77,2 mmol) a následně TEA (11,9 ml, 85,4 mmol) a výsledná směs se pak míchala 12 hodin. DMF se odpařil a zbytek se rozpustil v ethylacetátu (300 ml), promyl 1N hydrogenuhličitanem draselným (150 ml), vodou (150 ml), nasyceným hydrogenuhličitanem sodným (150 ml) a vodou (150 ml). Vrstva ethylacetátu se promyla 1N hydrogensíranem draselným (150 ml), vodou (150 ml), nasyceným hydrogenuhličitanem sodným (150 ml) a solankou (150 ml). Vrstva ethylacetátu se pak vysušila (MgSO₄), přefiltrovala, zakoncentrovala na poloviční objem a následovala krystalizace. Po filtraci se získalo 20,5 g (62% výtěžek) požadovaného tetrapeptidu ve formě bílého prášku: ¹H NMR (DMSO-d₆) δ 1,13 (d, J = 7,0 Hz, 3H), 1,17 (současně dvě d, J = 7,0 Hz, 6H), 1,25 (d, J = 7,4 Hz, 3H), 3,91 - 4,30 (m, 6H), 6,87 (d, J = 7,0 Hz, 1H),

7,92 (d, J = 6,3 Hz, 1H), 8,07 (d, J = 7,3 Hz, 1H), 8,07 (d, J = 7,3 Hz, 1H), 8,09 (d, J =

6,6 Hz, 1H); MS (HRFAB, NBA - Li ) m/z = 437,2600 [M⁺ + Lif; 437,2588 vypočteno prO CigH^^Oy Li.

• ·

Λ>1 · · * · · · · ··· · ·

Η/ ···· · · · · · ·· ·· ··· ···· ·· ··

Ε. Syntéza Boc-Ala-Ala-DAIa-Ala-OH

Roztok Boc-Ala-Ala-DAIa-OEt (10,9 g, 25,3 mmol) v methanolu (100 ml) se zahříval s 2,5 M hydroxidem sodným (20,0 ml, 50,0 mmol) a výsledný roztok se míchal 2 hodiny při laboratorní teplotě. pH roztoku se pak snížilo na přibližně 3 přídavkem vodného hydrogensíran draselného a výsledná směs se extrahovala ethylacetátem (3 x 100 ml). Smíchané extrakty se vysušily (MgSO₄), přefiltrovaly, zakoncentrovaly a získalo se 6,8 g (67% výtěžek) požadované kyseliny ve formě bílé pevné látky: ¹H NMR (DMSO-d6) δ 1,17 (d, J = 7,2 Hz, 3H), 1,20 (současně dvě d, J = 7,1 Hz, 6H), 1,28 (d, J = 1,3 Hz, 3H), 1,38 (s, 9H), 3,90-4,00 (m, 1H), 4,17-4,30 (m, 3H), 6,93 (d, J = 6,7 Hz, 1H); 7,96 (d, J = 6,7 Hz, 1H), 8,04 (d, J = 7,4 hz, 1H), 8,07 (d, J = 7,8 Hz, 1H); MS (HRFAB, NBA - Li) m/z = 409,2331 [M⁺ + Lif; 409,2353 vypočteno pro C17H^N₄O₇ Li.

F. Syntéza Boc-Ala-Ala-DAIa-Ala-DAIa-OBzl

K roztoku Boc-Ala-Ala-DAIa-Ala-OH (6,5 g, 16,3 mmol) v DMF (180 ml) se přidal HOBT . H₂O (2,86 g, 18,7 mmol) a EDC . HCI (3,58 g, 18,7 mmol). Výsledný roztok se míchal 15 minut při laboratorní teplotě, zreagoval s DAla-OBIz p-toluensulfonátovou solí (6,57 g, 18,7 mmol) a TEA (2,6 ml, 18,7 mmol). Směs se pak míchala 12 minut. DMF se odpařil a zbytek se rozdělil mezi ethylacetát (300 ml) a vodu (300 ml). Vrstva ethylacetátu se promyla 1N hydrogensíranem draselným (150 ml), vodou (150 ml), nasyceným hydrogenuhličitanem sodným (150 ml) a solankou (150 ml). Vrstva ethylacetátu se pak vysušila (MgSO₄), přefiltrovala, zakoncentrovala, a získalo se 9,0 g (100% výtěžek) požadované sloučeniny ve formě bílého prášku: ¹H NMR (DMSO-d₆) δ 1,17 (d, J = 7,3 Hz, 3H), 1,21 (současně dvě d, J = 7,0 Hz, 6H), 1,22 (d, J = 7,0 Hz, 3H),

