CZ22776U1 - Diagnostická souprava na detekci patogenních mikroorganismů ve vzorcích biologického původu - Google Patents

Description

Oblast techniky

Řešení se týká diagnostické soupravy na detekci patogenních mikroorganismů, respektive patogenních mikroorganismů ve vzorcích biologického původu, zejména v potravinách.

Dosavadní stav technikv

Patogenní mikroorganismy jsou stálým a trvalým nebezpečím ohrožujícím zdraví obyvatelstva a patří, podle každoročních zpráv Světové zdravotnické organizace (WHO), k nejrizikovějším faktorům i ve srovnání s takovými civilizačními chorobami jako je rakovina a AIDS. Zavedení „Systému kritických bodů“ (HACCP), které je v ČR pro výrobu potravin povinné od 1. 1. 2000, vyvolalo tlak na urychlený vývoj metod pro rychlé a specifické stanovení sledovaných parametrů. V roce 2005 přijala Evropská komise regulační opatření č. 2073/2005, kterým se stanovují mikrobiologická kritéria pro potraviny. Opatření bylo modifikováno v roce 2007, č. 1441/2007. Toto regulační opatření vyžaduje nepřítomnost patogenních mikroorganismů (např.: salmoneiy, listerie, enterobaktera, aj.), ve 25/10 g vzorku potravin. Detekce patogenních mikroorganismů klasickými kultivačními normovanými metodami trvá běžně 5 až 8 dní. Ani biochemické testy nebo využití chromogenních a fluorescenčních substrátů významně nezkracuje dobu potřebnou k získání výsledku. Moderní molekulámě-biologické techniky jsou sice rychlejší, ale vyžadují používání nákladných přístrojů, postupů a vysoce kvalifikované pracovníky.

Podstata teclmického řešení

Výše uvedené nevýhody odstraňuje diagnostická souprava na detekci patogenních mikroorganismů, která podle technického řešení sestává z diagnostického proužku z nitrocelulózové membrány fixované na plastové výztuži, diagnostický proužek je na začátku, v místě startu v kontaktu s první podložkou pro vzorek amplikonu, což je produkt polymerázové řetězové reakce (PCR), tj, části DNA získané ze zkoumaného vzorku obsahujícího patogenní mikroorganismy. Během této reakce vzniká značený amplikon specifický pro hledaný patogenní mikroorganismus. První podložka je nasycena prvním blokačním pufrem č. 1. Začátek diagnostického proužku je dále v kontaktu s druhou podložkou nasycenou druhým blokačním pufrem č. 2 a následně konjugátem nanočástic uhlíku s avidinem. Dále je na diagnostickém proužku v příčných linkách nanesena nejméně jedna specifická protilátka o koncentraci 10 až 500 ng/μΐ, a to podle počtu detegovaných patogenních mikroorganismů. Pro každý patogenní mikroorganismus je jedna linka protilátky, a dále je na diagnostickém proužku nanesena poslední kontrolní linka, na kterou je imobilizován biotin vázaný přes imunoglobuliny třídy IgG o koncentraci 1 až 100 ng/μΐ, konec diagnostického proužku je v kontaktu s absorpční podložkou a vše je zakryto plastovým krytem, který se dotýká plastové výztuže. Kryt je opatřen otvorem nad první podložkou, a průzorem nad detekční částí diagnostického proužku. Součástí diagnostické soupravy je dále lahvička s roztokem reakčního pufru.

Reakční pufr obsahuje 0,lM borátový pufr, pH 8,8, 1% (w/v) hovězí sérový albumin (BSA), 0,02% (w/v) NaN₃, 0,05% (v/v) neionogenní tenzid.

První blokační pufr č. 1 obsahuje 0,lM borátový pufr, 1% (w/v) hovězí sérový albumin (BSA), 0,02% (w/v) NaN₃ a 0,01 % (w/v) sacharózy.

Druhý blokační pufr č. 2 obsahuje 0,lM borátový pufr, 1% (w/v) BSA, 0,02% (obj./obj) NaN₃, 0,1% (v/v) neionogenní tenzid a 0,01 % (w/v) sacharózy.

První podložka má velikost pórů 3 až 12 pm, kapilární vzlínavost vody 20 až 250 s na 4 cm. Druhá podložka má velikost pórů 5 až 25 pm, kapilární vzlínavost vody 30 až 180 s na 4 cm.

-1 CZ 22776 Ul

Absorpční podložka je tvořena materiálem s velikostí pórů 2 až 14 pm.

