CZ233892A3 - Compound a87689, process of their preparation and a pharmaceutical composition in which said compound is comprised - Google Patents

Description

Oblast techniky

Vynález se týká nového kvartromycinu, jeho derivátů a farmaceuticky vhodných solí, způsobu inhibice enzymů a antivirové új/činnosti.

Především se vynález týká A 87689 - nového inhibitoru fosfolipssy A^ /PLA^/, který se může izolovat, v podstatě čisté formě z fermentačních kultur Amycolatopsis: mediterranei. Vynález se také týká způsobu ošetřování retrovirových infekcí zvláště HIV /a ošetření chorobných stavů , vyplývajících ze syndromu ztráty imunity - aquired immune deficiency syndrome AIDS/ a oncovirinae, jako je lidský virus leukemie T-buněk a podobných chorobných stavů. Vynález se také týká farmaceutických prostředků obsahujících sloučeniny A876S9 a způsobu použití takových sloučenin samotných nebo v kombinaci s jinými Činidly pro inhibici PLA^ a pro ošetřování retrovirálních infekcí.

Dosavadní stav technik;/·

Je

Zánětlivé stav;/ se přičítají velkému počtu nemocí souvisejících s oslabením organismu. Zánětlivé stavy, jako je arthritis, lupenka, astma a možná atherosklerosa pramení ze zánětlivých reakcí v kloubech, v pokožce a v krevních cévách, obecná doměnka, že centrální úlohu v zánětlivých reakcích má produkce fosfolipidových metabolitů. označovaných jako eikosanoidy. Sikosanoidy představují rodinu důležitých zprostředkovačů, jako jsou leukotrieny, prostanglandiny., lipoxiny, hydroxyeikošatetranoová kyselina a thrombnxany. Předpokládá se, že, generace eikosanoidů závisí na dostupnosti arašidcnové kyseliny, která se uvoňuje z fosf.olipidů působením fosfolipasy a₂ /pla₂/.

?LA₂ je běžným označením pro fosfatid 2-acylhydrolasu, který katalyzuje hydrolyzu sn-2-acylesterové vazby fosfoglyceridů za vzniku ekvimolárních množství lysofosf.olipidů ε volných mastných kyselin /Dennis E.A, The Enzymes, svazek 16, Academie Press, New York, 1933/. Enzymy PLA_O byly zjištěny ve všech živých druzích.',,různorodou rodinu enzymů. Byla charakterizována struktura více než čtyřiceti enzymů a tyto enzymy vykazují vysoký stupeň sekvenční homologie /J. Chang, J.H. Musser a H. McGregor, Phospholipsse Ag Eunction and Pharmacological Regulation“, Biochem. Pharm 36, str. 2429 až 2436, 1937/.

Nejlépe charaktérizovanými·druhy PLA^ enzymu jsou vylučované formy, které se uvolňují do extracelulárního prostředí, kde napomáhají trávení biologických materiálů. Vylučované formy mají molekulovou hmotnost přibližně 12 C00 až 15 000 /Chang a kol., viz uvedenou citaci/. ^£’a rozdíl od toho se cytosolické PLA₂ nalézají v menších množstvích v buňkách a mají úlohu v bi osyntetických postupech, vedoucích.k vytváření faktorů krevních destiček; a eikosanoidů. /Mobilio D. a Marshall L.A., “Secent Advances in the Design and Evaluation of Inhibitors of Phospholipase· A₂, Ann Reporte, in Med. Chem. 24, str. 157 až 166,

1989/. Cytosolické PLA₂ mají molekulovou hmotnost přibližně 85 000 /Clark J.D.Lin L.L., Kriz W., Ramesha C.S., Sultzman,

Li A.T., Merlona N., Knots:J.L., Cell 65, str. 1043 až 1051, , z . . .

1991./ Volná ar^idonová kyselina /arachidonic acxd/ ^e limitujícím prekursorem pro produkci, eikocanoidť/a uvolňuje se z fosfolipidové membrány působením cytosolického PLA₂· /Dennis Ξ.Α., “Phospholipase A₂ Mechanism: Inhibition and Role in Arachidonic Acid Release, Drug Dev. Res. 10, str. 205 až 220, 1987./ Stejný enzymatický stupeň také produkuje lysofosfolipiďy, které se mohou převádět na faktory vytvářející krevní destičky. Proto je doměnka, že cytosolický PLA2 centrální pro regulaci, biosyntetických cest potentních lipidových zprostředkovačů zánětu.

V důsledku.centrální úlohy cytosolického ?LA₂ při zánětlivých procesech, je žádoucí identifikovat a charakterizovat nové inhibitory enzymu. Takové inhibitory by mohly vést k novým terapeutickým způsobům ošetřování arthritis, astma, atherosklerosy

- 3 ε zánětlivých onemocnění pokožky /např /například dráždivý střevní syndrom/, specifických PLA₂ inhibitorů by mohla íklsd lupenky/ a střev Identifikace takových lékařům pomoci při oset řování zánětlivých stavů.

. Oď izolace prvního lidského retroviru v roce 19S0, lidského viru T-leukemie /HTLV, nyní HTLV-1/ bylo nashromážděno mnoho poznatků v tomto oboru. Retroviry jsou spojovány se mnoha onemocněními včetně zhoubných onemocnění rychlých a se dlouhou latencí, smrtelných nemocí, neurologických poruch, nedostatku imunity a celoživotních viremií bez·' .viditelných projevů; /například-Fundamental Virology, Fields B.N. a kol, 1991./ Viry, klasifikované jako retroviry se taxonomicky dělí na tři výrazné podrody: oncovirinae, lentivirinae a spumavirinae.

Podrod, oncovirinae zahrnuje lidský virus leukemie T-buněk. Podrod/ spumavirinae, známý také jako viry foamy zahrnuje mnohé izoláty lidské a primátů /například Simian foamy virus/, obecně se však považuje za benigní /nezhoubný/. Třetí podrod rodu retroviridae, lentivirinae, zahrnuje vir lidské ztráty imunity /HIV - human immunodeficiency virus/.

HIV /označovaný také jakožto virus AIDS/ byl již dříve znám a označován jako LAV, HRLV-III nebo ARV a nyní se označuje jako HIV-1. Jiné úzce příbuzné varianty HIV-1 zahrnují HIV-2 a SIV /simian immunodeficiency virus/. Výrazem HIV” se zde vždy míní tedy HIV-1 a HIV-2, pokud není jinak uvedeno.

Komplexní onemocnění získaného syndromu nedostatečné imunity /AIDS/ zahrnuje postupnou destrukci imunního systému a degeneraci centrálního a periferního nervového systému. Zdá se, že HIV přednostně napadá pomocné T-buňky /T-lympfocyty nebo 0KT4. nesoucí T-buňky/ a také jiné lidské buňky, například určité buňky v mozku. Pomocné T-buňky jsou napadány virem a T-buňky se stávají producery HIV viru. Pomocné T—bunxy /helper T—cells / jsou rychle rozrušovány a jejich počet v lidském těle klesá do té míry, že B-buňky stejně jako T-buňky, normálně stimulované pomocnými T-buňkami,nemohou již déle normálně fungovat: nebo produkovat dostatečné množství lymfokinů a protilátek k rozrušování napadajícího viru nebo jiných napadajících mikrobů.

- 4 Jakkoliv HIV jsko takový nemusí nutně znamenat smrt, potlačuje tak závažně systém lidské imunity, že Člověk podléhá nejrůznějším jiným nemocem, jako je opar, cytomegalovirus, sarkom Kaposi, lymphomas vázaný na lpstein--arrův virus, ^yto sekundární infekce se odděleně ošetřují za použití jiných léčiv, naž je běžné. V době bezprostředně po infikování lidé s HIV mají malé symptomy nebo nemají žádné symptomy, avšak infekce setrvává. V pozdějším stadiu onemocnění mají osoby mírně snížený imunitní systém s různými symptomy, jako je ztráta hmotnosti, neur- . čitý pocit neklidu, horečka, zdušení lymfatických uzlin. Syndromy, které jsou identifikovány takovými symptomy, se označují jako setrvávající syndrom obecné lymphadenopatie /PGL - persistent. generalized lymphadenopathy syndrome/ a komplex související s- AIDS /AIDS related comolex ARC/.

Ve všech případech takto nakažení jedinci virem AIDS jsou infekčními pro jiné osoby. AIDS a ARC jsou za nějakou dobu osudné.

Popis mechanismu, kterým vir infikuje svého hostitele, je uveden v článku R. Yarchoan a S. Broder Development of Antiretroviral Therapy for the Acquired Immunodeficiency Syndrome and Related Disorders New Sngland Journal of Médieine, 316, str. 557 až 564, 1987.'

Bylo již vynaloženo velké úsilí v boji proti HIV inhibici reversní transeriptasy HIT, potřebné pro replikaci viru, /V. Merluzzi a kol., Inhibition of the HIT-1 Replidation by a Nonnucleoside Reverse Transcrip.tase Ihnibitor, Science, 25, str. 1411, 1290/. Například současně používaná terapeutická, sloučenina, AZT /americký patentový spis číslo 4 724232/ je inhibitorem virové reversní transeriptasy. Naneštěstí jsou mnohé známé sloučeniny zároveň toxické, jsou špatně biologicky dostupné, dochází při jejich použití k odolnosti virů proti nim, mají v živých organismech krátký poločas nebo souhrn uvedených nedostatků. Vynález se proto týká řešení tohoto problému.

Podstata vynálezu

Podstatou vynálezu je sloučenina A 87689 nebo její alkyl- 5 ether s 1 εζ 5 atomy uhlíku v alkylovém podílu nebo alkanoylesterový derivát s 1 až 6 atomy uhlíku v alkanoylovém podílu nebe její farmaceuticky vhodná sůl.

Vynález se tedy týká rozšíření možných farmaceutických prostředků pro ošetřování lékařských indikací, které jsou iniciovány neinhibitovaným PLA₂ a používání takových sloučenin pro prevenci a ošetřování infekcí savců, způsobených retroviry. Obzvláště se tedy vynález týká sloučenin A876££, jejich derivátů a farmaceuticky vhodných solí, způsobu přípravy takových sloučenin a shora uvedených nejrůznějších možností použití takových sloučenin a farmaceutických prostředků, které jsou hodnotné pro inhibici 'LA₂ a pro potírání retrovirových infekcí savců.

na obr. na obr. na obr. na obr. na obr.

K objasnění vynálezu slouží i připojené nákresy: Infračervená /IR/ absorpční spektra A87689 a jeho sdí a derivátů /v KBr peletě/jsou na obr. 1 až 5:

na obr. 1 je IR vápenaté soli A87689, je IR A87689 ve formě volné kyseliny, je 13 vápenaté . solí'tetraa;oetátu Α8768£, je IR vápenatélsóli tetraměthyletheru A87689 a je IE pentasodné soli AS9689 a je počítačem generovaný dendrogram konstruovaný z profilů mastné kyseliny.

Vynález se tedy týká nového fermentačního produktu, který se označuje jako A87689. A 87689, která je užitečná například jakožto inhibitor enzymu, se obecně čistí ze kultivačního prostředí ve formě soli s kovem alkalické zeminy, například ve formě vápenaté soli. Vynález se také týká způsobu produkce A876.89 kultivací nového kmene mikroorganismu Amyeolatopsis mediterranei, selektovaného z NRRL 18815 a NRRL 18851 nebo jeho A87689 produkujícího mutantu a biologicky čištěných kultur Amycolatopsis měditerranei kmenů, které ho produkují. Pracovníkům v oboru fermentačních procesů je známo, ze ačkoliv se sloučenina obecně izoluje z mikroorganismu? ve formě soli s kovem alkalické zeminy, mohou se generovat také jiné formy sloučeniny laboratorní derivatizací, jak bude níže popsáno.

— 6 —

Připomíná se, že se jméno mikroorganismu, produkujícího A876S9 v roce 1986 zmínilo, když se dva nové rody odštěpily od nocsrdioformy actinomycetes. Nový rod Amycolata a rod Amycolatopsis identifikovány Lechevalierem a kol. /M.P. Leche.vs.lier, H Prauser:, D.P. Labeda, J. Huan, Two New Geners of Nocardioform Actinomycetes Amycolata New-Genus and Amycolatopsis New-Genus”, Int. J. Syst. Bacteriol., 36, str. 29 sž 37, 1986/.

