CZ26415U1 - Zařízení k provádění separace syrovátkových proteinů z mléčného média - Google Patents
Zařízení k provádění separace syrovátkových proteinů z mléčného média Download PDFInfo
- Publication number
- CZ26415U1 CZ26415U1 CZ2013-28770U CZ201328770U CZ26415U1 CZ 26415 U1 CZ26415 U1 CZ 26415U1 CZ 201328770 U CZ201328770 U CZ 201328770U CZ 26415 U1 CZ26415 U1 CZ 26415U1
- Authority
- CZ
- Czechia
- Prior art keywords
- separation
- milk
- lpo
- sorbent
- medium
- Prior art date
Links
- 238000000926 separation method Methods 0.000 title claims description 93
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 title claims description 70
- 239000008267 milk Substances 0.000 title claims description 70
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 title claims description 70
- 108010046377 Whey Proteins Proteins 0.000 title claims description 34
- 235000021119 whey protein Nutrition 0.000 title claims description 13
- 239000002594 sorbent Substances 0.000 claims description 75
- 108010023244 Lactoperoxidase Proteins 0.000 claims description 68
- 102000045576 Lactoperoxidases Human genes 0.000 claims description 68
- 229940057428 lactoperoxidase Drugs 0.000 claims description 68
- 102000007544 Whey Proteins Human genes 0.000 claims description 25
- 239000002245 particle Substances 0.000 claims description 18
- 238000003860 storage Methods 0.000 claims description 18
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 claims description 17
- 238000001914 filtration Methods 0.000 claims description 6
- CSSYQJWUGATIHM-IKGCZBKSSA-N l-phenylalanyl-l-lysyl-l-cysteinyl-l-arginyl-l-arginyl-l-tryptophyl-l-glutaminyl-l-tryptophyl-l-arginyl-l-methionyl-l-lysyl-l-lysyl-l-leucylglycyl-l-alanyl-l-prolyl-l-seryl-l-isoleucyl-l-threonyl-l-cysteinyl-l-valyl-l-arginyl-l-arginyl-l-alanyl-l-phenylal Chemical compound C([C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](C)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(O)=O)C1=CC=CC=C1 CSSYQJWUGATIHM-IKGCZBKSSA-N 0.000 claims description 5
- 239000006148 magnetic separator Substances 0.000 claims description 5
- 102000010445 Lactoferrin Human genes 0.000 claims description 3
- 108010063045 Lactoferrin Proteins 0.000 claims description 3
- 235000021242 lactoferrin Nutrition 0.000 claims description 3
- 229940078795 lactoferrin Drugs 0.000 claims description 3
- 238000011049 filling Methods 0.000 claims description 2
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 48
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 48
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 45
- 238000000034 method Methods 0.000 description 42
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 37
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 27
- 239000005862 Whey Substances 0.000 description 21
- 230000008569 process Effects 0.000 description 21
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 18
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 16
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 15
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 14
- 235000013365 dairy product Nutrition 0.000 description 13
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 10
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 9
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 9
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 8
- 238000007885 magnetic separation Methods 0.000 description 8
- 238000009928 pasteurization Methods 0.000 description 8
- 239000005018 casein Substances 0.000 description 7
- BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N casein, tech. Chemical compound NCCCCC(C(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CC(C)C)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(C(C)O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(COP(O)(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(N)CC1=CC=CC=C1 BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 235000021240 caseins Nutrition 0.000 description 7
- 239000000463 material Substances 0.000 description 7
- 239000000047 product Substances 0.000 description 7
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 6
- 238000005341 cation exchange Methods 0.000 description 6
- 235000019197 fats Nutrition 0.000 description 6
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 6
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 6
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 5
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 5
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 5
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 5
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 description 5
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 5
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 5
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 4
- 238000005277 cation exchange chromatography Methods 0.000 description 4
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 4
- 235000020183 skimmed milk Nutrition 0.000 description 4
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 4
- XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N Iron Chemical compound [Fe] XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102000014171 Milk Proteins Human genes 0.000 description 3
- 108010011756 Milk Proteins Proteins 0.000 description 3
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 230000000975 bioactive effect Effects 0.000 description 3
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 3
- 150000001768 cations Chemical class 0.000 description 3
- 230000008859 change Effects 0.000 description 3
- 235000013351 cheese Nutrition 0.000 description 3
- 238000013375 chromatographic separation Methods 0.000 description 3
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 3
- 235000015872 dietary supplement Nutrition 0.000 description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 3
- 239000004744 fabric Substances 0.000 description 3
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 3
- 238000005342 ion exchange Methods 0.000 description 3
- 235000021239 milk protein Nutrition 0.000 description 3
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 3
- 239000000741 silica gel Substances 0.000 description 3
- 229910002027 silica gel Inorganic materials 0.000 description 3
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 3
- MYRTYDVEIRVNKP-UHFFFAOYSA-N 1,2-Divinylbenzene Chemical compound C=CC1=CC=CC=C1C=C MYRTYDVEIRVNKP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 2
- 102100033468 Lysozyme C Human genes 0.000 description 2
- 108010014251 Muramidase Proteins 0.000 description 2
- 108010062010 N-Acetylmuramoyl-L-alanine Amidase Proteins 0.000 description 2
- PPBRXRYQALVLMV-UHFFFAOYSA-N Styrene Chemical compound C=CC1=CC=CC=C1 PPBRXRYQALVLMV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000003463 adsorbent Substances 0.000 description 2
- 238000013019 agitation Methods 0.000 description 2
- 230000000844 anti-bacterial effect Effects 0.000 description 2
- 230000003078 antioxidant effect Effects 0.000 description 2
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 239000002537 cosmetic Substances 0.000 description 2
- 235000020247 cow milk Nutrition 0.000 description 2
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 2
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 2
- 238000007306 functionalization reaction Methods 0.000 description 2
- 235000010335 lysozyme Nutrition 0.000 description 2
- 229960000274 lysozyme Drugs 0.000 description 2
- 239000004325 lysozyme Substances 0.000 description 2
- 239000000696 magnetic material Substances 0.000 description 2
- 239000006249 magnetic particle Substances 0.000 description 2
- 238000001471 micro-filtration Methods 0.000 description 2
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 2
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 238000001694 spray drying Methods 0.000 description 2
- NWUYHJFMYQTDRP-UHFFFAOYSA-N 1,2-bis(ethenyl)benzene;1-ethenyl-2-ethylbenzene;styrene Chemical compound C=CC1=CC=CC=C1.CCC1=CC=CC=C1C=C.C=CC1=CC=CC=C1C=C NWUYHJFMYQTDRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000002874 Acne Vulgaris Diseases 0.000 description 1
- HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N Acrylamide Chemical compound NC(=O)C=C HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 230000005526 G1 to G0 transition Effects 0.000 description 1
- HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N Heparin Chemical compound OC1C(NC(=O)C)C(O)OC(COS(O)(=O)=O)C1OC1C(OS(O)(=O)=O)C(O)C(OC2C(C(OS(O)(=O)=O)C(OC3C(C(O)C(O)C(O3)C(O)=O)OS(O)(=O)=O)C(CO)O2)NS(O)(=O)=O)C(C(O)=O)O1 HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000004407 Lactalbumin Human genes 0.000 description 1
- 108090000942 Lactalbumin Proteins 0.000 description 1
- 102000008192 Lactoglobulins Human genes 0.000 description 1
- 108010060630 Lactoglobulins Proteins 0.000 description 1
- 208000012868 Overgrowth Diseases 0.000 description 1
- 102000003992 Peroxidases Human genes 0.000 description 1
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 238000003916 acid precipitation Methods 0.000 description 1
- 206010000496 acne Diseases 0.000 description 1
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 208000007502 anemia Diseases 0.000 description 1
- 230000003217 anti-cancerogenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000000845 anti-microbial effect Effects 0.000 description 1
- 230000000840 anti-viral effect Effects 0.000 description 1
- 239000003963 antioxidant agent Substances 0.000 description 1
- 229910001566 austenite Inorganic materials 0.000 description 1
- OHDRQQURAXLVGJ-HLVWOLMTSA-N azane;(2e)-3-ethyl-2-[(e)-(3-ethyl-6-sulfo-1,3-benzothiazol-2-ylidene)hydrazinylidene]-1,3-benzothiazole-6-sulfonic acid Chemical compound [NH4+].[NH4+].S/1C2=CC(S([O-])(=O)=O)=CC=C2N(CC)C\1=N/N=C1/SC2=CC(S([O-])(=O)=O)=CC=C2N1CC OHDRQQURAXLVGJ-HLVWOLMTSA-N 0.000 description 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 1
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 235000014121 butter Nutrition 0.000 description 1
- 239000003729 cation exchange resin Substances 0.000 description 1
- -1 cationic ion Chemical class 0.000 description 1
- 235000019219 chocolate Nutrition 0.000 description 1
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 1
- 210000003022 colostrum Anatomy 0.000 description 1
- 235000021277 colostrum Nutrition 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 1
- 239000000945 filler Substances 0.000 description 1
- 235000013350 formula milk Nutrition 0.000 description 1
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 1
- 239000012737 fresh medium Substances 0.000 description 1
- 210000001035 gastrointestinal tract Anatomy 0.000 description 1
- 238000005227 gel permeation chromatography Methods 0.000 description 1
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 1
- 229920000669 heparin Polymers 0.000 description 1
- 229960002897 heparin Drugs 0.000 description 1
- 235000020256 human milk Nutrition 0.000 description 1
- 210000004251 human milk Anatomy 0.000 description 1
- 125000004435 hydrogen atom Chemical group [H]* 0.000 description 1
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 1
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 1
- 208000027866 inflammatory disease Diseases 0.000 description 1
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 1
- 239000003456 ion exchange resin Substances 0.000 description 1
- 229920003303 ion-exchange polymer Polymers 0.000 description 1
- 229910052742 iron Inorganic materials 0.000 description 1
- WTFXARWRTYJXII-UHFFFAOYSA-N iron(2+);iron(3+);oxygen(2-) Chemical compound [O-2].[O-2].[O-2].[O-2].[Fe+2].[Fe+3].[Fe+3] WTFXARWRTYJXII-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000011031 large-scale manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 239000007791 liquid phase Substances 0.000 description 1
- 238000012792 lyophilization process Methods 0.000 description 1
- 239000002122 magnetic nanoparticle Substances 0.000 description 1
- 230000005415 magnetization Effects 0.000 description 1
- 238000010907 mechanical stirring Methods 0.000 description 1
- 150000002734 metacrylic acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 239000011859 microparticle Substances 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 239000002324 mouth wash Substances 0.000 description 1
- 238000007040 multi-step synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 239000002105 nanoparticle Substances 0.000 description 1
- 229940031182 nanoparticles iron oxide Drugs 0.000 description 1
- 238000000879 optical micrograph Methods 0.000 description 1
- 238000012856 packing Methods 0.000 description 1
- 235000020200 pasteurised milk Nutrition 0.000 description 1
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 1
- 201000001245 periodontitis Diseases 0.000 description 1
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 1
- 239000000825 pharmaceutical preparation Substances 0.000 description 1
- 229940127557 pharmaceutical product Drugs 0.000 description 1
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000006116 polymerization reaction Methods 0.000 description 1
- 229920000193 polymethacrylate Polymers 0.000 description 1
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 1
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 238000002203 pretreatment Methods 0.000 description 1
- 239000012460 protein solution Substances 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 238000004062 sedimentation Methods 0.000 description 1
- 235000019333 sodium laurylsulphate Nutrition 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 1
- 229910001220 stainless steel Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010935 stainless steel Substances 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 238000006557 surface reaction Methods 0.000 description 1
- 238000004381 surface treatment Methods 0.000 description 1
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 238000010189 synthetic method Methods 0.000 description 1
- 239000013076 target substance Substances 0.000 description 1
- 239000000606 toothpaste Substances 0.000 description 1
- 210000001635 urinary tract Anatomy 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- 239000002699 waste material Substances 0.000 description 1
- 235000008939 whole milk Nutrition 0.000 description 1
- 235000013618 yogurt Nutrition 0.000 description 1
- 235000021241 α-lactalbumin Nutrition 0.000 description 1
Landscapes
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Dairy Products (AREA)
Description
Zařízení k provádění separace syrovátkových proteinů z mléčného média
Oblast techniky
Technické řešení spadá do oblasti mlékárenského průmyslu a týká se zařízení k provádění separace syrovátkových proteinů, například laktoferinu nebo laktoperoxidázy, z mléčného média, zejména čerstvého mléka.
Dosavadní stav techniky
Laktoferin (dále Lf) i laktoperoxidáza (dále LPO) jsou syrovátkové proteiny o stejné molekulové hmotnosti, a to 78 kDa. Oba tyto proteiny se nejvíce vyskytují v prvotním mateřském mléce, kde působí jako ochrana právě narozených mláďat před vlivy různých patogenů.
Lf je označován jako antibakteriální, antiviriální a antimikrobiální protein [Levay. P. F.; Viljoen, M. Hematol. J. 1995, 80, 252-267]. Má ovšem i antioxidativní a dokonce i antikarcinogenní účinky [(a) Gutteridge, J. M.; Paterson, S. K.; Segal, A. W.; Halliwell, B. Biochem. J. 1981,199, 259-261, (b) Tuccari. G.; Barresi, G. Biometals 2011, 24, 775-784], O Lf lze tedy obecně říci, že svými bioaktivními účinky podporuje lidskou imunitu. Na trhu proto existuje velké množství farmaceutických výrobků a doplňků stravy obsahujících tento protein. Nej častěji se přidává do produktů na posílení imunity, výjimkou nejsou ale ani produkty na potlačení akné, pro zdravou funkci močových cest, pro potlačení zánětlivých onemocněních trávicího traktu nebo produkty podávané při chudokrevnosti. Často se prodává i Lf samotný jako doplněk stravy nebo je obsažen v kojeneckých výživách.
LPO působí v těle jako antibakteriálná látka a především jako antioxidant [Ostdal, H.; Bjerrum, M. J.; Pedersen, J. a; Andersen, H. J. J. Agric. Food Chem. 2000, 48, 3939-3944], V praxi se často přidává do kosmetických přípravků či do zubních past a ústních vod pro léčbu paradentózy.