Diagnostický proužek nitrocelulózové membrány o rozměrech 2,5 až 5 cm x 0,4 až 0,8 cm je tvořen z materiálů vyznačujících se velikostí pórů 4 až 10 pm, kapilární vzlínavostí vody 40 až 200 s na 4 cm.

Plastová výztuž diagnostického proužku o rozměrech 3 až 6 cm χ 0,5 cm χ 1 cm a kryt jsou vytvořeny z plastů na bázi vinylů, polyamidů, polyesterů a ťluoroplastů.

Na diagnostickém proužku je ve vzdálenosti 1,5 až 4,0 cm od začátku diagnostického proužku v příčné lince imobilizována protilátka o koncentraci 30 až 300 ng.pl·¹, schopná imunochemické interakce se značkovací látkou obsaženou v amplikonu, čímž se prokáže přítomnost patogenního io mikroorganismu X. Ve vzdálenosti 2,0 až 5,0 cm od začátku diagnostického proužku je v další příčné lince imobilizována protilátka o koncentraci 40 až 400 ng.pl·¹, schopná imunochemické interakce se značkovací látkou obsaženou v amplikonu, který prokazuje přítomnost patogenního mikroorganismu Y. Značkovací látka je vybrána ze skupiny tvořené fluoresceinem, rhodaminem, texaskou červení digoxígeninem. Ve vzdálenosti 2,8 až 5,5 cm od okraje je imobilizován biotin, který interaguje s konjugátem nanočástic uhlíku s avidinem.

S výhodou je na diagnostickém proužku ve vzdálenosti 2,0 až 3,0 cm od začátku diagnostického proužku imobilizována protilátka o koncentraci 100 až 200 ng.pl·¹ interagující s digoxígeninem, tj. testovací linie pro patogenní mikroorganismus X, ve vzdálenosti 2,4 až 4,0 cm od okraje diagnostického proužkuje imobilizována protilátka o koncentraci 200 až 500 ng.pl'¹ interagující s fluoresceinem, tj. testovací linie pro detekci patogenního mikroorganismu Y, a ve vzdálenosti 2,8 až 5,0 cm od okraje diagnostického proužkuje imobilizován biotin vázaný na imunoglobulin třídy IgG, to je kontrolní linie.

Diagnostické proužky pro diagnostickou soupravu podle technického řešení jsou připravené a skladované v suchu ve vakuovaných sáčcích při teplotě kolem 20 °C. Expirační doba je nejméně jeden rok.

Detekce patogenních mikroorganismů diagnostickou soupravou podle technického řešení je založena na imunochemické interakci amplikonu se specifickými protilátkami zmobilizovanými na diagnostickém proužku. Amplikon je produkt polymerázové řetězové reakce (PCR), tj. části DNA získané ze zkoumaného vzorku obsahujícího patogenní mikroorganismy. Během této reak30 ce vzniká amplikon značený značkovací látkou vybranou například ze skupiny: biotin fluorescein, rhodamine, texaská červeň, nebo digoxigenin. Amplikon obsahuje též biotin a proto amplikon aplikovaný na první podložku pro vzorek amplikonu interaguje s konjugátem nanočástic uhlíku s avidinem, který je zakotven na startu v druhé podložce a postupně spolu postupují, díky kapilárním silám, diagnostickým proužkem k liniím s zmobilizovanými protilátkazni. Pri průchodu přes zóny obsahujícími protilátky proti značkovacím látkám amplikonu jsou prostřednictvím imunochemické interakce postupně zachytávány amplikony obsahující části DNA specifické pro jednotlivé patogenní mikroorganismy. Přebytek konjugátu nanočástic uhlíku s avidinem postupuje dále diagnostickým proužkem a interaguje s kontrolzií linií obsahující biotin. Nanočástice uhlíku umožní vizuální průkaz výsledku testu.

Schematický nákres diagnostické soupravy podle technického řešeizz je na Obr. 1 a na Obr. 2a, b, c je půdorys diagnostické soupravy s výsledky testu. Pri aplikaci pozitivního vzorku (vzorek obsahující hledané patogenní mikroorganismy) dojde ke vzniku celkem dvou/tri (podle počtu delegovaných patogenních mikroorganismů) černých linek - testovací (jedna/dvě) a kontrolní linky (jedna). Pokud se zbarví pozzze kontrolní linka, byl vzorek negativní a žádný patogenní mikroorganismus nebyl přítomen. V případě, že nedojde ke vzniku žádné barevné linky, svědčí to o nesprávném provedení testu.

Detekce pomocí diagnostické soupravy pro detekci patogenních mikroorganismů v biologických vzorcích podle technického řešení je velmi spolehlivá, přesná, rychlá a specifická. Práce s diagnostickým proužkem je velmi jednoduchá.