Podávaná sloučenina je zde označována jakožto vápenatá sůl A87689 nebo’*volná kyselina AS7689; nebo pokud jde o jeden nebo o několik derivátů, používá se zde označení A87689 sloučeniny .

Vápenatá sůl A87689 je bílá, krystalická látka, která má následující charakteristiky: molekulová hmotností 1222_t418 empirický vzorec :

FAB-MS /M+l/: nalezeno: 12234175 vypočteno: 1223^4254

Rozpustnost: velmi mírně rozpustná ve vodě / 1 mg/ml/ při hodno tě pH 7; docela dobře rozpustná ve vodném roztoku o hodnotě pH 12,0 nebo větší; rozpustná v dimethylsulfoxidu 4 mg/ml;: mírně rozpustná v methanolu; nerozpustná v organických rozpouštědlech jako jsou ethylacetát, aceton, diethylether, uhlovodíky, chloroform, vyšší alkoholy.

IR spektrum vápenaté soli A 87689 /KBr peleta/ je na obr, 1; nejvýznamnější absorpční maxima jsou při následujících frekvencích /cm“¹/: 34G2, 1711, 1609, 1534, 1449, 1078, 1006 a 792.

v

Sloučenina A87.689 je schopna vytvářet soli a má alespoň 4 hvdroxylové skupiny, které se mohou esterifikovat nebo mohou se podílet na vytváření etherových derivátů. Vynález se proto také týká alkanoylového esteru s 1 az 6 atomy unlíku v alkanoylovém podílu a alkyletherových derivátů s 1 až 6 atomy uhlíku v alkylovém podílu, a solí A87689 těchto derivátů /A87689 sloučenin/. «Jakožto příklady takových sloučenin se uvádějí tetraacetát a tetramethyletherové deriváty, ve formě.volné kyseliny a solí. Sloučeniny A87689 jsou užitečné jakožto

- 7 protizánítlivá činidla ky vhodné soli.

Obzvlášt užitečnými jcou řarmaceuticAdiční seli se zásadami zahrnují soli, odvozené od anorganických zásad, jako jsou amoniak, hydroxidy alkalických kovů a kovů alkalických zemin, uhličitany a hydrogenuhiičitany alkalických kovů a. kovů alkalických zemin. Takovéto zásady jsou vhodné pro přípravu solí podle vynálezu; příkladně se uvádějí hydroxid sodný, hydroxid draselný, hydroxid amonný, uhličitan sodný, uhličitan draselný, hydrogenuhličitan sodný, hydrogenuhličitan draselný, hydroxid vápenatý a uhličitan vápenatý. Obzvláště výhodnými jsou soli draselné, vápenaté a sodné.

Výrazem alkanoylová skupina s 1 až δ atomy uhlíku. se zde vždy míní alifatická acylová skupina s 1 až 6 atomy uhlíku s přímým nebo s rozvětveným řetězcem, jednomocnáj příkladně se uvádějí skupina formylová, acetylová, propionylová, butyrylová, cL-methylpropionylová, valerylová, d,-methylbutyrylová, ^>-methyl butyrylová, pivaloylová skupina.

Výrazem alkylová skupina s 1 až 6 atomy uhlíku se zde vždy míní alifatická skupina s 1 až β atomy uhlíku s přímým nebo s rozvětveným řetězcem; příkladně se uvádějí skupina methylová, ethylová, propvlová, isopropylová, n-butylová, isobutylová, sek.-butylová, n-pentylová, isopentylová, neopentylová, n-hexylová, isohexylová, 3-methylpentylová a 2,3-dimethy Ibutylová skupina.

Výrazy ester a ether zde mají o sobě známý význam.

Pro účely taxonomie A. mediterranei kultury NREL 18815 a NRRL 18851 se označují A87689 a. A87689.1. Kultura A876S9 se izoluje z kalové směsi /zředění/. Odvozený kmen A8T689..1 se připravuje chemickou mutagenesí. Nové sloučeniny, vytvářené A87689 a A87689.1 kulturami se označují jakožto A87689.

Vynález se tedy týká biologicky čištěné kultury mikroorganismu Amycolatoosis mediterranei ze souboru zahrnujícího NRRL 18815 a NRRL 18851 a jejich mutant produkující A876S9.

Tyto mikroorganismy jsou užitečné, jelikož produkují PLA₂ inhibitor s antiretrovirální sloučeniny A87689.

Kultury A87689 s A876S9.1 jsou uloženy podle budapeštské dohody a jsou části zásobní kolekce kultury organizace Midwesí Area Northern Regional Research Center, Ágricultural Research Service, United States Department of Agriculture, 1815 North University Street, Peoria, Illinois, 61604 pod Čísly: NRRL 18815 a NRRL 18851.

Taxoncmické studie kultur A87689 s A87689.1 prováděl Frederick ?. Mertz v laboratořích Lilly Research Laboratories,

Na. základě těchto studií jsou mikroorganismy A876S9 a A87689.1 klasifikovány jakožto nové členy druhu Amycolatopsis mediterra nei. Klasifikace je založena na přímých laboratorních srovnání a zkouškách publikovaných popisů pro podobné druhy.

Použité způsoby

Používá se taxonomických způsobů, doporučených organizací International Streptomyces Project /ISP/ pro charakterizaci Streptomyces /Shirling S.B. a Gottlieb. D., Methods for characterization of Step.tomyces species, Int. J. Syst. ^acteriol·., 16;, str. 313 až 340, 1996/ a doporučených pro charakterizaci Nocardis species /Gordon R.S., Barnett. D.A., Henderhan J.3., a Pang C.H., Nocardia coeliaca, Nocardia autotrophica, and the Nocsrdin Strain, Int. J. Syst. ^acteriol. 24/1/, str.

až 63, 1974/. Používá se tabulky ISCC-NBS Centroid Color Charta*,* normalizovaného vzorku číslo 2106 pro označení omen barvy na opačnou stranu s - na aeriální hyphae /National tiureau of Standards, 1958, U.S. Department of Commerce, Washington, D.C./.

Morfologie studována za použití optického světelného mikroskoou a řádkovacího elektronového mikroskopu /SEM/. Isomer diaminopimelové kyseliny /DAP/ a uhlohydraty v hydrolyzátech celých buněk st a kol. /Becker noveny chromátografiekým způsobem podle Beckera ., Lechevalier M.P., Gordon R.s. a Lechevalier

H.3., Rapid Differentiation between Norosrdia and Streptomyces by Paper Chrcmatogrsphy of·Whole-cell Hydrolysates Appl.

Microbiol. 12, str. 421 až 423, 1964/ a Lechevaliera a Le- 9 chevaliere /Lechevslier M.P. a Lochevalier H., A University ^s bor a tory Approach, Dietz snd Thayer /vyd./, Society for Industrial Microbiology Speciál Publication No. o, Arlington, VA, str. 227 až 233/.

Fosfolipídy se stanovují způsobem, který popsal Lechevalier a kol. /Lechevslier M.P., Stern A.S. a Lechevslier H.A., Phospholipids in the taxonomy of Actinomycetes v Actinomycetes, Schaal and Pulverer /vyd./, Zbl. Bakt. Suppl. 11 Gustav Fischer Verlag, 1981/.

⁷ i

Manechinonové složení stanoveno způsobem, který popsal R.

M. Kroppenstedt. /Chemical Methods in Bgcterial Systematics,

M. Goodfelow a D.E. Minnikin /vyd./, 1985, str. 173 až 196/ a M.S. Collins /tamtéž, str. 267 až 285/. Analýza mastných kyselin se provádí za použití HP 5898A mikrobiálního identifikačního systému Millera a Bergera /Miller. L. a Berger Τ., Bgcterial Identification by '^uas Chromátography of Whole Cell Fatty Acids, Hewlett-Packard Application Notě 228r4l, 8 stran, 1985/.

Methylestery mastné kyseliny se přípravují - z lyofilizovaných. celých buněk, které rostly za stejných podmínek. Mycolová kyselina se stanovuje způsobem, který navrhl Minnikin /Minnikin D. E., Hutchinson I.G. a Caldicott A.B., Thin-Layer Chromatography of: Methanolysates of Mycolic Acid-Containing Bscteria, J. Chromatography 188, str. 221 až 233, 1980/.

Charakteristiky kultury

Kultura A87689 roste dobře na komplexním a definovaném prostředí .Kultura A8768S neprodukuje aerialní hyphae s výjimkou stopového množství bílého aeriálního hyphae na IS? prostředí 4. Obrácená strana má výraznou oranžovou pigmentaci. Na IS? prostředí 2 produkuje sotva patrný lehce hnědý rozpustný pigment, který zůstane zanechán na prostředí. Jl/to charakteristiky kultury jsou shrnuty v tabulce I.

Tabulka I

Kultivační charakteristiky £87689

Prostředí	Růst	Reverzní barva	Aeriální růst	Rozpustný pigment
IS? 2 .·' '	hojný	50. s.C	zadny	světle hnědý
IS? 3	ž ádný			žádny
IS? 4^	hojný	50. i.O	stopa	žádný
IS? 5	žádný			žádný
IS? 7'	špatný	90. 'gy.ř	žádný	žádný
ATCC No.172	dobrý	50. s.C	v J «· / zaany	žádný
BEMMETTS	slušný	53. m.O	žádný	ž ádný
Ca-malát.	hojný	48. V.O	žádný	žádný
CZAPEK3	hojný	50. s;,o	žádný	žádný
TP0J	hojný	71. m.OY	žádný	žádný
1/ inkubováno při te	plotě 30 °C co	dobu 28 dní
2/ barva myc	:elia 263	. bílá
3/ tomátová	pasta ovesná mouka agar
Morfologieké	charakte	ristiky
Kultura	A87689 nevykazuje žádnou fragmentaci	. Hyphae seg-

ment do dlouhých kmenů conidia uspořádán do typické pavučinové morfologie charakteristické pro nestreptomycetové actinomycety. Conidia mají válcovitý tvar, hladký povrch a středně 1,4 x v

0,4 nmr. Spcrangia nebo pohyblivé buňky nejsou obsaženy.

Fysiologické charakteristiky

Kultura AS7689 produkuje kyselinu z následujících uh.lohydrátů: adonitol, D-erabinosa- L-arabinoss, cellobiosa, Dgalaktasa, D-fruktosa, D-glukcsa, glycerol, glycogen, i-inositol, inulin, laktosa, D-maltosa, mannitol, melebiosa, raffinosa, L-rhamnosa, D-ribosa, sacharosa, trehalosa a D-xylosa.

A87689 neprodukuje kyselinu s celulózy, z dextrinu, z dulcitolu, z ethanolu, z i-erythritolu, z D-melezitosy, z methyl-D-glukosidu, ze salicinu, ze sorbitolu:, z L-sorbosy a z xylitolu.

Kultura A87689 využívá následujících uhlohydrátů s prostředím IS? 9 jakožto basalní medium: L-erabinosa, D-fruktosa,

D-galaktosa, D-glukosa, inositol D-mannitol, D-raffinosa,

1

L-rhamnosa, sslicin, sacharosa a D-xylosa.

Kultura A87689 využívá sodných solí následujících organických kyselin /jakožto jediného zdroje uhlíku pro energii a růst/ acetát, butyrát, citrát, formát, laktát, malát, mukát, oxslá-tr., propionát, pyruvát a sukcinát. Kultura A 87689 je neschopná využívat benzoót a tartrát, Kultura A 87689 rozkládá kasein, hypoxanthin a L-tyrosin. Je neschopná hydrolyzovat, adenin a xanthin. Kultura A 87689 produkuje esculinasu, gelatinasu, sirovodík, fosfatásu a ureasu. Neprodukuje melanoidní pigmenty. Kultura A87689 roste při teplotě 15 až 42 °C. Snáší, až 4 % chloridu sodného, je citlivá k lysozymu.