Vzhledem k široké aplikaci obou uvedených proteinů byla od doby jejich objevení vyvinuta celá řada technik jejich velkoobjemových separací. Zvyšující se náročnost na kvalitu a čistotu Lf a LPO vedla v průběhu doby k vývoji sofistikovanějších a procesně i finančně efektivnějších separačních postupů. Obecně lze říci, že jako nejčastější zdroj pro velkoprodukci Lf a LPO se bez ohledu na separační techniku používá kravské mléko. Koncentrace Lf je zde cca 100 mg.l'1, koncentrace LPO okolo 30 mg.l1. Značnou výhodou Lf při izolaci z kravského mléka je jeho vysoká termostabilita [Sanchez, L.; Peiro, J. M.; Castillo, H.; Perez, M. D.; Ena, J. M.; Calvo, M. J. Food Sci. 1992, 57, 873-879]. Díky tomu lze Lf izolovat i ze syrovátky, což je odpadní produkt mlékárenství, který prošel pasterizací. Koncentrace Lf je ovšem v syrovátce značně nižší (až osmkrát) než v čerstvém mléku. Oproti tomu je méně stabilní LPO v syrovátce většinou již zcela v denaturovaném, tj. neaktivním, stavu.
Řešení dle spisu US 4 436 658 se zabývá problematikou separace Lf a immunoglubulínů (dále Ig) právě ze syrovátky pomocí kolonové adsorpce na silikagel při bazických podmínkách (pH 7,9 až 8,5). Ze silikagelu lze poté eluovat Lf změnou iontové sily (7) pří nízkých hodnotách pH; např. I = 0,5 M, pH 4. Touto metodou jsou souběžně eluovány i Ig, proto má získaný Lf maximální čistotu do 70 %, běžně okolo 50 %. Tato čistota je naprosto nevyhovující stejně tak jako výtěžnost Lf na 1 litr čerstvého mléka.
Častěji je prováděna separace Lf, případně i LPO, pomocí kationtově-výměnné chromatografie. Je to způsobeno faktem, že poUze tyto dva minoritní syrovátkové proteiny z velkého množství ostatních syrovátkových proteinů jsou za neutrálního pH v mléce/syrovátce kladně nabity, jejich hodnota pH je vyšší než 7, přičemž pH čerstvého mléka je okolo 6,7. Proto se v průmyslovém měřítku jiné postupy separace, jako např. zmíněná separace na silikagelu, gelová chromatografie, afmitní chromatografie, separace založené na specifické interakci s protilátkou, téměř nevyužívají.
- 1 CZ 26415 Ul
Separace Lf pomocí kationtově-výměnné chromatografie, a to nejen ze syrovátky, je popsána ve spise US 4 791 193. Zde jsou detailně rozebrány typy iontoměničových adsorbentů z hlediska jejich kapacity pro modelový protein a dále pak výtěžnost a čistota izolovaného Lf. Jako nejvhodnější adsorbenty jsou zde identifikovány iontoměniče z (bio)polymemích materiálů, tj. agarosa, agarosadextran, hydroxylovaný polymethakrylát aj., se slabě kyselou karboxylovou funkcí na povrchu. Výhodou těchto sorbentů je jejich vysoká porozita, která zaručuje vysokou kapacitu, a jejich hydrofílní povaha, která nedenaturuje separované proteiny. Z těchto sorbentů lze navázaný Lf a LPO vymýt pouhou změnou iontové sily. Kromě syrovátky je zde Lf izolován i z odstředěného mléka, které v uvedeném případě neprošlo pasterizací. V zaběhnutém mlékárenském provozu, který se věnuje kompletnímu zpracování mléka, je však téměř nemyslitelné přestavět výrobu tak, aby pasterizace byla provedena až po odstředění. Kromě toho spis neřeší separaci LPO, která se během izolace Lf za daných podmínek také váže na iontoměničový sorbent.
Problematika separace Lf a LPO pomocí kationtově-výměnné chromatografie je řešena ve spise US 5 516 675. Zde je popsáno, při jakých podmínkách jsou eluovány jednotlivé proteiny navázané na iontoměničový sorbent. Jsou zde použity různé hodnoty pH a různé hodnoty iontové síly. LPO je zde eluována jako první při pH nižším než 5, iontovou silou do hodnoty 0,5 M. Následně jsou eluovány Ig při pH okolo 7 a I < 0,5 M, přitom jen malé množství Ig se váže na kationtový iontoměnič, tj. mají isoelektrický bod nad 7, a jejich množství je v různých typech i ve várkách mléka jiné, většinou však téměř zanedbatelné. Jako poslední je eluován Lf při pH okolo 7 a I = 1 M. Diskutabilní je však čistota izolovaných frakcí (80 % a vyšší), která byla určena SDSPAGE (polyacrylamid gelová elektroforéza v přítomnosti dodecylsíranu sodného), pomocí které se nedá rozlišit Lf a LPO. Navíc používání pufrů pří elucích proteinů je v průmyslových aplikacích procesně náročnější.
Další relevantní spis US 5 596 082 aplikuje výše uvedené postupy při kolonové separaci Lf a LPO na kationtovém iontoměniči o velikosti náplně vyšší než 100 pm, s výhodou i 300 pm, eluce probíhá gradientem iontové síly při neutrálním pH. Díky těmto parametrům náplně kolony může syrovátka kolonou protékat vysokou rychlostí, a to až 600 objemů kolony za hodinu. To je zvláště výhodné při separacích z médií, kde je separovaná látka přítomna pouze v malém množství, tak jako právě Lf a LPO v mléce. Toto řešení však stále neposkytuje možnost separace Lf a LPO z mléčného média, které neprošlo pasterizačním procesem.
Jeden ze způsobů, který lze také použít pro rychlejší izolaci Lf a LPO je tzv. membránová separace. Při této separaci neprotéká syrovátka kolonou, ale systémem membrán, které jsou také funkcionalizované na typickou kationtově-výměnnou separací (-OSO3H, -COOH aj.). Tento způsob separace je např. uveden v publikaci Isolation and purification of proteins (Hatti-Kaul, R. & Mattiasson, B. Marcel Dekker, lne.: New York, 2003). Tato separace je však ještě náročnější na předzpracování syrovátky či mléčného média, bez kterého může mnohem častěji docházet k blokování separační jednotky než u kolonového uspořádání. Separace z čerstvého mléka se tedy při tomto uspořádání jeví nereálná.
Další známé spisy týkající se velkokapacitní separace Lf a LPO již pouze rozšiřují zde uvedené separační postupy. Jako příklad je možno uvést spis US 7 932 069, ve kterém je popsán proces produkce čistější frakce LPO díky vysrážení ostatních nečistot během ultrafiltrace. Další příklad obdobného procesuje uveden ve spise US 5 919 913, kde je řešena separace lidského Lf z mléka transgenně upravených krav. Nedílnou součástí produkce těchto proteinů je také i čištění získaných roztoků pomocí ultrafiltrace a následné sušení do práškové formy pomocí sprej ového sušení či lyofilizačních procesů. Tyto známé postupy je vhodné kombinovat takovým způsobem, aby docházelo k co nejnižší degradaci kvality, tj denaturaci čištěných vzorků proteinů. Jako příklad použitelného postupu čištění lze uvést řešení výrobní linky dle spisu CZ 23725 Ul, kde je popsáno, jak vhodnou kombinací zmíněných procesů lze dosáhnout minimálního znehodnocení vzorků.