-2CZ 22776 Ul

Přehled obrázků

Obr. 1: schematický nákres diagnostické soupravy a vysvětlující značky.

Obr. 2: znázorňuje půdorys diagnostické soupravy včetně krytu s otvorem nad první podložkou a průzorem v krytu nad detekční částí diagnostického proužku se zvýrazněním jednotlivých linií na diagnostickém proužku po provedení testu:

a) s pozitivním testem pro dva patogenní mikroorganismy přítomné ve vzorku,

b) s pozitivním testem pouze pro jeden patogenní mikroorganismus ve vzorku,

c) vzorek bez patogenních mikroorganismů.

Následující příklady diagnostické soupravy na detekci mikrobiálních patogenních mikroorganismů v biologických vzorcích, například v potravinách, diagnostickým proužkem membrány podle technického řešení pouze dokládají možná provedení a využití, aniž by toto řešení jakkoliv omezovaly.

Příklady provedení

Příklad 1

Zařízení pro diagnostickou soupravu na detekci mikrobiálních patogenních mikroorganismů v biologických vzorcích, podle technického řešení, je znázorněno na obr. 1 a skládá se z následujících dílů: z plastového krytu a a plastové výztuže f, na níž je fixován diagnostický proužek d. Začátek diagnostického proužku d je v kontaktu s první podložkou b pro vzorek amplikonu, která je nasycena prvním blokačním pufřem č. 1 a druhou podložkou c pro konjugát nanočástic uhlíku s avidinem, která je nasycena druhým blokačním pufřem č. 2. Na obr. 1 je první podložka b umístěna před diagnostickým proužkem d a druhá podložka c je umístěna v místě startu na diagnostickém proužku d. Dále je na diagnostickém proužku d nanesena ve vzdálenosti 2,1 cm od začátku diagnostického proužku d první příčná linka 1.1 obsahující specifickou protilátku X a dále je na diagnostickém proužku d nanesena ve vzdálenosti 2,4 cm od začátku diagnostického proužku d druhá příčná linka 1.2 obsahující specifickou protilátku Y a poslední příčná kontrolní linka 2 obsahující biotin vázaný přes imunoglobuliny třídy IgG je nanesena ve vzdálenosti 2,8 cm od začátku diagnostického proužku d. Konec diagnostického proužku d je v kontaktu s absorpční podložkou e, v tomto případě je umístěna na diagnostickém proužku d a vseje zakryto plastovým krytem a, který se dotýká plastové výztuže f. Plastový kryt a je opatřen otvorem 4 a pokud kryt a není průhledný, tak dále průzorem 5, který je pouhým otvorem nebo je tvořen průhledným plastem a umožňuje pohled na detekční část diagnostického proužku d. Kryt a je na obr. 2 spojen s plastovou výztuží f pružnými plastovými panty. Součástí je lahvička s roztokem reakčního pufru.

Diagnostické proužky d po nanesení příčných linek 1.1 až l.n protilátek a kontrolní linky 2 včetně použitých blokačních pufrů v první podložce b a druhé podložce c jsou zasušeny proudem vzduchu o teplotě 20 °C.

Diagnostické proužky membrán d se po zasušení skladují v suchu ve vakuovaných sáčcích při teplotě kolem 20 °C.

Součástí soupravy je lahvička s roztokem reakčního pufru 3 (0,lM borátový pufr, pH 8,8, obsahující 1% (w/v) hovězí sérový albumin, 0,05% w/v) Tween 20, 0,02% (w/v) NaNv Na obr. 2 je znázorněn 3^X půdorys diagnostické soupravy s proužkem membrány d:

a) Znázorňuje otvor 4 v plastovém krytu a pro vkápnutí vzorku amplikonu s reakčním pufřem 3 na podložku b a diagnostický proužek d s třemi zřetelnými pozitivními linkami 1.1. 1.2 a 2 po prostoupení vzorku amplikonu diagnostickým proužkem d až za kontrolní linku 2. Vzorek obsahuje patogenní mikroorganismy X a Y.

b) Znázorňuje otvor 4 v plastovém krytu a pro vkápnutí vzorku amplikonu s reakčním pufřem 3 na podložku b a membránu d se zřetelnou pozitivní linkou 1.2 po prostoupení vzorku ampli-3CZ 22776 Ul kónu diagnostickým proužkem d až za kontrolní linku 2. Vzorek obsahuje pouze patogenní mikroorganismus Y.

c) Znázorňuje otvor 4 v plastovém krytu a pro vkápnutí vzorku amplikonu s reakčním pufrem 3 na podložku b a diagnostický proužek d se zřetelnou pozitivní linkou 2 po prostoupení vzorku amplikonu diagnostickým proužkem d až za kontrolní linku 2. Vzorek neobsahuje patogenní m i kroorganismy.

