CZ203693A3 - Bradykinin antagonists - Google Patents

Description

Antagonisté bradykininu

Oblast techniky

Předložený vynález se týká antagonistů bradykininu.

Dosavadní stav techniky

Sradykinin (SK) je nentid^složený z devíti aminokyselin ( Arg¹ -Pro^Pro^Gly^Phe^-Ser^Pro ⁷-?he^S- Arg⁹1, který je spolu s lysyl-3K (kallidinem) uvolňován z kminogenových prekursorů proteázami štěpícími kallikrein. Plasmový kallikrein cirkuluje jako aktivní zymogen, ze kterého se aktivní kallikrein uvolňuje Hagemanovým faktorem·, Tkáňový kaJlikr-ein se jeví jako umístěný především ha vnější povrch-membrán, epiteliálních. buněk........

na místech předpokládaných, že jsou zahrnuta.do transc.elulárního elektrolytového transportu.

Dva hlavní kininové prekurzorové proteiny, kininogen· s vysokou molekulovou hmotností a s nízkou molekulovou hmotností, jsou syntetizovány v játrech, cirkulují v plasmě a byly nalezeny- v sekrecích jako je moč a nosní tekutina. Kininogen s vysokou molekulovou hmotností se štěpí plasmovým kallikreinem, poskytuje SK nebo tkáňovým· ksllikreinem·, což poskytuje kallidin. Kininogeňs nízkou molekulovou hmotností je substrátem pouze pro tkáňový kallikrein. Dále se může objevovat určitá konverze kallidinu na 3K protože arnino^eminální lysinový zbytek kallidinu se odstraňuje plasmovými aminopeptidázami. Poločas životnosti v plasmě pro kininy je přibližně 15 s, s jedním průchodem pulmonárním vaskulárním ložem, vedoucím k 80 až 90 % destrukci. Základní katabolický enzym ve vaskulárních ložích je dipeptidylkarboxypeptidáza kinináza II

-2nebo angiotenzin-konvertující enzym (ACE). Slaběji působící enzym, kinináža I nebo karbox.ypeptidáza N, které odstraňují karboxyl terminující Arg, cirkulují v plasmě ve velkém množství. To potvrzuje, že může jít o fyziologicky 9 důležitější katabolický enzym. Des-Arg -bradykinin jakož i des-Arg¹θ-kallidin vzniklý působením kininázy I na 3K nebo kallidin, jsou aktivní jako SK^ receptoroví agonisté , ale jsou relativně inaktivní při větším množství receptoru, při kterém jsou jak BK tak kallidin účinnými agonisty.

O bradykininu je známo, že je jedním z nejúčinnějších přirozeně se vyskytujících stimulátorú C-vláken zprostředkujících přenos; bolesti*. Je také účinným vasodilatátorem, Činidlem, produkujícím edém, a. stimulátoremrůzných vaskulárních a· nevaskulárních hladných svalů ve tkánícj jako je děloha, střevo a bronchioly. Dráha aktivace kinin/kininogen· byla také popsána jako hrající podstatnou roli v různých fyziologických a patofyziolo• ' v gických procesech, protože je jedním z prvních systémů, které se aktivují v zánětové odezvě a jedním z nejúčinnějších stimulátorú: i) fosfolipázy A^ a proto tvorbou prostaglandinů a leukotrientů a ii) fosfolipázy ,C a tak uvolnění inositol fosfátů a diacylglycerolu. Tyto účinky jsou zprostředkovány především pres aktivaci EK receptorů typu BKg.

Přímá aplikace bradykininu na nahou kůži nebo intraarteriální nebo viscerální injekce vede ke zdání bolesti u zvířat a u lidí. Kininu podobné materiály byly izolovány ze zánětlivých míst získaných různými stimuly. Déle bradykininové receotory byly lokalizovány k ňócicěpťivaím drahám periferních nervů a 3K demonstrován jako stimulující centrální vlákna zprostředkující vjem bolesti. Bra-3dykinin byl také prokázán jako schopný vyvolat hyperalgesii na zvířecích modelech bolesti (viz Surch a spol., 3rad'ykinin Receptor Antagonists, J.^ed.Chem., 30:237-263 (1590) a Clark '-V.O., Kinins and the Peripheral and Central Hervous Systems:’', Handbook of Experimental ^rharmacology, vol. XXV: Bradykinin, kallidin and kallilrein. Erdo E.G. (v.yď.), 311-322 (1979)).

Tato zjištění způsobila, že pozornost byla obrácena na použití 3K antagonistů jako analgetik. ^noho studií ^démona ťrujeT^ žT*^fago1u^Vé%T^dyíTninu**jsóV^scKpni^bíokóvat nebo zmírňovat jak bolest tak hyperalgesii jak u zvířat tak u lidí. Viz Anmons, W.S. a spol, Effects of intracardiac brad.ykinin on. medial spinothalamio ··*· cells, The American Physiological Society, 0363-6119 (1985); Clark W.G., Kinins and the Peripheral and Cen-¹ traX Nervous Systems, Handbook of Experimental Pharmacology, Vol.XXV: Bradykinin, kallidin and kallikrein.Erdo E.G.(vyd.) 311-322 (1979); Costello A.H. a spol., Suppression of carrageenan-induceď hyperalgesia, hyperthermia and edema by br&dykinin antagonist, European Journal of Pharmacology, 171:259-263 (1989); Laneuville a spol., Bradykinin analogue blocks bradykinin-induced inhibition óf spinal nociceptive reflex in the rat, European Journal of Pharmacology, 137:281-285 (1987); Steranka a spol.,

Antinociceptive effects of bradykinin”, European Journal of Pharmacology, 16:261-262 (1987); Steranka a spol., Brar dykinin as pain mediator: Receptors are localized to sensory neurons, and antagonists háve analgesic actions, Neurobiólogy, 85:3245-3249(1987)·

3ěšně akceptované terapeutická přiblžení k analgesii mají významná omezení. Estímco mírnou až střední bolest

-4lze mírnit použitím nesteroidních'protizánětlivých léčiv⁵ a jiných mírných analgetik, kruté bolesti jako jsou ty, které jsou spojeny s chirurgickými postupy, spáleninami a určitými traumaty , vyžadují použití narkotických analgetik. Tato léčiva jsou omezena možným zneužitím, fyzickou a psychologickou závislostí, měnící mentální stav a potlačením respirace, což výrazně omezuje jejich použitelnost.

Předcházející výzkumy v oblasti BK antagonistů indikují, že takoví antagonisté mohou být vhodná použity v různých funkcích. Tyto. zahrnují použití při léčení spálenin, poperační bolesti, migrény a jiných forem bolesti, šoku, poškození centrálního nervového systému, astma, rýmy, namožení, zánětlivé artritidy, zánětlivých střevních chorob atd.

Například Whalley a spol., v Nsunyn Schmiederberg*a árch.Pharmacol., 336:652-655 (1987) demonstruji, Že 3K

- antagonisté jsou schopni blokovat 3K-indukovanou bolest v lidském blisterovém modelu. To potvrzuje., že topická aplikace takových antagonistů by měla být schopna inhibovat bolest ve spálené kůži např. u těžce popálených pacientů, u kterých jsou vyžadovány velké dávky narkotik během dlouhé doby a pro lokální ošetření relativně malých spálenin nebo jiných forem lokálního poškození kůže.

Ošetřování pooperativní bolesti vyžaduje použití adekvátních dávek nerkotických anelgetik pro zmírnění bolesti a nevyvolávání nadměrné respirační deprese, kooperativní narkotikem vyvolaná hypoventilace předurčuje pacienty ke kolapsu segmentů pliCyobvyklému případu postoperativní horečky a často pozdržuje přerušení mechanické ventilace. Dostupnost schopných nenarkotických parenterál-5ních analgetik by měla být významným příspěvkem: k ošetření pooperčianí bolesti. 1 když žádný předchozí dostupný 3K antagonísta nemá vhodný farmakodynamický profil pro použití při ošetřování chronické bolesti, jsou časté dávky a kontinuální infuze běžné používány anesteziology a chirur- \ gy při ošetření pooperační bolesti.

Některé důkazy svědčí o tom, že dráha kallikrein/kinin může být zahrnuta do počátku nebo amplifikaci vaskulární reaktivity a sterilního zánětu při migréně. (Viz·

DaťeTmrhafron^oí *cOm po hě nts “ óf *t hě * kárii'^™™·'“** krein-kinin systém in the cerebrospinal fluid: of patients. with various diseases, Res.Clin.Stud.^eadachea:, 3:219226 (1972). Protože omezený úspěch jak profylaktických?;

tak nenarkotických terapeutických režimů pro migrénu jakož i potenciální narkotické závislost u těchto pacientů, jeví se použití ΞΚ antagonistů vysoce Žádoucím alternativním řešením při terapii migrény.

•i i; . jfy

Sradykinin je produkován během tkáňového poškození a může být nalezen v koronární sinusové krvi po experimentální okluzi koronárních arterií. Déle, jestliže se přímo injektuje do peritoneální dutiny, produkuje EK viscerální typ bolesti. (Viz Ness a spol., Visceral pain: a review of experimental studies, Psin, 41:167-234 (1990))·

I když je mnoho jiných mediétor.ů jasně zahrnuto v produkci bolesti a hyperalgesie v jiných spojeních než jsou popsána výše, očekává se, že antagonistě SK hrají roli při zmírnění takových forem bolesti.

Šok spojený s bakteriálními infekcemi je majoritním zdravotním problémem. Ve Spojených státech dochází ročně ke 400000 případům bakteriálních sepsí, z nich 200000

-6pokračuje do Šoku a 50 % z těchto pacientů umírá. Běžná terapie je podpůrná, s určitým doporučením ve studiích z posledních let, že monoklonélní protilátky ke grám-negativnímu endotoxinu mohou mít pozitivní účinek na odeznění choroby. Mortalita je stále ještě vysoká, protože vzhledem k této specifické terapii je třeba uvést, že výrazné procento pacientů se sepsí je infikováno gram-pozitivními organismy, které nejsou přístupné anti.endotoxinové terapii.

Mnoho studií potvrdilo úlohu systému kallikrein/kinin při vzniku šoku spojeného s endfotoxinem. Viz Aasen. a spol·., Plasma Kallikrein Activity and Prekallikrein Eevels during.Endotoxin Shock,in Dogs., Eur.Surg.·, 10:50— (1977); ^asen a spol., Plasma Kallikrein-Kinin System in 3_opticemia, Arch.Surg., 118:343-346 (19θ3) i tori a spol., Evidence for the involvement of plasma kallikrein/kinin systém in the immediate hypotension produced by endotoxin in anaesthetized rats'*, Br.J.Pharmacol., 98:1383*1391 (1989); a >arceaii a spol., Pharmacology of Kinins: Their Relevance to Tissue Injury and Inflammation, Gen. Fharmacol., 14:209-229 (1982). Studie: provedfhé v poslední době za použití nově dostupných ΞΚ antagonistů demonstrovaly na zvířecích modelech, še tyto sloučeniny mohou hluboce ovlivnit progres endotoxického šoku. (Viz Weipert a spol., “Attenuation of Arterial Blood

Pressure Fall in Endotoxin Shock in the Hat Using* the 2 5 8

Competitive Bradykinin ántagonist Lys-Iys-/Hyp ,Thi^?* , D-Phe⁷/-BK, Brit J.Pharm., 94, 282-284, (1988)). Méně údaj^:ů je dostupných pokud jde o úlohu 3K a jiných mediátorŮ při vzniku septického Šoku způsobeného gram-pozitivnímt organismym'¹ Je však pravděpodobné, že jsou zde zahrnuty podobné mechanismy. Šok sekundární k traumatu, často způsobený ztrátou krve, je také spojen s aktivací systému kallikrein/kinin. (Viz Haberland, The Role of KininogenasesKinin Formát i on and Kininogenase Inhibitor in Post Traumatic shock and Relsteď Conditions, Klinische? Woochen-schrift, 56:325-331 (1578)).

•Mnoho studií také demonstruje signifikantní hladiny aktivity systému kallikrein/kinin v mozku. Jak kallikrein tak SK dilatují cerebrální komory ve zvířecích modelech poškození CNS. (Viz Ellis a spol., Inhibition of ^radykinin- a Kallikrein-Induced Cerebral Arteriolar Cilation •by*Sp“ec if i“c*3r adyk inin**An-t agoni s-ttroke, 8 :,79 2-79 5-ÍL·..·.-.____1|T (198?) a Kamitani a spol., Evidence for a Possible Rola of the Srain Kallikrein-Kinin System in the ^odulation of the Cerbral Circulation, Circ.Rés·» 57:545-552 ' ...

(1985))· Antagonisté bradykininu také snižují cerebrální edém u zvířat po mozkovém trauma. Vzhledem k těmto údajům se očekává, že by SK antagonisté měli být užiteční při ošetření ran a trauma hlavy.

Jiné studie demonstrují, že 3K receptory jsou přítomny v plicích, že BK může působit bronchokonstrikce u zvířat i lidí a že zvyšující se citlivost ke bronchokonstriktivnímu účinku SK je přítomna u astmatiků. Některé studie byly schopny, demonstrovat inhibici jak SK tak alergenem, indukovanou bronchokonstrikci u zvířecích modelů použitím SK antagonistů. Tyto studie indikují potenciální úlohu použití 3K antagonistů jako klinických Činidel při' v . .

ošetřování astma. (Viz Bernee, Inflammetory ^ediator Receptors and Asthma”, An.Rev.Respir.Dis., 135:526-S31 (1987); Burch a spol., Sradykinin Receptor- Antagonists, J.Med. Chem·., 30:237-269 (1990); Fuller· a spol., Sradykinin-induceď Bronchoconstriction in Humans, Am. Rev. Respir.Dis., 135:176-180 (1987); Jin a spol., Inhibition of bradykinin-induced bronchoconstriction in the guineapig by synthetic.¹ Sg receptor antagonist, 3r.J.Pharmacol.,

-897:598-602 (1989) a Polosa a spol., Contribution of histamine and prostanaids.- to bronchoconstriction. provoked by inhaled bradykinin. in atopie asthma, Jlllergy, 45:174-182 (1990)). Bradykinin byl také implikován při vzniku symptomů jak alergické tak virové rýmy. Tyto studie zahrnují doložení jak kallikreinu tak BK v nosních tekutinách s že hladiny těchto substancí korelují dobře se symptomy rýmy. (Viz Saumgartea. a spol., Concentrations of Glandular Kallikrein in Ruman Nasal Secretions Tncrease During Experimentally Induced Allergic· Rhinitis, Immunology, 13741323—1328 (1986); Jin a spol., Inhibition of bradykinin-induced bronchoconstriction in the guinea-pig by a' synthetic 32 receptor antagonist, Br.J.Pharmacol., 97:598-602 (1989) θ Proucí a spol., Nasal Provocation with Bradykinin induces Symptoms of Rhinitis and a Sore Throat, Aa.Rev.Respir.Dis., 137:613-616 (1988)).

Dále studie demonstrují, že 3K samotný může působit symtopy rýmy.

Stewart a Vavrek v Chemistry of Peptide Sradykinin Aitagonists, Bradykinin Antagonists: Basic? and' Chemical Research, fi.Sí, Burch (vad.) str.· 51-96 (1991 ) uvádějí peptidové BK antagonisty a jejich možné použití vůči účinkům 3K. Značný podíl výzkumu byl zaměřen na vývoj takových antagonistů se zlepšenými vlastnostmi. Nebylo však nikde zmíněno nalezení takových zlepšených SK antagonistů, což neustále představuje potřebu účinnějších SK antagonistů.