1,32 (d, J = 7,3 Hz, 3H), 1,37 (s, 9H), 3,90 - 4,09 (m, 1H), 4,18 - 4,34 (m,4H), 5,13 (ABq, J = 12,7 Hz, Δν = 10,5 Hz, 2H), 6,94 (d, J = 7,3 Hz, 1H), 7,30 - 7,41 (m, 5H),

7,97 (d, J =7,0 Hz, 1H), 8,10 - 8,18 (m, 2H), 8,25 (d, J = 6,9 Hz, 1H); MS (HRFAB, NBA - Li) m/z = 570,3140 [M⁺ + Li]⁺; 570,3115 vypočteno pro C₂₇H₄₁N₅O₈ Li.

G. Syntéza Ala-Ala-DAIa-Ala-DAIa . HCI

Boc-Ala-Ala-DAIa-Ala-DAIa-OEt (10,4 g, 18,7 mmol) se rozpustil v kyselině octové (225 ml) a zreagoval s koncentrovanou kyselinou chlorovodíkovou (75 ml). Výsledný roztok se míchal 14 hodin při laboratorní teplotě. Reakce se pak zakoncentrovala, pd• ·

pařila s vodou (50 ml), azeotropicky vysušila odpařením s toluenem (2 χ 100 ml) a získalo se 7,8 g (96% výtěžek) pentapeptidu hydrochloridu s odstraněnými chránícími skupinami ve formě bílého prášku: ¹H NMR (D₂O) δ 1,29 - 1,39 (m, 12H), 1,47 (d, J =

7,0 Hz, 3H), 4,06 (q, J = 7,0 Hz, 1H), 4,18 -1,38 (m, 4H); MS (LRFAB, NBA - HCI) 374 [M⁺ + Hf.

H. Syntéza cyklo-(Ala-Ala-DAIa-Ala-DAIa-)

K roztoku Ala-Ala-DAIa-Ala-DAIa · HCI (7,8 g, 19,0 mmol) v DMF (2400 ml) se

I ^; při -40°C přidal DPPA (6,29 g, 22,8 mmol) a dostatečné množství TEA pro úpravu pH na přibližně 8 (měřeno kápnutím reakční směsi na zvlhčený lakmusový papírek). Roztok se pak nechal stát 48 hodin při

-23°C a 48 hodin při 8°C. Během této doby se pH opět udržovalo přibližně při 8 pravidelným přídavkem TEA. Nakonec se rekční směs nalila do vody (2400 ml) a míchala se át 6 hodin se smíšeným ložem iontoměničové pryskyřice. (1200 g). Pryskyřice se odsfra·' nila filtrací a filtrát se zakoncentroval přibližně na objem 100 ml. Přidal se ether (500 * ml) a precipitovaná bílá pevná látka se vyizolovala filtrací a promyla větším množstvím etheru (250 ml). Pevná látka se pak rozmělnila 12 hodinovým mícháním s THF (100 ml) (pro odstranění stop DMF), přefiltrovala, důkladně vysušila, a získalo se 3,15 g (47% výtěžek) požadovaného cyklického peptidu ve formě jemného bílého prášku: *H NMR (DMSO-de) δ 1,08 - 1,25 (m, 12H), 1,24 (d, J = 7,3 Hz, 3H), 4,00 - 4,10 (m, 1H), 4,26 4,30 (m, 2H), 4,34 (q, J = 7,2 Hz, 1H), 4,41 (q, j = 7,6 Hz, 1H), 7,58 (d, j = 7,0 Hz, 1H),

7,83 (d, J = 8,4 Hz, 1H), 8,22 (d, J = 6,2 Hz, 1H), 8,33 (d, J = 7,81, 1H), 8,49 (d, J = 6,8 Hz, 1H); MS (HRFAB, NBA - HCI) m/z = 356,1989 (M⁺ + H)⁺; 356,1934 vypočteno pro C₁₅H₂₅N₅O₅(M⁺ + H)⁺.

