CZ268192A3 - Spósob přípravy polyakrylamidových katalyzátorov pre biotransformácie - Google Patents

Abstract

Spósob přípravy katalyzátorov pre biotransformácie, spočívajúci v imobilizácii biopolymérov, hlavně proteinov a enzýmov rózneho stupňa čistoty, intaktných alebo de- ' zintegrovaných buniek mikroorganizmov a ich zmesí, zachytením do polyakrylamidového gélu a imobilizácii zosietením v tomto géli. Tohoto účelu sa dosiahne tým, že r 100 hmotnostných dielov aktívnych biomérov, alebo buniek o sušině 2 - 60 % hmot. sa zmieša s 0,5 - 5 hmot. dielmi vodného roztoku monoméru. zloženého z vodného roztoku akrylamidu a N,N ‘-metylenbisakrylamidu, s výhodou 50 % akrylamidu a 5 % N,N ‘-metylenbi- sakrylamidu. K zmesi sa za miešania pri teplotč - 3 °C až 30 °C, s výhodou 0-10 °C, přidá 0,01 -1,0 hmot. dielov bifunkčného sietovaciebo činidla, s výhodou 0,02 - 0,5 hmot dielov glutaraldehydu a ponechá sa regova‘t 1 až 30 min. Potom sa zmes polymerizuje prídavkom persíranu a Ν,Ν,Ν ‘,N ‘-tetrametylétyléndiamínu. Vzniknutý polyakrylamidový gél sa ‘dalej upraví na vefkos‘t částic 0,1 - 1 mm, premýva alebo ‘dalej zbavuje vody a ponechává před biotransformáciou napučiava‘t. Tento typ biokatalyzátorov má široké uplatne- ■ nie vo~farmácii při výrobě polosyntetických penicilínov a cefalosporínov a v potravinárskom priemysle pri výrobe-ňiektorých substanci·, kde je možné použi‘t biokatalýzu.

Description

Spósob přípravy polyakrylamidových katalyzátorov pre biotransíormácie

Oblasť techniky

Vynález sa týká spósobu přípravy pólyakry1amidových katalyzátorov pre biotransíormácie, spočívajúci na imobilizácii aktívnych biopolymérov, hlavně proteinov a enzýmov různého stupfta čistoty, natívnych alebo dezintegrovaných buniek mikroorganizmov a ich zmesi, zachytením do gélov a imobilizácii zosietením v polyakrylamidových géloch.

Takéto katalyzátory sú vhodné pre priemyselné biotransíormácie, hlavně vo farmaceutickéj a potravinářskéj oblasti, napr. pri biotransíormáciách antibiotik.

PotěrajSi stav techniky

Imobi1izované buňky mikroorganizmov majú stále rastúcu aplikáciu aj v oblasti chemického priemyslu a pri dekontaminácii životného prostredia, ako to uvédza prehlad z rokov 1983 - 87 /M.p.

Coughlan.,P.J.Kiersten -. J . Microb. Meth. , 8,1988,51 - 90/.

Pri biotransíormácii antibiotik, hlavně penicilinov a ceíalosporínov, sa priemyselne aplikuje póly-(metakryl)glutaraldehydové a poly-glycidy1(metakrylové) biokatalyzátory /Murray Moo Young Ed.: Bioreactor Immobilised Enzymes and Cells - Fundamentals and Applications. Elsevier Applied Science, 1988/.

Pri imobilizácii pěnici 1inacylázy na porézně polyakrylonitrilové vlákna sa ukázalo, ze účinná je imobilizácia priamo na poréznom nosiči, ktorý ma velký vnútorný povrch / F. Ishimura a H. Seijo.J.Ferm. Technol. 71,/2/.1991,140/. Najvyssiu speciíickú aktivitu a. výťažok imobi 1 izácie, aj v porovnaní s inými metodami přípravy, mal biokatalyzátor, v ktorom je enzým kovalentne viazaný na glutaraldehydom aktivovované hydrocrénované polyakrylonitrilové vlákna. V postupe imobilizácie puriíikovanej penicilínacylázy v poréznych «uličkách polyakrylamidového «élu sa Ca-aloinát-enzým-polyakrylamid suspenduje v roztoku glutaraldehydu s NaCl a po ir-. ermc leku lovem zcsie*. ení proteinu Ca-alginát sa vyluhuje fosfátovým tlmivým roztokom. Získajú sa rovnoměrné sférické «uličky o priemere 1,5 - 2,0 mm bez diíúznej limitácie /A . Prabkur.e, H.Sivaramen : Appl.Biochem.