Dva hlavní problémy spojené se současnými SK antagonisty jsou jejich nízké hladiny účinnosti a jejich extrémně nízké doby trvání aktivity. V souladu s tím jsou důležitými objekty předloženého vynálezu poskytnutí nových 3K antagonistů peptidů, které jsou charakterizovány zvýšenou účinností a dobou trvání působení. Jiné objekty budou zřejmé dále. \

Podstata vynálezu

Vynález· je založen, v jednom důležitém provedení, na nalezení takových sloučenin, zahrnujících dva nebo více *b rady k ini n- ant ago n ís* t i ckých^í-BKhAHpe p t i ďůy*» k te r é * j 3 o u·.*··»·»» spolu chemicky spojeny za vzniku dimerů nebo vyšších oligomer.ů (mečů) demonstrujících vyšší účinnost, a/nebo trvání působení, než původní bradykinin antagonistický peptiď samotný.

Široce vyjádřeno, sloučeniny podle vynálezu, v souladu s tímto provedením, mohou být ilustrovány vzorcem I !

X (SKA)_n (I) kde 3KA je jádro jakéhokoliv bradykinin antagonistického peptidu, X je spojující skupina a n je celé číslo větší než 1. Výhodně je n 2, což poskytuje dimer. Nicméně může sloučenina obsahovat, více než dva SKA substituenty, tj. sloučenina může být trimer nebo i vyšší mer, až do omezení daného charakterem spojující skupiny.

3KA substituenty mohou být stejné, takže poskytují homogenní sloučeninu, Naopak může být v některých situacích výhodné, když sloučenina zahrnuje různé substituenty, tj'. sloučenina může být heterogenní vzhledem, k 3BCA substituentům nebo může- obsahovat jeden nebo více 3KA a ligand nebo ligandy různého charakteru. Jak homogenní tak

-10heterogenní provedení jsou zahrnuta v předloženém vynálezu jek je popsáno dále.

Návrh poskytnutí dimerů farmaceuticky aktivních materiálů pro zlepšení takových charakteristik jako je meta- \ holická stabilita, selektivita a .receptorová vazebnost, byly již popsány pro jiné systémy. Dřívější práce zahrnula dimerizaci Deptidových agonistů a antagonistů za účelem zvýšení účinnosti a/nebo trvání působení, (viz Caporale a spol., Prou. 10. Anerican Peptide Sjtmp., Pierce Chemical Co., Rockford, IL 449-4-51 (1988) a Rosenblatt a spol., evropská pat.přihláška č. EP 29313042). Dimerizace p.eptidových agonistů byla popsána pro enkefaliny/endorfiny (Shinohigashi Y., a spol., SBRC, 146, 1109-1115, 1987)» substance P (Higuchi Y., a spol., E.J.P., 160, 413-416, (1989) i bradykinin (Vavrek R. a Stewart J., J.Pron.8th Aner Pept.Symp., 381-384, 1983)} neurokinin A and 8, (Kodama Η., a spol., E.J.P., 151, 317-320,. 1988)f insulin (Roth R.A. a spol., FĚBS, 170, 360-364 1984) a atriální natriuretický peptid (Chino N., a spol., B3RC, 141, 665-672, 1986). Dimerizace antagonistů byla uvedena pro parathyroidní hormon (Caproale,L.K., a spol., Proč. lOth Aner.Pept.3ymp., 449-451, 1987)). Literatura však nepopisuje BK antagonistické dimery nebo vyšší mer.y jak-jsou zahrnuty v tomto vynálezu.

Navíc?, předchozí dimerizace ve velké míře preferovaly dimerizaci z jednoho nebo obou konců přítomných sloučenin, zatímco podle předloženého vynálezu a jako jeho část bylo nalezeno, že dimerizace různých BK antagonistů z vnější polohy za použití bud volných alfa amino nebo kar'boxy lových skupin—na konci^těchtOligandů'neposkytuje· - zvýšení a v mnoha případech snižuje aktivitu těchto činidel. Podle předloženého vynálezu je jako výhodné provedení zahrnuto spojeni BKA peptidových ligandů v poloze mezi konci peptidu.

Delší provedení vynálezu poskytuje novou skupinu monotnerních sloučenin vzorce II

X(3KA) . (II) tj. sloučenin vzorce I, kde n je 1 a modifokované X působí zlepšení antagonistických vlastností původního 3KS 'pepTidcTpreáTtaw jZcífío*⁶'3K^rA*substatuěntT“Toťo^zlepŠehí’™¹ · ’ může být například⁷ představeno zvýšenou schopností a/nebo trvání působení... Opět je zde^: modifikovaný X výhodně umístěn v peptidovém řetězci, tj. ne na jeho zakončení'.

V jiném provedení vynález zahrnuje dimery'vzorce III .

ÍY)(X)(BKA) (III) kde X a SKA mají významy uvedené výše a Y je liganď, ' který demonstruje antagonistickou nebo agonistickou aktivitu nebradykininového receptoru.

Shrnuto,, týká se vynález a) bradykinin antagonistických peptidů vzorce I, které mohou být homogenní nebo heterogenní dimery nebo vyšší mery, b) monomerů vzorce II, kde SKA je modifikován zahrnutím skůpiny X a č) heterodimerů vzorce III, demonstrujících jak bradykinin antagonistickou aktivitu tak ne-SK receptorovou aktivitu (antagonistickou nebo agonistickou).

-12V oboru je známo mnoho 3K antagonistických peptidů a jakýkoliv z nich může být použit pro uvedený účel pro poskytnutí 'SK substituentů. Jedním z nejúčinnějších BKA in vitro je peptid, mající vzorec ϋΑΗΰθ- Arg^-Pro^-Hyp^-Gly^-Phe^-Šer^-(D)Phe ^-Leu®- Arg' (viz Regoli a spol., Trends in 'Pharmacological Science, 11:156-161 (1590)). Tento peptiď je zde označen jako. CP-0088 a pro účely předloženého vynálezu může být použit pro spojení bučí s tímtéž nebo jiným peotidem, majícím SKA aktivitu pro poskytnutí antsgonistů vzorce I.

Jestliže se použije CP-0088 pro ilustraci různých aspektů vynálezu, je třeba uvést, že vynález zahrnuje použití jakéhokoliv dostupného nebo známého BK antagonistického peptidů pro předložený účel. Například bylo v patentové literatuře posledních let navrženo velké množství modifikací BK antagonistických peptidů a tyto mohou být použity pro poskytnutí' BKA složky nebo složek pro produkty podle vynálezu. (Viz např. EP-A-033244 (Procter and Gamble), který popisuje nona- a delší BK antagonistické peptidy,·’ve kterých jsou určité zbytky aminokyselin modifikovány). EP-A-0370453 (Hoechst) a WO 89/01780 a WO 89/01751 (Stewart a spol.) také popisují SK antagonistické peptidy. Žádné z těchto patentových publikací nepopisuje; homogenní nebo heterogenní dimery nebo vyšší mery” nebo linkerem modifikované monomery jak jsou uvedeny v předloženém vynálezu. Nicméně však peptidy z těchto publikací mohou být použity v praktickém přovedení předloženého vynálezu. V souladu s tím, jestliže se po-13užije? CP-0088 pro účely ilustrace:, není na něj vynález omezen.

V souladu s jedním provedením vynálezu je linker X výhodně připojen k původnímu peptidovému antegonistovi přes c.ysteinový (Cys) zbytek peptidov&o řetězce. Toto může vyžadovat počáteční modifikaci výchozího peptidu takže zahrnuje Cys zbytek ve vhodné poloze peptidového řetězce.

..................... ..... Vynález. je ilustrován, za použití různých Cys deriII—l.li.l »,WUlW.I.|^||iirtlpJ... .-^U- -ar - ,- -,ν,,-,,.,ϋ.Α·,;.. .ti. ,ι.ι·ι , Hr.tM.ii. / im I ril—l X» I —. mu— III ri vátů CP-0088, kde Cys nahrazuje'Ser nebo některou jinou aminokyselinu v CP-0088 peptidovém řetězci. Bylo zjištěno, Že cystein Cys obvykle poskytuje kovalentní- napojení ke vhodnému linkeru X přes jeho thiolovou skupinu, produkující stabilní thioetherovou vazbu. Podle tohoto aspektu vynálezu je výhodné inkorporovat cysteinový zbytek do 6 polohy CP-0088. Tato poloha byla dříve považována ze relativně nedůležitou. (Viz Stewart J.M. a V_avrek R.J.,. 0991), Chemistry of peptide bradykinin antagonists, v Sradykinin ántagonists:3asic. and ^linical fiesearch, fí.M. 3urch (vad.), Parcel Dekkar· lne.., NY, str.51-96). Nicméně důležitý aspekt vynálezu je založen na zjištění, že na rozdíl oď obecně přijímaného pohledu na polohu 6, je toto specifické místo důležité jak pro dimeraci tak pro modifikaci monomeru při poskytnutí optimálních vlastností výsledných produktů. Nicméně vynález není omezen pouze na modifikaci v poloze 6. - .‘A

F'v

Jafc, bude uvedeno dále, jakýkoliv z velkého množství linkerů X může být použit pro účely podle vynálezu. Tato působí chemické spojení dvou nebo více peptiďů z nichž jeden nebo oba jsou SKA/^ůže mít pouze funkci .linkeru. Nicméně linker samotný se může také podílet na zlepšení celkových antagonistických vlastností jak bude uvedena dále. Výhodně je linker flexibilní, lineární skupina, kte^ rá je snadno reaktivní s požadovanými ligandy. Výhodné lin-14kery zahrnují bismaleimidoalkany (StóA) jako je bismaleimidohexan. (3iK). ^eakce s takovým linkerem probíhá mezi jeho- meleidoskupinami a tHolovou skupinou systeinového zbytku v peptidovém řetězci za vzniku 3-sukcinimidoderivátu. Například-1,ó-bis-S-sukcinimidohexan (SSH) dimer- mů· že být připraven reakcí 2 ekvivalentů Cys-obsahujíčího peptidQvého antagonisty a 1 ekvivalentu bismaleimiďofiexariu (EMH). ^alší vhodné spojující skupiny X jsou popsány dále.

^u*eden. z preferovaných, dimerních antagonistů vzorce I podle vynálezu je zde označen, pro zjednodušeni, jako CP-0127. Tato sloučenina byla shledána jako mající výrazně větší účinnost a poločas životnosti než nejznámější ze známých SK A, včetně CP-0088 který, jak bylo uvedeno je považován za jednoho z nejúčinnějších SK antagonistů známých v oboru. Zlepšené antagonistické vlastnosti GP0127'jsou naprosto neočekávané, protože přinášejí vyšší účinek, než by bylo možno očekávat jako aditivní efekt spojení dvou nebo více peptidových antagonistů. _x

Sloučenina Cp-0127, která demonstruje všechny charakteristiky vyžadované pro farmaceutickou aplikaci jako 3KA, např. sloučenina je vhodná pro parenterální použití při ošetřování akutních indikací jako je septický šok a pooperační bolest, může být strukturně znázorněna následovně :

-15DArg°- Arg¹ -Pro²-Hyp^-Gly⁴-Phe^-Cys^-DPhe^-Leu⁸-Arg^

DArg—Arg¹- Pro²-Hyp^- Gly^- Phe^-Cýs^-DPe^-^eu⁸- Arg^

CP-0127

Jafe bude zřejmé, je CP-0127 homogenní dimer v tom smyslu, že dva peptiďové řetězce připojené k linkeru jsou stejné. Sloučenina obsahuje dva ekvivalenty úy_S^ derivátů EKA CP-0088, tí· CP-0088, kde Ser v 6 poloze? byl nahrazen cysteinem (Cys), kovalentně spojeným s reakcí mezi thiolovou skupinou Cys. a bismaleiimiďohexanem (SMH). Výsledný produkt je 1,6-bis-S-šukcinimiďohexanový (BSH) dimer Qys^ CP-0088,

Qystéinivý derivát (Cys^) CP-0088 může být připraven obvyklými způsoby. Tento Cys^ derivát, který je zde označen, jako CP-0126 pro jednoduchost, může pak reagovat s požadovaným bismaleimido činidlem. V případě CP-0127, kde je bismaleimiďo činidlo bismaleimidohexan (9MH), je dimer (CP-0127) získán podle následujícího reakčního schena:

CP-0127

Toto schéma pouze: ilustruje možnou cestu přípravy produktů vzorce I* V jakékoliv alternativní metodě může být linker připojen ke fragmentu EKA peptidu, další pep tidový fragment připojen k jinému konci linkeru a rovnováha případných peptiďů (EKA) ukončena přídavkem jakýchkoliv jiných fragmentů peptidu, jak je to vyžadováno.

Pro odborníky bude zřejmé rozpoznat, kdy použít jakých stupňů, kdy chránit různé funkční skupiny, zejména amino a karboxy-terminální skupiny v peptidech nebo jejich fragmentech, před nežádoucími reakcemi.

Když'EMU poskytuje výhodnou spojovací skupinu X, jiný -b±sm'al-eim±dEaik-an--(-EM-A)v napří-k-l-ad— jakákoliv_bismal.eidp-„ činidla, kde alkan obsahuje 1 až 12 atomů uhlíku nebojíce,

-17mohou být použita, Alkanová skupina může být také substituována nebo přerušena například, karbonylovou nebo/a aminoskupu. LkdyŽ délka a charakter alkylového řetězce v EMA může být podle potřeby měněn; je zřejmé,že jk délka se zvyšuje od 1 do12,nemění podstatně pA?· Nicméně se zvyšuje inhibice získání. Dále, jak se alkylový řetězec zvyšuje nad 8 atomů uhlíku, může být zaznamenán parciální agonismus. Obecně řečeno, jestliže se použije BMA linker s CP-0126 jako BK složkou, nejvyšší pAg hočnnty se získají s délkami alkylového řetězce v rozmezí oď 6 do ^j******^Mr9 ^ťbmů^úhrííu^a^j ě^řFjmé*ža^e^^r£^^ých' jí nejlepší, výsledky použitím BMH (bismaleimidohexanu) pro poskytnutí uvedeného BSff spojení. Avšak jak je uvedeno, efektivní výsledky mohou být získány za použití jiných typů linkerů. Tak není podstatné, že skupina X zahrnuje sukcinimido substitueat s tou podmínkou, že modifikace je účinné pro spojení s EKA peptidovými substituenty hez nežádoucího ovlivnění antagonistických vlastností.

Reprezentativní alternativy k BMH jako spojující skupiny jsou uvedeny dále s označením výsledného dirneru, jak bude používáno dále (uvedeno vlevo od linkerové struktury) a je třeba uvést, že v každém případě je BKA složka dimeru/trimeru stejná jako v CP-0126.

-18PIMEF/TFIHEB LINKer

OMHtt

CP-íltt

CP43IM

Η—N / ~ τ, u &» ⁰ $ ⁰ o

CFMfií

o o

-19dimer/triher hfker cp-oir*

CP472

CP-OX76

CP-0177

O

H

-20Jak bude zřejmé, vynález zahrnuje použití širokého rozsahu linkerů X, s nebo bez Cys-modifikace původního EK antagonistického peptidu (EKA). Další alternativa linkerů výše uvedeného typu, která umožňuje zavést cysteinovou modifikaci jak je popsána u BSH typu sloučenin popsaných dříve, je uvedená dále:

RHN x ^lř X ^(CH2Ví

NHR'

R O₂ C

SO

COgR (I)

RHN

R'o₂cr

N—(CH_O) N i i St>

M’

NHR” co₂r^h (II) n=2-12 m=1-12 * Chiralita může být ekvivalentní buá k D nebo L aminokyselinám

R/R”*^Jmúže být jakákoliv kombinace chránících skupin? jako N-t-Bo®_t Emoo., Npys

R*/R může být jakákoliv kombinace chránících skupin jako je methylester, ethylester nebo benzylester, chránící sku-21piny R*, R a R***jsou takové, že mohou být různě odstraněny za účelem kovaleatního připojení peptidových fragmentů jak je to potřebné, například účinného EKj,

SK₂» NKj, NKg receptorového antagonisty nebo ^u opioidní- \ ho receptorového agonisty.