Je zřejmé, že zavedené separační postupy poskytují frakce Lf a LPO o dostatečné čistotě. V současné době je však klíčovým parametrem jejich výtěžnost na objem zpracovávaného mléka,
-2CZ 26415 U1 a také kvalita Lf a LPO. Oba tyto klíčové parametry závisí především na typu mléčného média, ze kterého jsou tyto proteiny izolovány. Výhodou izolace ze syrovátky je jednoznačně nízká cena, koncentrace Lf je zde však velmi nízká a LPO se zde již téměř nevyskytuje. Odstředěné mléko oproti tomu má vysokou koncentraci Lf, kvalita a koncentrace LPO je zde však stále závislá na typu pasterizace. Pro mlékárenské provozy zabývající se produkcí širší škály produktů je však výhodnější provádět pasteraci, při které je LPO plně denaturována. Ke všemu se musí odstředěné mléko před separací ještě náročně předzpracovávat, aby nedocházelo k blokování kolon, popř. membrán, čímž se notně zvyšuje procesní náročnost.
Problematiku separačního média řeší spis US 2005/0220953 AI popisující, jak získat koncentrovaný roztok Lf v průběhu zpracování mléka. Nízká koncentrace Lf v syrovátce je způsobena tím, že při srážení kaseinu ve výrobě sýrů a tvarohů dochází i k sedimentaci Lf, který má opačný náboj než kasein a silně s ním iontově interaguje. V syrovátce je posléze jen minimum Lf. Tato patentová přihláška popisuje postup, jak následně jednoduše uvolnit Lf do roztoku ze sraženého kaseinu např. iontovou silou, tj. roztoky NaCl. Získaný roztok se následně musí předzpracovat před samotnou chromatografickou separací, a to odstraněním NaCl. Sražený kasein je také nutné z roztoku NaCl přečistit, zvlášť pokud je kasein následně zpracován např. na tvaroh. Díky tomuto postupu se sice zvýší výtěžnost na objem zpracovávaného mléka a získá se poměrně koncentrovaný roztok Lf, čímž se zkrátí doba chromatografické separace, ale proces se technologicky náročnější. Ke všemu lze takto využít jen omezené množství mléka, které již prošlo pasterizací.
Aby byly splněny všechny podmínky kladené na separaci Lf a LPO, tj. čistota, kvalita a dobrá výtěžnost, jeví se jako nejvhodnější izolovat Lf a LPO kationtově-výměnnou chromatografií rovnou z čerstvého mléka. Čerstvé mléko nicméně obsahuje kuličky tuku (až 10 pm velké), které ucpávají separační jednotku (kolonu, membránu). V literatuře je možné dohledat postupy, aplikující čerstvé mléko na kolonu při 37 °C [C. J. Fee and A. Chand, Sep. Purif. Technol., 2006, 48, 143-149]. Při této teplotě totiž tuk přechází do kapalné fáze a neblokuje kolonu. V průmyslovém měřítku je však zcela nemyslitelné zahřát čerstvé mléko na tuto teplotu kvůli možnosti velmi rychlého přemnožení bakterií.
Rozumná cesta, jak separovat Lf a LPO o vysoké kvalitě, tedy z čerstvého média, je separace z mléčného proteinového koncentrátu (MPK). MPK se připravuje kombinací mikrofiltrace a ultrafiltrace. Z čerstvého mléka se mikrofiltrací oddělí tuk a kasein, který se dále zpracovává. Prošlé syrovátkové proteiny se zakoncentrují pomocí ultrafiltrace, aby se Lf a LPO nemuselo separovat z velkého množství média. Tento technologický postup je však extrémně procesně a investičně náročný a je téměř nemožné ho zavést do zaběhnutých mlékárenských provozů.
Jako vhodnou alternativou stávajícím procesů se jeví magnetická separace, která má nespornou výhodu v tom, že je založena na tzv. vsádkové separaci, tedy že separované látky jsou z média vychytávány pouhým mechanickým mícháním sorbentu v celém objemu tohoto média. Lze ji tedy použít i v heterogenních systémech, ze kterých lze magnetický sorbent jednoduše odstranit vnějším magnetickým polem. Díky vsádkové separaci nemusí médium protékat přes separační jednotku (kolonu, membránu), což je procesní krok, jehož časová náročnost u typických velkokapacitních chromatografických přístupů roste s objemem média. Magnetická separace se tedy jeví jako relativně časově nenáročná a také nenáročná na kvalitu a homogenitu separačního média.
Jako magnetický materiál pro separaci biosubstancí se nej častěji používají nanočástice či mikročástice založené na oxidech železa (Fe3O4, y-Fe2O3), které jsou komerčně dostupné či se dají připravit jednoduchými syntetickými postupy. Možností jejich povrchových úprav, tzv. funkcionalizací, je nepřeberné množství. Na jejich povrch se dá ukotvit celá řada polymemích či povrchově aktivních látek, které mohou být dále modifikovány. Dosud použité postupy pro separaci, izolaci či purifikaci proteinů byly důkladně shrnuty v literatuře [Šafařík, I.; Šafaříkova, M. BioMagn. Res. Technol. 2004, 17, 1-17],
Zásadní práce ve vývoji magnetických separačních metod byla vypracována v německém
Karlsruhe a je popsána ve spise US 6 942 806. Zde byla vyvinuta metoda nazývající se High
-3 CZ 26415 U1
Gradient Magnetic Fishing (vychytávání gradientovým magnetickým polem), dále jen HGMF. Jedná se o specifický způsob vychytávání magnetických částic, který je založen na průtočné separaci částic „vypínatelným“ permanentním magnetem. Poměrně důležitou roli v konceptu HGMF, hrají magnetické sorbenty. Pro dobré fungování HGMF musí tyto sorbenty splňovat následující parametry. Musí být co nejméně porézní pro rychlou adsorpci cílené látky (do 5 minut) a měly by být superparamagnetické, tzn. nevykazující žádnou remanentní magnetizaci, a tím i dobře rozptýlitelné po separaci. Další parametry jsou vysoká plocha povrchu pro vyšší kapacitu (20 až 100 m2.g'') a velikost těchto částic (spíše agregátů částic) nad 500 nm pro rychlejší odpověď na magnetické pole či případnou možnost separace částic přes velmi jemné mechanické filtry [Franzreb, M.; Siemann-Herzberg, M.; Hobley, T. J.; Thomas, O. R. T. Appl. Microbiol. Biotechnol. 2006, 70, 505-516].
Tento systém byl také vyzkoušen na separaci Lf a LPO. Jako magnetické částice byly použity agregáty superparamagnetického oxidu železa připravené precipitační metodou dle Massarta. Tyto agregáty byly následně funkcionalizovány na silně kyselou kationtově výměnnou skupinu (SO3H) náročnou několikakrokovou syntézou, která byla založena na metodě funkcionalizace povrchu částic. Nej lepší kapacita, která byla dosažena adsorpci modelového proteinu, lysozymu, na povrch takto připravených částic, měla hodnotu 230 mg lysozymu na 1 g částic při pokojové teplotě. Neuspokojivá byla však čistota vyizolovaného Lf, protože pomocí těchto částic nebylo možné od sebe rozseparovat Lf a LPO [(a) Heeboll-Nielsen, A.; Justesen, S. F. L.; Hobley, T. J.; Thomas, O. R. T. Sep. Sci. Technol. 2004, 39, 2891-2914, (b) Heeboll-Nielsen, A.; Justesen, S. F. L.; Thomas, O. R. T. J. Biotechnol. 2004,113, 247-262],
Jednou z dalších metod, která byla použita pro separaci Lf, byla afinitní magnetická separace pomocí magnetických nanočástic, na kterých byl ukotven heparin. Takto připravené částice vykazovaly kapacitu 164 mg proteinu na gram částic při 37 °C v roztoku samotného Lf, a díky specifické adsorpci navazovaly ze syrovátky pouze tento protein, který byl následně eluován roztokem NaCl. [Chen, L.; Guo, C.; Guan, Y.; Liu, H. Sep. Purif. Technol. 2007, 56, 168-174], Poměrně nízká kapacita a velmi finančně i procesně náročná příprava těchto částic se však zdá jako velká limitace rozšíření tohoto přístupu do větších měřítek.