I. Syntéza (2S, 5R, 8S, 11R, 14S)-pentamethyl-1,4,7,10.13-pentaazacyklopentadekanu

K míchané suspenzi cykfo-(Ala-Ala-DAIa-Ala-DAIa-) (3,10 g, 8,70 mmol) v THF (70 ml) se při laboratorní teplotě přidal lithiumaluminim hydrid (108 ml 1,0 M roztok v THF, 108 mmol). Výsledná směs se míchala 2 hodiny při laboratorní teplotě a pak se 16 hodin refluxovala. Směs se pak zchladila na -20°C a zastavila nasyceným síranem sodným (přibližně 30 ml) přidávaným po kapkách. Výsledná smě se zakoncentrovala na suchý ·· 9 9 9 · 9 9 9 9 9

999 9 · · · · · ·· · · · ♦·#····

Φϊ 9 9 9 9 9 9 9 9 9

99 999 9999 99 99 bílý prášek tento prášek se rozmíchal v etheru (2 χ 150 ml). Tyto rozmíchané roztoky se pak zakoncentrovaly a rekrystalizovaly z acetonitrilu a získalo se 1,10 g (44% výtěžek) požadovaného ligandu ve formě bílé pevné látky¹H NMR (CDCI₃) δ 0,96 (d, J =

5,2 Hz, 3H), 1,00 (současně dvě d, J = 5,0 Hz, 6H), 1,02 (současně dvě d, J = 5,0 Hz, 6H), 1,30 - 1,55 (širokém, 2H), 1,85 - 2,15 (široké s, 3H), 2,05 - 2,19 (m, 5H), 2,42 3,00 (komplex m, 12H); MS (HRFAB, NBA - HCI) m/z = 286,3013 (M⁺ + H)⁺; 286,2971 vypočteno pro C^H^Ns.

J. Syntéza fdichlor-(2S, 5R, 8S, 11R, 14S)-pentamethvl-1.4,7.10.13-pentaazacvklo pentadekanl hexafluorofosfátu železitého

Komplex se připravil analogicky podle popisu příkladu 3. Po rekrystalizaci surové žluté pevné látky z ethanolu se získaly žluté krystaly, které tvořily 40% výtěžek. Analýza vypočtená pro CisHssNsChFeFeP: C, 32,37; H, 6,34; N, 12,59. Nalezené hodnoty: C, 32,44; H, 6,30; N, 12,40.

Příklad 5

Kinetická analýza zastaveného toku

Kinetická analýza zastaveného toku se použila ke zjištění, zda může sloučenina katalyzovat dismutaci superoxidu (Riley, D.P., Rivers, W. J. a Weiss., R. H., StoppedFlow Kinetic Analysis for Monitoring Superoxide Decay in Aqueous Systems,” Anal. Biochem, 196, 344-349 [1991]). Pro dosažení konzistentního a přesného měření se všechny reagencie byly biologicky čisté a neobsahovaly kovy. Za tímto účelem byly všechny pufry (Cabiochem) biologicky odstíněny bez obsahu kovů a pracovalo se s nimi za pomocí laboratorních potřeb, které byly před použitím promyty nejprve v 0,1 N HCI, pak v přečištěné vodě, následně v lázni 10⁴M EDTA při pH 8 a pak se promyly v přečištěné vodě a sušily několik hodin při 65°C. Bezvodý roztok superoxidu draselného (Aldrich) v DMSO se připravil v suché, inertní atmosféře argonu ve vakuové atmosféře rukavicové skříně za použití suchých skleněných nádob. Bezvodý roztok DMSO se připravil čerstvý před každým experimentem zastaveného toku. Pro rozdrcení žluté pevné látky superoxidu draselného (přibližněl00 mg) se použil hmoždíř s paličkou. Prášek se pak rozmělnil v několika kapkách DMSO, a suspenze se umístila do nádoby obsahující dalších 25 ml DMSO. Výsledná suspenze se míchala 1/2 hodiny a pak se přefiltrovala. Tento postup je reprodukovatelný při přibližně 2 • ·