Biotechnol., 30, 1991, 265/.

Iný spósob přípravy biokatalyzátorov je imobilizácia enzým-membránových komplexov, vytvořených vazbou enzýmu s buňkami / buňky E.coli a puriíikovaná pěnici 1ínacy1sza/ popisovaná v

P.S.Nys et.al.: Dokl. Akad.Nauk SSSB, 315,4,1990,1000, /Biochim./. Takýto komplex zmobilizovaný v polyakryΪamidovom «ély aktivitou a stabilitou převyšuje zmobilizované nativně buňky aj enzým.

Přípravu buňkových katalyzétorov pre biotransíormécie, imobilizáciou buniek mikroorganizmov alebo rastlin, různého stupňa inteorrity a permeabi1izácie, chemicky reaktívnym vo vede rozpustným polymérom, vzniknu tým reskcic·.. .·.. 1.. e ·. y 1 -nimi r e podobných andnov s bi í-.inkcnymi a 3 ..-lehy dm i dikartoxylo^ch kyselin, ako je crlutaraldehyd, popisuje patentový spis CS 231459.

Dalšie československé postupy , závislé na. horeuvedenom patente, stabilizujú a spevhujú částice biokatalyzátora, v principe dalším zosietením buňkových katalyzátorov olutaraldehydom a připadne tiež s přídavnou bielkouinou z různých zdrojov a čistoty.

Takéto sú československé patenty 241730 pre transíormáciu (3-laktámových antibiotik, hlavně pre prlpravu kyseliny

6- aminopenicilánovéj a kyseliny 7-aminodeacetcxycefalosporénovej; CS 259997 pre imobilizáciu kvasiniek schopných transformovat' penicilín V; CS patent 251111, pre hydrolýzu kyseliny

7- |3-/4-karboxybutánamido-/ cefalosporénovej buňkami Pseudomonas species.

Tieto postupy, nevhodné na imobi1izovanie enzýmov, i keď ako nosiče využívajú bunkovú matricu, predstavujú niekoTkostupňové procesy / přípravu reaktívneho polyméru, vlastnú imobilizáciu a ďalžie spevnenie častíc /, vyžadujú nadbytok reaktantov a ďalších agens /aceton, etanol a pod./.

Specifická enzymové aktivita takto připravených bi okat-a i v zatorov je priamo závislá na aktivitě buniek, ktorá má váak svoje hranice. Tým je teda limitovaná aj koncentrácia vstupujúceho transíormovaného substrátu a ekonomia procesu.

Takýmito postupmi připravené biokatalyzátory majú malú mechanickú

pevnost' a	pružnost'	, čo negativné	ovplyvftuje	ich	operačnú
stabilitu a	limituje	technológie biotransíormácií.
Podstata vynálezu
Nevýhody	takýchto	biokatalyzátorov	a spdsob	ich	přípravy

odstraňuje navrhovaný spdsob přípravy polyakrylamidových katalyzátorov pre biotransíormácie, spočívajúci na imobilizácii biopolymérov hlavně proteínov a enzýmov rdzneho stupňa čistoty, natívnych /intaktných/ alebo dezintegrovaných buniek mikroorganizmov a ich zmesi, zachytením do gélu a imobilizácii zosietenim v polyakrylamidových géloch.