Lze shrnout, že magnetické separace založené na vsádkové separaci mají velký potenciál ve velkokapacitních izolacích biomakromolekul ze „surového“ a tedy i nehomogenního média. Tyto separace by mohly svými výhodami zastínit tradiční chromatografické postupy díky své nenáročnosti na předpřípravu média a díky procesní jednoduchosti. V případě izolace Lf však zatím nebyl použit postup magnetické izolace, a to ani v případě HGMF, který by poskytoval Lf o velké čistotě, byl ekonomicky i procesně nenáročný a zároveň by umožňoval izolovat Lf z čerstvého mléka, stejně jako ostatních mléčných médií, ve větším měřítku. Je proto úkolem předkládaného vynálezu představit novou metodu separace Lf a LPO, která by s využitím výše uvedených a popsaných postupů umožnila získávání těchto proteinů ze všech druhů mléčných médií při zavedení do zaběhnutých mlékárenských provozů, které se zabývají produkcí široké škály svých produktů, a to neinvazní formou při poměrně malých zásazích do technologií výroby mléčných produktů při malé finanční náročnosti na pořízení příslušného zařízení.
Podstata technického řešení
Stanoveného cíle je dosaženo technickým řešením, kterým je zařízení k provádění způsobu separace syrovátkových proteinů obsahující skladovací tank mléčného média opatřený hlavním míchadlem a výpustí, jehož podstata spočívá v tom, že v oblasti proudění promíchávaného mléčného média je umístěn filtrační mechanismus s obsahem ve vznosu udržovaných částic sorbentu, s výhodou filtrační koš, tak, že je ponořen v separačním médiu, přičemž velikost ok filtračního mechanismu se v závislosti na druhu použitého sorbentu pohybuje v rozmezí hodnot 1 pm až 1 cm.
Ve výhodném provedení je filtrační mechanismus umístěn ve vnitřním prostoru skladovacího tanku nebo je filtrační mechanismus umístěn v separačním tanku instalovaném v potrubním sys-4CZ 26415 U1 tému mimo skladovací tank, přičemž v potrubním systému je mezi skladovacím tankem a separačním tankem zabudováno plnící čerpadlo a na výtoku ze separačního tanku průtočné čerpadlo.
V optimálním provedení zařízení je filtrační mechanismus vybaven sekundárním míchadlem a na výpusti ze skladovacího tankuje zabudován magnetický separátor.
Technickým řešením se dosahuje vyššího účinku v tom, že se na rozdíl od konvenčního chromatograficko-kolonového přístupu vyznačuje značně jednodušším procesem adsorpce, který je prováděn pouhým rozmícháváním sorbentu v celém objemu média. Médium, tj. čerstvé mléko, mléčný proteinový koncentrát, syrovátka atd. nemusí protékat pod tlakem přes kolonu 4i membránu jako u typického chromatografického přístupu. Díky tomu navíc nemůže docházet k častému blokování a ucpávání separační jednotky, tedy kolony nebo membrány, a zároveň není doba separace závislá na objemu média ale pouze na poměru sorbentu k médiu. Další výhodou dle tohoto technického řešení je možnost použití navržené separace i v čerstvém mléku. To umožňuje izolovat Lf a LPO v té nejlepší kvalitě i výtěžnosti před samotnou pasterizací. Zjednodušení nastává i při samotném procesu eluce. Eluční objem potřebný pro vyvázání proteinů ze sorbentů pouhým mechanickým promícháním je totiž značně menší než při protékání elučního roztoku kolonou. Menší eluční objem značně ulehčuje další zpracování vyizolovaných proteinů. Ve srovnání s dnes nej modernějším způsobem separace, tj. chromatografickou separací z mléčného proteinového koncentrátu, se košově-vsádková separace jeví jako neinvazivní, tedy finančně i technologicky méně náročná, pro zavedení do zaběhnutých mlékárenských provozů, které se zabývají produkcí široké škály svých produktů. Kvalita i čistota Lf a LPO je u obou procesů srovnatelná. Košově-vsádková separace pomocí porézních sorbentů však poskytuje možnost izolovat ze širšího spektra mléka. Díky tomu se tato izolace jeví jako vhodnou alternativou k současným separačním procesům, avšak nabízí možnost vyšší výtěžnosti na objem celkově zpracovaného mléka za současného snížení technologické náročnosti.
Popis obrázků na připojených výkresech
Podstata technického řešení a jeho konkrétní provedení jsou schematicky znázorněny na připojených výkresech, na nichž:
obr. 1 je schéma základního provedení zařízení s filtračním košem umístěným ve skladovacím tanku, obr. 2 je schéma alternativního provedení zařízení s filtračním košem umístěným v separačním tanku, obr. 3 je snímek z optického mikroskopu s vyobrazením magnetický kationtový iontoměnič s -SO3 H funkcí o velikosti částic 50 až 80 pm, který byl použit při separaci Lf a LPO, obr. 4 a obr. 5 jsou vyobrazení sorbentu z obr. 3 nad a pod filtrační tkaninou z nerezového materiálu s oky 50 pm, ze které lze konstruovat výplň separačních košů, obr. 6 je grafické znázornění závislosti maximální kapacity (tj. hmotnosti vyvázaného proteinu) Lf na hmotnosti použitého sorbentu -OSO3H funkcí, obr. 7 je grafické znázornění závislosti maximální kapacity (tj. hmotnosti vyvázaného proteinu) Lf na hmotnosti použitého sorbentu s -COOH funkcí a obr. 8 zobrazuje SDS-PAGE vyizolovaných proteinů, které byly získány postupem, který je uveden v příkladu 1 (I - proteinové standardy dle velikostní škály v kDA, II - Lf standard, III - proteiny v čerstvém mléku: Imunoglobuliny, Lf/LPO, hovězí sérový albumin, Imunoglobuliny (velká podjednotka), Imunoglobuliny (malá podjednotka), β-laktoglobulin, α-laktalbumin). IV proteiny v čerstvém mléku po izolaci Lf a LPO, V - proteiny vymyté ze sorbentu vodou. VI - 1. frakce dle postupu v příkladu 1, VII - 2. frakce dle postupu v příkladu 1, VIII - 3. frakce dle postupu v příkladu 1.)