Příklad 2

Příprava potravinového/bio logického vzorku pro detekci probíhá stejně jako u všech dosud používaných metod detekce patogenních mikroorganismů:

to Vzorek 10 g instantní dětské výživy se homogenizuje ve 100 ml kultivačního média vhodného pro detegovaný patogenní mikroorganismus (např.: modifikovaná laurylsulfátová tryptická živná půda). Kultivace probíhá přes noc, obvykle 12 h při 37 °C. Z takto získaného vzorku s nabohaceným obsahem patogenních mikroorganismů se extrahuje mikrobiální DNA některou běžně používanou a komerčně dostupnou soupravou. Získaná DNA se amplifikuje metodou polymerázové řetězové reakce, a získá se amplikon značený digoxigeninem a biotinem, specifický pro hledaný patogenní mikroorganismus. Specifická protilátka proti digoxigeninu nanesená na lince 1.1 na diagnostický proužek d zachytí amplikon značený digoxigeninem a biotinem společně s navázaným konjugátem nanočástic s avidinem, který umožní vizuální detekci přítomného patogenního mikroorganismu.

Postup detekce jednoho patogenního mikroorganismu:

Použije se proužek membrány d s jednou testovací linkou 1.1, na které je nanesena specifická protilátka proti digoxigeninu a kontrolní linka 2. Na startovací místo na první podložku b se nanese 5 μΐ vzorku amplikonu smíchaného se 100 μΐ roztoku reakčního pufru (0,lM borátový pufr, pH 8,8, obsahující 1% (w/v) hovězí sérový albumin, 0,05% (v/v) neionogenní tenzid, 0,02% (w/v) NaN₃). Do 10 minut po aplikaci vzorku amplikonu se na dignostickém proužku d odečte pozitivní (dvě linky - obr. 2b) nebo negativní výsledek (jedna linka - obr. 2c), tedy přítomnost nebo nepřítomnost patogenního mikroorganismu ve vzorku.

Příklad 3

Postup detekce dvou patogenních mikroorganismů:

Použije se proužek membrány d se dvěma testovacími linkami 1.1 a 1.2 obsahujícími dvě různé protilátky, specifické pro dva různé patogenní mikroorganismy. Na startovací místo na první podložku b se nanese po 5 μΐ vzorku obsahujícího amplikon značený digoxigeninem a biotinem a amplikon značený fluoresceinem a biotinem smíchaných se 100 μΐ roztoku reakčního pufru. Do 10 minut po aplikaci vzorku na dignostický proužek odečteme pozitivní nebo negativní výsledek, tedy přítomnost nebo nepřítomnost patogenního mikroorganismu ve vzorku. Na obr. 2a je znázorněn pozitivní výsledek identifikující 2 patogenní mikroorganismy.

Průmyslová využitelnost

Zařízení pro diagnostickou soupravu na detekci patogenních mikroorganismů ve vzorcích biologického původu, zejména v potravinách, je využitelné v kontrolních laboratořích potravinářského průmyslu.

Claims (12)