Navrhovaný spdsob přípravy biokatalyzátorov sa vyznačuje tým, že k 10 hmotnostným dielom vodného roztoku alebo suspenzie, obsahujúcich 2 - 60 % hmotnostnývh aktivnych biopolymérov, hlavně enzýmov a proteínov, a/alebo buniek natívnych a/alebo dezintegrovaných buniek sa přidá 0,5 - 5 hmotnostných dielov vodného roztoku monoméru, zloženého z 15 - 60 % hmotnostných akry1amidu a 0,05 -5 % hmotnostných sieťovacieho činidla, s výhodou 50 % akrylamidu a 5 % N, N- -mety lénbisakry lamidu. K tejto zmesi sa po zhomogenizovaní přidá 0,01 - 1 hmotnostných dielov biíunkčného sieťovacieho reagentu, s výhodou 0,02 -0,5 hmotnostných dielov glutaralóehydu, a zmes sa ponechá reagovat'

1-30 min pri teplote -3 až 3000, s výhodou pri 0 až 10°C. Potom sa reakčná sústava polymerizuje prídavkom iniciátora a akcelerátora polymerizácie, s výhodou 0,07 - 0,20 hmotnostných dielov persíranu amonného a Ν,Ν,Ν» , N- -tetramety lety léndiamlnu . Vzniknutý zosietený polyakrylamidový katalyzátor sa upraví na velkost' častíc 0,1 -1,0 mm a premýva sa. Částice sa mčžu ďalej dosietiť 0,01 - 1 % vodným roztokom glutaraldehydu po dobu 10 až 120 min. Z takto upraveného, premytého a odseparovaného biokatalyzátora možno odstranit' vodu, sušením pri 10 - 40°C, kryoskopickým vymrazovaním a pod. Suchý biokatalyzátor sa před použitím ponechá napučiavať vo vodě resp. tlmivom roztoku pri 1-20 °C a po premytí sa vlhký použije do reakcie.

Výhodou navrhovaného spbsobu je jeho jednoduchost', umožrtujúca imobilizovať enzým i buňky a ich zmesi. Postup nevyžaduje špeciálnu úpravu komponent a reakčnej zmesi, reakcia imobilizacie prebieha za mierneho chladenia po krátku dobu a prakticky v jednom reaktore.

Takto vzniknutý polyakrylamidový biokatalyzátor nevyžaduje špeciálnu úpravu, je velmi pružný a mechanicky stabilný. Možno ho zbavit' vody a skladovat' v suchom stave.

Příklady prevedenia

Příklad 1

K 5 g /3 <3 sušiny/ roztoku tecnnického enzymu oxidázy

D-aminokyselin (ďalej DAAO), aktívneho na ceíalosporín C, o aktivitě 0,27 μkat/cr sušiny, sa za miešania a chladenia v l'adovom kúpeli přidalo 1,6 g- roztoku monomérov /50¾ hmot.akry 1amidu a 5% hmot.N,N'-metylenbisakrylamidu (ďalej BIS) vo vodě/. Po 10 min. sa k zmesi přidalo 0,63 g 25¾ vodného roztoku giutaraldehydu (ďalej GA) a zmes sa miešala pri teplote 5 °C 5 min. Potom sa k zmesi přidalo 0,05 g N,N,N N -tetrametyletyléndiamlnu (ďalej TEMED) a 0,3 ml 25¾ vodného roztoku persíranu amonného. Vzniknuty tuhy gél sa dezintegroval pretláčaním cez šito o velkosti otvorov 0/3 - 0/5 mm, dekantoval 5-krát 100 ml vody, odseparoval a na írite premyl 1 mol/dm³ roztokom chloridu sodného a 0/1 mol/dm³ íosíátového tlmivého roztoku. Získalo sa 6/9 g biokatalyzátora o o sušině 19,5 % hmotnostných a o aktivitě 0,12 ukat/g vlhkého katalyzátora.

Přiklad 2

Postup ako v příklade 1 s tým rozdielom, že namiesto enzý.mu DAAO sa použila zmes, 2,5 g / 0,5 g sušina/ vodného roztoku enzymu DAAO z příkladu 1 a 2,5 g /0,5 g sušiny/ vodnej suspenzie permeabilizovaných buniek kvasinky Trigonopsis variabilis

CCY-15-1-2 o aktivitě 0,1 μkat/g suspenzie buniek a 0,95 ml 25% roztoku GA.