Analýza buněčné stěny

Celé hydrolyzované buňky obsahují mesodiaminopimelovou kyselinu /DAP/. Diagnostickými cukry v extraktech celých buněk jsou arabinosa a galaktosa. Obsaženými fosfolipidy jsou fosfatidylethanolamin /PS/, fosfatidylinositol /PI/ a difosfatidylglycerol /DPG/. A 87689 má složení buněčné stěny typu IV a cukry celých buněk typu A /Lechevalier-M.P. a Lechevalier Η., Chemical composition as a criterion in the classification of aerobic anctinomycetes*,' Int. J. Syst. Bacteriol. 20, str. 435 až 443/ a fosfolipoidní charakteristiku typu PII /Lechevalier M.P.,

Stern Α.Ξ., Lechevalier H.A., Phospholipids in the Taxonomy of Actinomycetes, Actinomycetes, Schaal and Pulverer’ /vyd./ Zbl. Bakt. Suppl. II Gustav? Fischer Verlag, Stuttgart, New York/. Mykolové kyseliny nejsou obsaženy v hydrolyzátech celých buněk. Hlavními zjištěnými menachinony jsou MK^9/H^/ vedle menších množství MK-S/H.^/, MK-9/Hg/ a MK-1Q/H^/.

Identita A87689

Kultura A87689 je nestreptomycetový kmen s buněčnou stěnou typu IV s cukry celé buňky typu A, s fosfolipidy typu PII a bez mykolátů. Tyto chemotasonomické charakteristiky plus kultivační a morfologické vlastnosti zařazují A87689 do rodu Amycolatopsis. V tomto rodu je 6 druhů.a jeden poddruh: A. azurea,.

A. fastidiosa, A. mediterranei, A. orientalis, A. orientalis subsp. lurida, A. rugosa a A. slphures. Při porovnání těchto stávajících kmenů je kultura A87689 nejpodobnější A. mediterranei. Kultivačně je téměř stejná. Mcrfologické charakteristiky jsou minimální pro absenci aeriální hyphae, avšak primární růst je identický s A. mediterranei. Biochemické charakteristiky A87689 a A. mediterranei jsou také téměř stejné. V tabulce II jsou rozdíly mezi AS7689 a A. mediterranei.

Tabulka II

Rozdílné charakteristiky A87689 a Amycolatopsis mediterranei

Charakteristika rozklad L-t.yrosinu odolnost 4% chloridu sodnému růst při teplotě 42 °G kyselina produkovaná z sdonitolu z inulinu

A87689 A. mediterranei + +

+ +

+

Analýza mastných kyselin provedena u A87689 a všech dostupných Amycolatopsis kmenů. V tabulce III je procentové porovnání mastných kyselin. Počítačem generovaný dendrogram, konstruovaný z profilů mastných kyselin, je na obr. 6. Dendrogram ukazuje vztah A 87689 k jiným druhům Amycolatopsis, měřený Euklidovskou vzdáleností. Kultury vykazující příbuznost pod hranicí 10,00 se uvádějí jako synonymní, to znamená jako stejné druhy. A87689 je příbuzný A. mediterranei v hranici 12,00.

Analýza hlavních komponent je odvětví multivariantní statistiky, která se zabývá vnitrními vztahy sady proměnných. Při této analýze je největší odchylka od původních dat nebo výsledků zkoušek vyjádřena jako hlavní složka. /Alderson G. The appli :ation and relevance of non.hierarchie methods in bacterial taxo aomy, Computer-assisteď bacterial systemacics, Gooďfellow Μ., Jones D. a Priest P.G. /vyd./ Academie Press New York, 1985/. Může být tudíž zkonstruován diagram, ukazující rozptyl nebo variabilitu. Závislosti pak mohou být vyhodnoceny zkoumáním těchto odchylek a lze charakterizovat mikrobiální populaci. Byl zkonstruován dvourozměrný diagram hlavních složek, založená na □

οι

VO

Ή

m

tn

σ»

rH

O

m

03

vo

VO

·-H

tn

03

LD

03

03

0*

03

σ»

r'

«X

•s.

·>

•'s 1

»·>- 1

•“r.

Í-S.

*r

**-

03

o*

VO i

tn i

m

o

O*

CO

03

VO

Ή

0»

co

«Ή

-H

rH

Η <a

α.

o

U

Ή

O o

ΪΗ e

-H <U

OJ u

•i-l

Ό cu

S «ΐ (O

GJ

OO

Ό

Ρ»

OO

C •rl r—l OJ M r*5

P4

-C

O 'í>5 c

-P

CO

Oj·

C ω

>t<

o f—I m

oj >

o +->

c a;

o o

p

CL.

O

Φ rl o

Φ

Oi m

m §i (C m

o •3 jj oj •3 •H

L.

«a oj •H r|

OJ

U σ, co co pOJ <0!

LD

Ή

VO

oa

LO

rH

03

fO

co

tn

VO

03

OA

CO

Ol

tn

m

tn

m

CO

VO

03

ΓΠ

03

<-H

VO

0«

O

03

m

03

o

rH

r-

>.

*x.

•r.

«\ 1

·*

·«-.

«·

r-

·'

03

tn

03

Ή

oa

Ή

Ή

o

Ή

Ή

03

m

CO

·—1

03

Ή

CO

m

OA

O

tn

r*

co

ř*

03

OA

O

OA

03

tn

m

co

in

03

vo

tn

m

“H

rH

03

*v

·· 1

«<

»?· 1

i *“·

*-* I

ď\

r\

•~s

r*.

O

03

o

rH

OA

o

o

O

m

OA

O

O

rj (N

VO

vo

O

03

03

VO

rH

ro

03

0·

03

LO

OA

03

tn

0»

rH

co

0*

03

CO

m

O

O

CO

vo

O*

•s.

·*»·

«%. 1

•k

1

··*

•—w

*

P1

in

o

o

m

03

03

OA

O

O

O

rH

rH

Ή

tn

O

rH

«-Η

m

rH

co	03	0*	O	O
VO		m	m	O	03
		in 1	1
tn	OA	vo	rH
		rH			03

O	vo	rH	tn	rH	O		tn
rH	tn	in	co	vo	tn	co
r—		•-s	•v	•K	4*.	»-	»«
rH	O	o	o	co	m	vo	03
				Ή	rH

VO

co

OA

tn

tn

VO

co

03

o*

co

tn

OA

VO

tn

m

OA

vo

03

VO

tn

m

tn

co

P*

OA

tn

Ή

«%

·.«—

·-» 1

·*» 1

r—

«· —

r—1

*—

VO

OA

rH

vo

o

rH

0»

rH

o

O

o

CO

03

co

rH

03

rH

rH

OA

O

m

OA

CO

OA

o

rH

m

tn

tn

tn

tn

OA

OA

tn

03

OA

o

O

tn

rH

03

Γ*

OA

tn

vo

VO

rH

0*

OA

r··

*s

**

·*·

·>

n

rs l

*«·

r-.

<—

·—

03

Γ-

rH

03

tn

0*

O

03

o

M

O

rH

tn

rH

tn

m

M

M

H l-l fij

Pí r-l

X)

Oj

E-i

Oj C •rl i—I OJ DJ >i Pá '03

C

P>

ΙΠ polohy dvojné vozby e kongigurece nejsou známy

CL >cr rJ i X

T

c.

mastných kyselinách s vykázal shlukování kultury AS7689 s A. mediterranei. Ačkoliv mezi A87659 a A. mediterrsnei existuje kolísání, je toto kolísání rozdílem ..kmenů -. a nikoliv druhů, rroto je kultura A876S9 klasifikována jako kmen Amycolatopsis mediterrsnei /Lechevalier M.P., HauserH., Lsbeda D.P., Rusa J.S. Two new genera of nocardioform actionomycetes: Amycdata gsn. nov. and Amycolatopsis gen. nov.’’, Int. J. Syst.^acteriol. 36, str. 21 až 37/.

Porovnání drivátů kmenů

Kmen AS76S9.1 je dostatečně makroskopicky podobný kmenu A87689, takže je klasifikován jakožto kmen Amycolatopsis mediterranei» -^va kmeny se liší množstvím A87689, která produkují. Kmen A87689.1 produkuje přibližně dvakrát více sloučeniny . A87689 než kmen A87689.

A87689jje produkována kultivací kmene produkujícího A87689 Amycolatopsis mediterranei. za podmínek aerobní submerze ve vhodném kultivačním prostředí až do produkce získatelnéh' množství A87689. A87689 se může získat, různými způsoby izolace a čištění, běžnými v oboru.

Kultivační prostředí, používané pro růst Amycolatopsis me diterranei kultur může být kterýmkoliv z četných kultivačních prostředí. Z hlediska ekonomie produkce, optimálního výtěžku a snadnosti izolace produktu se vsak určitým kultivačním prostře dím dává přednost. Tak například výhodným zdrojem uhlíku pro . velkoprovozní fermentací je glukosa a maltosa, jakkoliv se také může použít ribosa, xylosa, fruktosa, galaktosa, mannosa, mannitol, rozpustný škrob, bramborový dextrir, methyloleát, oleje, například sojový a podobné substráty.

Výhodnými zdroji dusíku jsou moučka bavlníkových semen, peptonizované mléko a digerovaná sojová moučka, jakkoliv se také může použít, rybí moučky, kukuřičné půdy /corn steep/, kvasnicového extraktu, enzymem hydrolyzovaného kaseinu, hovězího ' extraktu a podobných zdrojů dusíhu.

Z živných anorganických solí, které se přidávají do kultivačního prostředí, se uvádějí běžné rozpustné soli, poskytující zinek, sodík, hořčík, vápník, amonium, chlorid, unličitan síran, dusičnan a podobné ionty.

Kultivační prostředí musí také obsahovat důležité stopové prvky, nu.tne pro růst a vývoj organismu. Takového stopové prvky 3sou běžnými nečistotami v jiných složkách kultivačního prostředí v dostatečném množství, aby splňovaly požadavky organismu ns růst.

Pro produkci podstatných množství A87689 jsou výhodné mícha né reaktory pro submerzní aerobní fermentaci. Malá množství A87689 se mohou produkovat v kultuře v třepané baňce. Pro časový odstup v produkci, běžně spojený s naočkováním velkých bioreaktorů organismem ve. formě spor,je výhodné používat vegetativního,, inokula . Vegetativní inokulum se připravuje naočkováním malého objemu kultivačního prostředí sporami nebo miceliálními fragmenty organismu k získání čerstvé, aktivně rostoucí kultury organismu. Vegetativní inokulum se pak převede do většího bioreaktcru. Vegetativní očkovací prostředí může být stejné, jakého se používá pro větší fermentaee, mohou být však vhodná jiná orostředí.

Sloučenina A876S9 se produkuje A87689 produkujícím organis mem při teplotě 27 až 32 °C. Optimální teplota pro produkci A87689 je přibližně 30 °C.

Při submerzních aerobních kultivačních procesech je běžné vhánět, sterilní vzduch do nádoby ode dna, přičemž je prostředí mícháno běžným oběžným kolem,Obecně míra provzdušnění a míchání mají být dostatečné k udržení koncentrace rozpuštěného kyslíku na alespoň 45 % nasycení vzduchem s vnitřním tlakem 0,5 MPa.

Produkce A87689 se může v průběhu fermentaee sledovat zkoušením extraktu živné půdy na P1A₂ aktivitu. Dále popsaný systém /Naja naja/ je vhodný pro tuto zkoušku.

Po produkování za podmínek submerzní aerobní fermentaee se sloučenina A87689 může získat z fermentačního prostředí o sob| známými způsoby. A87689, produkovaná při fermentaci A87689 produkujícího mikroorganismu, je hlavně v živné půdě.

A87689 se může získat z biomasy nejrůznějsími způsoby. Jakožto výhodný způsob se uvádí iiltra.ee veškeré fermentační půdy přes filtrační pomocnou látku, jako je křemelina.. Takto získaný filtrát se pak adsorbuje na vysoce porozním polymerním.

s.dsorbentu polystyrénového typu, jsko j· naoříklad

DIfi.ICM HP-2 0 /společnosti Mitsubishi Chemical Industries, Ltd., Tokyo/ nebo AMBSRLIIS XAD-2 nebo AMBERLITS XAD-41 /společnosti Rohm and Haas', Philadelphia, PA/. Adsorbent se promyje vodou a eluuje se organickovodným roztokem, jako je směs methanolu a vody. Eluát. se lyofilizuje a zkoncentruje. Podle výhodného separačního procesu se lyofilizovaný materiál rozpustí v dimethylsulfoxidu /DMSO/ a chromatografuje se na reversním fázovém siliksgelovém adsorbentu /C_Q nebo C._Q/. Frakce se eluují organicko vodným

O i pufrem, jako je systém acetonitril : amoniumacetát.