mM koncentracích superoxidu v DMSO. Tyto roztoky se přemístily do návlečného vaku v atmosféře dusíku, který se uzavřel před připojením stříkačky s atmosférou dusíku. Je třeba vzít v úvahu, že roztoky DMSO/superoxid jsou velmi citlivé na vodu, teplo, vzduch a vnější kovy. Čerstvý, čistý roztok má slabě nažloutlou barvu .Voda pro roztoky pufrů se použila z vlastního systému pro výrobu deionizované vody ze systému Barnstead Nanopure Ultrapure Series 550 a pak dvakrát předestilované, nejprve z alkalického manganistanu draselného a pak ze zředěného roztoku EDTA. Například roztok obsahující 1,0 g manganistanu draselného, 2 litry vody a navíc hydroxid sodný potřebný pro úpravu pH na 9,0 se přidal do 2 litrové nádoby s horní částí upravenou pro destilaci rozpouštědla. Tato destilace zoxidovala jakoukoli stopu oganické sloučeniny ve vodě. Závěrečná destilace se prováděla v atmosféře dusíku v 2,5 litrové nádobě obsahující 1500 ml vody z předchozí sedtilace a 1,5 χ 10⁶ M EDTA. Tento krok odstranil zbývající stopy kovů z ultračisté vody. Pro zabránění ztráty EDTA z celého objemu z refluxního ramena do pevné horní části, se 40 cm vertikálního ramena obalilo skleněnými kuličkami a utěsnilo izolací. Tento systém produkoval odvzdušněnou vodu, u které bylo možné naměřit vodivost menší než 2,0 nanoohmů/cm².

Systém spektrometru pro měření zastaveného toku byl navržen a vyroben Kinetic Instruments lne. (Ann Arbor, Ml) a byl připojen k osobnímu počítači MAC IICX. Software pro analýzu zastaveného toku byl testován Kinetic Instruments lne. a zapsán v QuckBasic s ovladačem MacAdios. Běžný objem nástřiku (0,10 ml pufru a 0,006 ml DMSO) se kalibroval kvůli velkému přebytku vody ve směsi s DMSO. Aktuální poměr byl přibližně 19/1, proto byla počáteční koncentrace superoxidu ve vodném roztoku v rozmezí 60 - 120 μΜ. Vzhledem k tomu, že v literatuře uváděný absorpční koeficient superoxidu v H₂O je při 245 nm přibližně 2250 M'¹ cm’¹ (1), očekávala se počáteční hodnota absorbance přibližně 0,3 - 0,5 pro 2 cm měřící dráhu kyvety, což se také potvrdilo experimentálně. Vodné roztoky smíchané s DMSO roztokem superoxidu se připravily za použití 80 mM koncentrace Heppes pufru, pH 8,1 (volná kyselina + forma Na). Jedna ze zásobních stříkaček se naplnila 5 ml roztoku DMSO, zatímco jiná se naplnila 5 ml vodného roztoku pufru. Vstupní blok pro nástřik vzorku, směsná komůrka a spektrometrická buňka se předem temperovaly v cirkulující vodní lázni termostatu o teplotě 21,0 ± 0,5 °C.