Připravilo sa 7,1 g biokatalyzátora o aktivitě 0,075 ukat/g vlhký

Příklad 3

Postup ako v příklade 1 s tým rozdielom, že namiesto enzýmu DAAO, sa použila suspenzia permeabi1izovaných a dezintegrovaných buniek Trigonopsis variabilis, / 20 % sušina / o aktivitě 0,07 ukat/g suspenzie. Připravilo sa 7,5 g biokatalyzátora, ktorý sa nechal volné pri laboratórnej teplote vysušit. Získalo sa 1,72 g suchého katalyzátora. Po troch mesiacoch skladovania pri 5«C sa suchý gel premyl 0,05 M fosfátovým tlmivým roztokom o pH 7,8 a po 16 hod. napučania vo vodě pri teplote 5°C sa namerala aktivita 0,068 pkat/g vlhk.

Přiklad 4

Postup ako v příklade 1 s tým rozdielom, že sa použila 10 %-ná suspenzia permeabi1izovaných buniek Trigonopsis variabilis s aktivitou 50 nkat/g suspenzie, 2,5 g vodného roztoku monomeru, zloženého zo 60 % akrylamidu a 0,5 % BIS, a 0,94 g 25 %-ného vodného roztoku GA. Připravilo sa 6 g biokatalyzátora s aktivitou 29 nkat/g gelu.

Příklad 5

Postup ako v příklade 1 s tým rozdielom, že sa imobi1izovalo 5 g vodnéj suspenzie /15 % sušina./ permeabi 1 izovaných buniek Pseudomonas sp. CCM 3635, obsahujúcich hydrolázu kyseliny

7-(3-/4-karboxybuténamido/ceí alosporánove j s aktivitou nkat/g suspenzie. Připravilo sa 7,2 g biokatalyzáta o aktivitě 25 nkat/g vlh.biokatalyzátora.

Příklad 6

Tak ako v příklade 5 s tým rozdielom, že sa. do reakcie použilo 1,25 ml 25 % vodného roztoku GA.V 6,9 g vlhkého gelu bola aktivita 192 nkat.

Příklad 7

Postupovalo sa ako v příklade 1, s tým rozdielom, že sa pracovalo s vodnou suspenziou permeabilizovaných buniek / sušina 9¾ Bacillus subtilis CCM-220 s acetylest©rázovou aktivitou na ceíalosporín C.

Připravilo sa 7,5 g biokatalyzátora s aktivitou 42 nkat/g vlh.katalyzátora.

Příklad S

Tak ako v příklade 7, ale sa přidalo 0,1 g TSMEP a 0,14 ml 25 % persíranu amonného. V 6,3 g vlhkého gélu bola aktivita 290 nkat.

Příklad 9 g vodnéj suspenzie buniek / 12 % sušiny

Escherichia coli, s penicilín G amidázovou aktivitou 8,4 ukat/g suš., sa rozmiešalo s 12 ml roztoku monoméru / vodný roztok 50 % akrylamidu a 5 % BIS /, za žhomogenizovaného roztoku sa za 7,5 ml 25 % vodného roztoku Gft pri 5®C. Potom sa přidalo 0,3 g persíranu amonného. V priebehu Tento sa upravil pretlažanim cez chladen i a na 0 - 10 ^cC. Do intenzivneho miešania přidalo a nechalo sa reagovat' 10 min

TEMED a 1,5 ml 25 % vod.roztoku 5 min sa vytvori i tuhý gel šito /priemer otvorov 0,5 mm/.

Vzniknuté válcovité částice biokatalyzátora sa dekantovali vodou do temer čirej a bezíarebnej odpadovéj vody. Potom sa částice odfiltrovali, premyli vodou, 100 ml 1 mol/1 vodného roztoku chloridu sodného a 0,1 mol/1 fosfátového tlmivého roztoku pH 7,8 a na írite odsáli. Připravilo sa 56 g biokatalyzátore o aktivitě 5,5 pkat/g vlhkého.