Obecně syntéza linkerů typu i a II může být provedena následujícím způsobem.Připraví se některé deparátní fragmenty, obsahující organické linkery a vhodně chráněné **aminokyseTiny^wa*vzájemně-se»spo jír-Výsledné* fragmenty*se pak cyklizují intramolekulárně na obecně hydanťoineré stnuktury za použití podmínek bází katalyzované cyklizace.

Specifičtěji zahrnuje syntéza linkeru typu I přípravu následujících separátních fragmentů:

(1 ) RHH v

(CH_O)

R O₂C

2'®

-NH.· lCH„)

2'ai /NHR' */ '^XxC0₂R^m *

-22Fragmenty (1),(2) β (3) jsou spolu spojeny za vzniku:

ΝΕΕΓ

CO₂R

Fragment (4) se pak zpracuje s ethylchlorformiátem s následující bází katalyzovanou nyklizací za vzniku požadovaného typu 1 alternativního linkeru.

Syntéza typu II zahrnuje přípravu následující separátních fragmentů

5) RHN

7) h₂n-( ch₂ ) _n-hh₂

-23Fragaenty (5) _r (6) a (7) jsou spojeny za vzniku:

Fragment (8) se pak zpracuje s ethylchlorformiátea a^následu jící*cyklTž ác'í* kat^y z ov ánou^SéTí 'za vznikuροζ adovaného alternativního linkeru typu II.

Po přípravě: mohou být požadované linkery bud ze skupiny I nebo XI kondenzovány se vhodnými peptidovými fragmenty za vzniku požadovaného hetero- nebo homo-dimeru. Dále je uvedeno schéma, představující takovou syntézu:

-24*=L chiralita aminokyseliny deprot.

Fragment C + —— RHN fragment D + -^^'RNH (I) _zdeprot.

C0₂&*-y ⁺ fragment A _C0₂R + fragment B ^ríklad: R*= methyl nebo ethylester R= benzyl.es tec*

R - 3-nitropyridylsulfid (NPYS) R'= FMOC

Fragment A = NHg-Pro-Leu

B = NHg-DPhe-Leu-Arg

C = Lys-Arg-Pno-Pco-ííly-Phe-COgH

D = DArg-^rg-Pro-Hyp-Gly-Phe-C0₂H

Konečný produkt;

Lys- Arg-Pro-Gly-Phe-C-NH' η BK. selektivní

C-NH-Pno-Leu (I) / \° ⁷ \-NH-]

DArg- Arg-Pra-Hyp-Gly-Phe-C^NH 'Q-NH-DPhe-Leu- Arg

SK₂ selektivní antagonista_?

-25Výše uvedená syntéza ilustruje přípravu heterodimeru, kde každá z reaktivních skupin linkeru je schopna být různě chráněna tak, že mohou být všechny čtyři fragmenty heterodimeru přidávány odděleně. \

Je třeba si uvědomit, že výše uvedený typ linkeru umožňuje? offsetting ligandů, tj. diferenciované připojení ligandů k linkeru. Například je možné připravit ligand, který je připojen z polohy 6 na jedno místo a **z pSIShy* SP**na*jifi'é7“ já šřť-l ižé^é^ťo^pbv ažu j e Z a‘*žádouc ··£*-*** z farmákologického hlediska. Příkladem, takového typu preferovaného typu heterodimeru je BK^antagonista/NKj antagonista, jehož příklady jsou uvedeny později, kde polohy 4, b a & NKj antagonistického ligandu jsou preferovány. Alternativně /u-opioiďovf agonisté, také popsány dále; v souvislosti se složkami vzorce XII, mohou využít tento typ linkeru s tou výjimkou, že pouze jeden fragment jer nutno kopulovat k linkeru, protože kopulace z C-konce- je výhodnou strategií pro tento typ heteroďiměrů.

Z předchozího je zřejmé, že sloučeniny vzorců I - II podle vynálezu mohou být připraveny za použití snadno dostupných postupů. Podíly antagonistických peptidů jsou snadno dostupné nebo mohou být připraveny ve fragmentech za využití techniky syntézy peptiďů v pevné fázi nebo v roztoku. Mohou být použity známé postupy pro poskytnutí Cys zbytku v požadované poloze v peptiďovém řetězci a při . přidání linkerové modifikace a při jakékoliv následující tvorbě merů se využije, běžné chemie.

Vynález je ilustrován Následujícími příklady a obrázky 1 A, 1B, 2A, 2B, 2C, 3, 4, 5A, 5B, 6·,? a 8(a)8(e), které představují různé aspekty vynálezu.

-26Fřiklady provedení vynálezu

Příklad 1

Příprava CP-0127

Peptid, CP-0126, který v ďimerizovaném bismaleimidohehanu (BMH) poskytuje CP-0127 byl generován syntézou peptidů v pevné fázi za použití standardního postupného prodlužování peptidového řetězce^-, obvyklého v oblasti peptidů (J.M.Stewart a J.D. Young, Solid Phase Peptide Synthesis, Pierce Chemical Cl., 1984). Stručně vyjádřeno, syntéza peptidů v pevné fázi začíná s deprotekoí H⁰** aminokyseliny připojené k syntézní pryskyřici. Tento stupen je následován: neutralizací a proaýváním pryskyřice, obsahující aminokyselinu zbavenou chránící skupiny,kterým je tato připravena k reakci s další aminokyselinou, aktivovanou dicyklohexylkarbodiimidem a 1-hydroxybenzotriazolea pro usnadnění tvorby první peptidové.vazby (-CO-NH-)» Následné promytí pryskyřice nyní obsahující (di)peptid se pak provede stejně a pokračuje se/žs 3^e získán požadovaný peptiď. konečný peptid se pak odštěpí z pryskyřice za podmínek, které současně odstraní všechny individuální chránící skupiny ve vedlejších řetězcích aminokyseliny.

Všechna činidla použitá při výše popsané syntéze jsou dostupná z komeráčních zdrojů.

Syntéza peptidů v pevné fázi se provádí manuálně za použití probublávání dusíkem jako agitačního zdroje míchání. -terč.butyloxykarbonylová (N-t-boe) ochrana byla použita jako- 'dočasná chránící skupina -ve - všedí p^jti-do— vých kopulacích. Specifičtěji byly v po sobě jdoucích postupech použity následující, pryskyřice a chráněné aminokyse-27liny: N-t-BOC-L-Arg(Tos )-PAM pryskyřice., N-t-BOC-L-Leu, N-t-BOC-D-Phe, N-t-BOC-UCys (4-M_eb), N-t-SOC-I^Phe, N-t-SOC-Gly, N-t-BOC-L-Hyp(Bzl), N^t-SUC-L-Pro, N-t-BOGL-Arg(Tos), N-t-3OC-B-árg(Tos).

konečná peptidylové pryskyřice? byla sušena ve vakuu a pak umístěna do reaktoru Peninsula Laboratories Type: I HF apparatus. CP-0126-byl odštěpen z pryskyřice· za použití standardních HP postupů bez jakých koliv karbonačních odpadů. Po odstranění HF ve vakuu se pryskyřice promyje j*wwR«*die thy le the rem*a*p eptřd^sO^ex trahu j e“’z*'p rý‘škýř'i e•e^ďiěfrcP^^-**’ nizovanou vodou.

Dra ekvivalenty výsledného peptidu (CP-O126) se nechají reagovat s 1 ekvivalentem (0,5 molární poměr) bismaleimidohexanu (Pierce) v 0,05 M pufru hydrogenuhličitanu amonného (pH 8,4) a míchají se 1 hodinu. Reakční směs se pak zahustí ve vakuu a výsledný koncentrát se znovu rozpustí v 0,1 M hydrogenuhličitanu amonném (pH 5)· Koztok se pak vloží jako takový na sloupec sulfopropyl.(SP) Sephadéxu (Sigma) a sloupec se eluuje gradientem pH 5-9 během jedné hodiny,. Frakce, obsahující peptidhvý dimer, se pak spojí zahustí se ve vakuu;, znovu se rozpustí v deionizované vodě a lyofilizují.

Konečný peptidový dimer CP-0127 je? hodnořkgd na svoji Čistotu pomocí HPLC s reverzní fází, je provedena analýza aminokyselin, analýza peptidových sekvencí a ElectroSpr^y hmotová spektrometrie.

Příklad 2

Sloučenina CP-0127 může být také připravena následujícím způsobem, ve kterém se připraví některé separátní

-28fragaenty, přidá se spojující skupina (BSH) pro spojení dvou fragmentů a výsledný fragmentový dimer se pak kompletuje přidáním jiných požadovaných peptidových fragmentů»

Specifičtěji tento způsob zahrnuje přípravu následujících separátních peptidových fragmentů:

) Phe-Cys-DPhe

2) Leu- Arg .

3) DArg-Arg-Pro

4) Hyp-Gly kde vhodné chránící skupiny jsou diskutovány dále. -fragmenty 1) a 2) se vzájemně spojí za vzniku:

5) NHg-Fhe-Cys-DPhe-Leu-Arg-OFot kde OPm jefluorenmethyl a Cys je chráněn Acm skupinou. Dvě molekuly meziproduktu 5). mohou být vzájemně spojeny přes jejich Cy& thiolové skupiny za použití 3MH za vzniku:

6) NH_?-Phe-Cys-DPhe-Leu-Arg-OPm

BSH i

NHg-Phe-Cýs-DPhe-Leu-Arg-OPm

Fragmenty 3) a 4) se spojí spolu za vzniku

7) (BOC)-DArg-Arg-Pro-Hyp-Gly-OH kde BOC je terč.butyloxykarbony 1 a pak s^fcvěmolekuly 7) připojí k 6) za vzniku:

BOC-D Arg- Arg-Pro-Hyp-Gly-Phe-Cys-DPhe-Leu- Arg-OPm

.......................- - -........................ .......

BOC-D Arg- Arg-Pro-Hyp-Gly-Phe-Cys-DPhe-Leu- Arg-OFa

-29Fak následuje odstranění N- a C-koncových chránících skupin za vzniku dimeru CP-0127.

Tento postup je podrobněji popsán dále:

Fragment 2) se připraví následovně:

N-T-BOC-Leu (16,68 g, 67 mmol) a Arg-OFm.2 HC1 (29,68 g, 70 mmol) se rozpustí ve 140 ml Ν,Ν-ďimethylf ormamidu a pak se přidá 16 ml difenylf osforylazidu (20,43 g> 74

..................... .•^.’amo3_c)wa^2-5^:,:ialw_:dii$O.pr_!o.pyle.thyl.aminii.4lQ,> ^.5,gi „J 43„maol).

Reakce se provede při teplotě místnosti až do konce podle chromatografie na tenké vrstvě (n-butanol:kyselina octová: voda 4:1:1) na silikagelu.

Po ukončeni se reakční směs zahustí za vakua na asi 10 % původního objemu. Výsledná kašovitá suspenze se rozpustí v ethylacetátu (150 ml) a promyje se ve 250 ml dělící nálevce 10¾ hydrogeauhličitanem sodným (3 x 100 ml), vodou (2 x 100 ml), 0,,1 M kyselinou chlorovodíkovou (3 x 100 al) a vodou (2 x 100 ml)_ř Finální organická vrstva, se suší nad síranem sodným a zahustí dosucha ve vakuu.

Pevná látka nebo olej se rozpustí v malém množství ethylacetátu a krystaluje se za použití hexanu, ^evná látka se odfiltruje vakuovou filtrací a suší se ve vakuu.

N-t-BOC skupina se odstraní za použití 4N HC1 v dioxaau (100 ml) po 1 hodinu při teplotě místnosti. Rozpouštědlo se pak odstraní ve vakuu a výsledná pevná látka (nebo olej) se rozpustí v malém množství methanolu (20 ml). Vyvolá se krystalizace přídavkem- ethyletheru a výsledná pevná látka se izoluje vakuovou filtrací, promyje se ř

ethyletherea. (2 x 50 ml) a suší se ve vakuu.

-30Estery (methyl nebo ethyl) se odstraní rozpuštěním peptidu ve 100 ml methanolu a přidáním 1,5 ekvivalentu hydroxidu sodného; reakční směs se pak míchá 1 hodinu při 0 °C. Reakční směs se neutralizuje IN HC1 a zahustí ve vakuu na objem asi 30. ml. Přidá se voda Ϊ100 ml) a pak IN HC1 až roztok dosáhne pH asi 1. Peptid se extrahuje z vodného roztoku ethyleeetátem (2 x 100 ml) a spojený ethylacetátový extrakt se suší nad síranem sodným, filtruje a zahustí ve vakuu. Výsledný olej se rozpustí v malém objemu ethylacetátu a krystaluje se za použití hexanu*

Fragmenty 1) a 2) »e spolu kopulují stejným způsobem jak je popsán výše za vzniku N-terminálního pentapeptidu. Fragmenty 3) a 4) se spolu kopulují a zpracují stejným způsobem jak je popsán výše za vzniku C-terminálního peptapeptidu.

C-^erminální pentapeptiď (10 g) se zbaví chránících skupin použitím 100 ml 4N HC1 v dioxanu po 1 hodinu. Dipxan se odstraní ve vakuu a poskytne olej, který se rozpustí ve 20 ml methanolu a zpracuje se s přebytkem ethyletheru za vzniku bílého prášku. Takto získaný prášek se rozpustí v 90 ml vody a pak se přidá 10 ml methanolu a dále 30 ml octové kyseliny nasycené jodem (I₂). V míchání se pokračuje 1 hodinu. Reakční směs se extrahuje dvěma stejnými objemy chloroformu a vodná vrstva se lyofilizuje. Výsledný špinavě bílý prášek se rozpustí ve 20 ml vody a zpracuje se s aktivovanou pryskyřicí Reductacryl (CALBIOCHEM) po 20 minut. Reductacryl se odstraní filtrací a pryskyřice se promyje 20 ml 0,1tf pufru hydrogenuhličitanu amonného (pH 8). Spojené fiítráťý,' obsahu jící peptTď še zpracují s 1,6 g bismaleiimidohexanu (Pierce) ve 3 ml Ν,Ν-dimethylformamidu a míchají se 2 hodiny. Reakční směs se pak zahustí ve vakuu a výsledný koncentrát se znovu

-31rozpustí v 50 ml 0,1M pufru hydrogenuhličitanu amonného (pil 5). Roztok se vloží in toto na 50 g sloupec sulfopropyl (SP) Sephadexu (Sigma) a sloupec se eluuje gradientem pH 5-9 během jedné hodiny při 3 ml za minutu. Frakce, obsahující peptid se spojí, zahustí se ve vakuu, znovu se rozpustí ve 100 ml vody a lyofilizují.

ekvivalenty N-terminálního peptidů (fragment 7) se kopulují k 1 ekvivalentu C-terminálního dimerického —- . ... peptidu^fragmen.t 6) za použiti stejného postupu jak je výše popsán pro fragment 2. .....* ''' im»......

Odstranění chránících skupin z finálního peptidů se provede rozpuštěním 5 g peptidů v 75 ml Ν,Ν-dimethyl- , formamidu, obsahujícího 30 % piperidinu a pak mícháním po 20 minut. Rozpouštědla se odstraní ve vakuu a výsledný olej se rozpustí ve 100 ml vody. pH se pak sníží na asi 1 1N HC1 a produkt se extrahuje do ethylacetátu (3 x 100 ml). Spojené ethylacetátové vrstvy se zahustí ve vakuu, zbyde olej, který se pak rozpustí ve 4N HCl v dioxanu a míchá se 1 hodinu. Dioxan se odstraní ve vakuu a výsled- , ný olej se rozpustí ve 30 ml methanolu. Přebytek ethyletheru se potom přidá a získá se produkt jako bílý prášek.

Konečné čištění peptidového dimeru se provádí rozpuštěním 5 g v u,1N pufru hydrogenuhličitanu amonného (pH 5), nanesením, roztoku na 50 g sloupec sulfopropyl(SP) Sephadexu (sigma) a gradientem od pH 5 ďo pH 9 během 1 hodiny při odbíráni 10ml frakcí. Každá frakce se zkouší pomocí HPLC a čisté frakce se spojí a 3x lyofilizujf s vodou.