1. NÁROKY NA OCHRANU

   1. Diagnostická souprava na detekci patogenních mikroorganismů ve vzorcích biologického původu, zejména v potravinách, vyznačující se tím, že je tvořena diagnostickým proužkem (d) z nitrocelulózové membrány fixovaným na plastové výztuži (f), diagnostický proužek (d) je na začátku, na místě startu v kontaktu s první podložkou (b) pro vzorek amplikonu, která je nasycena prvním blokačním pufrem č. 1 a po té s druhou podložkou (c) pro konjugát nanočástic uhlíku s avidinem, která je nasycena druhým blokačním pufrem č. 2, a je umístěna na diagnostickém proužku (d), dále je na diagnostickém proužku (d) nanesena minimálně jedna příčná linka (1.1, 1.2 až l.n) obsahující specifickou protilátku o koncentraci 10 až 500 ng/μΐ, a dále je na membránu nanesena poslední příčná kontrolní linka (2) obsahující biotin vázaný přes imunoglobuliny třídy IgG o koncentraci 1 až 100 ng/μΐ, přičemž konec diagnostického proužku (d) je v kontaktu s absorpční podložkou (e) a vše je zakryto plastovým krytem (a), s otvorem (4) nad první podložkou (b), a průzorem (5) nad detekční částí diagnostického proužku (d), kterýžto kryt (a) se dotýká plastové výztuže (f) a dále souprava obsahuje lahvičku s roztokem reakěního pufru.
2. 2. Diagnostická souprava podle nároku 1, vyznačující se tím, že první blokační pufr č. 1 obsahuje 0,lM borátový pufr, 1 % (w/v) hovězího sérového albuminu, 0,02% (w/v) NaN₃, a 0,01 % (w/v) sacharózy.
3. 3. Diagnostická souprava podle nároku 1, vyznačující se tím, že druhý blokační pufr č. 2 obsahuje 0,lM borátový pufr, 1 % (w/v) hovězího sérového albuminu, 0,02% (w/v) NaN₃, 0,1% (v/v) neionogenní tenzid, a 0,01 % (w/v) sacharózy.
4. 4. Diagnostická souprava podle nároku 1, vyznačující se tím, že reakční pufr obsahuje 0,lM borátový pufr, pH 8,8, 1 % (w/v) hovězího sérového albuminu, 0,02% (w/v) NaN₃, a 0,05% (v/v) neionogenní tenzid.
5. 5. Diagnostická souprava podle nároku 1, vyznačující se tím, že první podložka (b) pro vzorek amplikonu má velikost pórů 3 až 12 μιη, a kapilární vzlínavost vody 20 až 250 s na 4 cm.
6. 6. Diagnostická souprava podle nároku 1, vyznačující se tím, že druhá podložka (c) pro konjugát má velikost pórů 5 až 25 μπι, kapilární vzlínavost vody 30 až 180 s na 4 cm a je nasycená blokačním pufrem č. 2, k němuž je následně aplikován konjugát nanočástic uhlíku s avidinem.
7. 7. Diagnostická souprava podle nároku 1, vyznačující se tím, že absorpční podložka (e) je tvořena materiálem s velikostí pórů 2 až 14 μηι.
8. 8. Diagnostická souprava podle nároku 1, vyznačující se tím, že diagnostický proužek (d) o rozměrech 2,5 až 5 cm ^x 0,4 až 0,8 cm je tvořen nitrocelulózovou membránou s velikostí pórů 4 až 10 μτη a kapilární vzlínavostí vody 40 až 200 s na 4 cm.
9. 9. Diagnostická souprava podle nároku 1, vyznačující se tím, že plastová výztuž (f) membrány (d) o rozměrech 3 až 6 cm ^x 0,5 cm χ lem je vytvořena z plastů vybraných ze skupiny na bázi vinylů, polyamidů, polyesterů nebo ťluoroplastů.

   -5CZ 22776 Ul
10. 10. Diagnostická souprava podle nároku 1, vyznačující se tím, že na diagnostickém proužku (d) je ve vzdálenosti 1,5 až 4,0 cm od začátku diagnostického proužku (d) imobilizována první linka (1.1) protilátky X o koncentraci 30 až 300 ng.pl'¹, kteráje schopná imunochemické interakce se značkovací látkou vázanou na vzorek amplikonu, ve vzdálenosti 2,0 až

    5 5,0 cm od začátku diagnostického proužku (d) je imobilizována druhá linka (1.2) protilátky Y o koncentraci 40 až 400 ng.pf¹, která je schopná imunochemické interakce se značkovací látkou vázanou na vzorek amplikonu, a ve vzdálenosti 2,8 až 5,5 cm od začátku diagnostického proužku (d) je imobilizována poslední kontrolní linka (2) obsahující biotin o koncentraci 1 až 100 ng/μΐ, který interaguje s konjugátem nanočástic uhlíku s avidinem.

    ío
11. 11. Diagnostická souprava podle nároku 1, vyznačující se tím, že značkovací látka je vybrána ze skupiny tvořené biotinem, fluoresceinem, rhodaminem, texaskou červení nebo digoxigeninem.
12. 12. Diagnostická souprava podle nároku 1, vyznačující se tím, že na diagnostickém proužku (d) je ve vzdálenosti 2,0 až 3,0 cm od začátku diagnostického proužku (d) imobili15 zována první linka (1.1) protilátky X o koncentraci 100 až 200 ng.pf¹ schopná imunochemické interakce s digoxigeninem, a ve vzdálenosti 2,4 až 4,0 cm od začátku diagnostického proužku (d) je imobilizována druhá linka (1.2) protilátky Y o koncentraci 200 až 500 ng.pl¹, kteráje schopná imunochemické interakce se fluoresceinem obsaženým ve vzorku amplikonu a ve vzdálenosti 2,8 až 5,0 cm od začátku diagnostického proužku (d) je imobilizována poslední kontrolní linka (2)