Fosfolipasová A^ inhibični účinnost

Sloučeniny podle vynálezu jsou užitečné pro snížení záně tu tkání, jelikož inhibují PLA^, enzym, který řídí zánět tkán

Sloučeniny A876S9 vykazují inhibični účinnost při nejrůzněj ších zkouškách, které jsou určeny specificky pro zjištování PLA₂ účinnosti. Sloučeniny jsou účinné in vitro-pri .zkoušce ze použití hadího jedu /Naja naja/ PLA₂, in vitro při zkoušce za použití čištěného lidského eytosclického PLA₂ a in vitro při zkoušce celých buněk, při které se zjištuje inhibice sekrece metabolitů fosfolipidů /leukotrien a thromboxan/.

Je významné, že sloučeniny podle vynálezu nejsou účinné při zkoušce 5-lipoxygenazové, čímž je doložena jejich specifičnost ze zřetelem na PLA₂·

Kromě toho vykazují sloučeniny podle vynálezu účinnost in vivo jako protizánětlivé prostředky. Sloučeniny jsou obzvláště účinné při modelech arthritis navozené třemi pomocnými látkami·

Biologickými zkouškami se posuzují také A87689 ve formě dvou solí. Jedna forma je rozpustná ve vodě a v d ime tiiy lsulfoxidu. Je to sodná sůl A87SS9. Jiná forma soli je nerozpustná ve vodě avšak rozpustná v dimethylsulfoxidu. Je to vápenatá sůl A87689. Tato forma se zkouší buď ve formě roztoku v dimethylsulfoxidu nebo ve formě suspenze v 1% karboxymethylce— luloze /CMC./

- 17 Kromě t biologickou oho se účinnost solí a der zkouškou, zkouškou hadího ivátů A87689 porovnává jedu /Najs naja/ PLAg/.

rat, ství

Vynález se při kterém sloučeniny A87689.

tedy také týká způsobu snižování zánětů u zvíse zvířatům podává protizánětlivě účinné množPodle výhodného provedení se vynález týká snižování otoků, ke kterým dochází při arthritis zvířat, přičemž se zvířatům pod množství sloučeniny A876S9 v množství dostatečném pro snížení zánětu a otoku.

Podle jiného výhodného provedení se vynález týká způsobu ošetřování astma, při kterém se podává zvířatům množství sloučeniny A87689 dostatečné ke snížení zánětu dýchacího systému, ke kterému dochází u astmatických zvířat.

Vynález se také týká způsobu ošetřování lupenky, při kterém se podává živočichům, trpícím lupenkou množství sloučeniny A87689 účinné proti lupenee.

Retrovirová účinnost

Produkovaná a izolovaná sloučenina A78689 je při podávání živočichům užitečná pro prevenci retrovirových infekcí u savců i pro ošetření savců infikovaných retroviry.

Jelikož jsou sloučeniny A876S9 účinné proti retrovirální infekci, rozumí se zde výrazem “ošetřování retrovirálních infekcí prevence, počáteční nebo vracející se infekce jedním nebo několika retroviryja také ošetření savců po počáteční nebo vrace jící se retrovirální infekci.

Vynález se tedy také týká ošetřování stavů způsobených 'etroviry a oodrodem oncovirinae v případe savců, zvláště v pri )adě viru leukemie T-buněk, přičemž se podává takovým savcům mcovirálne účinné množství sloučeniny ze souboru A87689-sloučenin nebo ze souboru jejich solí farmaceuticky vhodných.

Obzvláště se vynález týká ošetřování HIT u lidí, přičemž se takovým lidem podává pro ošetřování HIV účinné množství sloučeniny ze souboru sloučenin A87689 neoo jejich farmaceuticky vhodných solí.

Sloučeniny A87689 jsou také vhodné pro ošetřování stavů zoůsobených retroviry AIDS. Proto se vynalez zvláště týká způsobu osetřování AIDS u lidí podáváním takovým lidem pro AIDS účinného množství sloučeniny ze souboru sloučenin A876S9 a jejich farmaceuticky vhodných solí.

Vzdor ke znalostem o terapeutických možnostech prostředků, dosud známých proti HIV a AIDS a přes ohromné vynaložené výzkum né úsilí neexistuje dosud jediné, životaschopné léčivo proti těmto nemocem. Vynález se proto týká způsobu ošetření HIV a. AIDS u lidí, přičemž se takovým lidem podává množství pro ošetření HIV a AIDS potřebné první složky, která je volena ze souboru. A87689 sloučenin nebo jejich farmaceuticky vhodných solí a účinné množství další složky, kterou je jedna nebo několik slou cenin inhibujících HIV a/nebo AIDS nebo jejich farmaceuticky vhodných solíu Obzvláště výhodnou druhou složkou jsou inhibitory^r nukleosid reversní trsnscriptasy, jako je například. 3 azido-2',3'-dideoxythymidin /AZT, americký patentový spis číslo4 724232/ a 2',3'-dideoxycytidin /DDC/ a 2',3'-dideoxyinčsin /DDI, Mitauya H. a kol., Proč. N_atl. Acad. Sci., 83, str. 1911 až 1915, 1986/ a jako jsou podobné sloučeniny. Jinou užitečnou druhou složkou jsou nenukleosidové deriváty tetrahydroimiďazo/“4,5,1-jk_7/”l,4_7benzodiazepin-2/lH/-on a thion a podobné sloučeniny /deriváty TIBO; Debyser a kol., Proč,

Nati. Acad. Sci., 88, str. 1451 až 1455, 1991/. Avšak deriváty TIEO jsou účinné pouze proti replikaci HIV-1. Další účinnou druhou složkou sloučenin jsou inhibitory HIV proteázy. Například SPA 361341, SPA 346847, SPA 402646 a SPA 337714 popisují sloučeniny, které jsou užitečné jako inhibitory HIV proteasy. První složka, která se liší od sloučeniny A87689 sloučeniny, podávaná jakožtoprvní sloučenina se také může použít jakožto druhá sloučenina.

Vynález se tedy také týká farmaceutických, prostředků obsahujících účinné množství první složky, jak shora uvedeno a druhé složky, jak shora uvedeno, spolu.s farmaceuticky vhodným nosičem, excipientem nebo ředidlem.

Výrazem účinné množství se zde vždy míní dávka účinné látky nebo účinných látek, dostatečná pro terapeutické ošetření podle specifikované lékařské indikace.

Výrazem účinná látka se zde vždy míní alespoň jedna sloučenina ze souboru A87689, jejich derivátů nebo farmaceuticky vhodných solí a anti-HIV a/nebo anti-AIDS činidla nebo jejich farmaceuticky vhodné soli.

Pro terapeutické ošetřeni specifických indikacírse může podávat první složka se druhou složkou nebo bez druhé složky jako taková nebo ve formě farmaceutického prostředku v jednotkové dávkovači formě pro parenterální, transdermální, rektální, nasální nebo intravenózní podání s výhodou však pro orální podání. Takové farmaceutické prostředky se připravují o sobě známým způsobem a obsahují alespoň jednu účinnou látku ze souboru, sloučenin A87639 a popřípadě jednu nebo několik druhých složek spolu s farmaceuticky vhodným nosičem. V takovém prostředku' jsou. účinná látka a popřípadě druhá složka účinnými složkami. Při výrobě farmaceutického prostředku se alespoň jedna účinná látka o sobě známým způsobem mísí s nosičem nebo se ředí nosičem nebo se zapouzdřuje v nosiči, který může mít formu kapsle, sáčku, papírového nebo jiného obalu. Pokud nosičem je ředidlo, může to být pevná, polotekutá nebo tekutá látka, která působí jakožto nosič, excipient nebo prostředí pro účinnou látku. Farmaceutický prostředek může být ve formě tablety, pilulky, prášků, kosočtverečků, sáčků, elixírů, emulzí, roztoků, sirupů, suspenzí, měkkých a tvrdých kapslí, sterilních vstřikovátelných roztoků a sterilních balených prášků.

Jakožto příklady vhodných nosičů, excipientů a ředidel se uvádějí laktosa, dextrosa, sacharosa, sorbitol, mannitol, škroby, klovatina akacia, kalcium fosfát alginát, kalciumsalicyláh, mikrokrystalieká celulóza, polyvinylpyrrolidon, celulóza, tragakant, želatina, sirup, methyleelulóza, methylhydroxybenzoát a propylhydroxybenzost, mastek, stearau horečnatý, voda a minerální olej. řsrmaceutické prostředky mohou přídavně obsahovat mazadla, smáčedla, emulgátory a suspenzacní činidla, konservační přísady, sladidla a přísady upravující chut. Farmaceutické prostředky mohou být formulovány tak, aby alespoň jednu účinnou látku uvolňovaly ukamžitě, prodlouženě nebo po prodlevě po padání nemocnému, přičemž jsou takové úoravy o sobě známé. Pro orální podání sloučenina, obsahující popřípadě druhou složku, se může mísit s nosiči s ředidly, lisovat na tablety nebo uzavírat do želatinových kapslí. Směsi se také mohou rozpouštět v kapalinách, jako je například 10% vodný glukozový roztok, isotonický fysiologický roztok, sterilní voda nebo podobně a mohou se podávat intravenozně nebo formou injekcí.

Farmaceutické prostředky se s výhodou formulují v jednotkové formě, přičemž každá dávka obsahuje přibližně 1 až přibližně 500 mg a především přibližně 5 až přibližně 300 mg alespoň jedné účinné látky. Výrazem jednotková dávkovači forma se zde vždy míní fyzikálně oddělené jednotky vhodné pro jednotkové dávky pro ošetřované lidi nebo zvířata, přičemž každá jednotka obsahuje předem stanovené množství účinné látky vypočítané tak, aby se dosáhlo žádaného terapeutického efektu, spolu s požadovaným farmaceuticky vhodným nosičem. Takové pro· středky mohou obsahovat sloučeninu A87689 spolu se druhou slož kou aktivní nebo mohou obsahovat sloučeninu A876S9 samotnou. Výrazem farmaceuticky vhodný se zde vždy míní nosič, ředidlo nebo excipient, které jsou vhodné s ostatními složkami pro far· maceutické prostředky a které jsou neškodné.

Následující příklady formulací vynález toliko objasňuji a nijak jej neomezují. Výraz účinná látka má shora definovaný význam.

Formulace 1

Tvrdá želatinová kapsle se připravuje za použití následujících složek:

Množství /mg/kapsle/ alespoň jedna účinná látka 250 škrob, sušený 200 stearát hořečnatý celkem

460 mg rormuiece 2

Tableta se připravuje za použití následujících složek:

Množství /mg/tableta/ alespoň jedna účinná látka 250 celulóza, mikrokrystalická 400 oxid křemičitý, sublimovaný 10 kyselina stearové 5 celkem 665 mg

Sloučeniny se smísí a lisují se na tablety o hmotnosti 665 mg.

P_crmulace 3

Připravuje se aerosolový roztok za použití následujících složek:

Hmotnost alespoň jedna účinná látka 0,25 ethanol 25,75 hnací prostředek 22 70,00 /chlordifluormethan/ celkem 100,00

Účinná látka se smísí s.ethanolem s směs se vnese po částech do hnacího prostředku 22ý .ochlazeného na teplotu -30 °C' a směs se převede do plnicího zařízení. Požadované množs.tví se pak zavede do nádoby z nerezavějící oceli a zředí se zbytkem hnacího prostředku. Na nádobu se pak upevní ventil.

formulace 4 íableta, obsahující vždy 60 mg účinné látky, se připravuje následujícím způsobem:

alespoň jedna účinná látka ákrob nikrokrystalická celulóza polyvinylpyrrolidon /jakožto

10¾ roztek ve vodě natriumkarbcxymethylovaný škrob nastek stearát hořečnatý selkem

60,0 mg 45,0 mg 35,0 mg

4,0 mg 4,5 mg 1 ,0 mg 0,5 mg

150,0 mg účinná látka, škrob a celulóza se protlačí sítem Mo. 45 mesh U.S. /promsr ok. 425 yum/ a důkladně se promísí. Vodný roztok, obsahující polyvinylpyrrolidon, se smísí se získaným práškem· a smos se protlačí sítem No. 14 mesh U.S. /průměr ok

Takto získané granule se usuší při teplotě 50 C a vedou se sítem No. IS mesh U.S. /průměr ok 1000 /Um. Natriumksrboxymethylovaný škrob, stearát hořečnatý a mastek, předem protlačené sítem No. 60 mesh U.S /průměr ok 250 ^um/ se pak přidají ke granulím a po smíšení se směs lisuje ns tabletovacím stroji za získání tablet, vždy o hmotnosti 150 mg.