U konečného produktu se hodnotí čistota pomocí HPLC s reverzní fází, provádí se analýza aminokyselin, analýza

-32peptidových sekvencí a Electro-Sprajr hmotová spektrometrie.

Při provedení výše popsané syntézy je třeba uvést, že aminoskupina každé aminokyseliny je chráněna N-terc. butoxykarbonyl (N-t-BOC) nebo podobnou skupinou podle' potřeby. Karboxylové skupina aminokyselin je také chráněna, v tomto případě esterovou funkcí (např. ethyl, methyl nebo 9-fluorenmethylester). Guanidino-vedlejší řetězec argininu CArg) je chráněn jako hydrochloridová (HC1) sůl a atom síry v cysteinu (Cys) je chráněn za použití acetamidomethylové skupiny (Acm).

I

Příklad 3 * Sloučenina CP-0127 se připravila jak je popsáno v příkladu.1 a byla porovnávána s Cys^-modifikovaným peptidem CP-0126·- a původním peptidem CP-0088 na biologickou aktivitu za použití testů, které jsou v oboru dobře známy. In vitro studie byly provedeny na standardních zkušebních systémech, jmenovitě ileu morčat (GPI), děloze krysy (RU) a králičí jugulární véně (RJV). Je dobře známo, že: každá z těchto tkání má EK receptor, který je třídy ale každý je jiného podtypu. Pčinaost každé sloučeniny byla vyjádřena jako hodnota podle metody Arunlakshana a Schilda, Br.J.Pharmacol.Chemother., 14í48-58 (1959). pág může být definována jako aáporný logaritmus molárnl koncentrace anta gonisty v přítomnosti které je účinnost agonisty dvojnásobně snížena, tj. dvojnásobek množství agonisty je vyžadován pro poskytnutí dané odezvy za přítomnosti nepřítomnosti^antagonisty. Vysoká účinnost antagonismu je indikována vyšší pAg hodnotou tj. je účinná nízká koncentrace antagonisty. ...... ' .........

Procenta regenerace (% Rec) byla také stanovena u sloučenin v každé zkoušce, -^rocento regenerace je měření trvání působeni, Čím nižší hodnota procent regenerace, tí^a

-33je delší trváni působení sloučeniny.

pA^ a procenta regenerace (% Rec) v hodnotách získaných pra CP-0088, CP-0126 a CP-0127 ve studiích s GPI, RU a RJV, jsou uvedeny v tabulce A:

Tabulka A

Sloučenina GPI RU RJV

t	p4>	REC	p^	% REC	P·^	% REC
	CP-0088	6,6	100	7,4	100	θ,5	9.0
	CP-0126	6,4	100	7,1	100	θ,8	60
	CP-0127	7,7	100	8,8	50	10,5	10

Lze vyvodit, že v každé tkáni je původní peptid!

CP-0088 přibližně stejně účinný jako Cys^-modifikovaný peptid (CP-0126). Naopak dimer, CP-0127, je výrazně účinně j· ší než jalt CP-0126 tak CP-0088. Zvýšení účinnosti CP-0127 je výrazně vyšší než CP-0126 a CP-0088 v každé tkáni s negivySSÍa zvýšením u RJV zkoušky. Zvýšení účinnosti pro CP-0127 vs. CP-0126 na GPI a RU byly méně markantní ale? ještě podstatná.

Je třeba uvést, že CP-0127 vykazuje podstaně nižší % Rec v RU a RJV zkouškách než CP-0088 a CP-0126. % Reo pro CP-0126 v RJV zkoušce byla také výrazně lepši než hodnoty získané s CP-0088.

S ohledem na trvání aktivity je nutno uvést, že po vystavení nejvyšší koncentraci antagonisty, byla každá tkáň intenzivně promyta a pak sledována pokud jde o znovudosažení antagonistického efektu. Obr. 1Aa1B představují křivku vlivu koncentrace na 3K na krysí děloze in vitro

-34za použití (1 A) CP-0126 a (13) CP-0127. Rozdíly v křivkách regenerace StC b,y měly být zaznamenány. ^uak je zřejmá z obrázku 1 A, křivka vlivu koncentrace na BK po vystavení CPP126 se téměř vra·-·! k hodnotě získané pro kontrolu. Naopak, s CP-0127 je ještě významný antagonismus BK i po opakovaném promytí (obr.15). Toto indikuje, že CP-0127 má delší trvání aktivity než CP-0126.

Příklad 4

Byly použity tři in viv-o modely pro studie srovnání vlivů CP-0126 a CP-0127. Byly jimi (a) vaskulární permeabiii ta králičí kůží, b) ΞΚ-indukovaná hypotenze u krys a o)

LPS-indukovaná hypotenze^- u anestetizovaných krys (C0-0127 pouze).

ai) Vaskulární peemeabilita králičí kůží

V těchto pokusech byly použity dva postupy. Prv.ní se použije w klasického pokusu, při kterém se BK injikuje intřadermálně buď samotný nebo v kombinaci se sloučeninou s hodnocením po následujícím podání barviva Evans Bluet. Třieet minut po intrádermální injekci SK a a bez sloučeniny, se zvířata usmrtí, jejich kůže se odstraní a plocha naaodření (tj. vaskulární permeabilita něho edém) se měří. Výsledky tohoto pokusu jsou uvedeny na obr.2Ar Je ařájlé, že CP-0126 je účinnější než. CP-0127 přo použití tohoto postupu.

Druhý postup zahrnuje injekci testované sloučeniny bučí 15 nebo 30 minut před injekcí BK na totéž místo. Výsledky jsou uvedeny na obr. 2B a 2C. Je zjevné, že CP0127 má úplně inhibované odězáyna brádykihín, zatímco'.......

CP*^0126 je výrazně méně účinný.

b) Krevní tlak krys

Srovnání antagonistické účinnosti CP-0126 a CP-0127

-35Syla provedeni u anestetizovaných krys. Následně po vypočetl křivky odezvy na hypotenzní dávku k SK v těchto zvířat, minimální dávka produkující maximální snížení krevního tlaku, byla opakována v asi tříminutových intervalech před, během a po intravenozní. infuzi buŮ CP-0126 nebo CP-0127 v dávce 9 nmol.kg’¹.min¹. Obr. 3 ukazuje výsledky získané a vyjádřená v procentech změny středního _g arteriálního krevního tlaku u krys k BK (4x10 mol) před, během a po intravenozní infuzi buá CP-0126 nebo CP-0127 v dávce 9 naol.kg¹.min“¹. 2 obrázku 3 je zřejmé, že CP-0127 ^pťémě^tř*upTně*lnh'ibirje^dézvy^wha*ťútO^v¹elkó'u^dávkuBK*žátí^^s*** co CO-0126 je téměř zcela neúčinný. Po ukončení infuze CP-0127 je zřejmé, že odezvy na BK se pomalu navracejí a plně jsou regenerovány po přibližně 20 minutách. ?·'

c) Lipopolysacharidy (LPS) indukovaná hypotenze tt anestetizovanýcfa krys

LPS-indukovaná hypotenze u krysje standardní zví-’ řečí model septického šoku. V tomto modelu se aneštetizované krysy injektují intravenozně LPS z Escherichia coli v dávce 15 mg.kg;¹. Toto vyro lá bezprostřední a hluboký pokles (50 až 60¾ změna) středního arteriálního krevního tlaku (obr.4). Jestliže se CP-0127 infunduje při Í8 nmol/kg/ min intravenozně 60 minut před, během a po injekci LPS, je zde významné oslabení bezprostředního poklesu krevního tlaku, který se pak rychle vrací k normálnímu. Noraotenze se pak udržuje po dobu trvání pokusu (přibližně 3 až 4 hodiny). Toto je v kontrastu s kontrolní skupinou, ve které se udrželi hluboká hypotenze. Je skutečností, že 3 zvířata uhynula po podání LPS injekce během 20 minut. Viz obr.4, který ilustruje procenta změn ve středním arteriálním ktevním tlaku u anestetizovaných krys k injekci intravenosního bolusu LPS, 15 mg.kg¹.

Získané hodnoty ukazují, že dimerní BK antagonista

-36θ (CF-0127) je výrazně účinnější než ^cys° monomerní antagonista (CP—0126) jak v modelu in vitro tak in vivo BK aktivity za použití standardních systému zkoušek pro hodnocení účinnosti antagonistů vůči specifickému stimulu (tj.

BK) a vůči nespecifickému stimulu (LPS) u zkoumaného zvířecího modelu septického šoku.

Data in vitro demonstrují výjimečnou účinnost CP-0127 v každé zkoušené tkáni nejznatelnější aktivita je zřejmá na králičí jugulární véně. Jak bylo uvedeno, byla sloučenina CP-0088 vybrána z literatury pro účely testů, protože je nejúčinnější (hodnoceno standardním stanovením p^) · BKA v klasických in vitro zkušebních systémech. Za použi- tí stejného kriteria (stanovení pAg) se účinnost CP-^0127 jeví jako přesahující většinu, pokud? ne všechny dřívější BKA, které byly uvedeny, zejména na králičí jugulární véně·

Nejvyšší pAg hodnota pro CP-0127 byla získána na vaskulární, preparátu, králičí jugulární véně a zdá se, že tato třída BKA by měla být vhodná pro ošetřování vaskulárních procesů, kde je zahrnut BK. Z hlediska úlohy· HK v zánětu, jsou účinky CP-0127 na permeabilitu/edém a vasodilataci zvláště významné. Odaje ze studie kožní vaskulární permeability jsou zajímaví, protože CP-0126 byl nalezen jako účinnější než CP-0127, jestliže oba antagonisté byli koinjektováni s BK. Asršak, jestliže CP-0127 a CP-0126 byly injektovány předem buÚ 15 nebo 30 minut před BK podnětem, inhibuje CP-0127 plně odezvy na BK zatímco CP-0126 je mnohem méně účinný než když byl současně injektován s BK. Tento rozdíl nebyl vysvětlen, ale může být způsoben tím, Že dimer vyžaduje více Času pro ekvilibraci s récěptorem a jednu vazbu je obtížnější nahradit ve srovnání a monomerem. Dále se zdá, že CP-0127 bude metabolicky sta-37bilnější než CP-0126.

Jak bylo uvedeno, je naprosto zjevné, že SK je výrazně zahrnut v septickém Šoku způsobeném gramnegativní bakteriální infekcí. V této souvislosti je třeba uvést, že předložený dimer (CP-0127) úplně obrací odezvu na LPS při dávce, která účinně blokuje hypotenzivní odezvy k maximálním dávkám BK u anestetizovaných krys. I když CP-0126 nebyl zahrnut v LPS septickém modelu- šoku, oče;— -^káy.á^,s.e..^že-b.y^.ve^s.tejné^dá.v.op».,.nioh-l^být-mnohafa-méně^účú.n·-^.

ný než CP-0127, ztrátou účinku této sloučeniny (CP0126) vůči vysokým dávkám BK.

Takto, stručně vyjádřeno, hodnoty poskytnuté z imjvitro a in vivo zkoušek, představují významné kvantitativní rozdíly mezi monomeraími (CP-0126) a dimerními (CP-0127) BK antagonisty vzhledem k absolutní účinnosti, odolnosti k vymytí a průběhu působení.

Při hodnocení biovyužitelnosti CP-0127, bylo doloženo použitím jediné dávky (3,6 /umol/kg) podané subkutánně ^ks.c.), že odezvy krevního tlaku a bolesti na EK mohou být úplně blokovány alespoň 2 hodiny (průběh pokusu). Užitím anestetizovaných krys byly konstruovány křivky dávkové odezvy na BK a stanovena ED^q (viz obr. 5a). ED^q byla pak injektována před a 15 minut po jediném podání s.c. injekce CP-0127. Z obr. 5b je možno vidět, že odezva na SK je úplně blokována v průběhu pokusu (2 hodiny).

V odděleně provedeném souboru pokusů byla hodnocena bolest v odpovědi na intraarteriáiní injekci EK u krys při vědomí, které byly předem (48 hodin před) implantovány prozatímní kanylou do krteria carotitf. Bradykinin (20 nmol.kg“¹) byl injektován intraarteriálně, čímž se dosa-38huje charakteristické kontralaterální elevace tlapky a rotace hlavy a těla, s následující periodou uklidnění. Odez va byla hodnocena stupnicí 0 až 5 vzhledem ke stupni po^ zorované odezvy v chování.

Údaje zřejmé z obr. 6 demonstrují, že jediná s.c. injekce CP-0127 v dávce 3,6 /umol.kg’¹ úplně odstraňuje odezvu na BK s inhibici trvající po dobu provádění pokusu (přibližně 2 hodiny). Kontroly ukazují stabilní odezvu během celého trvání pokusu.

Příklad 5

Tento příklad ilustruje účinek zavedení Cys zbytku a následně linkeru do různých poloh řetězce CP-0088. Různé sloučeniny označené v tabulce B byly připraveny pes-so ··« tupé» podle příkladu 1 s Cys skupinou zavedenou do původního CP-0088 v poloze, které je označena s následující reakcí mezí thiolovou skupinou Cys zbytku a SMH za vzniku uvedených? dimerů. CysE-módifikované monomery a výsledné dimeny byly testovány na aktivitu na ileu morčat in vitro ve standardním tkáňová lázeň/hodnocení chování systému jako dříve. Výsledky jsou vyjádřeny v pA^, spolu s výsledky pro CP-0088, CP-0126 a CP-01 27 jsou uvedeny v tabulce B. Pro označení optických isomerů jsou použity symboly L a D.

-39Tabulka B

	SlouČ.Č.	složení	popis	r .. 1 η . more. ?Pa2 1 PIG ILEUM
	CP-0088	0123456789 Οβ'β’Ρ-J-C-f-S-OF-L-R	Monomer	6.5 + 0.2
CP—0126	L-CYS6	Monomer	6.6 ± 0.1
	CP—0127	L-CYS6	Dimer	7.7 + 0.2
	CP-0140	L-CYS0	Monomer	6.7 + 0.1
CP-0152	L-CYS0	Dimer	< 8
	CP-0149	D-CYS0	Monomer	6.7 + 0.5 1
~^cP-ofef*	D-CYS0	Dimer	6,5 + 0.1	* 7
CP-0141	L-CYS1	Monomer	6.1 + 0.1
CP-0153	L-CYS1	Dimer	7.6 ± 0,6
	CP-0142	L-CYS2	Monomer	< 6
CP-0154	L-CYS2	Dimer	6.9 + 0.3
CP-0143	L-CYS3	Monomer	6.7 + 0.4
CP-0155	L-CYS3	Dimer	7.7 + 0.2
	CP-0136	L-CYS4	Monomer	Inafctiv,
CP-0137	L-CYS4	Dimer	Inafctiv
CP-0173	D-CYS4	Monomer	Inafctix
CP-0203	D-CYS4	Dimer	Inafctiv.
CP-0144	L-CYS5	Monomer	6.4 ± 0.2
CP-0156	L-CYS5	Dimer	7.9 + 0.1
CP-0145	L-CYS7	Monomer	Xnafctiv,
CP-0157	L-CYS7	Dimer	Inaiftiv.. |
CP-0146	D-CYS7	Monomer	Inafctiv:
CP-0158	D-CYS7	Limer	Ináfetiy
CP-0147	L-CYS8	Monomer	Inafctiy .
CP-0159	L-CYS®	Dimer	Inafctiv/
CP-0148	L-CYS9	Monomer	Inafctiv.;	*
CP-0160	L-CYS9	Dimer	Inagtiv

-40Výše uvedené výsledky ukazují, že rozsah řádu účinnosti dimerů uvedených v tabulce B, podle polohy spojení je:

6 > 1 > 2 > 3 > 0 >>> 4, 7, 8, 9 s dimery v poloze 4,7,8 a 9 inaktivními. Tabulka 3 dále ukazuje, že všechňy aktivní dimery s Cys v poloze 1,2,

3,5 a 6. jsou mnohem účinnější než odpovídající monomer.