Před zahájením sběru údajů pro rozklad superoxidu se získal průměr základní linie několika nástřiky pufru a roztoku DMSO do směsné komůrky. U těchto nástřiků se zaznamenal průměr a uchoval jako základní linie. První nástřiky získané během série měření byly vodné roztoky, které neobsahovaly katalyzátor. To potvrdilo, že žádná série měření neobsahovala kontaminační látky, které by mohly vzniknout zahájením rozkladu superoxidu. Jestliže se objevil rozklad superoxidu u nástřiků s roztokem pufru v pořadí jako druhý, použitým roztokem mohl být manganatý komplex. Potenciál SOD byl obecně zjišťován pro velké koncentrační rozmezí. Poněvadž byla počáteční koncentrace superoxidu po smíchání DMSO s vodným pufrem přibližně 1,2 χ 10^-4 M, bylo třeba použít koncentraci manganatého komplexu, která byla alespoň 20 krát nižší než koncentrace substrátového superoxidu. Následně se sledovaly sloučeniny pro aktivitu SOD za použití koncentrací v rozmezí 5 χ 10'⁷ M až 8 χ 10^-6 M. Získané hodnoty z měření se převedly do vhodného matematického programu (jako je například Cricket Graph) pro provedení standardní kinetické analýzy. Katalytická rychlostní konstanta pro dismutaci superoxidu manganatým komplexem z příkladu 1 byla stanovena z lineární závislosti získaných rychlostních konstant (K^) na koncentraci manganatého komplexu. Hodnoty K^ se získaly z lineární závislosti In absorbance při 245 nm na čase dismutace superoxidu manganatým komplexem. K_kal (M¹ sek'¹) manganatého komplexu z příkladu 1 při pH = 8,1 a 21°G byla zjištěna 0,77 χ 10⁺⁷ M¹ sek'¹.

Makrocyklický ligand manganatého komplexu obsahující dusík z příkladu 1 je účinný katalyzátor pro dismutaci superoxidu, jak je zřejmé z k_kat uvedené výše.

TABULKA I

Sloučenina kkat@ pH=7,6, 21 °C

Příklad číslo (M~¹ sek'^{1 1 2})

1,06χ 10⁷

0,96 χ 10⁷

1,60 χ 10⁷

2,94 χ 10⁷

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Farmaceutická kompozice ve formě jednotkové dávky využitelná pro dismutaci superoxidu obsahující (a) terapeuticky nebo profylakticky účinné množství komplexu kde R, R’, Rí, Rí ,R2, R2 , R3. R3. R*. R4, R5. R5. Re. Re. R7. R7,Re. Re. R9 a R9 jsou nezávisle vybrány ze skupiny zahrnující vodík a alkyl, alkenyl, alkinyl, cykloalkyl, cykloalkenyl, cykloalkylalkyl, cykloalkylcykloalkyl, cykloalkenylalkyl, alkylcykloalkyl, alkenylcykloalkyl, alkylcykloalkenyl, alkenylcykloalkenyl, heterocyklickě, arylové a aralkylové radikály a radikály připojené k α-uhlíku a-aminokyselin; nebo Rí nebo R^ a R₂ nebo R₂, R₃ nebo R₃ a R₄ nebo R₄ , R₅ nebo R₅ a R₆ nebo R₆, R7 nebo R₇ a R₈ nebo R₈ a R₉nébo Rg a R nebo R spolu s uhlíkovými atomy, ke kterým jsou připojeny, tvoří nezávisle nasycený, částečně nasycený nebo nenasycený kruh se 3 až 20 uhlíkovými atomy; nebo R nebo R a R1 nebo R/ a R2 nebo R₂, R₃ nebo R₃ a R₄ nebo R₄ , R₅ nebo R₅ a R₆ nebo R₆, R? nebo R₇ a R₈ nebo R₈ a R₉ nebo R₉ , spolu s uhlíkovými atomy, ke kterým jsou připojeny, tvoří nezávisle heterocyklus se 2 až 20 uhlíkovými atomy, obsahující dusík, za předpokladu, že pokud heterocyklus obsahující dusíkje aromatický heterocyklus, který neobsahuje vodík, připojený k dusíku, výše uvedeného vzorce, tento dusík je též v makrocyklu a skupiny R připojené ke stejnému uhlíkovému atomu makrocyklu chybí;