-5CZ 26415 Ul
Příklady provedení technického řešení
Způsob separace Lf a LPO v zařízení podle technického řešení je založený na tzv. košově-vsádkové separaci těchto proteinů pomocí typických chromatografických sorbentů z čerstvého mléka, z odstředěného mléka či ze syrovátky nebo z ostatních Lf obsahujících médií. Tento typ separace kombinuje možnost vsádkové separace jako v případě magnetických separací, tj. izolace pomocí rozmíchání sorbentu v celém objemu média, a zároveň využívá typických chromatografických sorbentů, které lze z média odstranit mechanickým filtrováním případně i vnějším magnetickým polem. Zároveň lze po eluci, tedy vymytí, separovaných proteinů sorbent opakovaně použít.
Uvedeného cíle je dosaženo, použije-li se při separaci Lf a LPO sorbent typický pro kolonové uspořádání separací Lf a LPO, tedy sorbent splňující následující parametry:
a) Sorbent je tvořen polymemím materiálem, který je funkcionalizován na typickou kationtově výměnnou funkci, např. -COO', -OSO3, -PO32, -OPO3 2‘ či jinou skupinou s kyselým vodíkem nebo ve formě její soli.
b) Polymemí materiál sorbentu má především hydrofílní charakter, avšak není ve vodě za běžných podmínek rozpustný. Hydrofílní charakter je vhodný pro zachování nativního stavu proteinů v průběhu separace. Dále musí polymemí materiál splňovat možnost další funkcionalizace na typickou kationtově výměnnou funkci. Zejména se jedná o materiály tvořené ve vodě nerozpustnými polysacharidy (např. agaróza, celulóza, modifikovaný dextran) nebo případně i nehydrofilními organickými látkami běžně využívanými jako stacionární fáze chromatografických kolon při separaci biomakromolekul, např. sorbenty které vznikly polymerací akrylamidu, styrenu, divinylbenzenu, metakrylátů aj.
c) Pro dosažení cíle uplatnění tohoto technického řešení musí dále sorbent vykazovat potřebnou mechanickou stabilitu a určitou velikostní distribuci, aby vydržel procesní nároky na něj kladené při separaci Lf a LPO a zároveň aby byl i mechanicky filtrovatelný. Se značnou výhodou lze použít sorbent splňující výše zmíněné nároky (a, b), jenž dále vykazuje sférický charakter, tj. má kulovitý tvar, a má velikost v řádech desítek až stovek mikrometrů, např. s distribucí 50 až 80pm, 80 až 150 pm, pro snadnou filtrovatelnost mechanickými filtry. Díky sférickému tvaru je sorbent posléze i mechanicky stabilnější.
d) Dále musí být sférické částice sorbentu vysoce porézní a vykazovat vysokou kapacitu pro Lf/LPO.
e) Sorbentem je i polymemí materiál s uvnitř zabudovaným magnetickým materiálem, s výhodou magnetické nanočástice oxidu železa případně jiný materiál reagující na vnější magnetické pole. Tato magnetická složka následně slouží jako druhý pojistný mechanismus, kromě mechanicky filtrujícího způsobu, jak odstranit sorbent z mléčného či jiného média.
Základní provedení zařízení k provádění dané separace je znázorněno na obr. 1 a sestává ze skladovacího tanku 1 mléčného média, např. čerstvého mléka, opatřeného hlavním míchadlem 2, v jehož vnitřním prostoru je umístěn filtrační mechanismus 3, s výhodou filtrační koš, jehož velikost ok se v závislosti na druhu použitého sorbentu pohybuje v rozmezí hodnot 1 pm až 1 cm tak, že je ponořen v separačním médiu. Na výpusti 4 ze skladovacího tanku I je pak zabudován pojistný magnetický separátor 5 pro zajištění 100% oddělení magnetického sorbentu z média. Díky proudění média ve skladovacím tanku i dochází k obměně média i ve filtračním mechanismu 3, kde je pomocí sekundárního míchadla 31 zajišťován vznos částic sorbentu a dochází k jejich intenzivnímu kontaktu se separačním médiem. Filtrační mechanismus 3 mechanicky zamezí přímému kontaktu sorbentu s celým objemem média, avšak zachová možnost jejich vzájemné interakce.
V alternativním provedení zařízení podle obr. 2 je filtrační mechanismus 3, tedy koš, umístěn v separačním tanku 6 instalovaném v potrubním systému 9 vyvedeném mimo skladovací tank f, kam je mléčné médium přečerpáváno pomocí plnícího čerpadla 7, které zajišťuje neustálou obměnu média. Ze separačního tanku 6 je pak médium vedeno průtočným čerpadlem 8 zpět do
-6CZ 26415 Ul skladovacího tanku 1. Průtok média přes separační mechanismus 3 je možno zajišťovat po celou dobu jeho skladování před samotným zpracováním mléka.
Vlastního cíle tohoto technického řešení, tj. separace Lf a LPO z mléčných či jiných Lf obsahujících médií pomocí košově-vsádkové separace za použití uvedených sorbentů, vykazujících vysokou kapacitu pro Lf a LPO, je dosaženo pomocí několika jednoduchých operací.
Počáteční krok při izolaci Lf a LPO je adsorpce těchto proteinů pomocí sorbentů, tj. pomocí kationtově-výměnné interakce. S výhodou je sorbent při adsorpci mechanicky rozmíchán do celého objemu mléka/syrovátky i ve velkých objemech. Množství vyizolovaného Lf/LPO následně závisí zejména na kapacitě použitého sorbentů pro daný protein, na poměru magnetického sorbentu k množství média, na době kontaktu a teplotě média. Další důležitý faktor ovlivňující čistotu separovaných proteinů je pH daného mléčného média, tato hodnota by měla být okolo 7 (např. 6,7, tj. pH čerstvého mléka).
Fáze sorpce, tj. vychytávání, proteinů lze s velkou výhodou provádět v skladovacích nádobách, např. tancích, ze samotného čerstvého mléka před jeho vlastním zpracováním jako je pasterizace, odstředění, aj., jak je znázorněno na obr. 1. Podmínkou je, aby tato skladovací nádoba v sobě měla vložený či zabudovaný filtrační mechanismus, například koš, tedy pevnou konstrukci obloženou filtrační tkaninou z nerezového potravinářského materiálu. Proces sorpce proteinů je zaručen mechanickým pohybem sorbentů, avšak díky filtračnímu koši se sorbent nemůže dostat do dalších mlékárenských zpracovatelských procesů a je mechanicky zachycen při vypouštění mléka na filtrační tkanině filtračního koše. V případě použití magnetického derivátu tohoto sorbentů může být na odtoku čerstvého mléka do další fáze zpracování umístěn magnetický separátor pro kompletní zachycení sorbentů, aby bylo dosaženo 100% záruky, že se sorbent nedostane do dalších zpracovatelských fází. Tyto magnetické separátory jsou komerčně dostupné a jsou také často používány v potravinářském průmyslu, např. při výrobě čokolády.
Tento košově-vsádkový proces separace proteinů z čerstvého mléka lze také provádět v jiných uspořádáních, jak je zobrazeno na obr. 2. Tato separace je založena na stejném principu jako výše uvedený proces separace, jen je sorbent umístěn ve vedlejším, až desetkrát menším, tanku s filtračním košem s vlastním mechanickým mícháním. Čerstvé mléko je v tomto menším separačním tanku obměňováno pomocí čerpadel, čímž je kompletně odděleno od samotného separačního procesu a celý zpracovatelský proces mléka je tak zcela nenarušen. Magnetická separace může být pak zařazena jen jako pojistná separace.