Toto platí jak. pro L- tak pro D-isomerní formy, kde bylo provedeno stanovení.

Příklad 6 pAg a % regenerace pro model krysí dělohy EK aktivity byly stanoveny pro různé monomery a dimery uvedené v příkladu 5 a porovnány's'odpovídajícími hodnotami získanými s referenční sloučeninou CP-0088, CP-0127 a původním Cys^-obsahujícím monomerem (CP-0126). Výsledky jsou uvedeny dále v tabulce G.

-41 ;uik‘

MONOMER		DXMER	JA2 MONOMER	pA2 DIMER	4 RSC MONOMER	4 REC DXMER |
CP-0088		—	7.4+0.2	—	100
*'CP-0126'*’	·*( L-CYS6)*	*ČP-OÍ27*		8.8+0.3	' 100	50
»*wwjx						«X
CP-0144	(L-CYS6)	CP-0156	7.1+0.1	8.1+0.1	95	75
CP-0136	(L-CYS4)	CP-0137	Ina^tive	Inafctive	—
CP-0173	(D-CYS4)	CP-0203	Inadfctive	Xnafetive		«ta
CP-0143	(L-CYS3)	CP-0155	P.A.*	6.4+0.1	ta	100
CP-O142	(L-CYS2)	CP-0154	6.4+0.2	P.A.*	80	90
CP-0141	(L-CYS1)	CP-0153	< 6	7.7+0.2	100	100 .
CP-0140	(L-CYS0)	CP-0152	7.1+0.4	7.9+0.1	50	50
CP-0149	(D-CYS0)	CP-0161	7.1	6.5	75	100
I CP-0145	(L-CYS7)	CP-0157	Ina4tÍTe	Inajfetiv·		ta
| CP-0146	(D-CYS7)	CP-0158	Inajfctive	Inafctive	—	—.
I C7-0147	(L-CYS8)	CP-0159	Xaajktiv·	Inaiftive		ta
i CP-0148	(L-CYS9)	CP-0160	Ina^tive	InaJetiv·	—	—

^x = ?.A.= parciální antagonista

-42I když se relativní účinnosti uvedené v tabulce C pro model krysí dělohy o něco liší od hodnot získaných v příkladu 5 na ileu morčat, je jisté, že sloučeniny s Cysmodifikací v polohách 4, 7, 8 a 9 CP-0088 jsou opět neaktivní. Dále výsledky na krysí děloze zaznamenávají výhodnost 6 polohy pro modifikaci, i když bude možné, že jiné polohy mohou být preferovány pro jiná spojení a modifikace v závislosti například na typech nebo subtypech zahrnutých receptorů.

Příklad 7

I když údaje získané z homodimeru CP-0127 indikují, že tato sloučenina je výrazným zlepšením ve srovnání s jinými sloučeninami z literatury, pro realizaci je důležitá, že účinky dimerizace nejsou jedinečným aspektem specifického zvoleného linkeru, BMH, V tabulce D je uvedena řada dimerů, které jsou odvozeny ze základní sloučeniny CP-0126 a různých bisqialeimidoalkanových linkerů.

Tyto údaje zřetelně indikují, Že různé bismaleiimidoalkany mohou být použity pro přípravu účinných EK antagonistických dimerů. Volba výhodné sloučeniny bude záviset na zamýšle?né aplikaci podlé požadované farmakodynamické kvality.

Tabulka D

Vliv délky linkeru

počet C atomů	sloučenina č.	P^2 (uterus)	%REC (40 min)
n= 2	CP-0162	8,4+0,2	50
n= 3	CP-0172	8,6 + 0,2	90
n= 4	CP-0209	9,2 + 0,2	50
n= 6	CP-0127	8,8 + °»3	50
n= 8	CP-0211	8?4	25
n= 9	CP-0229	9,3 + 0,4	0-10
n= 10	.CP-0230	8,6+0,2	0

CP-0166 .8,2 + 0,3 0^x

Příklad 8

Byly také připraveny následující sloučeniny podle vynálezu jako modifikace CP-0126:

-44CP-0174

CP-0175

CP-0139

CP-013·

Cys⁶—SS— Cys⁶ i I (DUvlfid Dimer)

-45CP-0I70

0^N‘

CP-0I76

CP4J163

CP-0164

Μ

N· h-n

Η < H \ i. / _Λ N^~N~\^h o >

ďf

-46kde —pCys⁶ představuje CP—0126- Tyto sloučeniny byly připraveny reakcí CP-0126, tj.

DA g-Arg-PRO-Hyp-Gly-Phe-Cys-DPhe-Leu- Arg

SH s uvedenou linkerovou sloučeninou v podstatě způsobem popsaným v příkladu 1.

Uvedené sloučeniny zahrnují modifikované peptidové monomery (0Ρ*01 74, -01 75, -0139), dimery (CP-0138, -0163 a -0170) a trimery (CP—0164 a -0176).

Tabulka E uvádí pAg hodnoty získané testováním výše uvedených sloučenin na aktivitu v ileu morčat (GPT) a děloze krys & CP-0126 a CP-0127;

Tabulka E
Sloučenina	GPI	děloha	krysy
	P*2	P^2	% regenerace
CP-0126	6,6+0,2	7,1+ 0,1	100
CP.-0.1 27.......	.. 7,7+0.,2 .	8,84.0,3	50
GP-0174	7,2	8,4	50
CP-0175 *	7,2	8,5	30
CR-0139	6,2+0,2	7,2+0,2	100
CP-0138	7,2+0,1	8,0+0,1	100
CP-0163	8,2+0,2	7,6+0,3	100

-47Tabulka E. (pokračování)

CP-0164	7,5	7,6	50
CP-0170	6,3	7/+0,4	100
CP-01 76	7,0	8,6	50

Hodnoty uvedené v tabulkách D a E ukazují následující i

1. Reakce cysteinu v 6 poloze s volným maleimidem a tak j eho*pře v e dě hí^na^S- s uKp i ni a ido-L-cýs te ínový*zby te k'“Έΐθρ¹-^¹¹'''¹ Suje účinnost (srovnej CP-0126 s CP-0139, -0174, -017?).

Bylo však také zjištěno, že? monomery jako třída se chovají rozdílně oď dimerů jako třídy s: ohledem ne jejich odolnost k vyprání vzhledem k jejich struktuře. Monomery /' mohou být odstraněny a profil dávka/odpověd tkáně se vrací na stav před ošetřením s jednou výměnou pufru, zatímco dimery vyžadují násobné promývání pro navrácení jejich aktivity a vrácený systému do výchozího stavu. Toto hledisko aktivity monomer vs. dimer v in vitro modelech HK antagonismu je znamením prodloužené doby působení pro dimery in vivo.

2. Zlepšená účinnost pomocí dimerizace je nejeví být dramaticky ovlivněna linkerem, pokud je linker lineární a flexibilní. Avšak rigidnější nebo bráněný linker (CP-0170) neposkytuje zlepšení účinnosti s ohledem na odpovídající monomer (CP-0126). Pro potvrzení tohoto názoru, disulfidový dimer (CP-0138), který je pravděpodobně nejvíce bráněným a rigidním z testovaných dimerů, je také relativně méně aktivní. Ve skutečnosti se neliší v inhibiční aktivitě od CP-0126 monomeru v tomto systému.

-483. Trimerizace (CP-0164 a CP-0176) se nejeví jako zlepšující účinnost vzhledem k účinnosti získané dimerizací (CP-0127, -0163 a.-0166).

I

Příklad 9

Pro prokázání obecné platnosti tohoto hodnocení vzhledem.k ligandu byl jiný reprezentativní BKA (CP-0181 ): D-ArgO- Arg¹ -Rro^-Hyp^-Gly^-Phe^-Ser^-DPhe^-PheQ- Arg?

modifikován zavedením Cys do polohy '6 a dimerizací s BMH za vzniku BSH dirneru (CP—0215)· pAg hodnoty na krysí děloze a procenta regenerace jsou stanovena pro tento BSH dimer a porovnány s CP-0088 a CP-0127. Výsledky jsou uvedeny dále v tabulce F a je třeba uvést, Že zlepšené pAg výsledky a procenta regenerace

byly dosaženy pro oba dimery ve	srovnání s	jejich odpo
vídajícími referenčními monomery	• ·
Tabulka F
Sloučenina	krysí.	%
	děloha	regen.
CP-0088 DArg°-Arg1-Pro2-Hyp3-Gly4-Fhe5“	P*2
Ser -DPhe^-Leu-Arg	7,4	100
, CP-0127
- 3SH(Cys-‘)dimer CP-0088......... CP-0181 DArg°- Arg1-Pro2-Hyp3-Gly4-Phe^-	..... .8,.8..	. .50. ......
Ser -DPhe -Phe -Argy	7,9	100
CP-0219
BSH(Cysb)dimer CP-0181	812	40

-49Výáe uvedené výsledky (příklady 3-9) ukazují, že dimery jsou účinnější jak než; původní nebo modifikovaný antagonista a že trimery, i když jsou lepší než monomery, nevykazují vůči dimerům zlepšení. Takto se očekává, že . nejlepší výsledky se dosáhnou za použití reaktivních bismaleimido skupin, které jsou samotné výhodně spojeny jednoduchým rozvětveným uhlovodíkovým řetězcem, jako peptidovou spojující skupinou. Zavedení dvou nových chirál— - n-t er* s «-ná sl- e d ují cí m*pří d a vk e m* p e p tú d u * po s ky t u j θι<»*^’*ι*ί«***

I opticky rozdílné sloučeniny (tj. diasteromery), které se nejeví jako nežádoucím způsobem ovlivňující antagonistickou aktivitu.

Z předchozího je zřejmé, že různé modifikace? mohou být provedeny bez vybočení z myšlenky a rozsahu vynálezu. Například¹, jestliže se SK antagonista označený jako CP-0088 modifikuje zavedením Cys de různých poloh při přípravě uvedených dimerů, může být použit jakýkoliv původní antagonista pro tvorbu vhodných dimerů nebo podobně, bez jakékoliv modifikace nebo s různým typem modifikace. Jak bylo uvedeno dříve, může se také měnit linker použitý pro tvorbu sloučenin podle vynálezu. Pro další ilustraci tohoto aspektu vynálezu se uvádí, že linker může obsahovat dextran, který může být modifikován náhodně podél délky dextránové molekuly tak, že vykazuje reaktivní maleimidové zbytky jak je uvedeno dále:

maleimidem odifikovaný dextran dextran

-51Výsledný maleimidem substituovaný dextran pak může reagovat s peptidem, obsahujícím voln.pu thiolovou skupinu | způsobem analogickým výše popsanému při změnách solárních poměrů za vzniku konjugátů peptid-dextran s různými hustotami substituce a celkovou velikostí.

Λ

Jak bylo uvedeno dříve, důležitým aspektem vynálezu je poskytnutí heterodimerů nebo vyšších hetero-merů”, kde se použijí různé SKA pro poskytnutí sloučenin vzorce »It*T o t o* heťe ro-'* p r o ve d eni^urn ož ή u j e*t v o ř i t* a imery v* π ap ř í-»*“ klad, které jsou účinné vůči dvěma nebo více různým, bradykininovým receptorům:, např. EK^ a BKg re cep torům·. Tyto dva receptory se jeví jako nejhojnější a zřejmě mají největší distribuci v různých tkáních. Obecně EK₁ receptorové ligandy (jak agonisté tak antagonistě) jsou tvoženy, jestliže se C-zakončující arginin odstraní z odpovídajícího SKg receptorového ligandu buá cirkulací nebo karboxypeptidázami spojenými s tkáněmi.

Příklady této konverze z EK_O na EK. selektivitu jsou zřejmé z konverze bradykininu na des-Arg -SK a kallidinu na des-Arg^O-kallidia. Toto potvrzuje, že by bylo výhodné pro SK antagonisty obecně, aby obsahovaly jak BK^ tak EKg receptorovou antagonistickou aktivitu:. Na druhé straně může dojít k situacím, kde antagonísta by měl být selektiv ně účinný proti SK^ nebo BKg receptorům samotným.

I

Distribuce a relativní důležitost těchto dvou receptorových systémů se mění tkáň od tkáně a druh od druhu. Dále mohou různé patofyziologické procesy měnit distribuci a důležitost těchto dvou receptorových systémů během času u téhož zvířete. Jinými slovy, receptorové distribuce u naivního zvířete se může výrazně lišit od receptorové

-52distribuca u téhož zvířete po patofyziologickém procesu (například sepsi), po určitou dobu (viz ^arceua P. a spol.,ve Pharmacology of Kinins: Their Relevance to Tissue Injury and Inflammation, General Pharmacology, 14, str. 209229). Výsledkem je:, že je obtížné zjistit, jaký typ antagonist.y je nejvhodnějí pro jakokoliv danou aplikaci a uskutečnění in vivo konverze BK^ antagonisty na EK^ antagonistu nemůže: být uskutečnitelné za určitých okolností. Poskytnutí heterodimerů podle vynálezu nabízí možnost uplatnění v takových situacích, kde například jsou zahrnuty jak 3SC| tak B^2 re cep tory.

Příklady heterodimerů podle vynálezu, založené na uvedených BKg a SKj antagonistických monomerech jsou uvedeny dále:

SK, ANTAGONIST MONOMERY

CP-0126: 0ARG«ARG-FR0-HY7-GLY-PHE-CYS-DPHE-LEU*ARG

I

SH

CP-0X85: cARG-ARG-PRO-HYP-GLY-PHE-CYS-Dťnd-Oic-ARG

I

SH

BK, ANTAGONTST MONOMERY, **-”“CP-02S4;“*D'ARG-ARG-PRO-HYP-GLY-PHE<YS-DPHE-LEU í

SH

CP-0268: , DARG«ARG-PRO-HYP-GLY-PHE-CYS-D(Tid-Oic

I

SH

SKJBK. ANTAGONIST BSH HETEROPIMER Z

CF-0273:

CP-0272:

CP«-029fc

CP-0291:

DARG-ARG-PRO-HYP-GLY-PHE-CYS-OPHE-LEU

I (BSH) i

□ARG-ARG-PRO-HYP-GLY-PHB-CYS-OPHE-LEU-ARG

DARG-ARG-FRO-HYP<LY*PHE-CYS-DFHE.L£U

I (BSH)

I

DARG-ARG-PRO-HYP-GLY-PH&CYS-OfncWMc-ARG

DARG-ARG4^CÚHYP-GLY-PHE<YS-Dmd-Ok

I (BSH)

I

DARG-ARG-PRO-HYT-GLY-PHBCYS-DPHE-LEU-ARG

DARG-ARG-PRO-HYP-GLY-PHECYS-Dfnd-Oic

I (BSH) l

DARG-ARG-PRO-HYP-CLY-FHE-CYS-DíTid-Oie-ARG

-54^ri použití těchto heterodiaerů je možné pro každóu stranu dimeru, že působí na svůj případný receptor, tj.

3Kj antagonistická strana bude blokovat BK₁ receptory a antagonista bude blokovat receptory. Toto je ilustrováno následovně.

Příklad 10

Některé heterodimery byly hodnoceny na svoji antagonistickou účinnost vůči BK v krysí děloze (EK_?-recepton) nebo vůči des-Arg -BK (BK^-receptorový selektivní agonista) na králičí aortě (HKj-receptor) in vitro. Očinnosť v krysí děloze byle hodnocena jak je popsáno výše a byly stanoveny hodnoty pA^. Tyto jsou uvedeny v tabulce G,

Odinnost v králičí aortě byla zkoušena následujícím způsobem: Křivky vlivu koncentrace byly konstruovány pro des-Arg^-EK 1 hodinu a 3 hodiny po podání přípravků.