kde X, Y a Z jsou nezávisle vybrány ze skupiny obsahující halogenid, skupiny oxo, aquo, hydroxo, alkohol, fenol, molekulární kyslík, peroxo, hydroperoxo, alkylperoxo, arylperoxo, amoniak, alkylamino, arylamino, heterocykloalkylamino, heterocykloarylamino, aminoxid, hydrazin, alkylhydrazin, arylhydrazin, oxid dusičný, kyanid, kyanát, thiokyanát, izokyanát, izothiokyanát, alkylnitril, arylnitril, alkylizonitryl, arylizonitril, dusičnan, dusitan, azido, alkylsulfonovou kyselinu, arylsulfonovou kyselinu, alkylsulfoxid, ·· ··· · ^>5 · · · · · ······· ···· · · · · · ·· ·· ··· ···· ·· ·· arylsulfoxid, alkylarylsulfoxid, alkylsulfenovou kyselinu, arylsulfenovou kyselinu, alkylsulfinovou kyselinu, arylsulfinovou kyselinu, alkylthiolkarboxylovou kyselinu, arylthiolkarboxyiovou kyselinu, afkylthiolthiokarboxylovou kyselinu, arylthiolthiokarboxylovou kyselinu, alkylkarboxylovou kyselinu, arylkarboxylovou kyselinu, močovinu, alkylmočovinu, arylmočovinu, alkylarylmočovinu, thiomočovinu, arylthiomočovinu, alkylarylthiomočovinu, síran, siřičitan, hydrogensíran, hydrogensiřičitan, thiosíran, thiosiřičitan, hydrosiřičitan, alkylfosfan, arylfosfan, alkylkfosfanoxid, arylfosfanoxid, alkylarylfosfanoxid, alkylfosfansulfid, arylfosfansulfid, alkylarylfosfansulfid, alkylfosforitou kyselinu, arylfosforitou kyselinu, alkylfosfornou kyselinu, arylfosfornou kyselinu, alkylfosfinitou kyselinu, arylfosfinitou kyselinu, fosforečnan, thiofosforečnan, fosforitan, pyrofosforitan, trifosforečnan, hydrogenfosforečnan, dihydrogenfosforečnan, alkylquanidin, arylquanidin, alkylarylquanidin, alkylkarbamát, arylkarbamát, alkylarylkarbamát, alkylthiokarbamát, arylthiokarbamát, alkylaryltrhiokarbamát, alkyldithiokarbamát, aryldithiokarbamát, alkylaryldithiokarbamát, hydrogenuhličitan, uhličitan, chloristan, chlorečnan, chloritan, chlornan, bromistan, bromečnan, bromitan, bromnan, tetrahalogenmanganan, tetraflourborát, hexafluorfosforeečnan, hexaflorantimoničnan, fosfornan, jodičnan, jodistan, metaboritan, tetraarylboritan, tetraalkylboritan, vinan, šťavelan, jantaran, citrát, askorbát, sacharinát, aminokyselinu, hydroxamovou kyselinu, thioparatoluensulfonát, a anionty iontoměničových pryskyřic, nebo systémy, kde jeden nebo více X, Y a Z jsou nezávisle připojeny k jedné nebo více skupinám ”R”, kde n je 0 nebo 1, a (b) netoxický, farmaceutickz přijatelný nosič, adjuvans nebo pojivo.
2. Kompozice podle nároku 1, kde alespoň jedna z R, R’, Ri, Rf, R₂, R2 , R3, R3, R4, R4, R₅, R₅, R₆, Re, R7, R7, Re, Re, Rg a R₉ je alkyl nebo alkyl substituovaný -OR10 nebo -NR10R11, kde R10 a Rn jsou nezávisle vodík nebo alkyl; a zbývající skupiny ”R” skupiny jsou vodíky, nebo tvoří část nasyceného, částečně nasyceného nebo nenasyceného kruhu, nebo tvoří část heterocyklu obsahujícího dusík.
3. Kompozice podle nároku 2, kde alespoň dvě z R, R’, R1, R/, R₂, R₂', R3, R3, R4, R4, Rs, Rs, Re, Re, R?, R?. Re, Re, Rg a R₉ jsou alkyl nebo alkyl substituovaný skupinami OR10 nebo -NR₁₀Rn, a uvedené zbývající skupiny ”R” jsou vodíky.