Formulace 5

Kapsle, obsahující· vždy 80 mg účinné látky, se připravuje z následujících složek:

alespoň jedna účinná látka	80	mg
škrob	59	mg
mikrokrystalická celulóza	59	mg
stearát hořečnatý	2	mg
celkem	200	mg

Účinná látka, celulóza, škrob a stearát hořečnatý se smísí, vedou se sítem No. 45 mesh U.S. /průměr ok 355 /Um/ a plní se do tvrdých želstinových kapslí v množství 200 mg na kapsli.

Formulace 6

Čípky, obsahující vždy 225 mg účinné látky, se připravují z následujících složek:

alespoň jedna účinná látka 225 mg glycerid.y nasycených mastných kyselin —2000 ,_mg__ celkem 22^5 mg

Účinná látka se vede sítem No. 60 mesh U.S. /průměr ok 250 yum/ a suspenduje se v glyceridech nasycených mastných kyselin, oředem roztavených za využití minimálně nutného tepla.

Směs se pak lije do-formy na čípky o nominální kapacitě 2 g a nechá se ochladit.

Fcrmulac e 7

Suspenze, obsahující vždy 50 mg účinné připravuje z následujících složek:

latí ϊΐ, se alespoň jedna účinná látka 50,00 mg natriumkarboxymethylcelulóza 50,00 mg sirup 1,25 ml roztok kyseliny benzoové 0,10 ml chutová přísada q.v.

barvivo g.v.

čištěná voda do celkových 5,00 ml

Účinná látka se vede sítem No. 45 mesh U.S. /průměr ok 355 /Um/a smísí se s natriumkarboxymethylcelulózou a sirupem za získání pasty. Přidá se roztok kyseliny benzoové, chutová přísada a barvivo a zředí se částí vody a zamíchá se. Pak se dodá dostatečné množství vody k dosažení žádaného objemu.

Formulace 8

Tntrovenczní prostředek se může připravit z následujících složek:.

alespoň jedna účinná látka 100 mg isotonická solanka 1000 mg

Sloučeniny A87689 jsou účinné v širokém oboru dávkování.

Například denní dávka je zpravidla přibližně 0,1 mg/kg až přibližně 50 mg/kg tělesné hmotnosti. Při ošetřování dospělých je výhodné', dávka přibližně 5 mg/kg až přibližně 25 mg/kg podávat, v jedné nebo v rozdělených dávkách, váné množství stanovuje lékař se zřetelem na minky a se zřetelem na závažnost onemocnění, čeniny nebo sloučenin, ktere se podavači, ^s®

Skutečně podápříslušné podna volbu slouzřetelem na věk, hmotnost a odezvu jednotlivých nemocných a na volbu cesty podá ní. Shora uvedené dávkování není omezení. Dávky druhé složky jsou vy kle.

tedy míněno jako jakékoliv známy a volí se jako ob- 24 A87689 in vitro íosfolipascvé A2 modely in vitro zkouška s hadím jedem, /Naja na i a/

Podle této zkoušky se endogenní fosfolipasy, produkované mikroorganismem odstraní z živné půdy odfiltrováním ořeš membránový filtr /molekulová hmotnost řez 10 000 Centricon/. Živná půda /100 ml/ se inkubuje v reakční směsi celkového objemu 0,540 ml po dobu jedné hodiny při teplotě 37 °C. Reakční směs sestává z 0,24 mM 1-pelmitcyl-2-/”6-/“/7-nitrc-2-1,3-benzoxadiazol-4-yl/amino_7kaproyl_7fosfatidylcholinu /PLA₂ chromogenní substrát, Avanti, Polar-Lipids, lne., Alabaster, AL/, 0,76 mM fosfatidylcholinu, 10 mM TRITONu X-100 /povrchově aktivní činidlo, Sigma/, 10 mM chloridu vápenatého, 37 mM TRIS-HC1 o hodnotě pE8,5 /Sigma/, 0,07 jednotek/ml Naja naja PLA~ /Sigma/. Reakce se ukončí přidáním 0,2 ml 0,25 M ethylendiamintetraacetátu /EDTA/. Produkt, 7-nitro-2-1,3-benzoxadiazol-4-yl_7amino_—7kaproová kyselina, se oddělí od substrátu vysoce účinnou kapalinovou chromatografií /HPLC/. Zkušební směs /20 ml/ se vstřikuje na Οθ sloupec /0,46 x 15 cm, ZOREAX/ s Cg schránkou; /rozpouštědlo, acetonitril:vodaíkyselina octová 40:60:1, průtoková rychlost 1,5 ml/min;. detekce produktu: UV při 453 nm;.. retenční doba: 3,72 až 3,76 minut/. Tabulka IV a V dokládá vliv A87689 sloučenin při této zkoušce.

Lidská cytosolická PLA^ zkouška

Cytosolick.ýí PLA~, isolovaný zbuhěk'lřdského moncblaátu. U937 se použije pro zkoušku inhibiční účinnosti A87589 in vitro. Zkouška se provádí způsobem, který popsal Kramer a kol., /Kramer R.M., RobertsE.F. Manetta J. a Putmsn J.E., The Ca⁺⁺ -sensitive Cytosolic Phospholipase Ag a 100-kD Protein in Humen Monoblast U937 Cells, J. ciol. C^em. 266/8/, str. 5268 až 5272/. Přidá se 50 ml zvukem zpracovaných liposomů, obsahujících 1-palmitoyl-2-/ ⁴C__7snachidonoyl-sn-glycero-3-fosfocholin . a 1,2-dioleoylglycerol /2 : 1 mcl«rní poměr/ do měnících se mikromolárních koncentrací zkoušené sloučeniny ve 150 ml zkušebního pufru. Tato zkušební směs obsahuje 1 mM chlorid vápenatý, 2 mM 2-merkaptoethanol, 150 mM chlorid sodný, 50 mM N-/2-hydroxyethyl_7piperszin-N'-/“2ethansulfonovou kyselinu /KEP3S/, hodnota pH 7,5 a 1 mg/ml hovězího sérového albuminu /BSA/. Do každé zkumavky se vnese enzym /5 ml, zředěno pro 1 C až 20% hydrolyzu substrátu/ a směs se inkubuje při teplotě 37 °C po dobu 15 minut* Reakce se ukončí reakčním činidlem Doles /Zhang Y.Y., Deems R..&. a Dennis S.A., Methods in Bnzymology, svazek 197, str. 4-57, Academie: Press., New York, 1991/. Volná arašidonová kyselina se extrahuje systémem heptan:voda /1,2 : 1/. Horní fáze se odstraní ze zkumavky, obsahující 0,1 g silikagelu, pr.omísí se, odstředí se za 1500xg a supernatant se odstraní pro scintilač'ní čítání. Vypočte se stupeň inhibice a vyjádří -se: jako množství, které inhibuja maximum reakce o 50 % /ΙΟ^θ/. Působení A87689 při této zkoušce je uvedeno v tabulce IV. Při této zkoušce jsou sloučeniny A87689 mnohem účinnější než klasické inhibitory jedu nabo pankreatového PLA₂, jako para-bromfenac.ylbnomid,. mepaerin nebo manoalid.

Zkouška PLA₂ celé buňky

Buňky lidské promyelocytické leukemie /HL-60/, zavedené k diferenciaci do granulocytických buněk' růstem v přítomnosti 1,5% dimethylsulfoxidu, uvolňují leukotrien /LTB^/ a; thromboxan B-₂ /TXBg/ v odezvě ns stimulaci kale iumionof ořem. A23187. Uvolňování těchto eikosanoidů je inhibováno ošetřením buněk PLA_n inhibitorem manoalogue // S,S_7-2-/ 3-/2,.5-dihydro-2-hydroxy-5-oxo-3-furanyl/propyliden_7-6,1O-dimethyl-5, 9undekadienal/. Monoalogue je inhibitor vylučované formy PLA₂, /Reynolds a kol./ a intracelulární formy ?LA₂ /Dennis a kol./ /Reynolds a kol., J*. American Chemical Society 110, str. 5172, 1 988 5 Dennis a kol., J · Biol· u^sni. 2o4, str. 8520, ^1989/*

Protokol pro HL-60 buňku, uvádějící výsledky zkoušek, je následující: HL-60 buňky, získané-od organizace American Type Culture Collection /ATCC/ rostou v suspenzní kultuře v RPMI 1640 prostředí /Gibco/ doplněném zárodečným hovězím šerem, ve zvlhčeném prostředí 5% oxidu uhličitého při teplotě 37 C. Buňky se diferencijí na granulocytické buňky kultivací v prí- 26 tomnosti 1,5 % dimethylsulfoxidu po dobu 7 dní. Buňky se oddělí odstředěním při teplotě 4 C v průběhu pěti minut a promyjí se jednou 118 mM chloridem sodným, 4,6 mM chloridem draselným,, 24,9 mM hydrogenuhličitanem sodným, 1 mM dihydrogenfosforečnanem draselným a 11,1 mM D-glukosou, 5 mM HEPES, hodnota pli 7,4, doplněno 0,1 % BSA, 1,1 mM chloridem hořečnatým a 1 mM chloridem vápenatým. Promyté buňky se opětně suspendují ne koncenpředehřívají se na 37 °G po dobu 5 mi· ky. Buňky se předběžně inkubují po donačež se 5 minut inkubují s ionoforem traci 1 x 10° buněk/ml a nut před započetím zkouš bu 5 minut s inhibitory, vápenatým, A23187. Reakce se ukončí odstředěním. Supernatant se dekantuje a zpracuje se na enzym imunozkouškou /EIAs/. Enzym imunizkouška· pro leukotrien a thromboxan B₂ se provádí v konečném objemu 150 ml, při obsahu 100 mM pufru fosforečnanu draselného, za hodnoty pEL 7,4, 0,4 mM chloridu sodného, 1 mM EDTA, 1 ,5 mM NaíEj a 0,1 % BSA s 5 ml vzorkem pro ETB^ a 50 ml pro TXB₂. Vzorky se pak inkubují s protilátkou a se stopařem na mikrotitrové destičce s 96 důlky /která je předběžně povlečena 5 mg myší protikráličí IgG protilátky na důlek/ při teplotě místnosti přes noc. Po vymytí nadbytku protilátky a stopaře, se do důlku vnese 200 ml reagencie Ellmanovy /imunozkouška, Cayman

Q

Chemical Company/ a vzorky se inkubují při teplotě 25 C po dobu 4 hodin. Měří se CD při 405 nm. Inhibitory, kalciumionofor; A23187 a zkoušená sloučenina se rozpustí v dimethylsulfoxidu na zásobní roztoky /10 mM/ a používá se jich při zkoušce za různých koncentrací v celkovém objemu 10 ml. Účinnost. A87689 při této zkoušce je uvedena v tabulce IV.

Tabulka IV

Účinnost A87689 v PLA? při zkoušce in vitro I.C

Zkouška

Hadi jed /Naja naja/ '50

PLA₂ čištěný lisdký cytosolický PLA₂ zkouška celých buněk HL-60

Vápenatá sůl Volná kyselina

8,0 mg/ml 6,3 mg/ml

22,0 mg/ml

17,2 mg/ml insktivní + volná kyselina má určitou účinnost při 10 mrš avšak inhibiční účinnostjna deskách při 30 až 40% inhibicí

Tabulka V

Účinnost sloučenin A87689 při zkoušce PLA~ s hadím jedem /Naja naja/

Sloučenina 1C,

6,3 mg/ml 9,5 mg/ml 6,7 mg/ml volná kyselina vápenatá sůl tetraacetátu pentasodná sůl

A87SS9 v in vivo modelech arthritis

A87689 se zkouší ve třech, odlišných in vivo zkouškách arthri tis určených pro stanovení protizánětlivé účinnosti. V případě každého živočišného modelu se do zadní packy krysy vstřikne látka, která navozuje arthritický stav v kloubech, projevující se otokem, zapálením měkkých částí a poškozením kosti. Tento stav je formou navozené arthritis, takže 3e mohou identifikovat činidla, která mají protizánětlivou účinnost prostřednictvím snížení zánětu tkáně a sníženo poškození kosti.