Po 5 hodinách byla přidána jedna koncentrace (10“ M) desΛ ί každý antagonista, kumulativním způsobem, na vrchol kontrakce a byl měřen negativní logaritmus molární koncentrace antagonisty, vyvolávající 5056 reverzi (ΙΟ^θ) koncentrace. Výsledky jsou uvedeny v tabulce G.

-55Tabulka-G

BK.An/BK.An MONOMERS, HOMO QtMESŠ ANO HETEŘOOIMER Y

Sloučen lna. .i.	BK, krysí děloha	bic, králičí jgorta
MONOMER ϊ ,
CP-0126	7.1 ± ai	Inafchr
CP-0185	. 10.7 ±0.9	4.1 ± 02 ;
CP-0254	Inatóv	6.4 ±0.1
CP-O2S8	6Ό	62 ±0.1
OíMERX
CP-0127	8J±O2	Inattiv·
CPO273	i2±ai	5.7 ±0.1
CP-0272	8.1 ±02	5.9 ±0.1
CP-O291	&0ŽO2	- 62 ±0.1

-56Z údajů v tabulce G je zřejmé, že každá část heterodimeru může působit nezávisle na druhé na svůj odpovídající receptor. JJe tak vhodný pro léčení chorob, ve kterých hrají úlohu jak EK₁ tak EK₂ receptory.

Údaje? v tabulce G 'také ukazují, že když jsou syntetizovány EK^/EK₂ antagoaisticjé heterodimery, výsledná aktivita každého ze sousedících ligandů se liší od aktivity bud homodimerů nebo uvedených monomerů. To znamená,, že alespoň Část zlepšení aktivity dimerů (homo- nebo heΛ tero-) může být přičtena spojujícímu prvku a že? hodnocení optimální linkerové polohy a chemie může být zkoumáno, pro každý z geminálních ligandů nezávisle syntézou a testováním linker modifikujících monomerů. Příklady vyrobených sloučenin a jejich testů jsou popsány dále v příkladu 11.

Příklad 11

Studie linkerové chemie za použití modifikovaných monomerů:

Pro optimalizaci linkerové chemie před syntézou požadovaného homo- nebo heterodimeru je výhodné prozkoumat serie linkerů za použití jednoho referenčního ligandů be2 přípravy čistých dimerních sloučenin. ^uak je ilustrováno dále (tabulka H) je serie modifikovaných BK₂ antagonistických monomerů vytvořena z referenčního ligandů CP-0126 a různých modifikátořů, sloužících k přiblížení se chemii jednoho z geminálních ligandů plus linkeru pro použití v homo- nebo heteaO-dimerních konstruktech. V této sérii jsou zahrnuty- různé -mono-maleimidoalkany.modifikované sloučeniny, které mohou být porovnávány se svými odpovídajícími homodimery popsanými výše.

Tabulkah

Slou£.	struktura ki-Mímm-s	ZTerex,
CP-0126	DAKG-ARS-PRO-HYP-CLY-PHE-CYS-PHE- 7,1	100
X-SH	veu-arc ;

CP-O264

7.5 100

CP—0256

9.2 0

CP-0266

I

8.2 70

8.4 50

CP-0175

8.5 30 laotaer

Cys<<;

-58Modifikované monomery uvedené v tabulce H zahrnují S-(N-alkylsukcinimido)-L-cýsteinové deriváty CP-0126, a byly připraveny následovně:

Ke směsi CP-0126 (1 ekv.) a N-alkylipaleimidu (1,5 ekv.) v DMF (asi 21 ml na mmol peptidu) bylo přidáno 10 objemů PBS (pH 7,5)* -Reakční směs byla míchána přes noc při teplotě místnosti (sledováno periodicky analýzou pomocí HPLC s reverzní fází) a výsledný S-(N-alkylsukcinimido)-modifikovaný peptid byl čištěn preparativní HPLC s reverzní fází. Lyofilizací pak byl získán čistý peptiď v 60 až 80% výtěžku jako chmýrovitá, bílá pevná lát ka. Deriváty CP-0126 připravené tímto obecným postupem zahrnují: CP-0139, 264, 257, 174, ’75, 2% a 266. Charakterizace (hmotově spektrální) je pro tyto peptidy uvedena v tabulce I.

-59Tabulka I Haotověspektrilní charakteristiky cystgnem modifikovaných derivátů CP-0126

^aelektrorozprašovací nebo plasmový popis hm.spektra b netestováno

-60Udaje v tabulce H znamenají, že obecně, daného monomeru se zvyšuje se zvětšováním délky alkylového řetězce a je dobře v souladu s p^ jeho odpovídajícího homodimeru. Údaje také ukazují, Že S-(IT-alkylsukciftimido)cystein-modifikované monomery jsou účinnější než S-(Nhexylacetamidoj-cysteinem modifikovaný monomer. Déle výsledky ukazují, že racemické směsi jakož i individuální optické isomery jsou oba funkčně vhodné s možností, že racemické směsi mohou být yýh0dné..Z hlediska možnosti heterogenity receptorové interakce.

I když údaje v tabulce H indikují, že i když jsou modifikovaná monomery samy účinné a vhodné pro použití podle vynálezu, je obvykle výhodná použití dimerů nebo vyšších merů (hoao- nebo hetero-), protože tyto druhé sloučeniny, obecně řečeno, vykazují i vyšší stupen aktivity proti nemodifikovanému peptidovámu monomeru, než odpovídající linkerem modifikovaný monomer. Je třeba uvést, že heteřodimery schopné interakce s různými typy receptorů se budou kategoricky lišit v aktivitě a použitelnosti, než jakýkoliv daný modifikovaný monomer.

Právě tak, jak je možno účinněji hodnotit linkerovou chemii vhodnou pro zahrnutí v požadovaném homo- a heterodimerním konstruktu za použití jediného referenčního ligandu a série různých modifikátorů, je také možno zkoušet serie potenciálně žádoucích geminálních ligandŮ a

J, omezeným počtem reprezentativních modifikátorů pro účely nejúčinnější optimalizace homo- a heterodimerních konstruktů. Jedna z takových sérií modifikovaných EK^ antagonistických monomerů je uvedena v příkladu 12 s výsledky, které byly dosažena, uvedenými, v grafické formě ná obr. 7.'

-61Příklad 12

Tento příklad ilustruje přípravu S-(N-hexylsukcínimido)-L-cysteinových analogů CP-0298, kde je S-(N-hexylsukcinimido)skupina posunována podél peptidového řetězce změnou polohy Cys od 0 do 8.

Ke směsi Cys-obsahujícího BK^ peptidového antagonisty (1 ekv.) a N-hexylmaleimiďu (1,5 ekv.) v DMF (asi 21 al na mmol peptidu) se přidá 10 objemů 0,1M hydrogenuhličitanu amonného (pH 8). SeakČní směs se přes noc.· míchá při teplotě místnosti (monitorováno periodicky pomocí analýzy HPLC s reverzní fází) a výsledný S-(N-hexylsukcinimido)-L-cysteinový analog CP-0298 se čistí preparativní HPLC s reverzní fází. Lyofilizací. se pak získá čistý peptid v 60-80½ výtěžku jako chaýřovitá, bílá pevná látka. Analogy CP-0298 připravené tímto obecným postupem zahrnují CP-0311, 322, 324, 326, 328, 307, 305, 309 a 313. Charakteristiky (hmotové spektrum) těchto peptidú jsou Uvedeny v tabulce J.

-62Tabulka J

Hnotověspektrální charakteristiky S-ÍN-hexylsukcininiďO’ )L-cystěžňových analogů CP-0298

Sloučenina č<	struktura	vyp· HH	hodnota
CPO298	Lys:-Argl«Prci-Pro3-GÍy4-Phe1-Ser‘-Proz· Leu1	978	978
CP-0311	Cysí*S-(N-hexy1su4pnimido)-CPO298	1154	1154
CP-0322	Cys‘-S-{N-hexyisu4eínimido)*CP0238	1126	1128
CP-C324	Cys^-S-ÍN-hexyteufcinimicJoJ-CP-OGSe	1185	1185
CP-0326	Cys3-S-{N4>exyteuiícriirnřdo)-CP-0298	1185	1185
CP-0328	Cys*-S-{N-hexyteutoimido}-CP-0298	1225	1225
CP-O3O7	Cys^-S-fJi-hexyteufeininitdoJ-CP-OSSe	1134	1134
CP-0305	Cy3‘’S-{N-bexytauicjniniido)-CP-0298	1193	1194
CP-0309	Cys7-S-(N-hexýisufconifnÍdo)-CP-0298	1185	1185
CP-0313	Cys*-S-{NrMxylsute3nimido}-CP’C298	1189	1189

a

-S^N-hexyisufspnimido)

b....... .. ... ........ ...................... ........... ........

elektrorozprašování při získání heotového spektra

-63Ůčinnost 6P-0298 jako referenčního ligandu a jeho analogů uvedených v tabulce J byly porovnávány in vitro ve zkoušce na králičí aortě . a výsledky jsou graficky znázorněny na obr. 7.‘

Mnoho důležitých hodnot může být získáno z údajů poskytnutých příklady 11 a 12, včetně skutečnosti, že? použitím modifikovaného monomeru může být rychle získána . důležitá informace vzhledem k jak preferovanému typu chemie spojení tak k výhodné poloze, ze které se tvoří požadovaný homo- nebo heterodimer. Stejně jako v případě 81^2 s®rií je zde výrazný vliv linker/modifikované polohy na aktivitu výsledné BE^ sloučeniny. Vztah polohy modif,ikótoru a aktivity pro sérii EK^ antagonistů sloučenin, uve- * dý- na obr.7 je výrazně odlišný oď vztahu poloha linkeruaktivita, nalezeného pro BEg antagonistickou sérii homodimerů. Toto je nejzretelnější při porovnání účinku modifikace nebo spojení odpovídajícího referenčního ligandu v poloze 6. V BEg antagonistickém homodimeru a modifikované monomerní sérii sloučenin , byla tato poloha shledána jako výhodná poloha jak pro zvýšení aktivity tak pro zlepšení doby trvání výsledných sloučenin. V BK| sériích nicméně je hoaologní poloha, ve skutečnosti, jedna z nejpreferovanějších poloh při které vznikají podobné modifikace .

Příklad 13

BKg antagonistÍcké/BE₁ antagonistické heterodimery ÍHEgAn/BK, An)

Tento příklad popisuje sérii EKgAn/BK^An hetero-. dimerů, které byly syntetizovány a testovány na základě

-64vztahů struktury a aktivity popsaných v příkladu 12. Tabulka K představuje seznem reprezentativních monomerů použitých v těchto studiích, jejich struktur a jejich účinností měřených zkouškou na králičí sortě pro EK^ receptorem zprostředkovanou aktivitu. Tabulka 1« je tabelace reprezentativních SKgAn/SK^An heterodiaerů odvozených od těchto· monomerů, ilustrující schopnost připravit účinné, duálně působící aktivní sloučeniny, ne bázi principů popsaných v předcházejícím příkladu.

W β

<—i 3 XJ s

BK, reoeptorové antagonistické monomery

O) ' >s' fc.

	-	-	OJ		OJ	co	co	co	co
o	o	o	o	a	ó	O	o	o	ó	a j
H	H	*		+i	Ή	H	H	H	Ή	-H
<n	05				O	OJ	tn	UO	oo	VO
S	•			IS	CO	cd	e	<0		cd
Ή	M	*rl			M	M	M	Ή	Ή	M
Λ	0	C			c	C	c	X	C	c
> 5	3	Sí aj	o •H.	o H	2> 5	ST a	57 <a	jí ca
c	c	C	Γ*	CD	c	c	c	c	c	c
			in	o-

r— i

C

Λ

O

H

O

CL

C

Ct +» .H

U

-t->

M *

>O β

C

H e φ o 3 O »—t to

Cí _J

0.

<1

I «

t

u.

Ó »

I

I

I

Q.

♦ i

«

OL

I t

ce

I

I

I

X ti.

a

LU

O

u.

t

I

I »

-o co m

« o

a.

cc a

’Τ vo w

o

I

0.

o u

o

I _o ώ

CE a

o

O ύ

H

O ώ

a.

*

I

CE

O r* m to 3 oj co O

0.

O

I

Q.

O *

0)

LU a

I

I

I

CE a

CS <0 o

( ou o

O

I _Q

H·

O ώ

co

-C

H o

I

I

CE

O co o

I

a.

ř*

CO

O «

0»

LU

O «

I

LU

CL

I

I

0.

I

I

I čd

WO co o

I

0.

I

I

CE

O co a

0_ . I t

« a:

a

-66Cys-(bis-sukcinimidohexan)-Cys antagonistické heterodimery uvedené v tabulce L byly připraveny následujícím způsobem:

Ke směsi CP-0126 (1 ekv.) a bismaleimidohexsnu ÍBMH, ekv.) v DMF (asi 21 ml na mmol peptidu) bylo .přidáno 10 objemů O,1M hydrogenuhličitanu amonného (pH 8). Reakční směs byla míchána při teplotě místnosti asi 1 hodinu (sledováno periodicky analýzou HPLC s reverzní fází) a výsledný S-vT-hexylaaleíaido)sukcinimidoderivót CP-0126 byl čiětěa preparativní HPLC s reverzní fází. Výsledný peptiá, izolovaný v asi 70% výtěžku po lyofilizací, byl pak spojem s Cys-obsahujícím BK^ peptidovým antagonistou (1,5. ekv.) v DMF (stejně ml/mmol jak je uvedeno výše).10 objemů 0,1M hydrogenuhličitanu amonného (pH 8) bylo přidáno a dimerizace probíhala asi 1 hodinu při teplotě místnosti. Výsledný Cys(bissukcinimidohexan)-Cys-peptidový dimer byl čištěn preparativní HPLC s reverzní fází a fyofilizací poskytl bílou, péřovitou pevnou látku. Výtěžky se pohybují v rozmezí 40 až 50 %. Heterodimery připravené tímto obecným postupem zahrnují^ CP-0273, 364, 365, 386, 382 a 383 jak je uvedeno v tabulce L.

67-M C03 ť u

O

+)

N.

tO o

H to r<

o

+) v

N

CM

Ó +t

O «Η tn co co ó

-H

CM co o

-H eo

Tabulka ρ-ι

X

UI

S

O o

X

LU

H·

LU

X s

ffi ϋ

ffi —tň— u

ω +» íí³< ffi μ α m

At β

§ q

*>

VI s

« >0 3 o 1—t w

O +1

CM

CO n· tn

CM o

*

X o

I β

X tn a

I <0

CM

O ♦

X o

co

N.

x □

CM o

-H co

CD

CM <0

CO o

t

CL

O

X

CZ) ffi

I co

CM

CL

O o

I

X o

O

-H

V

CD o

-H cd

O +1 v

ut c

o

O) <

<ň

C

O o

<

CO

CO co o

I

X □

I «

X tn m

I tn <d

T· o

X ϋ

CO

N

CO

O

I

X

O «

<

X co ffi

I <0

CM o

x o

co sj co o

<

X

O

O cn ffi f

co

CM

O »

X ϋ

tn o

I

CL

Q co o

<

X o

0} o

X ϋ

v

K co o

I

X □

X cn m

I co

CM

O

X o

CM co

I

X u

tn r-.

<0 o

X

Q

X cn ω

(O

CM

O

I

X o

<0 o

I

X o

x φ

Xl

O

Ό •rt a

o

u) rM >5

O t4 a

Λ >· i

β.

ι o

a

II

X cn ffi cn a

φ

□.

ω ffi

-68Ch ar aktér i z ace? (hmotn. spektrum) peptidů uvedených v tabulce M.