Příklad 10

Postup ako v příklade 9, s tým rozdielom, Se sa použila suspenzia buniek Cryptococcus sp. / 10¾ sušina / s penicilín V amidázovcu aktivitou 2,58 μkat/g sušiny . Na reakciu zosietenia sa použilo 0,53 ml 25 % vodného roztoku GA.

Získalo sa 55 <3 biokatalyzátora o aktivitě 0,9 ukat/g sušiny.

Příklad 11

Postup ako v příklade 9, s tým rozdielom, Se sa pracovalo s parciálně puriíikovaným enzýmom o aktivitě 1,7 Mkat/g sušiny /sušina 5¾ / a do reakcie sa použilo 0,53 ml 25¾ vodného roztoku GA. Připravilo sa 52 g biokatalyzátora s aktivitou 0,057 .ukat/g vlhkého.

Příklad 12

Postupovalo sa ako v přiklade 1, s tým rozdielom, že sa použil vodný roztok technickej invertázy /sušina 5 ¾ , aktivita 210

Mkat/g sušina. Připravilo sa 6,3 g biokatalytátora o aktivitě 1,67 pkat/ g vlh.

Přiklad 13

Postupovalo sa tak, ako v příklade 1, s tým rozdielom že sa pracovalo s vodným roztokem technickej amylázy / aktivita 0,67 μkat/mg roztoku, sušina 15 ¾ z. Získalo sa 6,75 g biokatalyzátora o aktivitě 0,42 Mkat/mg vlhkéj hmoty.

Příklad 14

Postup ako v přiklade 9, s tým rozdielom, ze částice polyakrylamidového katalyzátora sa suspendovali v 150 ml 0,3 % vodného roztoku GA a miešali 20 min. Potom sa částice odseparovali, premyli vodou a sušili kryoskopickým vymrazovanim. Připravilo sa 11 cr biokatalyzátora o aktivitě 26,1 jikat/<? .

Priemyselná využitelnost

Polyakrylamidové katalyzátory,připravené spósobom podlá vynálezu, možno aplikovat' vo farmaceutickéj oblasti pri výrobě róznych substancií, napr. pri bictransformácii antibiotik. Ich využitelnost' siaha aj do oblasti potravinářskéj a chemickej výroby

Claims (1)

1. Patentové nároky

   Spósob přípravy polyakrylamidových katalyzátorov pre biotransfcrmácie vyznačujúci sa tým, že k 10 hmot.ncst.nyni dielom vodného roztoku, alebo suspenzie, obsahujúcich 2-60 % hmotnostných aktívnych biopolymérov, hlavně enzýmov a proteinov, a /alebo intaktných buniek, a/alebo dezintegrovariých buniek, sa přidá 0,5 - 5 hmotnostných dielov vodného roztoku monomeru, zloženého z 15 - 60 % hmotnostných akrylamidu a 0,05 - 5 % hmotnostných sieťovacieho činidla, s výhodou 50 % akrylamidu a 5¾

   N, N -metylénbisakrylamidu, po zhomogrenizovaní sa k zmesi přidá

   O, 01 - 1,0 hmotnostných dielov biíunkčneho sieťovacieho reagentu, s výhodou 0,02 - 0,5 hmotnostných dielov glutaraidehydu, zmes sa ponechá reagovat¹ pri teplote -3 až 30® C, s výhodou pri O - 10®C po dobu 1 až 30 minut, potom sa přidá 0,05 - 1,0 hmotnostných dielov iniciátora a akcelerátora polymerizácie, s výhodou 0,07 0,20 hmotnostných dielov persíranu amonného a Ν,Μ,Ν ',N tetrametyletyléndiaminu, vzniknutý polyakrylamidový biokatalyzátor sa upraví na velkost' častíc 0,1 - 10 mm, suspenduje vo vodě a/alebo v tlmivom rozteku a/alebo v 0,01 - 1 % rozteku glutaraldehydu uo vodě, alebo v tlmivom roztoku 10 - 120 min., separuje, premýva a/alebo ďalej zbaví uody a potom ponechá napučiavať vo vodě, alebo v tlmivom roztoku pri teplote 1-20 ®C.