Zkoušená sloučenina se podává orálně a intraperitoneálním s subkutanním vstřikováním. S výhodou se používá orálního podání;, avšak parenterálnfpodání A87689 vede k vynikající protizánětlivé účinnosti. Intraperitoneální vstřikování četných dráždivých.látek vede často k peritonitis. Taková peritonitis je ve vztahu s protizánětlivou účinností, jak je zřejmé ze snížení zánětu měkkých tkání. Hrome toho sub28 kutanní vstřikování dráždivých materiálů může také vést k nespecifickým protizánštlivým účinkům. Každá zkouška se provádí paralelně s nespecifickou dráždivou látkou, jako je 1% karragenin nebo zředěná kyselina octová k posouzení, do jaké míry je protizánětlivá účinnost nespecifická.

Lipodalaminem indukovaný model arthritis

Lipoidalaminem navozená zkouška srtritis je modelem systemického zánětu a arthritis se navozuje pomocnou látkou,

N,N-dioktadecyl-M ,N -bis/2-hydroxyethyl/propandiamin /LA/_y suspendovanou v minerálním oleji. Navozené onemocnění je velmi podobné onemocnění při použití Freundova kcmpletnííio adjuvantu /FCA/, použitého pro ošetření krys podle Changa /Chang A., Fearson C.M. a Abe C., Adjuvant polyarthritis IV. Induction by a synthetic adjuvant.: immunclogic, histopathologic^ and other studies, Arth. Rheum. 23, str. 62 až 71, 1980/.

K zánětu dochází v různých tkáních, avšak nejčastěji ve slezině a v kloubech. Sloučeniny se zkoušejí se zřetelem na schopnost modulovat zánět sleziny a kloubů při probíhající nemoci /ošetření se zahajuje 9. den/.

Zvířata /samečci Lewis/Sprague Dawley, samečci, hmotnost 200 až 220 g/ se rozdělí na skupiny po 5 a umístí se v klecích s krmivém a vodou podle libosti. V den O se jim vstřikne 7,5 mg LA subkutanně do kořene ocasu. Devátý den se zvířata zváží s začne se podává zkoušená sloučenina. Sloučenina se suspenduje za použití tkáňového homogenizéru v \% roztoku karboxy methy leelul 6 zy. Orálně se podává dávka 50 mg/kg. Sloučeniny se podávají jednou denně po dobu 5 dní /9. až 13· den/, přičemž 14. den se žádná sloučenina nepodá. Fatnáctý den se zvířata zváží znova a měří se objem zadní packy použitím vodního manometru. Zvířata se pak anestetizují a krev se odebere pukcí do srdce. Zvířata se pak usmrtí, slezina se vyjme a zváží a zadní packa se odejme právě nad · ·- kotníkovým kloubem a zváží se. V jednotlivých vzorcích krve se analyticky zjištuje fibrincgen. Vypočte se střední a standardní chyba všech hodnot a procentový rozdíl od nemocného /LA/ kontrolního zví— řete. Stanoví se statistický význam zc použití kalkulace Dunnet. T. Positivní kontrolou pro LA arthritis zkoušku je dexsmethason. Dexamethason v dávce 0,1 mg/kg při orálním oodání inhibuje otok packy o 80 až 90 % a hmotnost sleziny 90 až 100 %. Vlivy na fibrinogen jsou mnohem, proměnlivější, zpravidla je však inhibice 50 až 70 %.

Sloučeniny, které vykazují statistickou inhibici otoku packy nebo hmotnosti sleziny se znova zkouší v dávce 50 mg/kg; jestliže se účinnost potvrdí, provede se zkouška odezvy na dáv ku. Sloučeniny se také mohou zkoušet za použití dvou kompletních Freundových adjuvantu k navození modelů arthritis u krys, jak bude dále uvedeno.

Při podávání kalciové soli A87689 subkutanně v dávce 14 mg/kg v dimethylsulfoxidu při této zkoušce se otok injektovené packy inhibuje ze 46 %.

Jestliže se sodná sůl A87689 solubilizuje ve vodě a podává.' . subkutanně v dávce 20 mg/kg při této zkoušce, inhibuje otok packy 30 %, Podobně jestliže se A87689 rozpuství v dimethylsulfoxidu a podává intraperitoneálně v dávce 10 mg/kg, inhibuje otok packy 15 %. Jestliže se však sodná sůl rozpustí v di methylsulfoxidu a podává subkutanně v dávce 10 mg/kg, inhibuje otok packy 65 %·

Polyarthritis navozená Freundovým kompletním adjuvantem

Používá se dvou modelů in vivo, založených na zavedení , FCA dochodidla' zadní packy krys a na měření vyvolaného zá nětu; s loučenina A87689 se podává třemi způsoby: intraperitoneálně /IP/, orálně /PO/ a subkutanně /SC/. Lva modely, které jsou založeny na zavedení FCA do packy krysy, 3souzkouškou vývoje /developing tesť'/ a”zkouškou probíhání /established test/ onemocnění.

Při zkoušce vývoje se používá samců krysy Wistar-Lewis o hmotnosti 220 až 240 g /Karlac Sprague Dawley Laboratories/. Krysy se aklimatizují v laboratorních podmínkách po dobu 7 dní ořed zkouškou. . Krysám se podává krmivo Purina Lab Chov/ a vodapodle libosti. Cyklus osvětlení je 12 hodinový. FCA se připravuje zředěním PhRRIGhHu /adjuvant, Calbiochem/ i : 6 minerálním olejem za získání končené koncentrace 0,083$.

V den 0 se krysám dá jedna injekce na chodidlo 0,1 ml PCA suspen ze ne pravou zadní pecku. Zvířata se rozdělí do skupiny po pěti a zváží se. Při zkoušce vývoje se ošetřování zkoušenou sloučeninou nastartuje v den 0, Normální a FCA kontroly se ošetří podáním pojidla placebo. Měří se objem packy elektrickým zařízením tři dny v týdnu. Čtrnáctý den se zvířata opět zváží a ošetří se vhodnou dávkou. Zkouška se ukončí 28. den, zvířata se opět zváží, měří se objem packýma pořídí se radiogrefy obou zadních pacek. Konstruuje se křivka pro objem packy ijektované a neinjektovsné a vypočte se plocha pod křivkou. Tato plocha se porovnává s PCA kontrolou a vypočte se procentová inhibice PCA kontroly. Stanoví se poškození kosti analýzou radiograftr, založeno na periostiálním hodnocení, kloubu a ukládání vápníku.

Pokud se při zkoušce vývoje podává vápenatá sůl A87689 orálně v dávce 25 mg/kg v 1$ karboxymethylcelulózovém roztoku, inhibuje ot^ok packy 59 Pokud se vápenatá sůl A87689 podává intraperitoneálnč v dávce 10 mg/kg v dimethylsulfoxidu, inhibuje otok packy 98 %,

Pokud se sodná sůl A87639 podává intraperitoneálně v dimethylsulfoxidu v dávce 5 mg/kg, inhibuje otok packy 108 $, je však zřejmá peritonitis u krys takto ošetřených. Za týchž podmínek, avšak při podání 10 mg/kg,sodná sůl A87689 inhibuje. otok packy 1C1 $ /dvě krysy z této skupiny zemřely na peritonitis/ •ř . ti „. _v

Zkouška probíhání je variací zkoušky vývoje,,pncemz jsou všechny podmínky stejné, evšak ošetřování zkoušenou sloučeninou se začíná až 14 nebo 15 den, když je u krys již rozvinuto onemocnění, jsk je zřejmé na alespoň 0,5 ml otoku packy bez injekce. Při této zkoušce se podává vápenatá sůl A87689 v dávce 50 mg/kg v 1% karboxymethylcelulózovém roztoku intrsperitoneálně za inhibice otoxu pecky p8 %·

Zkoušky, prováděné se sloučeninami A87689 , dokládají účinnost sloučenin podle vynálezu proti viru leukemie lidských.

T-buněk a HIV-1.

Následující zkoušky se týkají zjištování účinnosti sloučí nin A8768S proti viru lidské leukemie a EIV-1.

Zkouška in vitro viru myší leukemie Moloney /Mo-MGLV/

Sloučeniny A87689 se zkouší in vitro proti viru myší leukemie Moloney /Mo-MuLV, klona 37, The Salk Institute, Ls Jolla, Californis/ za použití zkoušky XC, kterou popsal Rowe V.P. a kol., Virol. 42, str. 1136 až 1139, 1970. Obecně se ooužívá 3 až 5 x 10' SC-1 buněk /CRL-1404/; American Type Culture Collection ATCC/ na důlek mikrotitrové destičky s 96 důlky v minimálním prostředí doplněném 5 % zárodečného hovězího sera, penicillinem /150 jednotek/ml/, streptomycinem /150 ^ug/ml/ a polybrenem /2 /Ug/ml/. Každý důlek se infikuje Mo-MuLY /rozmanitost infekce = 10 PEU/buňka/ další den.

Vir se nechává adsorbovat na buňky po dobu jedné hodiny a k buňkám se přidá prostředí obsahující řady zředění A87689. Nepoužívá se žádného polopevného prostředí.

Po inkubaci v době 5 dní /když buňky stékají/ se SC-1 buňky ozařují GV po dobu 10 sekund a do důlku se vnese 5 až 8 x 1 O⁴' XC buněk /CCL-l65j ATCC/; zpravidla je potřebná inkubace po dobu dalších dvou dnů k získání plně navozeného cytopatického jevu virem. Vliv sloučenin A87689 při této zkoušce je v tabulce

Pro posouzení viricidní účinnosti A87689 sloučenin se používá řadového zředění sloučenin, které se předinkubuje Mo-MuLV po dobu jedné hodiny při teplotě 37 °C. Buňky SC-1 se pak infikují dvojnásobným zředěním různými směsemi sloučeniny A87689 a viru. Vir se nechává absorbovat na buňkách po dobu jedné hodiny při teplotě 37 °C, virem infikované buňky se promyjí třikrát Hankovým vyváženým roztokem soli /HESS, GIBCO, Grand Island, N. Y./ a buňky se monitorují se zřetelem na cytopatický jev za použití zkoušky XC buňky, jak popsáno shora.

Zkouška in vitro proti viru HIV

Propaguje se HTLY-IIIB.kmen HIV-1 v lidské T-lymfocytové buňce linie ’Ή9” /nopovic M. a kol., Science 224, str. 497 až nu

500, 1984/. Virové inoculum z oroduceru kultur H9-IIIB.

0035 *1

CJ k-_L

Pro rutinní kol., Science 229 Nátuře 332, str. středí SPMI 1640.

zkoušku so použije , str. 563 až 566, 469 až 470, 1988/. Pro propagaci H9 linie buněk MT-2 /Karada a 1985/ a CEM /Nera a kol., Buňky se nechají růst v pro buněk se prostředí ΒΡΜΣ doplní zárodečným hov--zim šerem 20 % /objem/objem/, Prostředí, použité pro propagaci linie MT-2 buněk, pro ředění sloučenin a pro udržování kultur v průběhu zkoušky, se doplňuje 10 % /objem/cbjem/ zárodečného hovězího sera. Každé prostředí obsahuje také 100 jednotek/ml penicillinu, 100 mcg/ml streptomycinu a 25 mM pufru HEPES. Kultury se udržují v tkáňovém prostředí pro jedno použití při teplotě 37 °C ve zvlhčeném prostředí vzduchu obsahujícího 5 % oxidu uhličitého.

Přípravek pro předzkoušku obsahuje také formulaci činidla XTT-PMS, používaného pro calorimetrické hodnocení životnosti buňky za smíšení XTT / tetrazoliové činidlo, Diagnostic Chemicals, Oxford, CT/ v množství 200 yUg/ml a 0,02mM PMS Zfenazinmethosulfát, Sigma Chemicals, St. Louis, MO./.

Sloučeniny A87689 se rozpustí v dimethylsulfoxidu v množství 40 mg/ml nebo ve sterilní, deíonižované vodě v množství 2 mg/ml. V dimethylsulfoxidu se zvláště rozpouští vápenatá sůl a volná kyselina A87689. Sloučeniny v dimethylsulfoxidu se zpočátku zředí v prostředí na koncentraci 0,2 mg/ml, zatímco sloučenina ve vodě se zpočátku zředí na prostředí o koncentraci 0,2 mg/ml. Následující zředění se provedou v log nebo 0,5 log řadách.