Další fází separace je několikanásobné promytí sorbentů vodou pro odstranění nenavázaných proteinů a jiných nežádoucích složek mléka. Poté následuje samotná eluce navázaných proteinů. Eluci lze provést, obdobně jako adsorpci, pouhým mechanickým mícháním sorbentů v elučním roztoku. S výhodou lze eluci provést až v desetině objemu oproti objemu mléčného média, ve kterém byla provedena adsorpce. Lf a LPO se ze sorbentů eluují při obdobných hodnotách iontové síly jaké jsou využívány při klasických chromatografických řešeních. Při nízké iontové síle, např. 0,05 až 0,2 mol/dm3 (dále M) roztoku NaCl o pH 7, která závisí na typu použitého sorbentu, se ze sorbentů eluují nežádoucí imunoglobuliny, jejichž pH dosahuje vyšší hodnoty než 7. Při nepatrně vyšší iontové síle, např. 0,1 až 0,5 M NaCl se eluuje LPO a při iontové síle 0,5 až 1 M roztoku NaCl se eluuje Lf. Získané roztoky proteinů po odstranění sorbentů lze pouze odsolit a zakoncentrovat (např. diaultrafiltrací), posléze ponechat vyschnout běžně používanými procesy (např. sprej ové sušení, lyofilizace). Sorbent následně stačí opět promýt vodou, sterilizovat, například teplotně nebo chemicky, a vrátit pět na začátek separace do separačního tanku a celý proces separace proteinů mnohonásobně opakovat.
Následně uvedené příklady nastiňují jen malou část ze široké škály možností separace Lf a LPO pomocí porézních sorbentů dle technického řešení. Jako sorbent zde byl použit magnetický kationový iontoměnič na bázi celulózy s -OSO3H a - COOH funkcí. Jako sorbent lze však použít i jiné typy (magnetických) porézních sorbentů, které se s výhodou používají jako náplně kolon pro separaci proteinů (bez magnetické složky). Je zde ilustrován především fakt, že lze Lf a LPO
-7CZ 26415 U1 izolovat z čerstvého mléka, dále pak poměr částic k mléčnému médiu, a čistoty elučních frakcí v závislosti na kapacitě a typu použitého sorbentu (slabě kyselá či silně kyselá výměnná funkce).
Čistota Lf a LPO frakcí byla určena pomocí poměru koncentrace daného proteinu k celkové koncentraci všech proteinů. Koncentrace Lf byla určena pomocí ELISA KITu, koncentrace LPO pomocí stanovení peroxidázové aktivity tohoto enzymu k ABTS a celková koncentrace proteinů pomocí Bradfordovy analýzy.
Příklad 1
Do 50 ml čerstvého mléka, které neprošlo pasterizací, bylo přidáno 0,8 ml koncentrovaného komerčně dostupného magnetického celulozového sorbentu s -OSO3H funkcí, 50 až 80 μιη, který byl před samotným použitím třikrát promyt vodou. Hodnota pH vzniklé suspenze byla 6,7. Tato směs byla míchána při pokojové teplotě po dobu následujících dvou hodin. Magnetický sorbent byl následně stažen ručním magnetem a třikrát promyt vodou. Poté byly eluovány proteiny mechanickým promícháním po dobu 10 minut ve tříkrokovém elučním krokovém gradientu iontové síly v 5 ml roztoku NaCl o pH 7. V první frakci se při iontové síle 0,1 M eluovala LPO znečistěná bazickými imunoglobuliny, čistota této frakce LPO byla 60 %, výtěžek 1 mg. V druhé frakci bylo eluováno 0,6 mg LPO o čistotě 85 %. V posledním kroku byl eluován Lf, 4 mg o čistotě >95 %. SDS-PAGE vyizolovaných proteinů je zobrazena na obr. 3. Magnetický sorbent byl následně promyt vodou a znovu několikanásobně použit ve stejném uspořádání s obdobnými výtěžnostmi. Mléko bylo následně testováno na změnu tučnosti a kyselosti. Mléko před samotným přidáním sorbentu a mléko po odstranění částic s absorbovanými proteiny vykazovalo stejné hodnoty tučnosti i kyselosti.
Příklad 2
Adsorpce i eluce Lf a LPO byla provedena obdobně jako v příkladu 1. Magnetický sorbent však byl míchán v čerstvém mléce, jehož teplota byla po celou dobu adsorpce udržována v rozmezích 2 až 8 °C. Doba mechanického míchání byla proto zvednuta na 4 hodiny. První frakce obsahovala LPO o výtěžku 0,8 mg o přibližné čistotě 65 %, druhá frakce 0,45 mg LPO o čistotě 80 % a poslední frakce 4,2 mg Lf o čistotě >95 %.
Příklad 3
Adsorpce i eluce Lf a LPO byly provedeny obdobně jako v příkladu 1. Namísto magnetického kationtového iontoměniče se silně kyselou funkcí (-OSO3H), byl použit iontoměnič se slabě kyselou funkcí (-COOH). Tento magnetický iontoměnič vykazoval vyšší maximální kapacitu pro Lf (viz obr. 7). Do 200 ml čerstvého mléka byly přidány 2 ml tohoto magnetické iontoměniče. Postup adsorpce i eluce byl totožný jako v příkladu 1. Takto bylo získáno 3,2 mg LPO o čistotě 55 % z 1. Frakce, 2,9 mg LPO o čistotě 70 % z 2. Frakce a 12 mg Lfo čistotě >95 % z 3. frakce.
Příklad 4
Adsorpce Lf a LPO z 200 ml čerstvého mléka byla provedena stejným způsobem jako v příkladu 1, jako sorbent byl použit magnetický kationtový iontoměnič se středně kyselou funkcí (-OPO3H2). V první frakci se při iontové síle 0,05 M eluovala LPO, čistota této frakce LPO byla 45 %, výtěžek 5 mg. V druhé frakci bylo při iontové síle 0,2 M eluováno 2,8 mg LPO o čistotě 80 %. V posledním kroku bylo eluováno 15,8 mg Lf o čistotě >95 %.
Příklad 5
Pět mililitrů komerčně dostupného magnetického celulozového sorbentu s -OSO3H funkcí, bylo přidáno do 0,5 litru syrovátky (pasterizace 85 °C po dobu 20 s, kyselé srážení kaseinu, pH upraveno pomocí NaOH na hodnotu okolo 7). Magnetický sorbent byl následně v syrovátce mechanicky míchán (150 rpm) po dobu 1 hodiny při laboratorní teplotě. Sorbent byl následně magneticky stažen a obdobně třikrát promyt vodou. Vzhledem k faktu, že samotná syrovátka již nevy-8CZ 26415 U1 kazovala přítomnost LPO, byl sorbent jednou promyt málo koncentrovaným roztokem NaCl (/ = 0,2 M) a posléze byl eluován samotný Lf iontovou silou 1 M. Takto bylo získáno 6 mg Lf o čistotě >98 %.
Příklad 6
Do 20 litrů čerstvého mléka bylo přidáno 250 ml nemagnetického celulózového sorbentu s OSO3H funkcí, 100 až 250 μηι. Tyto částice byly posléze mechanicky míchány v mléce po dobu 2 hodin při 4 °C a následně byly z mléka mechanicky odstraněny pomocí fdtraěního koše s velikostí ok 63 pm. Částice byly posléze v tomto filtračním koši promyty vodou a proteiny z nich byly eluovány obdobně jako v příkladu 1. Bylo získáno 0,4 g LPO o čistotě 70 % a 1,14 g Lf o čistotě >95 %.