Tabulka M

Charakterizace (hmotn.spektrum) S^Aa/ESjáa heterodiaerů

slouč.C. HUlYlDCn	struktura	vyp· , MH	(M+H) hodnota®
CP-0273	CP-0126-(BSH)*-CP-0254	2647	2648
CP-0364	CP-0126-(BSH)*-CP-0362	2529	2530
CP-O365	CP-0185-{B$H)*-CP-0363	2681	2682
CP-0386	CP-0126-(BSH)*-CP-0376	2579	2580
CP-0389	CP-0126-(ESC)b-CP-0388	2470	2471
CP-0382	CP-0126-(BSH)*-CP-0374	2502	2503
CP-0383	CP-0126-(BSH)*-CP-0375	2492	2493

* BSH s bissukeiaiaidohexan ^b ESC = epsilon ; sukciaimido-n-kaproyl • Plasmové desorpční hmotové spektrum

-69In vitro screeningi

Sloučeniny CP-0273 a CP-0386 byly vybrány pro srovnávací účely, protože tyto heterodimery používají stejný HKg antagonistický liganď (CP-0126) a stejný linker (3SK) se dvěma geminálními ligandy (CP-0254 a CP-0376), které se liší pouze v poloze dimerizace. ^rrvní sloučenina je dimerizovéna v poloze 6 obou řetězců dimeru (nejpreferovanější a alespoň preferované polohy pro EKg a BK^ antagonisťy), zatímco druhá sloučenina využívá nejpreferovanější polohy pro každý z geminálních ligandů.jek bylo stanovena analýzou modifikovaného monomeru (polohy 6° a 1). Z údajů v tabulce L je zřejmé, že účinnosti dvou sloučenin vzhledem k BKg receptorovému antagonismu, jsou identické v rozsahu experimentální chyby zkušebního systému i když jejich BK₁ antagonistické aktivity jsou většinou lOOkrát rozdílné, podle jejich odpovídajících monomerů.

Je nutno poznamenat, že použití modifikovaného monomeru jako základního Článku aktivity s ohledem na receptorovou specifickou aktivitu heterodimeru má svá omezení. Tato omezení dále ilustrují důležitost interakcí geminálního ligandů s ligandem v otázce stanovení konečné aktivity dimerního konstruktu. Příklady důležitosti této interakce jsou sloučeniny CP-0382 a CP-0383, kde byl BK^ antagonismus zachován, ale Bí^ aktivita byla změněna ze striktního antagonismu na v podstatě částečný enonismus.

BK₁ antagonistické ligandy (CP-0374 a CP49375), při testování jako monomery nemají měřitelnou aktivitu ani jako agonisté ani jako antagonisté v receptorovén EKg systému krysí dělohy.

-71a přítomnosti BKg antagonisty CP-0088. Obr.b ilustruje profily ode2vy podobných skupin zvířat za přítomnosti selektivního ΕΚη antagonisty Cp-0298. Konečně obr. 8c je profil odezvy skupiny podobně ošetřených zvířet na BKj a EKg sgonisty za nepřítomnosti e přítomnosti heterodimeru CP-O364. Jak je zřejmé z těchto záznamů, selek tivní antagonisté budou pouze ovlivňovat odezvy na své odpovídající agonisty, zatímco dimer (hetero) je schopen blokovat profil odezvy pbbu agonistů současně. Toto neznamená, že jakýkoliv daná heterodimerní molekula působí na receptory dvou rozdílných tříd současně, ale že populace heterodimerních molekul může antagonizovat obě populace a BKg receptorů u stejných zvířat ve stejné době. Data z reprezentativní skupiny monomerů, homodimerů a heterodimarů, jsou shrnuta v tabulce N.

Očekávané antagonistická aktivita je založena na údajích shrnutých v tabulkách K a L. In vivo experimentální data, která jsou uváděna, jsou kvalitativní měření antagonistické aktivity při třech různých dávkách (1,3 a 10 /Ug.kg^min’¹) u králíků, kteří dostali subletální dávku LPS (10 /Ug) 20 hodin přeď počátkem pokusu. Symbol označuje úplnou blokádu odezvy krevního tlaku na vhodného agonistů (jak je zřejmé na obr.8), zatímco +/- indikuje částečnou blokádu a označuje nepozorovatelný účinek při uvedené dávce. Z těchto dat je zřejmé, že in vitro charakterizace antagonistické aktivity těchto'sloučenin je relativně precizním měřením jejich in vivo aktivity a je: 1 vhodná technika pro screening heterodimeru na jeho požadovanou aktivitu.

’72Tsbulke N

IN VIVO aktivita různých monomerů a hot&odimerů a heterodimerů

Sloučenina	očekávaná antagonistick; aktivita	• pozorovaná aktivita	antagonističtí
		BK,	BKj I
		1 3 10	1 3 10
CP-0088	BKj	-	+ + + i
CP-0126	BKj		+ + + i
CP-0127	BKj	• · *	+ + + I
CP-O184	BKj		+ + + j
CP-O298	BK,	+ + +
CP-0267	ΒΚ,/BKj	- - +	- - +/·
CP-0345	ΒΚ,/BKj	+ +	• +/- +
CP-0364	ΒΚ,/BKj	+ + +	+ + +
CP-0365	BK,/BKj	- ·+ +	- + +
CP-0386	BK/BK,	+ + +	+ +. +

-73Jak bylo uvedeno dříve, je delším provedením vynálezu poskytnutí sloučenin vzorce III (y)(x)(bka) (5) kde X a BKA mají dříve uvedené významy a Y představuje péptidový řetězec, který demonstruje antagonistickou nebo agonistickou aktivitu vzhledem k ne-BK receptoru, tj. heterodimery cílené k BK (např. BKg) a ne-BK receptorové populaci. Protože dříve bylo uvedeno, že EK^/BKg antagonistické heterodimery' podle vynálezu mohou poskytovat účinnou duální aktivitu cílenou k oběma typům receptorů, je třeba si uvědomit, žel jiné účinné heterodimery mohou být připraveny podle předloženého popisu a poznatků. Toto je zvláště důležité v případě, že existuje blízký vztah mezi zahrnutými aktivitami.

J

Je známo, že mnoho patofyziologicky důležitých procesů jer blízké souvislosti se zánětovými a neurogenními mediátory. Toto se projevuje například jak v sekundární bolesti tkáňového trauma (accidentální a postoperativní) tak v astma. V obou situacích je zde existující komplex součinnosti tkáňových a plasmových mediátorů (kininy působící jako BK₂ receptory) a neuronálních odvozených faktorů jako je substance P (NKj receptory) a neurokinin A (NK₂ receptory). Konečně jsou zde lokálně působící neuronální receptory yu-opioidové třídy,které, mohou při stimulaci inhibovat uvolňování neurogenních peptidů bez ohledu na typ (substance P, neurokinin A, neurokinin B, cholecystokinin, 8GRP atd.).

Vzhledem k interakcím těchto jakož i jiných zánětlivých a neurogeQních mediátorů, není žádné jediné činidlo pravděpodobně univerzálně účinné ve zmírňování symtomů»

-74vedoucím lc patofyziologii. Avšak heterodimery podle vynálezu by měly být zvláště vhodné pro tyto problémy s užitím jednotlivých činidel, vykazujících dvojí selektivitu. Dále se jeví, Že heterodimery podle vynálezu mohou být použity k potlačení množství takových limitujících problémů ve srovnání s vývojem jedinečně selektivních Činidel. Například jako v případě BK antagonistů, substance P a neurokinin A antagonisté jakož i ^u-opioidové agonistické peptidy všechny trpí obvyklým problémem rychlé inaktivace množstvím spojených tkání jakož i rozpustnými andoa exopeptidázami. Předpokládá se, že předložené heterodimery znamenají cestu, ve které může být zabráněno rychlé inaktivaci bez ztráty jak účinnosti tak specifičnosti jak bylo zjištěno u BK₂ homodimerů, které jsou zde popsány: EnkefaliMo«£‘;nebo opioidoví agonisté mají další problém, tím že; mají značnou možnost zneužití nebo vzniku závislosti a kognitivní vedlejší účinky, jestliže zasahují do centrálního nervového systému. Opět se předpokládá, že heterodimery by měly vykazovat adekvátní, jestli ne neobyčejnou, periferní aktivitu bez neočekávaných a omezujících vedlejších účinků na centrální nervový systém tím, že /^u -opioidový receptorový agonista bude kovalentně připojen k vysoce kationtovému BK antagonistovi, který neprostupuje kravní mozkovou bariérou v jakémkoliv výrazném množství.

Následující příklady popisují různé heterodimery vytvořené dimerizací referenčního BK₂ ligandu, CP-0126, a různými NKj a NKg antagonisty jakož i sérií /U-opiodních agonistických peptidů. Jak bude odborníkům zřejmé, skladba, syntéza a použití takových heterodiaerů není žádným způsobem omezeno na specifické sloučeniny ilustrované v tomto popise, ale může být provedeno spárováním jakých-75koliv dvou z mnoha vhodných ligandů za použití standardních chemických reakcí a bez přehnaného experimentování.

Příklad 14

BK2 antagonistické/HKi antagonistické heterodimery (BK₂Ai/NK₁ én)

Za účelem ilustrace potenciálu blokování dvou různých receptorových populací . jednou sloučeninou byl zkonstruován NK^ receptorový antagonista (Darg-DPro-Lys-Pro-Gln-Asn-DPhe-Phe-DTrp-Leu-Nle?), U antagonisty bylo zjištěno, že má p^2 při testu proti substanci P ve zkoušce na ileu morčat na NKj receptorovou aktivitu. Byla stanovena aktivita tohoto referenčního ligandu a byla syntetizována serie lysin obsahujících monomerů systematickou náhradou lysinového zbytku postupně referenčním peptidem. Tyto sloučeniny byly pak spojeny k CP-0126 za použití heterobifunkčního spojujícího činidla: epsilon maleimido-n-kaproyl-N-hydroxysukcinimidoesteru (EMCS), za tvorby řady epsilonsukcinimido-n-kaproyl tESC) heterodimerů (Tabulka 0).

-76Tabulka O

BKJ^n/NK.An HETERODtMEtfE

Slouč eaiiac	struktura	NK,:GP! PAj (±	BKjiRU pAj (±
CP-0390	CP-0126-{ESC)*-LYS’[CT-0008f	4.8 ± 0.2	7.2 ± 0.2
CP-0391	CP-0126-{ESCr-LYSi[CT-0008ř	5.0 ±0.1	7.1 ± 0.2
CP-0392 ’	CP-0126-{ESC)-LYSaICT-0008f	5.3 ±0.1	7,0 ± 0.2
GP-0393	CP-0126-{ESC)l-LYS4tCT-0008]b	5.5 ± 0.2	7.4 ±0.1
CP-0394	cp-o^e-fEscp-LYS^CT-ooosf	5.8 ± 0.3	7.9 ±0.1
CP-0395	CP-0126-(ESC)4-LYS^CT-0008f	6.3 ±0.1	7.3 ±0.1
CP-0396	CP-0126-(ESC)4-LYS7[CT-0008f	tna£tiv	8.0 ±0.1
CP-0397	CP-0126-(ESC)e-LYS*íCT-0008r	Inaáftřy	7.7 ±02
CP-0398	CP-O126-<ESC)e-LYS*ICT-0OOef	InaAtrv	6.4 ±0.2,
CP-0399	CP-0126-{ESC)*-LYS,otCT-OOO8JĎ	4.9 ±02	7.4 ±0.1
CP-0400	CP-0126-{ESC)4-L.YSn[CT-0008f	Inaftiv	7.6 ± 0.3

⁴ ESC = <epsilo* sukcÍ*iaido-*-kaproyl ^b CT-0008 = D-Arg-D-ProLys-Pro-GIn-Asn-D-Phe-Phe-O-Trp-Leu-NIe-CONHj

-77Cys-(epsilo* sukeinimido-n-kaproyl)-Dys Ο^Αλ/ΝΚ^Α* heterodimery uvedené v tabulce 0 byly připraveny následovně i

Pro přípravu L-Lys(FMOC)-obsahující NK^ peptidový antagonistů- pryskyřice (M3HA, 0,5 mmol peptidu), bylo přidáno 50 % v DMF (asi 20 al). Výsledná směs byla šetrně probublávána dusíkem (g) 20 minut pro dosažení úplného odstraněni(Lys)FMOC chránící skupiny a pak byla pryskyřice s peptidem dobře promyta DMF, Pryskyřice s peptidem byla resuspendována v DMF a bylo přidáno 1,5 ekv.

EMCS (N-hyčroxysukcinimidoester- epsilon maleimido-nkaprové kyseliny). Aoylační reakce probíhala při teplotě místnosti 2-3 hodiny (ověření úplné acylace bylo pro vedeno Kaiserovým testem) a pak byla peptid-pryskyřice⁵ dobře promyta DMF, potom 10% (obj./obj.) NH^HCO^/DMF v koncentraci: 0,1 M, pH 8). Ke pryskyřici, obsahující peptid, obsahující aaleimidosBupinu byl přidán CP-0126, ekv. v 10% (obj./obj.) NH^HCO-^/DMF a následující adice konjugátu (1,4-adice) probíhala při teplotě místnosti několik hodin. Beptid-pryskyřice pak byla promyta (postupně) dobře 10% NH^HCOj/DMF, DMF a dichlormethanee. Po sušení ve vakuu byl heterodiaer zbaven chránících skupin/oďštěpen ze systému peptid-pryskyřice bezvodým HF při 0 °C a pak byl purífukován pre^arativní HPLC s reverzní fází. Lyofilizací byl Získán čistý peptid v 50-60% výtěžku jaká chmýřovitá, bílá pevná látka, heterodimery připravené tímto obecným postupem zahrnují: CP-0390, 391, 392, 393,

394, 395, 396, j97, 398, 399 a 400. Charakterizace (hmotoáá ' spektra) pro tyto pdaje jsou uvedeny v tabulce P.

-78Tabulka P

Hmotově spektrální charakteristiky £K₂4i/NK₁ 4a heterodi

Sloučenina	i struktura	vyp. MH	(M*HT I hodnota^
| CP-0390	CP-0126-íESCMys'(CT-0008ř	2074	2875
CP-0391	CP41264ESCr-lysfcTX)008ř	2933	2934
CP-0392	CP^126-{ESCr-Lysfc7-OQ08f	2903	2904
CP-0393	CP-012^ESCMys4(CT-0008f	2933	2934
CP-0394	CP-0126^ESCr-LysfcT-0008f	2902	2903
CP-0395	CPO126^ESCr-LyslCT<X)08f	2916	2917
CP-0396	CP-01264ESC)*-LysTÍCT-0008f	2883	2884
CP-0397	CP-01264ESC)*-Lys*(CT-0008f	2883	2884
CP-0398	CP-01264ESCMys*ICT-0008r	2844	2845
CP-0399	CP-O^S^ESCr-Lys^CT-OOOer	2918	2919
CP-0400	CP-0!26-{ESC)e-Lys”tCT-0008ř	2918	NT*

• ESC*epsilcft sukeiniaiďo n-kaproyl

CT-0008 = D-ArgOPro-Lys-Pro-Cln-Asn-D-Phe-Phe-D-Trp-Leu-NIe-CONHj získané plasma desorpění hmo^Jtové spektrum ⁴ NT*_net_estováno

-79V souvislosti s výše uvedeným je třeba uvést, že maleimido-obsahující NKj peptidový antagonists může být štěpen z peptid-pryskyřice, čištěn a pak kondenzován s CP-012&V roztoku, je-li to nezbytné nebo žádoucí.

Je také důležité poznamenat, že pro tuto sérii sloučenin může být použita rozdílná strategie spojení za účelem zdůraznění, že chemie založená na cysteinu není nezbyt ná pro provedení vynálezu a pro ilustraci rozsahu potenciálních chemických reakcí, které mohou být použity pro tvorbu dimerníeh struktur, °ak je zřejmé z předložených údaji jsou heterodimery schopné antagonizovat jak BK₂ tak NKj receptorovou aktivitu, zatímco si uďržují nebo zlepšují aktivitu vhodného geminálního ligandu pro specifický receptor, možným užitím takového typu strategie.