Pro hodnoceni cytotoxicity^; se každé zředění vnese na mikrodestičku v množství 100 ^ul/důlek. Sloučeniny A87689 se zkoušce třech důlcích na každé zředění s infikovanými buňkami a ve dvou důlcích na každé zředění v případě neinfikovaných buněk.

Před přípravou infikovaných a neinfikovaných buněk se stas# noví počet živoucích buněk se zřetelem na buňky používané pomocí trypanové modře.

v

Zadaný počet buněk se vnese do 50 ml konické odstředivkové kyvet.y /sterilní a odhoditelná/ a vnese se vir pro dosažení MCI 0,03 TCIB.-₀/buňka pro MT-2 a přibližně 0,12 TCID_co/buňka pro OEM buňky, iřidá se Čerstvé prostředí k nestavení hustoty buněk 1 x. 10^z buněk/ml a suspenze viru a buněk se inkubuje při teplotě 37 °O po dobu jedné až dvou hodin před vnesením na destičku. Stejným způsobem se připraví neinfikované buňky, které jsou tedy prosté viru.

Fak se infikované i neinfikované buňky nanesou na destičku v množství 100 /ul/důlek, čímž se získá výchozí počet buněk Λ ' x 10' bunšk/důlek. Tímto způsobem připravené mikrodestičky se pak inkubují po dobu 7 dní ve zvlhčené atmosféře obsahující 5 % oxidu uhličitého.

Pro vyhodnocení virálního cyťops.tického jevu /CPE/ a pro stanovení účinnosti sloučenin A87689 se do každého důlku přidá 50 /Ul XTT-PMS roztoku a mikrodestičky se vrátí do C0₂ inkubátoru na 4 hodiny. Pak se z destiček odstraní víčka a nahradí se přj.lnavými destičkovými pečetěmi. Destičky se hodnotí na čítači desce- VMax Plate. Reader při 450 nm a 650 nm. Působení sloučenin A87689 je zřejmé z tabulky VIZ.

Tabulka VX

Účinnost sloučenin A87689 při zkoušce leukemie Moloney

A87689 vápenatá sůl volná kyselina pentasodná sul volná kyselina tetraacetátu iin vitro s myším virem

0,4 yug/ml 0,4 yUg/ml 0,5 /Ug/ml 0,2 /Ug/ml + IC,-« znamená 50 hibici CPE o koncentraci sloučeniny AS7689, 50 % potřebnou k. in- 34 Tavulka VII účinnost sloučenin A87689 při zkouškách in vitro proti ZLIV IC, ⁺ '50

A87689 volná kyselina pentasodná sůl

8,5 /Ug/ml 8,8 /Ug/ml

IC‘ _θ znamená koncentraci sloučeniny AS7689 potřebnou k inhibici CPE o 50 %

Následující příklady praktického provedení vynález blíže objasňují, nijak jej však neomezují.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 11

Fermentace A87689 A. třepačka je —

Množství /%/

M

2,0

2,0

0,2 do 1 litru

Kultura A87689, NRRL 18815 bud ve formě lyofilizovaných let nebo ve formě suspenze se.udržuje v kapalném dusíku a použije se k naočkování vegetativního prostředí; vegetativní prostředí A má následující složení

Vegetativní prostředí A Složka glukosa bramborový dextrin sojová moučka moučka z baviníkových semen uhličitan vápenatý vodovodní voda q.s.

hodnota pH se nenastavuje + moučka PROFLO, Traders Protein, P.O. Box 8407, Memphis,

TN 38108

Za udržování kultury v kapalném dusíku se připraví ampule za použití mycelia z vegetativní kultury /48 hodin inkubace, teplotě 30 °C/, která se suspenduje na kultivační objem v suspenzním prostředí. Suspenzní prostředí obsahuje laktozu /100 g/, glycerol /200 ml/ g leicnizovsnou vodu /q,s. do 1 litru/.

Ampule getativního při teplotě s kapalným dusíke prostředí ve 250 30 °C co dobu 48

5,08 cm za počtu otáček 250/min.

m se použití k inokulaci 50 ml ve v

ml bankách. Kultury se inkubují hodin na třepačce, opisující kruh

Vegetativní kultury se používá /2 % objem/objem inokula/ k naočkování 50 ml produkčního prostředí následujícího složení

Produkční prostředí I

Složka glukosa pepton⁺ melasa /Blackstrap/ uhličitan vápenatý deionizovaná voda hodnota pH se nenastavuje + BACTD PEPTONE, Difco Laboratories

Množství /%/

3,00

0,75

0,50

0,20

g.s. do 1 litru

Naočkované produkční prostředí se inkubuje v Erlenmayerově baňce o obsahu 250 ml při teplotě 30 °C. po dobu 5 až 6 dní na třepačce opisující kruh 5,08 cm zs počtu otáček 250/min.

Takto připravená inkubovaná vegetativní kultura ve druhém stadiu /2,4 1/ se používá k naočkování 80 až 115 litrů sterilního produkčního prostředí II.

Produkční prostředí II

Složka glukosa pepton melasa /Blackstrap/ uhličitan vápenatý deionizovaná voda

Množství /%/

2,35

0yT5

1,40

0,20

q.s. do 1 litru hodnota pH se nenastavuje; pro omezení pěnění se přidává protipěnicí přísada /SAG 471/

BACTG PEPTONE nechává fermentovat až 8 dní při teplotě rychlost míchání

Naočkované produkční prostředí se v míchaném bioreaktoru 165-L po dobu 7 30 °C. Řídí se rychlost toku vzduchu, v míchané nádobě a počítač k udržení koncentrace rozpuštěného kyslíku na 45 % nasycení vzduchem. /Popřípadě/', se řídí hodnota pH za použití kyseliny sírové nebo hydroxidu sodného, aby odpovídala 6,7 až 7,6. Zavádí se glukosový roztok /0,33 g/ml deionizované vody/ rychlostí 4,5 g/l/den, které se započne 25 sž 27 hodin po naočkování. Rychlost se zvýší na 5,7 g/l/der ve 42 sž 44 hodině.

Příklad 2

Fermentace A87689.1

Sloučenina A376S9 se produkuje jako podle příkladu 1, použije se však A876S9.1 /NRRL 18851/ kultury.

Příklad 3

Izolace a čištění A87689

Fermentační půda /88 L/, /připravená způsobem podle příkladu 2/ se zfiltruje přes keramický filtr /Membralox System, Illinois Water Treatment, Rockford, Illinois/, čímž se získá 66 1 filtrátu, obsahujícího A87689. Filtrát se čerpá na sloupec z nerezavějící oceli /7,62 cm x 121,92 cm/ DIAICNu HP-20SS /pryskyřice polystyrénového typu, Mitsubishi Chemical Industries·, Ltd., Tokyo/ /5 litrů/ za rychlosti 500 ml/min. Sloupec se promyje 20 litry systému methanol:voda /1 : 3/ a aktivita se eluuje systémem methanol:voda /1 : 1/ za shromáždění 10 -4 - 1 frakcí. Frakce se zkoušejí na inhibiční aktivitu ?LA₂« Frakce 4 s 5, kte ré vykazují nejvyšší aktivitu,se spojí a zkoncentrují se ve vakuu na 2500 ml jakožto fond 1. frakce 3, 6, 7 a 8 se spojí jakožto fond aktivity 2. Sraženina, vytvořená ve fondu 1, se odstředí a rozpustí se v 60 ml dimethylsulfoxidu. 10 ml podíly dimethylsulfoxidového roztoku se čerpají na sloupec DYNAMAK HPLC Cg /4_}1 x 30 cm/ /Rainin Instruments Co., Smeryville, Ca/, obsahující 400 ml silikagelu Cg /150A/ pryskyřice. Sloupec se vyvíjí gradientem acetonitril:voda:5% acetát amonný /10 : 85 :

5/ až acetonitril:voda:5% acetát amonný /50 : 45 : 5/ v 70 minutách rychlostí 25 ml/min a shromažďují se 25 ml frakce. Eluování se monitoruje detektorem VTaters 481 /Millipore Corporation

- 37 Milford, Μ 37 s 38,se se opakuje krystalick

Ο_η ~ z , ,

C, 2sony

A/ při 254 nm. Vytvořené krystal odfiltrují a vysuší se ve vakuu 5 x, čímž se dosáhne celkového

é._ AS7689 soli /rozklad při te pravý bod teploty tání/.

y ve frakcích 36, . Cd d ě1ování podílů výtěžku 1162 mg plotě přibližně 300 rTlklC

Alternativní způsob izolace a čištění A87oS9

Veškerá fermentační půda /225 1/, získaná při způsobu podle příkladu 1, se zfiltruje přes filtrační lis s 3 % HYFLC SUPERCSL jakožto filtrační pomocnou látkou /křemelina, Johns Manville Products Corp./. Filtrát /190 .'1/ se upraví na hodnotu pE 7,4 až 7,0 5N kyselinou chlorovodíkovou; přidá se pryskyřice DIAION HP-20 /20 1/ a míchá se po dobu dvou hodin. Pryskyřice se odstraní filtrací, promyje se 100 1 destilované vody, pak se promyje 100 1 systému.voda:methanol /3 : 1/ za míchání v nádobě po dobu 30 minut. Supernatant se dekantuje a pryskyřice se míchá s 50% methanolem k eluování A87689 aktivity. Methanclový supernatant, obsahující aktivní látku, se odfiltruje a pryskyřice se míchá se 100 1 methanolu k odstranění zbylé účinnosti a k regeneraci pryskyřice. Eluování se monitoruje za použití zkoušky s hadím jedem /Naja naja/ PLA₂·

50% methanolový eluát se zkoncentruje ve vakuu na 20 ' 1. Hodnota pH se nestaví.na 7,0 a roztok se extrahuje, dvakrát 20 1 n-butanolu. Odpadní vodná vrstva se suší vymrazcváním za získání 56 g surového produktu. /Čištění tohoto materiálu, který není extrahovatelný n-butanolem, je popsáno v příkladu 4B../ Spojí se n-butanolcvé extrakty a zkoncentruji se ve vakuu k suchu. Zbytek se rozpustí ve 100 ml vody a 100 ml dioxanu a suší se vymrazcváním, čímž se získá 14,7 g suťového A87689. Surový A87689 se rozpustí ve 300 ml methanolu za působení zvuku a nechá se stát při teplotě -10 °c až.do vytvoření sraženiny. Sraženina se odfiltruje a vysuší se ve vakuu, čímž se získá 1,4 g částečně vyčištěné A87689.

Materiál /100 mg/ se míchá v 10 ml vody a hodnota pH

- 38 suspenze se upraví na 12,0 5N roztokem hydroxidu sodného k rozpuštění sraženiny, Hodnota;pH se pomalu nastavuje ns 7,0 pN kyselinou chlorovodíkovou a roztok se vnese na sloupec LYNAMAX 150A /Rainin Instrument Co., ňmeryville, CA/, obsahující 100 ml silikagelu C_R /150 A/ pryskyřice. Sloupec se vyvíjí gradientem acetonitril:voda:1% acetát amonný /5 : 85 : 10/ až acetonitril: voda:1% octan amonný /50 : 40 : 10/ v 50 minutách při průtokové rychlosti 8 ml/min. Sluování se monitoruje při 260 nm za použití detektoru Waters 481 /Millipore Corporation, Milford, MA/. Spojí se frakce 2 a 3, zkoncentrují se ve vakuu k odstranění ace tonitrilu a nechají se stát přes noc pro krystalizaci. Proces se opakuje a krystaly ze dvou fází se spojí, odfiltrují a vysuší ve vakuu, čímž se získá 29 mg krystalické vápenaté soli A87689 teplota tání - rozklad při teplotě nad 300 C/. Tato forma soli má velmi malou rozpustnost ve vodě, je však rozpustná v dimethylsulf oxidu s označuje se jakožto ve vodě nerozpustná sůl nebo váoenatá sůl.

Příklad 4A

Další alternativní způsob izolace a čištění A87689

Obměnou způsobu podle příkladu 4 jo opětovné suspendování částečně vyčištěné A87689 ve fromě usušené sraženiny ve vodě a nanesení roztoku přímo na sloupec, bez nestavení hodnoty pH ne 12 až 7. Získaná nekrystalická-sodná sůl se lyofilizuje a je rozpustná ve vodě. Při posuzovaní užitečnosti se označuje jako ve vodě rozpustná sůl nebo sodná sůl.