4. Kompozice podle nároku 1, kde alespoň jedna z Rí nebo R/a R₂ nebo R₂ , R₃ nebo R₃ a R4 nebo R₄, R5 nebo R₅ a R₆ nebo R₆, R7 nebo R₇ a R₈ nebo R₈ a R₉ nebo R₉ a R nebo R’ spolu s atomy uhlíku, ke kterým jsou připojeny, tvoří nasycený, částečně nasycený nebo nenasycený cyklus se 3 až 20 atomy uhlíku; a zbývající skupiny ”R” skupiny představují vodík, alkyl nebo alkyl substituovaný skupinami -OR_W nebo NR₁₀Rn, nebo tvoří část heterocyklů obsahujícího dusík; kde R₁₀ a Ru jsou nezávisle vodík nebo alkyl.
5. Kompozice podle nároku 4, kde zbývající skupiny ”R” skupiny jsou vodík, alkyl nebo alkyl substituovaný skupinami -OR₁₀ nebo -NR₁₀Ru
6. Kompozice podle nároku 5, kde alespoň jedna z R! nebo R/a R₂ nebo R₂, R₃ nebo R₃ a R4 nebo R₄, R5 nebo R₅a Re nebo Re, R₇ nebo R₇ a R₈ nebo R₈ a R₉ nebo R₉ a R nebo R’ spolu s atomy uhlíku, ke kterým jsou připojeny, je cykloxéxanová skupina.
7. Kompozice podle nároku 6, kde alespoň dvě z Rí nebo R/a R₂ nebo R₂ , R₃ nebo R₃ a R₄ nebo R₄, R₅ nebo R₅a R₆ nebo R₆, R₇ nebo R₇, a R₈ nebo R₈ a R₉ nebo R₉ a R nebo R’ spolu s atomem uhlíku, ke kterému jsou připojeny, jsou cykloxexanové skupiny.
8. Kompozice podle nároku 1, kde alespoň jedna z R₁ nebo R/a R₂ nebo R₂ , R₃ nebo R₃ a R₄ nebo R₄, R₅ nebo R₅a R₆ nebo R₆, R₇ nebo R₇, a R₈ nebo R₈ a R₉ nebo R₉ a R nebo R’ spolu s atomy uhlíku, ke kterému jsou připojeny, přičemž tvoří heterocyklus obsahující dusík; a zbývající skupiny ”R představují vodík, alkyl nebo alkyl substituováný skupinami -OR10 nebo -NR10R11, nebo tvoří část nasyceného, částečně nasyceného nebo nenasyceného cyklu; kde R10 a Rn jsou nezávisle vodík nebo alkyl.
9. Kompozice podle nároku 1, kde X, Y a Z jsou nezávisle vybrány ze skupiny sestávající z halogenidu, organické kyseliny, dusičnanového nebo hydrogrnuhličitanového aniontu.
10. Použití komplexu podle nároku 1 pro přípravu léku k prevenci nebo léčbě nemoci nebo poruchy alespoň částečně vyvolané superoxidem.

·· ····
11 Použití podle nároku 10, kde uvedená nemoc nebo porucha je vybrána ze skupiny zahrnující reperfuzní poranění ischemického orgánu, chirurgickým zákrokem vyvolanou ischemii, zánětlivé onemocnění střev, revmatoidní artritidu, osteoartritidu, psoriázu, rejekci transplantovaného orgánu, radiací vyvolané poranění, oxidací vyvolané poranění tkáně a poškození, atherosklerózu, trombózu, agregaci destiček, metastázy, mozkové příhody, akutní pankreatitidy, diabetus mellitus závislý na inzulínu, roztroušenou intravaskulární koagulaci, tukovou embolii, respirační nedostatečnost u dospělých a dětí a karcinogenezi.
12. Použití podle nároku 11, kde uvedené onemocnění nebo porucha je vybrána ze skupiny zahrnující reperfuzní poranění ischemického orgánu, chirurgickým zákrokem vyvolanou ischemii, mozkovou příhodu, atherosklerózu a zánětlivé onemocnění střev.