. syntézy. V tomto příkladě se jeví polohy 4,5 a 6 v NK^ antagonistickém geminálním ligandu jako optimální pro zachováni nebo zlepšení jalc NKj antagonisty tak BK₂ antagonisty, pokud jde o jejich aktivitu. Cys/cys heterodimery tohoto typu jsou také možné a mohou být i v určitých aplikacích preferovány.

Přiklaď 15

SK₂ antagonÍsta/NH₂ antagonistické heterodimery (ΞΚ₂4η/ΝΚ₂Λι) , Pro účely ilustrace a dalšího doložení, že BK₂Zn-heterodimery jsou schopny účinně blokovat dvě různé receptorové populace:, byly připraveny serie BK₂4i/NK₂án heterodiaerů způsobem popsaným výše pro heterodimerní struk........tury. ϊ-tomto-pří-paďě by-la-užl-t-a-Cys/Cys spojující staatér.

. gi®, ale předpokládá se, že Cys/Lys nebo alternativní strategie by mohly být použity také snadno.

-80Cys-(bissukcinimidohexan)-Cys EKg/NKg ⁸ⁿ^agonistiu-. ké heterodimery uvedeného láganďu CT,0022 (Asp-Tyr-dTrpVal-DTrp-DTrp-Arg-COMHg tyly připraveny následovně:

Ke směsi Cys· obsahují čího.., SK2 peptidového entagonisty (1 ekv.) a bismaleitaidohexanu (EHH, 2 ekv.) v IMF (asi 21 al na mol peptidu) se přidá 10 objemů 0,1 iá NH^HCO^ (pH 8), Heakční směs se míchá při teplotě místnosti několik hodin (sleduje se občas analýzou za pomoci HPLC s reverzní fází) a výsledný S-(N-hexylmaleimido)sukcinimido derivát antagonisty se Čistí preparativní HPLC s reverzní fází. Výsledný peptid, izolovaný v přibližně 70% výtěžku po lyofilizaci se pak spojí s CP-0126 (1,5 ekv.) v DMF (stejné ml/mmol jak je uvedeno výše). Přidá se deset *· objemů' NH^HCO^ (pH 8) a dimerizace probíhá několik hodin při teplotě místnosti. Výsledný Cys-(bissukeinimidohexan)Cys peptidový dimer byl čištěn preparativní HPLC s reverzní fází a lyofilizaci byla získána bílá, <hmýrovitá látka. Všechny výsledky byly v rozmezí 40-50 %. Heterodimery připravené tímto obecným postupem zahrnují: CP-O411, 412, 413,

414, 415, 416 a 417· Charakterizace (hmotáové spektrum) těchto peptidů jsou uvedeny v tabulce Q.

Tabulka Q

Hmotově spektrální charakteristiky heterodimerů

sloučenina CP-0411	struktura	vypočt. MW	ÍM+H1* hodno 1.1 2640
CP-0126-(BSH)‘-Cys’[CT-0022r	2639
CP-0412	CP-0126-{BSH)‘-Cys’íCT-0022f	2591	2592
CP-0413	CP-0126-(BSH)l-Cysí[CT-0022f	2568	2569
CP-0414	CP-0126-{BSH)‘-Cys*tCT-0022f	2655	2656
| CP-0415	CP-0126-(BSH)*-CyssICT-0022f	2568	2569
| CP-0416	CP-O125-{BSH)*-CysaICT-0022f	2568	2569
| , CP-0417	CP-0126-{BSH)‘-Cys7[CT-0022]*	2598	2598

• BSH =' bianukciaimidohexa® ^b CT-0022 = Asp-Tyr-D-Tfp*Val-O-Třp-D-Trp-Arg-CONH2 * Plasmovou desorpcí získané hmotové spektrum

-82Heterodimery takto získané byly testovány na aktivitu jak bylo již popsáno a výsledky jsou uvedeny y tabulce R.

Ψ této tabulce -log/U/ představuje záporný log molární koncentrace antagonisťy nezbytné pro snížení trvalé kontrakčaí odezvy získané aeurokininem Ana'50 %·

Tabulka R

BEgWHK^An heterodimery

Sloučeni- na	struktura	BK, krysí uteroar pA,	NK. j králičí Pulm Art
CP-0411	CP0126-{BSH)*-Cys1|CT-0022f	7.5 ± 0.1	5.5 ± 0.3
CP-0412	CPOISS-ÍBSHr-Cys^CT-CO^r	7.9 ± 0.1	Inattw,
CP-O413	CPOiaS-íBSHp-CysíCT-OOZŽf	8.5 ± 0.3	Inafetiv»
CP-O414	CPOIZS-fBSHf-Cys^CT-íXESf	7.8 ± 0.1	5-2 ±0.2
CP-O415	CP0126-{BSH)*-CysslCT-0022ř	7.8 ± 0.1	5 J ± 0.1
CP-O416	CP0126-{BSH)*-Cys*fCT-0022ř '	8.7 ± OJ	5.6 ± OJ
CP-O417	CP0126-(BSH)‘-Cys7[CT-0022f	8.0 ± OJ	5.6 ±0.1

* BSH =bissukciftimidohexaa ^b CT-0G22 = Αίρ-ΤγΓ-Ο-ΤΓρ-νδμΟ-ΤΓρ^ΤΓρ-Α^ΌΟΝΚ,

-83Odaje uvedené v tabulce R zřetelně: ukazují, jako v případ? ΞΚ^Αι/ΕΚ^Αη a BKgAn/NKjAn heterodimerů, jsou možné vhodné HKgAn/N^An heterodimery. Vzhledem k těmto výsledkům a dříve uvedeným poznatkům je zřejmé, že jiné typy heterodimerů vzorce III mohou být připraveny, kde ligandy použité pro tří série heterodimerních antagonistů, které jsou zde ilustrovány jsou reprezentanty antagonistů uvedených v literatuře.

Příklad 16

Tento přiklaď ilustruje? přípravu BK₂ antagonista/yuopioidový receptor. agonistických heterodimerů (SKgAn/yuAg)· Protože je zřejmé z výše uvedeného, že antagonista/antagonista heterodimery jsou schopny interakce? se svými případnými receptorovými populacemi, heterodimery antagonista/a®onista mohou být také připraveny, které jsou schopny; interakce se svými případnými receptory.

Pro ilustraci tohoto hlediska vynálezu byly připraveny serie monomerních yu-opioidových receptorových agonistů, ve kterých karboxylový terminálni zbytek cysteinu byl přidán ke známému inhibičnímu peptiďu, Tito noví antagonisté byl) pak spojen/ s CP-0126 se seriemi bismaleimidoalkaAových linkerů a testovány standardní zkouškou na yu-opioidovou receptorovou aktivitu jakož i se standardním EK^ zkušebním systému použitém pro dříve zmíněné heterodimery.

Cys-(bissukcínimidoalkanJ-Cys EKg antagonistické/yuopiodní receptori-agonistické heterodimery v tomto příkladu byly připraveny následovně:

Ke směsi Cys-obsahujícího, yu-opiodního receptorového agonisty (1 ekv.) a bismaleimidoalkanu (2 ekv.) v DMF (asi 21 ml na mmol peptirfi) bylo přidáno 10 objemů Q,1M NH^HCO^

-84(pH 8). Reakční směs byla míchána při teplotě místnosti asi 1 hodinu( sledováno periodicky pomocí analýzy HPLC s reverzní fází) a výsledné S-(N-alkylmaleimido)sukcinimidoderiváty /U-opioidového receptorového agonisty čištěny preparativní HPLC s reverzní fází.Výsledný peptiď izolovaný v přibližně 70¾ výtěžku po lyofilizaci pak byl spojen s. CP-0126 (1,5 ekv.) v DMF (stejně ol/mmol jak je specifikováno výše).* Bylo přidáno deset objemů 0,1M Nff^HCO^ (pH 8) a dimerizace probíhala několik hodin při teplotě místnosti. Výsledný Cys-(bissukcinimidoalkan)-Cys peptidový dimer-· byl Čištěn preparativní HPLC s reverzní fází a lyofilizací poskytl bílou, chmýřovitou pevnou látku. Všechny výtěžky se pohybovýly mezi 40 a 50 %. Heterodimery připravené tímto obecným postupem zahrnují CP-0427 až CP-0432.

Charakteristiky (hmot.spektrální) pro tyto peptidy jsou uvedeny v tabulce S.

-85—. Tabul ka S

Hmotově spektrální charakteristika EK₂>n//o Ag heterodimerů

f Sloučeaiaa struktura	vypoSt. .Mg	(Μ+ΗΪ- hodnot)
CP-0427	CP-0126-{BSH)‘-CO-0001	2200	2201
CP-0428	CP-0126-{BSH)*-CO-0003	2101	2102
CP-0429	CP-O126-(BSB)*-C0-0001	2172	2173
GP-0430	CP-0126-(BSB)*-CO-0003	2073	2074
CP-O431	CP-0126-(BSD)*-C0-0001	2283	2284
CP-O432	CP-0126-(BSD)*-C0-0001	2184	2185

BSH bissukeimini do hexan: ^b BSB =» bissukciaimidobutao.

* BSD « bissu&nimidododq^an ^- získané plasmově desorpčsí hmotové spektrum

-86Jak je zřejmé z údajfc v tabulce T, tyto typy sloučenin jsou také schopny interakce s svými případnými receptorovými populacemi předpovězertým způsobem. U sloučenin jako jsou tyto se očekává, že budou vhodné pro léčení řady chorobných stavů, včetně pooperační bolesti a astma.

tabulka T

In vitro aktivita EKgW/U 4s heterodimenů

Sloučenina	pppis;	BK, krví UTERUS PS	μ-OPIOtD *morčěéí ILEUM ICB
C00001	Y-G-G-F-L-C-CONH,	-	6.0 ± 0.5
CO-0003	Y4DA)-G-F«ONH,	-	6.8 ± 02
CP-O427	C00001-{BSH>CPO126	7.6 ±02	6.4 ± 0.4
CP-0426	CO-0003-{BSH}-CP-012e	8.3 ± 0.5	6.6 ±0.4
CP-O429	CO-0001-(BSBhCP-012fi	7.6 ±0.1	6.3 ±0.3
CP-0430	C0-0003*{BSB)-CPO128	7.6 ±0.1	6.7 ±0.1
CP-0431	CO-0001-(BSD)-CP-0126	82 ±0.1	6.3 ± 0.3
CP-0432	CO-0003-{BSD)-CP-0126	7.5 ± 02	6.1 ± 0.3

-87BK antagonisté podle vynálezu ,zahrnující jak homotak heterodimery·, i modifikované monomery, mohou být použity ve formě konvenčních farmaceutických přípravků, obsahujících antagonistů a farmaceuticky přijatelný nosič.'·. Takové přípravky mohou být upraveny pro topické, orální, aerosolové, intramuskulární, subkutánní nebo intravenózní podání. Množství antagonisty přítomného v takových přípravcích se bude pohybovat v rozmezí, napříklaď, asi 0,001 až 90,0 % hmotnosti v závislosti na ap likaci a způsobu podání i když může být použito více nebo méně aktivní složky. Obvyklé dávky se budou měnit podle zamýšlené aplikace,např. 0,1 až 100 mikrogramů na kg tělesné hmotnosti za minutu jsou zamýšleny pro použití v souvislosti se septickým šokem.

Rozsah vynálezu je definován následujícími patentovými nároky.

Claims (25)

1. PATENTOVÉ . N A*R O K Y

   1. Sradykininový antagonista vzorce

   X(EKA)

   A kde BKA je peptidový řetězec bradykinin antagonistického peptidů, X je spojující skupina a n je celé číslo větší než 1.
2. 2. Bradykininový antagonista podle nároku 1, kde linker obsahuje sukcinimidoskupinu. ,
3. 3. Bradykininový antagonista podle nároku 2, kde peptidová skupina (EKA) je kovalentně připojena k linkeru přes thioetherovou vazbu.
4. 4* Bradykininový antagonista podle nároku 3, kde peptidová skupina zahrnuje cysteinový zbatek a sukciaimidoskupina je připojena ke každému peptidovéau řetězci přes cysteinový zbytek.
5. 5. Bradykininový antagonista podle nároku 4, kde n je 2 a linker je bissukcinimidoalkan.
6. 6. Bradykininový antagonista podle nároku 5, kde alky lový řetězec mé délku mezi 2 a 14 methylenovými skupinami

   -887. Bradykininový antagonista podle nároku 6, kde linkerová skupina má vzorec

   O O

   -4/H O O H kde a je? 2 až 14.
7. 8. Bradykininový antagonista podle nároku 1, kde n je 2 a spojující skupina je jedna z následujících skupin I, II

   O O

   Λ Λ ·

   CCH₂)_e- N/j* ϊζ kde a je 2 až 12 a n^ a n₂ jsou 1 až 12 a R, R*, R a R jsou chránící skupiny.

   -899. Bradykininový antagonista podle nároku 4, kde peptidem je dekapeptiď a cyšteinová skupina je v poloze 6 podle číslování bradykininu.
8. 10. 3radykininový antagonista podle nároku 9, kde peptidem je DArgO-Arg^-Pro^-Kyp^-Gly^-Phe^-Cys^-DPhe⁷Leu®-Arg⁹.
9. 11. Bradykinový antagonista podle nároku 10, kde n je 2 a spojující skupina je bissukcinioidohexan napojený přes thioetherovou vazbu k Cys^-skupině.
10. 12. Bradykininový antagonista podle nároku 1, obsahuv jící alespoň dva různé BEA substituenty.

    * ' *
11. 13. Bradykininový antagonista podle nároku 12, kde rozdílné BEA substituenty jsou antagonisty k různým receptorůo.
12. 14. Bradykininový antagonista podle nároku 13» kde jeden BEA substituent je BEj receptorový antagonista a druhý je BE₂ receptorový antagonista.
13. 15· Bradykininový antagonista vzorce

    X(HEA) kde BEA je peptidový řetězec bredykin antagonistického peptidu a X je modifikující skupina.

    -9016. Bradykininový antagonista podle nároku 15, kde X - je nepojeno přes thiolovou skupinu cysteinového zbytku v peptidovém řetězci BK.
14. 17. Bradykininový antagonista podle nároku -1-6, kde cysteinový zbytek je v poloze ó” peptidového řetězce.
15. 18. Bradykininový antagonista podle nároku 15, kde X je N-alkylsukcinimido skupina.
16. 19. Bradykininový antagonista podle nároku 15, kde X je N-alkylsukcinimidoskupina s alkylovým řetězcem, obsahujícím 1 až 10 methylenových skupin.
17. 20. Bradykinin antagonistický heterodimer- vzorce . (Y) (X) (BKA) kde BKA je peptidový řetězec bradykinin antagonistického peptidu, X je spojující skupina a Y je ligand, který je antagonistou nebo agonistou nebradykininového receptoru.
18. 21. Bradykininový antagonista podle nároku 20, kde BKA je peptidový řetězec BK! nebo HK₂ selektivního antagonisty a Y je neuropeptidový receptorový antagonista.
19. 22. Bradykininový antagonista podle nároku 21, kde neuropeptidový receptor je NK^ nebo UK₂ receptor.
20. 23. Bradykininový antagonista podle nároku 20, kde

    .......l-i-nk-erem---je--bl-S'S-uk-c-i-n-im-idOal-kan-.· ·· - ..... .......
21. 24. Bradykininový antagonista podle nároku 23, kde' linkexr je vybrán z linkerů uvedených v nároku 7 nebo nároku 8.
22. 25. Bradykininový antagonista podle nároku 20, kde BKA je BK-£ nebo BK2 receptorový antagonista a Y je opiodový receptorový agonista.
23. 26. Bradykininový antagonista podle nároku 25, kde BKA je BK-j- nebo BK2 receptorový antagonista a Y je μ-opiodový receptorový agonista.
24. 27. Farmaceutický přípravek, vyznačující se -tím, že obsahuje antagonistu podle nároků 1, 15 nebo 20 a jeho nosič.
25. 28. Bradykininový antagonista podle nároků 1, 15 nebo 20 pro použití jako léčivo.