?říklad 4B tištění produktu neextrahovatelného n-butanolem

Část n-butanolem neextrahovatelného produktu podle příkladu I /200 mg/ se rozpustí v 10 ml vody a nanese se na sloupec DYNA£AX 150A, obsahující 100 ml silikagelu C_Q pryskyřice. Sloupec se vyvíjí gradientem acetonitril:0,1% octan amonný /1 : 20/ až acetonitril:0,1% octan amonný /1 : 1/ v 30 minutách za průtokové rychlosti 10 ml/min za shromažďování 3 ml frakcí a monitorování eluce při 260 nm. Krystaly, vytvořené ve frakci 22 /nej- 39 aktivnější frakce/ se odfiltrují a vysuší se v získá S mg krystalické A87689 soli. Filtrát se suší vymrasová ním, čímž se získá dalších 19 mg amorfní A87689 soli.

vamuu, číms se i x IaIcU J

Příprava AS7Ó89 volné kyseliny z A87689 vápenaté soli čištěná A87689 vápenatá sůl /0,44 g/, získaná podle příkladu 4, sa suspenduje ·· 5Ν’ kyselinou chlorovodíkovou /0,05 1/ při teplotě okolí; aceton /0,05 1/ se přidá. Žlutý roztok se pozoruje po 10 minutách a po 30 minutách se začne vytvářet sraženina. Suspenze se míchá po dobu 18 hodin v prostředí dusíku při teplotě místnosti. Objem reakční směsi se ve vakuu sníží na polovinu a směs se zfiltruje, čímž se získá žlutý prášek /0,58 g/ po promytí 1N kyselinou chlorovodíkovou. Ještě mokrý prášek se rozpustí v chloroformu /0,2 1/ a promyje se dvakrát vodou. Chloroformová vrstva se vysuší síranem sodným. Směs se zfiltruje a rozpouštědlo se: odstraní ve vakuu, čímž se získá žlutá pěna /0,306 g/, kterou je volná kyselina A87689. Produkt je žlutý a krystalický. TLC /Merck: SG/demonstru je 1 skvrnu /R^ = 0,5, systém chloroform:

methanol:amoniak, 6:3:1/ detektovanou parami jodu a HPLC indikuje čistotu 77,9$. Volná kyselina vykazuje HPLC retenční dobu 6,4 minuty za použití /uBondapak C.jg SG sloupce /Nstsrs Chromatography Division, Millipore C_orporation/ v gradientu kyanonitril:0,1$ acetát amonný /1 : 9 ež 7 : 3/ při průtokové rychlosti 2 ml/min a za detekce UV při 254 nm.

Volná kyselina A87689 má tyto charakteristiky:

molekulová hmotnost: empirický vzorec: FAB-MS/M+1/: nalezeno vvoočteno

1184,462 ^C6o^H72°20 1185»4695 1185»4680

mentární a	nalyza:
vypočteno:	C 66,88	H	6,12
nalezeno:	C 66,52	S.	5,95
nezjištěna	žádná síra	ani	dusík

UV /ethanol, 1max/:

meutrální zásada kyselina

304 /e = 54805/ 300 /e = 56569/ 314 /e = 59871/ 218 /e = 40085/

238 /e = 64335/ 237 /e = 72695/ 236 /e = 38628/ teplota tání vyšší než 200 sž 320 °C titrsee vykazuje pKa 3,5 /přibližná tři skupiny/

-Λ

O br. 2 je ±R spektrum volné kyseliny A87689. Nejvýznamnější absorpční maxima jsou při následujících frekvencích /cm V 3439, 1758, 1688, 1636, 1568, 1395, 1002, 981 s 753.

Příklad 6

Příprava vápenaté soli tetracetátu

Vápenatá sůl A87689 /100 mg/ se rozpustí v bezvodém pyridinu /3 ml/. Do roztoku se přidá acetanhydrid /1 ml/. Roztok se zahříváním udržuje na teplotě 40 °C po dobu 120 hodin v prostředí dusíku. Roztok se pak ochladí na teplotu místnosti a zkoncentruje se ve vakuu k suchu, čímž se získá lepkavý zbytek. Zbytek se trituruje se systémem chloroform:methanol /1 : 1/, zviltruje se, vysuší se ve vakuu, čímž se získá světle žlutý prášek /1.12 mg/. Vápenatá sůl tetraacetátu A87689 má retenční dobu 12,2 minuty na HPLC systému, popsaném v příkladu

5. Vápenatá sůl tetraacetátu má následující charakteristiky: molekulová hmotnost: 1390,460 empirický vzorec: Ογ^ΗγθΟ^Οβ

FAB-MS/M+1/: nalezeno 1391,.4659 vypočteno 1391,4677 UV /ethanol, 1max/:

neutrální 300 /e = 31700/

233 /e = 32700/ 206 /e = 311000/ 225 /e = 62300/ zásada 295 /e = 57900/ kyselina 306 /e = 53900/

Na obr. 3 je IR spektrum vápenaté soli tetraacetátu A87689 /KBr peleta/. Nejvýznemnější absorpční maxima osou při následujících frekvencích /cm“¹/: 3436, 1723, 1641, 1457, 1241, 1027 s 1003.

Příklad 7

Příprava vápenaté soli tetramethyletheru A87689

Vápenatá sůl A87689 /0,1 g/ se rozpustí v áimethylsuifoxidu /10 ml/, obsahujícím 10 % hydroxidu sodného /1,5 ml/. Do tohoto roztoku se přidá methyljcdid /9,5 ml/. Roztok se míchá oři teplotě 40 °C po dobu 13 hodin v prostředí dusíku. Ochladí se na teplotu místnosti a hodnota pH se nastaví na 1,5 1ΓΓ kyselinou chlorovodíkovou, brazenina se oddělí filtrací, oromyje se dv krát vodou, vysuší se ve vakuu a tak se získá 11 5 mg tříslově zabarveného orášku.

Vápenatá sůl tetramethyletheru A876S9 má hodnotu R.^ 0,75 podle TLC systému, popsaného v příkladu 5. Vápenatá sůl tetramethyletheru A87689 má následující přídavné charakteristiky: molekulová hmotnost:

empirický vzorec:

Na obr. 4 je IR spektrum vápenaté soli tetramethyletheru A87689 /KBr pelety/.Nejvýznamější absorpční spektra jsou při následujících frekvencích /cm Ví 3434, 1718, 1637, 1465 a 1089.

Příklad 8

Příprava pentasodné soli A87689

Volná kyseliny A87689 /70 mg/ se rozpustí v methanolu /1 ml/, do kterého se přidá 1 ml vody a hodnota pH se nastaví na 12 2N roztokem hydroxidu sodného. Tento roztok se míchá po dobu jedné hodiny při teplotě místnosti v prostředí dusíku. Roztok se zkoncentruje ve vakuu téměř k suchu, čímž se získá polopevný produkt, který se trituruje se 2 ml systému acetonitril: methanol /1 : 1/ a zfiltruje se, čímž ss získá bílý prášek /25 mg/. Tento ve vodě rozpustný prášek se trituruje s methanolem a získaná pevná látka se oddělí, vysuší a tak se získá bílá pevná látka /38 mg/.

Pentasodná sůl AS7689 má hodnotu R_f. 0,3 podle TCL systému, popsaného v příkladu 5 a retenční dobu 5,25 na systému HPLC, popsaném v příkladu 5· -ťentasodna sůl A87689 má následující přídavné charakteristiky:

129

4,

371 molekulová hmotnost empirický vzorec

FAB-MS/M+1/: nalezeno:

vyDočteno:

π w π y_o ~66~67^U2<T^a5 1295,3814 1295,3792

UV /ethanol	., 1max/
neutrální	299 /e = 40379/	237	/e = 47771/
zásada	299 /e = 42623/	235	/e = 30162/
kyselina	312 /e = 40908/	235	/e = 30162/
	221 /e = 29110/

ta/,

Na obr. 5 je IR spektrum pentasodné soli A87689 /KBr peleNejvýznamnější absorpční spektra jsou při následujících frekvencích /cm”¹/: 3430, 1710, 1623, 1436, 996, 834 a 701.

Příklad 9

Příprava volné kyseliny tetramethyletheru A876S9

Vápenatá sůl A87689 /50 mg/ se rozpustí v 5 ml dimethylsulf oxidu, obsahujícím 0,8 ml 10% roztoku hydroxidu sodného.

Do této směsi se přidá 0,25 ml methyljodidu. Reakční směs se pak ochladí na teplotu místnosti a hodnota pH se nastaví na 2 5N kyselinou chlorovodíkovou. Reakční směs se zkoncentruje na 0,75 svého původního.-ob jemu ve vakuu a zředí se 100 ml chloroformu. Chloroformová vrstva se promyje 2 x 5% roztokem ' ^2^0^ a pak 2 x vodou·. Organická vrstva se odstraní a vysuší se ve vekuu, čímž se získá 68 mg krémově žluté pevné látky. Tato pevná látka se trituruje s petroleumetherem a pak s diethyletherem. Pevná látka se oddělí filtrací a vysuší se ve vakuu, čímž se získá 33 mg jemně žlutého produktu.

Volná kyselina tetramethyletheru A87689 má hodnotu R^ 0,7 na systému TLC, popsaném v příkladu 5 a retenční dobu 10,23 minut. na systému HPLC, popsaném v příkladu 5. Volná kyselina tetramethyletheru A87689 má následující charakteristiky:

molekulová hmotnost; empirický vzorec: FAB.-MS/M+1 /: nalezeno:

1240 ^C7C^H80°20

1241 ,5387 vycočteno: 1241,5322

UV /ethanol	, 1max/
neutrální	3C4 /e = 47104/	239	/e = 51704/
zásada	296 /e = 51763/	233	/e = 71752/
	212 /e = 227629/
kyselina	312 /e = 50737/ 218 /e = 37705/	233	/e = 37297/
Průmyslová využitelnost

Fermentační produkt A87689 použitelný pro ošetřování retro virových infekcí savců a zvláště pro ošetřívání HIV a/nebo AIDS u lidí.

r\

V

KÁR r· ·<λ v i\.

Claims (13)

1. Použití kvartromicinu oře přípravu léčiva oro inhibici PLA-. z
2. 2. A87Ó89 nebo její alkylether s 1 sž 6 atomy uhlíku v alkvlovém podílu, nebo alkynoylesterový derivát A87689 s 1 é—atro’—·-·· my uhlíku v alkanoylovém podílu nebo její farmaceutický sůl.

   llljd

   /.Λ3Γ30 V •iíx .V NA Λ 03c dvyn
3. 3. Sloučenina podle nároku 2, kterou je AS7689 nebo—její--——' farmaceuticky vhodná sůl.
4. 4. Vápenatá sůl A87689.
5. 5. Volná kyselina A87689.
6. 6. Pentasodná sůl A87689.
7. 7. Způsob přípravy A87689 nebo jejích derivátů podle nároku 2 až 6, vyznačující se tím, že se kultivuje Amycolatopsis mediterranei NRRL 18815, NRRL 18851 nebo A87689 produkující je- ., jich mutant v kultivačním prostředí obsahujícím asimilovatelné zdroje uhlíku, dusíku a anorganických solí za podmínek submerzní aerobní fermentaee a popřípadě se následně - produkt převádí na., sůl, provádí se estarifikace, acylace nebo převádění na etherový derivát.
8. 8. Biologicky čistá kultura Amycolatopsis mediterranei NRRL 18815, NRRL 18851 nebo A87689 produkující jejich mutant.
9. 9. Sloučenina A87689 podle nároku 2 až 6 použitelná jakožto inhibitor PLA.-,.
10. 10. Sloučenina AS7689 podle nároku 2 až 6 použitelná jakožto prostředek pro ošetřování retrovirových infekcí.
11. 11. Sloučenina A87689 podle nároku 2 až 6 použitelná jakožto prostředek pro ošetřování HIV.

    podle nároku 2 až 6 použitelná nako

    AIDS.
12. 12. Sloučenina A8763S prostředek pro ošetřování
13. 13. farmaceutický prostředek, vyznačující se tím, že obsahuje sloučeninu A37S89 podle nároku 2 až 6 spolu s jednou nebo s několika látkami se souboru zahrnujícího nosiče, excipienty a ředidla.