Z uvedených příkladů je patrné, že lze magnetickou separaci použít nejen v syrovátce, kde je již minimální koncentrace Lf, ale také v čerstvém mléce s velmi dobrými výtěžnostmi. Jako nejvhodnější sorbent se pro izolaci Lf a LPO pouhým promícháváním sorbentu v mléce, tedy vsádkovou separací, jeví magnetický iontoměnič se silně kyselou funkcí, tj. s -OSO3H. Ten poskytuje nejen dobré výtěžnosti, ale poskytuje vysokou čistotu obou vyizolovaných proteinů. Tyto čistoty jsou obdobné jako u typických průmyslových chromatografických řešení. Podstatný fakt při separaci v uvedených příkladech je také to, že v průběhu separace nedocházelo ke změně důležitých parametrů čerstvého mléka, tj. tučnosti a kyselosti, a že výtěžnosti a čistoty proteinů se po několikerém opakování separace nemění.
Průmyslová využitelnost
Košově-vsádková separace Lf a LPO podle technického řešení nalezne své uplatnění především v provozech mlékárenského průmyslu, kde se nezabývají pouze zpracováváním mléka na typické mléčné produkty, např. máslo, tvaroh, sýry, jogurty aj., ale také izolací bioaktivních substancí z mléka, např. výrobou kolostra. Vyizolované proteiny jsou následně využitelné na výrobu doplňků stravy, při výrobě kosmetických přípravků či jako bioaktivní složky léčiv ve farmaceutickém průmyslu.
Claims (5)
- NÁROKY NA OCHRANU1. Zařízení k provádění separace syrovátkových proteinů, zejména laktoferinu nebo laktoperoxidázy, z mléčného média, obsahující skladovací tank (1) mléčného média opatřený hlavním míchadlem (2) a výpustí (4), vyznačující se tím, že v oblasti proudění promíchávaného mléčného média je umístěn filtrační mechanismus (3) s obsahem ve vznosu udržovaných částic sorbentu, s výhodou filtrační koš, tak, že je ponořen v separačním médiu, přičemž velikost ok filtračního mechanismu (3) se v závislosti na druhu použitého sorbentu pohybuje v rozmezí hodnot 1 μηι až 1 cm.
- 2. Zařízení k provádění separace syrovátkových proteinů podle nároku 1, vyznačující se t í m , že filtrační mechanismus (3) je umístěn ve vnitřním prostoru skladovacího tanku (1).
- 3. Zařízení k provádění separace syrovátkových proteinů podle nároku 1, vyznačující se tím, že filtrační mechanismus (3) je umístěn v separačním tanku (6) instalovaném v potrubním systému (9) mimo skladovací tank (1), přičemž v potrubním systému (9) je mezi skladovacím tankem (1) a separačním tankem (6) zabudováno plnící čerpadlo (7) a na výtoku ze separačního tanku (6) průtočné čerpadlo (8).-9CZ 26415 Ul
- 4. Zařízení k provádění separace syrovátkových proteinů podle některého z nároků 1 až 3, vyznačující se tím, že fdtrační mechanismus (3) je vybaven sekundárním míchadlem (31).
- 5. Zařízení k provádění separace syrovátkových proteinů podle některého z nároků až 4, 5 vyznačující se tím, že na výpusti (4) ze skladovacího tanku (1) je zabudován magnetický separátor (5).
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CZ2013-28770U CZ26415U1 (cs) | 2013-11-15 | 2013-11-15 | Zařízení k provádění separace syrovátkových proteinů z mléčného média |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CZ2013-28770U CZ26415U1 (cs) | 2013-11-15 | 2013-11-15 | Zařízení k provádění separace syrovátkových proteinů z mléčného média |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CZ26415U1 true CZ26415U1 (cs) | 2014-02-03 |
Family
ID=50064955
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CZ2013-28770U CZ26415U1 (cs) | 2013-11-15 | 2013-11-15 | Zařízení k provádění separace syrovátkových proteinů z mléčného média |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CZ (1) | CZ26415U1 (cs) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CZ305371B6 (cs) * | 2013-11-15 | 2015-08-19 | Univerzita PalackĂ©ho | Způsob separace syrovátkových proteinů z mléčného média a zařízení k provádění tohoto způsobu |
-
2013
- 2013-11-15 CZ CZ2013-28770U patent/CZ26415U1/cs not_active IP Right Cessation
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CZ305371B6 (cs) * | 2013-11-15 | 2015-08-19 | Univerzita PalackĂ©ho | Způsob separace syrovátkových proteinů z mléčného média a zařízení k provádění tohoto způsobu |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US7368141B2 (en) | Process of isolating lactoferrin | |
| JP5967665B2 (ja) | Ｃｍｐまたはカゼイン種を含有する供給物を使用してオステオポンチンを単離する方法 | |
| Xu et al. | Effect of calcium sequestration by ion-exchange treatment on the dissociation of casein micelles in model milk protein concentrates | |
| Fee et al. | Capture of lactoferrin and lactoperoxidase from raw whole milk by cation exchange chromatography | |
| DE60203176T2 (de) | Fraktionierung von proteinhaltigen mischungen | |
| CN103709246A (zh) | 一种乳铁蛋白及乳过氧化物酶的纯化方法 | |
| Krolitzki et al. | Current practices with commercial scale bovine lactoferrin production and alternative approaches | |
| WO2006132553A1 (en) | Preparation of metal ion-lactoferrin | |
| CZ305371B6 (cs) | Způsob separace syrovátkových proteinů z mléčného média a zařízení k provádění tohoto způsobu | |
| CZ26415U1 (cs) | Zařízení k provádění separace syrovátkových proteinů z mléčného média | |
| Wang et al. | Manufacturing technologies of whey protein products | |
| CA2553733C (en) | Process for producing lactoperoxidase | |
| CN106793797A (zh) | 分离α‑乳白蛋白和β‑乳球蛋白的方法 | |
| CN1663961A (zh) | 牛初乳中乳铁蛋白的分离纯化技术 | |
| Aslam et al. | Recent Developments in Purifi cation Techniques for Whey Valorization | |
| CN106793793A (zh) | 来自含有聚集的酪蛋白的混合物的可溶性蛋白的分离 | |
| JP5261732B2 (ja) | シアル酸含有オリゴ糖の製造方法 | |
| US5436014A (en) | Removing lipids from cheese whey using chitosan | |
| JP2985158B2 (ja) | 活性の高いラクテニン画分の回収方法 | |
| RU2211577C2 (ru) | Способ извлечения белка из молочной сыворотки | |
| WO1999015023A2 (en) | Recovery process | |
| Nath et al. | Emerging purification and isolation | |
| CN116836257A (zh) | 骨桥蛋白纯化方法 | |
| RU2510849C1 (ru) | Способ обработки молочной сыворотки | |
| IE85516B1 (en) | Enriched milk products |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| FG1K | Utility model registered |
Effective date: 20140203 |
|
| ND1K | First or second extension of term of utility model |
Effective date: 20171116 |
|
| ND1K | First or second extension of term of utility model |
Effective date: 20201113 |
|
| MK1K | Utility model expired |
Effective date: 20231115 |